ES2902202T3 - Una cepa de levadura Saccharomyces bayanus - Google Patents

Abstract

Una cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS y depositada en el DBVPG con número de depósito 36P.

Description

DESCRIPCIÓN

Una cepa de levadura Saccharomyces bayanus

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a una cepa de levadura que pertenece a la especie Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, y un método de selección de levaduras para uso enológico a partir de flores. Además, la invención se refiere al uso de la cepa de levadura en la producción fermentativa de alimentos.

Estado de la técnica

El uso de cultivos iniciadores de levadura en la producción de vino es una práctica fundamental que permite el control y la dirección del proceso fermentativo.

El término levadura seleccionada o iniciador seleccionado se usa para designar una cepa de levadura caracterizada por propiedades fisiológicas, bioquímicas y enológicas que se optimizan con respecto a las demandas tecnológicas de los procesos de fermentación en términos de pureza (Pretorius, 2000).

El uso de levaduras seleccionadas asegura el rápido inicio de la fermentación ya que la calidad y cantidad de levadura añadida al mosto son cuidadosamente seleccionadas; permite un mayor control del proceso fermentativo por parte del operario que opta por realizar la fermentación sin que dicho proceso quede en manos de levaduras presentes de forma natural en las uvas que no siempre tienen características positivas; reduce los problemas de parada o ralentización del proceso, propios de los procesos de fermentación espontánea; consigue buenos rendimientos de transformación del azúcar en alcohol, lo que reduce la posibilidad de que otros microorganismos se establezcan en el vino, dañándolo así (por ejemplo, bacterias acéticas); reduce o elimina características organolépticas anómalas y, por último, pero no menos importante, contribuye a la estandarización de la producción de un determinado vino, permitiendo así que sea reconocible por el consumidor año tras año (Fleet y Heard, 1993).

De manera predominante, la selección de levaduras se produce por medio del aislamiento de cepas de levadura de mosto o uvas, que son sometidas a pruebas de fermentación y caracterización enológica. Dichos ensayos son muy laboriosos y requieren una gran cantidad de tiempo, ya que contemplan el estudio de numerosas características fisiológicas y metabólicas de la levadura. Además, los mostos y las uvas pueden contener múltiples copias de la misma cepa, por lo que existe el riesgo de aislar dichas múltiples copias y así realizar pruebas por duplicado.

Las características enológicas importantes se pueden subdividir en dos grupos: aquellas con importancia tecnológica, que influyen en la progresión del proceso de vinificación, y aquellas que afectan a la calidad, que influyen en las características químicas y sensoriales de los vinos (Zambonelli, 2003). Por el término características enológicas se entiende las características asociadas con la actividad fermentativa de las levaduras (poder alcohólico absoluto, fuerza fermentativa, velocidad de iniciación de la fermentación), mientras que las características cualitativas incluyen aquellas características que contribuyen al aroma, y más en general, a la calidad organoléptica del vino, como por ejemplo la producción de glicerol, sustancias volátiles y compuestos sulfurados (Pretorius, 2000; Fleet, 2008).

Las principales características tecnológicas incluyen el poder fermentativo o alcohólico que, de acuerdo con Delfini, es el grado máximo de alcohol (entendido como % de etanol) producido una determinada levadura mediante la fermentación de un mosto que contiene exceso de azúcar (Delfini, 1995). El principal alcohol etílico producido por la actividad de las levaduras en condiciones anóxicas es el compuesto que ejerce una acción inhibidora sobre todos los microorganismos. Dado que, para uso enológico, las levaduras requieren características de rendimiento significativas, por ejemplo, para la producción de vinos con alto contenido alcohólico, también tiene, evidentemente, una importancia fundamental la resistencia (tolerancia al alcohol) al alcohol etílico.

Una característica tecnológica importante adicional es la fuerza fermentativa (o velocidad de fermentación), que expresa la velocidad a la que la levadura inicia la fermentación, incluso en presencia de antisépticos en las dosis legalmente permitidas y a temperaturas entre 15°C y 30°C. La rápida iniciación del proceso fermentativo es una de las características que debe poseer una levadura enológica independientemente de su tipo de uso (fresca o seca) y por tanto se debe considerar un requisito fundamental en la selección de levaduras para la vinificación.

Una característica adicional muy importante es la resistencia al dióxido de azufre SO2, es decir, la capacidad de mantener inalterada o suficientemente alta la velocidad de fermentación en presencia de dosis selectivas de SO2 añadido a los mostos con el fin de evitar la oxidación y conseguir una adecuada estabilidad microbiológica. Donde se producen vinos enriquecidos con SO2, es por lo tanto importante disponer de cepas resistentes a este antiséptico, con el fin de evitar problemas de iniciación que afecten al proceso de fermentación.

Otro aspecto importante se refiere a los métodos de crecimiento, es decir, al comportamiento de las células de levadura en la finalización del proceso de gemación, ya que dicha característica puede afectar al manejo del proceso de fermentación. El crecimiento de la levadura se puede distinguir entre crecimiento pulverulento, floculante o agregado. La velocidad de sedimentación de la cepa es, por tanto, una característica positiva adicional, ya que ayuda a las operaciones de clarificación y filtración del vino.

Las cepas que enturbian el vino de forma molesta y persistente manera son las cepas que generan espuma. La capacidad de generación de espuma es una característica dependiente de la cepa, asociada con la hidrofobicidad de la pared celular. En muchas cepas (20-30%) las células se adhieren a las burbujas de CO2 que se producen durante la fermentación, y estas burbujas, después de llegar a la superficie, en lugar de romperse, se fusionan y aumentan de volumen, dando lugar a espumas que adquieren un color marrón grisáceo debido a la presencia de las células. La ausencia o producción reducida de espuma es una característica positiva, tanto en fermentaciones primarias como en refermentaciones, ya que reduce el volumen ocupado por el mosto.

Con respecto a las características cualitativas, que se describirán posteriormente en detalle, las principales consideraciones incluyen:

- producción baja o nula de sulfuro de hidrógeno;

- la producción o degradación del ácido málico (como una función del mosto y de la añada enológica);

- alta producción de glicerol;

- baja producción de ácido acético;

- alto potencial aromático.

Desde el punto de vista cualitativo, los compuestos sulfurados consisten principalmente en sulfuro de hidrógeno (o H2S) y dióxido de azufre (SO2); dichos compuestos siempre son producidos por cepas de S. cerevisiae disponibles comercialmente como iniciadores del vino, aunque en cantidades diferentes y variables dependiendo de la cepa.

La vinificación que usa levaduras no productoras o que producen bajo H2S es particularmente ventajosa para aquellas variedades que están particularmente predispuestas a la "reducción". De hecho, el sulfuro de hidrógeno es el principal compuesto de los mercaptanos ligeros y tiene el inconveniente de tener olor a huevos podridos. Los vinos que presentan defectos olfativos atribuidos a la presencia de H2S tienen concentraciones de este último que varían entre 0,8 y 80 pg/l (Suzzi y Tofalo, 2014). El H2S también puede reaccionar con otros compuestos presentes en el vino, que alteran el perfil aromático. Esto se produce principalmente durante la fermentación alcohólica, como resultado de la acción de las levaduras.

Por lo tanto, el uso de una levadura que no produce, o produce poco sulfuro de hidrógeno, no solo permite fermentaciones más limpias y vinos más fragantes, sino que también retrasa y/o evita el trasiego al finalizar la fermentación, lo que permite que el vino permanezca más tiempo sobre los posos con el consiguiente enriquecimiento de manoproteínas y otras sustancias resultantes de la lisis de la levadura. Se sabe que la producción de H2S en Saccharomyces cerevisiae varía de 0 pg/litro a 300 pg/litro y que la cantidad producida es una característica dependiente de la cepa. Además, los datos de la literatura muestran que solo aproximadamente el 1% de las cepas enológicas es incapaz de producir H2S (Zambonelli y cois., 1984).

Así mismo, la producción de SO2 por levaduras muestra una amplia variabilidad. Ciertas cepas que producen cantidades significativas de SO2 (100-120 mg/l) también tienen tendencia a producir cantidades significativas de acetaldehído (para defenderse de dicho antiséptico) y el resultado, al finalizar la fermentación, es una alta concentración de SO2 unido, que puede comprometer la calidad del vino. Por lo tanto, durante las operaciones enológicas de selección de cepas iniciadoras, se debe dar preferencia a las cepas que producen niveles bajos de SO2 (máximo de 10-20 mg/l) (Vincenzini y cois., 2005).

Con respecto a la producción de ácido málico durante la fermentación alcohólica, esto representa una ventaja en la mayoría de los procesos de vinificación que implican uvas blancas de calidad, ya que la presencia de altas cantidades de ácido málico da una mayor sensación de frescura al vino resultante, en particular una sensación ácida, considerada más intensa, en comparación con el ácido tartárico.

Una ventaja adicional es que la producción de ácido málico permite un pH más bajo, con el resultado de una mayor actividad de dióxido de azufre y, en general, una mayor estabilidad microbiológica además de una mayor acidez global. Dicha producción por levaduras de interés enológico se ha descrito en la técnica conocida para determinadas levaduras criotolerantes, capaces de producir hasta 1 g/l de ácido málico durante el proceso de fermentación (Castellari y cois., 1994).

Otro producto secundario de la fermentación por levaduras es el glicerol.

Después del etanol y el CO2, el glicerol es el compuesto que se produce en mayor cantidad durante la fermentación alcohólica. Esto influye significativamente en el "cuerpo" del vino, lo que contribuye a que los vinos tengan las características de "plenitud" y "dulzura", con un umbral de percepción que corresponde a unos 5,2 g/l. La concentración de glicerol presente en el vino depende de la concentración de azúcares presentes en el mosto, las condiciones de fermentación y la cepa de la levadura.

En particular, en los procesos de vinificación, Saccharomyces puede producir de 2 a 10 g/l, dependiendo de la especie y cepa de levadura. Generalmente, S. cerevisiae es la levadura que produce las menores cantidades de glicerol, y esta es la razón principal de su alto rendimiento de etanol. En realidad, este compuesto no es un producto de fermentación secundaria ya que se deriva directamente de los azúcares y, cepa por cepa, la cantidad producida es proporcional a su concentración (Zambonelli y cois., 2000).

Entre los productos secundarios, aunque negativos, juega un papel muy importante el ácido acético, que durante la fermentación, se deriva de la degradación de los azúcares debido a la oxidación del acetaldehído (Ribéreau-Gayon, 2000). Además de la especie, la capacidad de producir cantidades mayores o menores de ácido acético es una característica que varía en función de la cepa.

Dicha capacidad para producir ácido acético se define realmente por el término de pureza fermentativa y se expresa como la relación entre la acidez volátil formada y el alcohol etílico producido. Las mejores cepas son aquellas que tienen el menor valor de pureza fermentativa y, por lo general, las levaduras empleadas con fines enológicos no deben producir cantidades de ácido acético superiores a 0,4 g/l.

Sin embargo, la acidez volátil de los vinos puede ser el resultado de varios orígenes y no solamente el resultado de la actividad de la levadura. De hecho, la concentración final de ácido acético en el vino también depende de la calidad de las uvas y de las condiciones de vinificación. El acetaldehído es el compuesto carbonílico más importante que se forma durante la fermentación y representa más del 90% del contenido total de aldehído del vino. Es un producto normal de fermentación alcohólica, y su contenido en vino puede variar significativamente (10-300 mg/l) dependiendo de la cepa de levadura y también de las condiciones de vinificación, y de la concentración de dióxido de azufre, al que se une el acetaldehído. La evaluación del contenido de acetaldehído se usa como indicador del grado de oxidación del vino. Una baja concentración de dicho compuesto en el vino confiere a este último un agradable aroma afrutado; sin embargo, a concentraciones crecientes, da lugar a un olor acre y oxidado y un sabor a hierba, de modo que el vino ya no es comercializable cuando la concentración de acetaldehído supera los 500 mg/l.

Para los vinos blancos, el valor medio es generalmente de 80 mg/l. Se sabe que uno de los principales factores que determinan la variabilidad del contenido de acetaldehído es la cepa de levadura. Así mismo, también se sabe que el dióxido de azufre puede inducir la producción de acetaldehído por las levaduras debido a la correlación entre la resistencia de las propias levaduras al dióxido de azufre.

Los alcoholes superiores, generalmente representados en el vino por n-propanol, isobutanol, alcohol amílico y alcohol 2-feniletílico, son productos de fermentación secundaria de la levadura y son compuestos que pueden influir significativamente en el aroma del vino. Dichos compuestos se derivan predominantemente del metabolismo de los aminoácidos presentes en el mosto, pero también del metabolismo de la glucosa sin la participación de aminoácidos precursores. De hecho, no existe una correlación directa entre las cantidades de aminoácidos presentes en el mosto y los alcoholes superiores presentes en el vino. La producción de dichos compuestos se debe principalmente a la acción de las cepas de levadura que pueden producir de 100 a 500 mg/l, dependiendo de la composición del medio, la disponibilidad de oxígeno, la fuente de nitrógeno y la concentración inicial de azúcar. Generalmente, cuando su concentración total es inferior a 300 mg/l, aportan un aporte positivo a la complejidad del aroma, mientras que cuando están presentes en concentraciones superiores a 400 mg/l dan una calidad negativa al producto (Suzzi y Tofalo, 2014). La excepción es el 2-feniletanol, que libera una fragancia con aroma a rosas, e incluso en altas concentraciones contribuye positivamente al aroma del vino (Vincenzini, 2005).

Durante la fermentación, las levaduras pueden producir ésteres que se originan de la condensación de ácido acético y ácidos grasos, predominantemente de cadena media, con etanol u otros alcoholes presentes en el vino, y ellos mismos también producidos por el metabolismo de las levaduras. La actividad esterasa de la levadura es muy importante en el proceso de vinificación ya que tiene un poderoso efecto sobre las características sensoriales del vino, produciendo la mayoría y más importante de los aromas de fermentación. La influencia de los ésteres en la calidad del vino puede ser negativa y no deseada, especialmente en el caso del acetato de etilo, que le confiere el típico aroma a vinagre (o incluso a disolvente). Por otro lado, la producción de acetato de isoamilo o acetato de isobutilo es positiva, ya que es responsable de un carácter afrutado.

Los documentos EP1978083 y Verspohl A. y cols., Appl Microbiol Biotechnol (2016) 101: 2507-2521 describen cepas de Saccharomyces que poseen varias de las propiedades anteriores, como la producción de bajas cantidades de H2S y altas cantidades de glicerol cuando se usan en procesos de fermentación, y que son aptas para la vinificación.

Descripción de la invención

El objetivo de la invención es proporcionar una cepa de levadura de la especie Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, dotada de las características tecnológicas y enológicas que permiten una buena fermentación del mosto, lo que permite la elaboración de un vino agradable con una complejidad aromática aumentada y equilibrada.

Un objetivo adicional es proporcionar una cepa que produzca ácido málico y glicerol en grandes cantidades y, al mismo tiempo, no produzca sulfuro de hidrógeno durante la fermentación alcohólica.

Otro objetivo de la presente invención es identificar una cepa de levadura adecuada para su uso como cepa parental para obtener híbridos de levadura con potencial enológico. La provisión de un autolisado de levadura para su uso como activador de la fermentación también es un objetivo de la presente invención.

De ninguna manera el objetivo final de la invención es la optimización de un método perfeccionado y rápido para la selección de cepas de levadura para uso enológico, particularmente levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae y bayanus aisladas a partir de flores.

Los objetivos antes mencionados se consiguen por medio de la cepa de levadura como se caracteriza en la reivindicación 1, y precisamente por una cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS, y depositada en el DBVPG con número de depósito 36P. También se describe en esta memoria, pero no cubierto por la invención reivindicada, un método de selección de cepas de levadura para uso enológico, cuyas características se establecen a continuación, y de manera precisa, mediante un método de selección para cepas de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus y Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, adaptado para la fermentación alcohólica, particularmente de uvas, aisladas a partir de flores.

La cepa de levadura Saccharomyces bayanus subsp. uvarum de acuerdo con la invención posee características enológicas óptimas, tanto tecnológicas como cualitativas, y se ha aislado de flores en una zona de la región del Véneto con alta actividad vitivinícola. La cepa ha sido identificada con el nombre SERIUS, y ha sido depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest, el 24 de mayo de 2016, en la "Colección de Levaduras Industriales" DBVPG en Perugia, con número de depósito DBVPG36P.

La cepa también se ha seleccionado por su producción de sulfuro de hidrógeno esencialmente inexistente, una característica muy rara en las cepas de levadura del género Saccharomyces. De hecho, en placas de medio de cultivo de agar Biggy, preferiblemente usado para verificar la capacidad para producir H2S, las colonias son blancas, lo que demuestra así la incapacidad de la cepa para producir este metabolito.

Otro aspecto positivo observado con esta levadura se refiere a la producción de glicerol. De hecho, en el mosto, la cepa produce glicerol en mayores concentraciones con respecto a cepas de S. cerevisiae comercialmente disponibles usadas como control. De manera ventajosa, se ha analizado la cantidad de glicerol producido en mostos de uva de fruto blanco y mostos de uva de fruto rojo y, con ambos tipos de uva, la cantidad de glicerol producido de forma natural fue mayor con respecto al mosto correspondiente obtenido con la cepa de referencia disponible comercialmente. De manera ventajosa, el vino producido que usa la cepa de acuerdo con la invención tiene una concentración de glicerol producida naturalmente por la cepa superior a aproximadamente 8,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 9,5 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 10 g/l.

Mediante el término "producido por la cepa" (en esta memoria y en contextos similares) se entiende que el compuesto se ha producido como resultado de la fermentación que usa la cepa y no se ha añadido artificialmente.

La cepa de acuerdo con la invención también se ha seleccionado por su inesperada capacidad para producir ácido málico.

De manera ventajosa, la cepa de la invención tiene la capacidad de producir un vino con una cantidad de ácido málico superior a aproximadamente 0,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 1 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 2 g/l. Esta molécula es especialmente ventajosa en los procesos de vinificación, especialmente en los procesos de uva blanca de calidad, ya que aporta al vino una mayor sensación de frescor. Un aspecto adicional y ventajoso viene dado por el hecho de que una alta cantidad de ácido málico permite tener vino con un pH más bajo, una característica que permite una mayor actividad del dióxido de azufre.

Aún de manera ventajosa, la cepa de la invención con su producción de ácido málico inesperadamente alta hace posible obtener una estabilidad microbiológica incrementada para el vino, con una acidez total incrementada.

Debido a sus cualidades tecnológicas, la cepa SERIUS es, por tanto, notablemente superior a las cepas comerciales actualmente disponibles.

De manera ventajosa, la cepa tiene buena capacidad de fermentación, con valores medios de pérdida de peso análogos a los observados en levaduras comerciales de la especie Saccharomyces cerevisiae y con tiempos de clausura de fermentación que varían en función del tipo de mosto usado y de la temperatura de fermentación, con duraciones, a temperatura óptima de fermentación, de entre 10 a 15 días.

Aún de manera ventajosa, la cepa de la invención tiene buena capacidad fermentativa, incluso a bajas temperaturas, particularmente a temperaturas entre 12°C y 15°C, lo que permite también así su uso para la fermentación de vinos a bajas temperaturas, y por lo tanto aumentando la posibilidad de activar reacciones bioquímicas específicas conocidas que dan lugar a la producción de compuestos aromáticos, adaptados para mejorar la calidad del vino.

Para la cepa de la invención, también se ha evaluado la capacidad de producir ácido acético en mostos naturales de fruto blanco y rojo, y los resultados obtenidos demuestran que la cepa SERIUS se caracteriza por la capacidad de mantener valores de acidez volátil muy bajos; en particular, los valores obtenidos son generalmente más bajos en comparación con los valores obtenidos de fermentaciones comparativas con cepas de S. cerevisiae comercialmente disponibles.

La cepa de la presente invención también se ha seleccionado en función de su denominada actividad asesina, es decir, la capacidad de producir toxinas que provocan la muerte de otras levaduras; de hecho, en el caso de que se usen mezclas de cepas, las cepas a usar deben ser necesariamente compatibles entre sí, es decir, incapaces de producir las toxinas asesinas que pueden inhibir a las otras cepas presentes en la mezcla. A partir del análisis realizado, se demostró de manera ventajosa que la cepa SERIUS no es capaz de inhibir a otras levaduras y, aún de manera más ventajosa, la cepa a su vez no ha sido inhibida por ninguna de las levaduras ensayadas.

La cepa se ha clasificado taxonómicamente a nivel de especie mediante secuenciación de la región ITS (Internal Transcribed Spacer) del operón ribosómico, y posteriormente comparada mediante alineación con la región homóloga disponible para las especies filogenéticamente más relacionadas del género Saccharomyces Meyen ex Rees (1870), de acuerdo con Vaughan-Martini & Martini; dicho análisis molecular ha permitido la identificación de la cepa SERIUS como Saccharomyces bayanus subsp. uvarum.

La cepa también se ha sometido a caracterización genotípica mediante análisis de los perfiles de restricción del ADN mitocondrial usando la enzima Hinf I, como lo describe Zilio y cois., e informado en detalle en el ejemplo 1, punto 1.6 y, además, mediante el uso de marcadores moleculares particulares, conocidos como microsatélites, de acuerdo con un método, también descrito en detalle en el ejemplo 1, punto 1.6.

Si se transfiere a un medio de cultivo adecuado en condiciones de nutrientes limitantes, la cepa de acuerdo con la invención es capaz de esporular. Las condiciones mejoradas para inducir la esporulación de la cepa SERIUS se obtienen en medio SP (acetato de potasio al 1%; extracto de levadura al 0,1%; glucosa al 0,05%; agar al 1,8%) incubada a 25°C durante 7-10 días.

Otros aspectos positivos encontrados para esta levadura se han observado durante el crecimiento en mosto sintético y natural (ejemplo 2).

La cepa de la invención tiene las características enológicas descritas a continuación: azúcares consumidos después de 2 días (vigor fermentativo): aproximadamente de 4-5 g/100 ml; azúcares consumidos después de 7 días: aproximadamente de 15-17 g/100 ml; 10-15 días: duración de la fermentación a temperatura óptima; baja producción de espuma.

Un aspecto positivo particularmente ventajoso observado con esta levadura se refiere a la producción de H2S, que está sustancialmente ausente.

Además, la cepa es resistente a una concentración de SO2 de al menos 50, preferiblemente 100, incluso más preferiblemente 200 y posteriormente preferiblemente 300 ppm. La cepa también tiene una alta resistencia al cobre, en particular es resistente a una concentración de cobre de 300 pmol/l. De manera ventajosa, también se ha demostrado que dicha concentración de cobre es superior a la resistencia al cobre de las cepas de levadura comercialmente disponibles, igual a aproximadamente 50-100 pmol/l.

Preferiblemente, la cepa se almacena de forma congelada (-80°C) en presencia de agentes crioprotectores apropiados (40% p/p de glicerol) o se conserva mediante liofilización/desecación. La congelación o liofilización/desecación se logra usando métodos conocidos por los expertos en la técnica.

La cepa de acuerdo con la invención se puede industrializar de manera ventajosa en forma de crema, forma desecada, forma liofilizada o en forma de una pasta, dependiendo de las necesidades del usuario.

La cepa de acuerdo con la invención está adaptada para ser usada como inóculo alimentario en la producción de alimentos, obtenidos mediante fermentación alcohólica. Los alimentos que se pueden producir con esta levadura incluyen, por ejemplo, el pan, los productos lácteos, la sidra, la cerveza, el espumoso y el vino. Sin embargo, también se conciben otras bebidas alcohólicas obtenidas a través de la fermentación alcohólica de otras frutas o cereales, como el trigo o el arroz. La cepa también está adaptada para usarse como un probiótico en suplementos dietéticos o en alimentos. Las pruebas preliminares de caracterización sugieren que esta cepa es resistente a la acidez y a las sales biliares, y por lo tanto tiene la posibilidad de sobrevivir al tránsito gástrico.

De manera ventajosa, la cepa S. bayanus subsp. uvarum SERIUS de la invención ha sido particularmente adecuada para la producción de un autolisado de levadura para ser usado como un activador de fermentación en la producción de vino y otras bebidas alcohólicas.

De acuerdo con una variante ejecutiva preferida de la invención, la cepa se usa como un inóculo en la vinificación con el fin de obtener vinos, por ejemplo, vinos tintos, vinos rosados o vinos blancos. Además, también se puede usar tanto en fermentación primaria como en refermentación.

De manera ventajosa, el uso de la cepa de la invención en un proceso de vinificación permite la elaboración de un vino con aromas agradables y equilibrados, con una concentración de H2S sustancialmente inexistente, alta concentración de glicerol y alta concentración de ácido málico.

De manera ventajosa, el vino es un vino elaborado a partir de uvas seleccionadas de uvas de fruto blanco y uvas de fruto rojo. Además, dichas uvas se pueden derivar tanto de variedades de vid autóctonas como de variedades de vid internacionales.

En particular, las pruebas de vinificación realizadas en uvas seleccionadas de garganega, kerner, trebbiano, merlot, nerello mascalese, nero d'avola y traminer han permitido obtener vinos de aroma agradable y sabor equilibrado.

De acuerdo con la realización preferida de la invención, la cepa SERIUS se usa para la producción de vino que contiene glicerol y ácido málico, producidos naturalmente por la cepa en las siguientes concentraciones: glicerol superior a aproximadamente 8,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 9,5 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 10 g/l; ácido málico superior a aproximadamente 0,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 1 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 2 g/l. La cepa SERIUS se puede cultivar fácilmente y, por lo tanto, es particularmente adecuada para ser usada para producir biomasa, incluso a una escala industrial, usando métodos estándar conocidos.

Preferiblemente, la producción de biomasa usando la cepa SERIUS sucede en un medio sintético que contiene dextrosa, extracto de levadura, vitaminas y sales minerales, con fermentación tipo continua (primeras 24 horas) seguida de fermentación tipo discontinua durante 20-24 horas más. Todavía preferiblemente, el crecimiento se produce a una temperatura de entre 29 y 31 °C. La cepa produce etanol y, por lo tanto, es particularmente aplicable en la fermentación de alimentos. La cepa no es patógena para seres humanos o animales.

Otro aspecto de la invención se refiere a un inóculo alimentario que consiste en la cepa de Saccharomyces bayanus identificada como SERIUS (DBVPG 36P).

Preferiblemente, el inóculo alimenticio es un iniciador de vino.

Un aspecto adicional, no cubierto por la invención reivindicada, es un vino que se puede obtener mediante el uso de acuerdo con la invención. De manera ventajosa, el vino es un vino obtenido a partir de la fermentación de uvas seleccionadas entre uvas de fruto blanco y uvas de fruto rojo. De manera ventajosa, dichas uvas pueden provenir tanto de variedades de vid autóctonas como de variedades de vid internacionales.

Los cultivos de levadura Saccharomyces bayanus subsp. uvarum SERIUS, que se pueden obtener mediante multiplicación de la cepa SERIUS de la presente invención, susceptibles de ser usados como inóculos alimentarios en la producción de alimentos obtenidos a través de fermentación alcohólica, también se deben entender como protegidos por la presente invención. De acuerdo con la variante ejecutiva preferida de la presente invención, dichas cepas están adaptadas para ser usadas en procesos de fermentación alcohólica para la producción de vino, es decir, en procesos de vinificación.

Particularmente preferidos son los cultivos que se pueden obtener a partir de la multiplicación de la cepa SERIUS de la invención, adaptados para ser usados para la producción de vino elaborado a partir de uvas seleccionadas de uvas de fruto blanco y uvas de fruto rojo, en donde dichas uvas pueden provenir tanto de variedades de vid autóctonas como de variedades de vid internacionales.

Preferiblemente, dichos cultivos están adaptados para ser usados para la producción de un vino que contiene glicerol y ácido málico, producidos naturalmente por las cepas en las siguientes concentraciones: glicerol superior a aproximadamente 8,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 9,5 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 10 g/l; ácido málico superior a aproximadamente 0,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 1 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 2 g/l.

Independientemente de su especie, se sabe que las levaduras se pueden reproducir sexualmente con el fin de asegurar la supervivencia de la especie, lo que crea diversidad genética, y la hibridación es parte esencial de este ciclo de reproducción sexual, que puede existir en la naturaleza tal cual es o ser inducida en el laboratorio. La hibridación antes mencionada permite la obtención de nuevos híbridos de levadura que se originan a partir de una cepa parental, de acuerdo con un proceso que está absolutamente libre de OGM. Por consiguiente, el establecimiento de cepas híbridas es un modo de evolución de las levaduras naturales.

Las cepas de levadura obtenidas por hibridación de la cepa SERIUS con una cepa de levadura perteneciente a la misma especie, o más bien una cepa de Saccharomyces, por medio de la denominada hibridación intraespecie, no están cubiertas por la invención reivindicada.

Sin embargo, no se excluye que se puedan obtener cepas mediante hibridación de la cepa SERIUS con cepas de levadura de otras especies, por medio de hibridación interespecies.

Otro aspecto no cubierto por la invención reivindicada se refiere a un método de selección de cepas de levadura a partir de flores, particularmente de cepas de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus y Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, adaptadas a la fermentación alcohólica, especialmente de uvas. Obviamente, el muestreo de flores también se puede transferir a otras matrices de aislamiento de cepas (por ejemplo, frutas, hierbas medicinales).

El método de selección consiste preferiblemente en una etapa para el aislamiento de levaduras a partir de flores, preferiblemente una etapa de identificación de levaduras, una fase de siembra para las levaduras aisladas en placas, con el fin de identificar cepas no productoras o poco productoras de H2S, y una fase de inoculación en el mosto y la vinificación de la uva con el propósito de estudiar sus características tecnológicas y de calidad.

Preferiblemente, las uvas usadas son uvas seleccionadas de uvas de fruto blanco o de uvas de fruto rojo.

Se analiza el vino obtenido durante la etapa de vinificación antes mencionada y se determinan las concentraciones de glicerol y ácido málico presentes en este. También se realiza una evaluación sensorial con el objetivo de identificar olores desagradables atribuibles a la presencia de compuestos sulfurados. Se presta especial atención a la identificación de defectos de reducción debido a la presencia de H2S. Posteriormente, se seleccionan cepas con mayor vigor fermentativo, que producen vinos donde las concentraciones de glicerol y ácido málico cumplen los siguientes límites: glicerol superior a aproximadamente 8,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 9,5 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 10 g/l; ácido málico superior a aproximadamente 0,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 1 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 2 g/l; además, el examen sensorial no debe dar una percepción olfativa de defectos de reducción debido a la presencia de H2S, es decir, preferiblemente menos de 1-1,5 |ug/l.

De manera ventajosa, el análisis de esta combinación específica de compuestos se ha mostrado muy adecuada para la sustitución de posteriores y laboriosos procesos de caracterización, y para el hallazgo de cepas que produzcan vinos de aroma agradable y equilibrado.

En una variante preferida no abarcada por la invención reivindicada, el método de selección de cepas de levadura de la especie Saccharomyces previamente especificado como adaptado a la fermentación alcohólica, en particular de uva, consiste en las siguientes etapas:

a) tomar muestras de flores, preferiblemente en primavera y en zonas de alta actividad vitivinícola, y aún más preferiblemente alejadas de las bodegas, con el fin de evitar la contaminación con levaduras comerciales usadas en las bodegas que pueden estar presentes no solo en las bodegas, sino también en las áreas colindantes;

b) fermentación de las muestras sobre sustratos adecuados y cultivo de las muestras fermentadas en medios de aislamiento, preferiblemente que contengan verde de bromocresol;

c) si el medio de aislamiento contiene verde de bromocresol, la identificación de las presuntas cepas de levadura del género Saccharomyces basada en la morfología y el color de la colonia, y su discriminación de levaduras no Saccharomyces de menor interés enológico;

d) identificación de aislados pertenecientes al género Saccharomyces mediante análisis genético de las colonias de levadura aisladas en la etapa b) o la etapa c); de manera ventajosa, realizado dicho análisis genético usando métodos moleculares, permite tanto la identificación de la especie de origen como la identificación de las diversas cepas, o más bien individuos, presentes dentro de una determinada especie;

e) fermentación en laboratorio de las cepas seleccionadas en la etapa d) sobre mosto sintético y/o mosto natural, y posterior selección de las cepas con las características tecnológicas y enológicas más interesantes, y, al mismo tiempo, siembra de las cepas en medio de agar Biggy con el fin de identificar aquellas que no son productoras o bajas productoras de H2S;

f) la vinificación en bodega de las cepas seleccionadas en la etapa e) y selección de las cepas más adecuadas en función de los resultados obtenidos a través del análisis químico del vino obtenido, que incluye preferiblemente el pH, los azúcares residuales, el alcohol, la acidez total, los parámetros volátiles de acidez, y, en particular, la cantidad de glicerol, ácido málico y preferiblemente sulfuro de hidrógeno, donde este último se evalúa por medios olfativos.

Preferiblemente la recolección de flores y su posterior procesamiento se realiza evitando tocar las flores con las manos y con una esterilización periódica del equipo de muestreo, para las etapas a) y b), con el objetivo de limitar cuanto más se pueda la contaminación.

A modo de ejemplo no limitante, a su llegada al laboratorio, las flores se transfieren a matraces estériles que contienen 200 ml de mosto sintético u otro medio de cultivo capaz de mantener el crecimiento de cualquier levadura presente. Se ha demostrado que es particularmente útil la adición de un antibiótico a cada muestra con el fin de evitar la proliferación de cualquier bacteria.

De manera ventajosa, las preparaciones se recubren con aceite de parafina estéril para evitar el crecimiento de moho en la superficie.

Las muestras con fermentación evidente en marcha se procesan para el aislamiento de las levaduras en la etapa posterior b) o c). Un medio de aislamiento muy adecuado y preferido para dicha etapa es el medio de aislamiento de agar WL (4,0 g/l de extracto de levadura, 5,0 g/l de triptona, 50 g/l de glucosa, 550 mg/l de fosfato de potasio monobásico, 425 mg/l de cloruro de potasio, 125 mg/l de cloruro de calcio, 125 mg/l de sulfato de magnesio, 2,5 mg/l de cloruro ferroso, 2,5 mg/l de sulfato de manganeso, 22 mg/l de verde de bromocresol, 20 g/l de agar, pH final 5,5 ± 2). La característica sobresaliente de este medio es que contiene un colorante, verde de bromocresol, que es capaz de ser absorbido por las levaduras en diferente grado. Por tanto, es posible caracterizar el microorganismo en función de la morfología de la colonia y del color que asume. Las cepas pertenecientes al género Saccharomyces absorben mal el verde de bromocresol y, por lo tanto, sus colonias asumen un color que varía de crema a verde, lo que permite su discriminación de cualquier levadura no Saccharomyces.

De manera ventajosa, el uso de verde de bromocresol y la ejecución de la etapa c) permiten una reducción simple, y en una etapa inicial del método, del número de cepas a someter a la etapa posterior d).

Aún de manera ventajosa, antes de la etapa d), las colonias a analizar se someten a purificación por medio de uno o más pases de resiembra en un medio adecuado. Preferiblemente, cualquier resiembra se produce en medio de crecimiento de agar WL. De manera ventajosa, el procedimiento se repite con el fin de garantizar que cada aislado provenga definitivamente de una única colonia.

La etapa c) ya es algo selectiva para el aislamiento de cepas pertenecientes al grupo Saccharomyces, pero además de Saccharomyces también existen otras cepas que, en este medio de cultivo, pueden presentar una morfología y coloración muy similar a las de las levaduras Saccharomyces. Por tanto, con el fin de eliminar estas cepas de las muestras y dar una identificación definitiva a los aislados, es preferible realizar la etapa d) que, mediante un método genético rápido y sencillo de ejecutar, hace posible realizar un cribado en un gran número de aislados, lo que elimina por tanto así las levaduras que no pertenecen al género Saccharomyces e identifica las cepas (= individuos) que deberían estar presentes en el marco de una especie determinada.

De manera ventajosa, dicha evaluación genética preliminar reduce el riesgo de realizar la caracterización tecnológica en levaduras potencialmente no adaptadas a la producción del vino e, igualmente de manera ventajosa, permite la exclusión de cualesquiera copias múltiples de la misma cepa que puedan estar presentes en una muestra determinada.

Aún de manera ventajosa, dicho análisis preliminar evita la necesidad de probar tecnológica y químicamente cepas que no pertenecen al género Saccharomyces.

Además, de manera ventajosa, dicho análisis permite realizar la caracterización tecnológica y enológica solamente en cepas verdaderamente diversas, y no en posibles copias múltiples de la misma cepa.

Con el fin de confirmar el origen del género Saccharomyces y, por tanto, excluir levaduras que pertenecen a diferentes géneros y, por tanto, poco interesantes desde el punto de vista enológico, es preferible usar la caracterización genética contemplando el uso de la técnica de PCR. Para ello se pueden usar tanto técnicas de PCR específicas, capaces de reconocer las diversas especies de levaduras, como técnicas de RAPD-PCR (análisis de ADN polimórfico amplificado aleatorio), conocidas por los expertos en el sector.

De manera ventajosa, en los casos en los que el uso de métodos de PCR no permite una identificación fiable de la cepa, es posible recurrir al análisis potencial de la secuencia del ADNr; este análisis hace posible distinguir entre S. cerevisiae, S. bayanus y S. bayanus subsp. uvarum, especies que filogenéticamente están estrechamente relacionadas y de alto interés enológico, con características metabólicas que les permitan sobrevivir y crecer en el vino. Preferiblemente, la secuenciación se refiere a la región ITS (Espaciador Transcrito Interno) del operón ribosómico.

De acuerdo con la realización preferida del método no abarcado por la invención reivindicada, la caracterización genética a nivel de cepa en la etapa d) se realiza mediante análisis del perfil de restricción del ADN mitocondrial, obtenido por digestión enzimática del ADN total. La digestión enzimática del ADN total se realiza preferiblemente usando la enzima Hinf I. El análisis genético de este tipo permite agrupar las levaduras en grupos, cada uno de los cuales tiene un perfil genético diferente, común a todos los aislados que pertenecen a ese grupo. En función de los datos genéticos recopilados, es posible realizar un cribado de las levaduras recogidas, lo que evita la selección de múltiples copias de la misma cepa.

De acuerdo con una variante ejecutiva del método no abarcado por la invención reivindicada, se usa la caracterización genética mediante análisis de polimorfismo de restricción del ADN mitocondrial en asociación con el análisis de microsatélites. Los microsatélites son secuencias repetitivas de ADN no codificante, que consisten en unidades de repetición muy cortas (1-5 pb) dispuestas como repeticiones en tándem que se pueden usar como marcadores moleculares de loci genéticos. De acuerdo con la realización preferida del método no abarcado por la invención reivindicada, el análisis de microsatélites para la especie Saccharomyces bayanus subsp. uvarum se realiza en los ocho loci más variables, descritos por Masneuf-Pomarede y cois. en 2016. Las condiciones de análisis se muestran posteriormente en detalle (ejemplo 1, punto 1.6). Generalmente, se realiza una reacción para cada locus denominados: SuYIL130W (16 formas alélicas), SuYHR102W (8 formas alélicas), SuYKR045C (10 formas alélicas), SuHTZ1PLB3 (7 formas alélicas), SuARS409 (5 formas alélicas), SuYHR042-043 (5 formas alélicas), SuYBR049C (5 formas alélicas), SuYGC170W (4 formas alélicas). Posteriormente, para la definición del perfil y la caracterización de las cepas, se realiza la amplificación de los productos de PCR relacionados con los ocho loci mencionados anteriormente, además de la migración a través de electroforesis en gel de agarosa, de acuerdo con métodos conocidos.

De manera ventajosa, de acuerdo con el método, posteriormente a la etapa d), para la caracterización de las levaduras S. bayanus subsp. uvarum, se realiza opcionalmente un análisis adicional de los ocho loci descritos anteriormente mediante PCR multiplex, preferiblemente dos reacciones de PCR multiplex, definidas como PCR1 multiplex y PCR2 multiplex. Mediante dicha PCR multiplex, es posible amplificar simultáneamente más de un locus a la vez. En particular, la PCR1 multiplex y la PCR2 multiplex permiten la amplificación de tres y cinco loci respectivamente. En detalle, la PCR1 multiplex permite el análisis del perfil de microsatélites de ADN para los loci SuYIL130W, SuYHR102W y SuYGC170W, mientras que la PCR2 multiplex hace posible obtener el perfil de microsatélites de ADN para los loci SuYKR045C, SuHTZ1 PLB3, SuARS409, SuYHR042-043 y SuYBR49C.

Para caracterizar aún más las levaduras S. bayanus subsp. uvarum, antes de la etapa e), es posible realizar un análisis genético adicional mediante electroforesis capilar basada en la amplificación de los cuatro loci caracterizados por un mayor número de formas alélicas, seleccionadas de acuerdo con los datos informados en la bibliografía.

De manera ventajosa, dicha caracterización hace posible definir el tamaño exacto de los productos de PCR para los loci considerados.

Los loci considerados son los siguientes: SuYIL130W, SuYHR102W, SuYKR045C y SuHTZ1 PLB3.

Preferiblemente, para la caracterización de la etapa e) a nivel tecnológico, se evalúan los siguientes parámetros: vigor fermentativo, entendido como la cantidad de azúcar consumida a los 2 y 7 días, y la duración de la fermentación, la capacidad de producción de espuma, tipo de crecimiento, producción de sulfuro de hidrógeno (en medio de agar Biggy), producción de glicerol, producción de acidez volátil, la capacidad de producir o degradar ácido málico, el perfil olfativo de los fermentados.

Con respecto a la progresión de las fermentaciones, estas se monitorizan sobre muestras de mosto sintético y/o mosto natural, preferiblemente sobre ambos tipos de mosto. Los principales parámetros monitorizados se refieren preferiblemente a: pH, azúcares residuales, nivel de alcohol, acidez total, acidez volátil, vigor fermentativo, producción de glicerol, producción/degradación de ácido málico, perfil olfativo. Las pruebas de vinificación en bodega para la etapa f) se realizan preferiblemente sobre mostos de uva de fruto blanco y mostos de uva de fruto rojo.

De manera ventajosa, el análisis de la progresión de la fermentación de las cepas en mostos tanto de fruto blanco como de fruto rojo hace posible comprobar la progresión y evaluar la actividad de una cepa para la elaboración de vinos blancos, rosados y tintos, de acuerdo con necesidades específicas.

Particularmente de manera ventajosa, la fase de vinificación del método se realiza en uvas tanto de variedades de vid autóctonas como variedades de vid internacionales. Preferiblemente, las concentraciones de glicerol, ácido málico y sulfuro de hidrógeno se determinan en el vino obtenido, y se seleccionan cepas productoras de vino cuando las concentraciones cumplen los siguientes límites: glicerol superior a aproximadamente 8,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 9,5 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 10 g/l; ácido málico superior a aproximadamente 0,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 1 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 2 g/l; y sulfuro de hidrógeno por debajo del nivel de percepción olfativa, es decir, menos de aproximadamente 1 -1,5 pg/l. De manera ventajosa, el vino elaborado con la cepa SERIUS se caracteriza por la presencia de altas cantidades de glicerol y ácido málico, mientras que la cantidad de sulfuro de hidrógeno es particularmente reducida. En particular, el vino elaborado por la cepa de la invención tiene glicerol en cantidades superiores a 9 g/l, ácido málico en cantidades superiores a 1,1 g/l y H2S en cantidades inferiores al nivel de percepción olfativo.

Los parámetros tecnológicos y químicos examinados pueden variar en función de las características requeridas para la cepa y también dependen del tipo de vino a producir con la cepa seleccionada. La selección de las cepas más adecuadas al final de las etapas individuales es preferiblemente una selección combinada que considera todos los resultados de todos los análisis realizados.

Este método de selección garantiza el cribado de múltiples aislados de levadura procedentes de flores.

Se han descrito ejemplos particulares de ejecución de las etapas individuales en los ejemplos 1, 2 y 3. Las etapas individuales se deben considerar independientes entre sí, es decir, la ejecución de la etapa d) de una manera definida no implica automáticamente, por ejemplo, la ejecución de la etapa e) precisamente como se informa en los ejemplos. Los parámetros dentro de una etapa (p. ej., los tipos de parámetros tecnológicos bajo prueba) se pueden modificar independientemente de las otras etapas.

Breve descripción de las figuras

- La Figura 1 muestra el árbol filogenético construido en función de secuencias ITS, en donde la cepa SERIUS de la presente invención está indicada como P16063.BI01;

- La figura 2 muestra el perfil de restricción del ADN mitocondrial para la cepa de la invención, obtenido usando la enzima Hinf I, indicado por el número 1), en donde el perfil indicado como M corresponde al marcador de peso molecular; - La figura 3 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa para cada producto de PCR obtenido por amplificación de ADN de la cepa SERIUS en los ocho loci más variables. El orden de carga que se muestra es el siguiente: (M) Marcador patrón O'Gene (Fermentas),

(1) Producto de PCR para el locus SuYIL130W,

(2) Producto de PCR para el locus SuYHR102W,

(3) Producto de PCR para el locus SuYKR045C,

(4) Producto de PCR para el locus SuHTZ1 PLB3,

(5) Producto de PCR para el locus SuARS409,

(6) Producto de PCR para el locus SuYHR042-043,

(7) Producto de PCR para el locus SuYBR049C,

(8) Producto de PCR para el locus SuYGCI70W,

(9) el perfil obtenido cargando los productos de amplificación obtenidos en las reacciones de PCR individuales para los loci SuYIL130W, SuYHR102W, SuYKR045C y SuHTZ1PLB3 en el mismo pocillo,

(10) el perfil obtenido cargando los productos de amplificación obtenidos en las reacciones de PCR individuales para los loci SuARS409, SuYHR042-043, SuYBR049C y SuYGCI70W en el mismo pocillo;

- La figura 4 muestra el resultado de la electroforesis para las 2 reacciones de PCR multiplex en gel de agarosa al 3%, en el orden de carga que corresponde a lo siguiente:

(M) Marcador patrón O'Gene (Fermentas),

(1) producto de PCR1 multiplex para los loci SuYIL130W, SuYHR102W y SuYGC170W,

(2) producto de PCR2 multiplex para los loci SuYKR045C, SuHTZ1 PLB3, SuARS409, SuYHR042-043 y SuYBR049C. Ejemplo 1 - Etapas de aislamiento y selección de la cepa de acuerdo con la invención

1.1 Toma de muestras

La toma de muestras se ha realizado mediante la recolección de flores durante la primavera, en una zona de la región del Véneto con una gran actividad vitivinícola.

La recolección se ha realizado evitando tocar las flores con la mano desnuda en todas las etapas, y esterilizando periódicamente las tijeras, con el objetivo de limitar al máximo la contaminación.

Se han cosechado flores en cantidades suficientes para llenar una bolsa estéril debidamente sellada. Tras su llegada al laboratorio, se han trasladado las flores a matraces estériles que contienen 200 ml de mosto sintético, previamente preparado en agua destilada, ajustado a pH 3,2 usando KOH y esterilizado por filtración, cuya composición se muestra en la tabla 1.

Tabla 1

Además, el mosto sintético se ha enriquecido con el antibiótico oxitetraciclina, a una concentración de 0,1 mg/ml, para evitar cualquier proliferación bacteriana. A continuación, las preparaciones se han recubierto con aceite de parafina estéril con el fin de evitar la formación de moho. Los matraces se han sellado con un tapón de silicona perforado, en los que se ha insertado una pipeta Pasteur, curvada en el extremo superior. Esto tiene el propósito de evitar la contaminación potencial con microorganismos presentes en el medio ambiente y permitir que el CO2 se descargue sin pérdida de vapor de agua. Los matraces se han colocado en una incubadora a una temperatura constante de entre 22°C y 25°C.

Se ha monitorizado el progreso de la fermentación midiendo la pérdida de peso de cada matraz (un indicador de la fermentación de los azúcares a CO2 y por tanto el progreso de la fermentación).

1.2 Aislamiento de las cepas a partir de las muestras.

Al finalizar la fermentación, se han extraído 10 ml de producto de cada matraz, se ha realizado una primera dilución seriada 1:10, de la cual se ha eliminado 1 ml y se han realizado 5 diluciones seriadas posteriores (1:10) en solución de Ringer; a continuación, se han sembrado 100 gl de las tres diluciones finales extendiéndolas en medio de agar WL (4,0 g/l de extracto de levadura, 5,0 g/l de triptona, 50 g/l de glucosa, 550 mg/l de fosfato de potasio monobásico, 425 mg/l de cloruro de potasio, 125 mg/l de cloruro de calcio, 125 mg/l de sulfato de magnesio, 2,5 mg/l de cloruro de hierro, 2,5 mg/l de sulfato de manganeso, 22 mg/l de verde de bromocresol, 20 g/l de agar) esterilizado adecuadamente en autoclave y ajustado a un pH final de 5,5 ± 2. A continuación, las placas se han incubado a 28°C durante 3 días en condiciones aeróbicas. En este medio, las colonias de levadura del género Saccharomyces aparecen con colores variables que van del crema al verde claro, con una superficie lisa-opaca y una consistencia cremosa. El recuento de levaduras ha revelado una concentración de Saccharomyces de aproximadamente 107 UFC/ml, con la presencia de colonias tanto blancas como verdes, de superficie lisa-opaca y consistencia cremosa.

1.3 Purificación y almacenamiento de los aislados

Las colonias picadas a partir de las placas de aislamiento se han vuelto a sembrar en medio de cultivo de agar WL, cuya composición se ha especificado en el punto 1.2 del ejemplo 1. El procedimiento se ha repetido al menos dos veces, para tener la certeza de que cada aislado procede de una única colonia. Los cultivos puros obtenidos tras el último pase en placas se han picado usando un asa estéril y luego se crioconservaron a -80°C después de la adición de glicerol al 40% (p/p). En placas, la cepa, posteriormente identificada como Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, aparece como en pequeñas colonias, con un color verde intenso, mientras que las cepas atribuibles a la especie Saccharomyces cerevisiae proceden de colonias más grandes, con una consistencia cremosa, de color blanco o con tendencia al verde claro.

1.4 Identificación de los aislados a nivel de especie y cepa

Se han identificado las presuntas colonias de las levaduras Saccharomyces a nivel de especie mediante RAPD-PCR usando el cebador M13, de acuerdo con el método descrito por Andrighetto y cois. en 2000. En el análisis y posterior procesamiento de los perfiles de amplificación de las levaduras aisladas a partir de flores, también se han incluido cepas tipo y de referencia de diversas especies de levaduras de interés enológico y no enológico. La comparación de los perfiles ha hecho posible el reconocimiento de levaduras atribuibles a las especies S. cerevisiae y S. bayanus.

Para poder discriminar a nivel de cepa, se han usado dos técnicas:

1) Análisis de perfiles de restricción de ADN mitocondrial;

2) Análisis de microsatélites;

que se describirán en detalle en los ejemplos ejecutivos del apartado 1.6.

No se excluye que la implementación de dichas técnicas genéticas se pueda realizar usando métodos conocidos en sí mismos por los expertos en el sector y que, por tanto, las indicaciones técnicas descritas en la presente memoria pueden variar de lo informado en los ejemplos antes mencionados.

1.5 Caracterización tecnológica de las cepas aisladas

Con el fin de evaluar las características de fermentación, cada una de las levaduras seleccionadas se ha sometido a pruebas de fermentación usando mosto natural o sintético según la composición descrita en la tabla 1.

El inóculo se ha preparado en mosto sintético o natural (dependiendo de si la prueba de evaluación del vigor fermentativo se realizó en mosto sintético o en mosto natural), partiendo de una picadura con hilo de siembra tomada de un cultivo inclinado o en placa, y luego se incubó a 25°C durante 24 horas. Posteriormente, esta se ha inoculado en torno al 10% en mosto sintético o natural con un volumen final de 200 ml, en matraces sellados con un tapón de silicona con perforación central, en los que se ha insertado una pipeta Pasteur doblada para permitir la ventilación del dióxido de carbono sin pérdida de vapor de agua.

Se ha monitorizado diariamente la pérdida de peso debida a la pérdida de CO2 de los matraces, preparados para la prueba de fermentación, hasta completar la fermentación, lo que corresponde a la fase en donde se ha mantenido constante la caída de peso durante varios días. Para cada aislado cultivado, se evaluó la capacidad de producir espuma durante la fermentación mediante evaluación visual. De nuevo, mediante evaluación visual, se ha evaluado el método de crecimiento de la cepa durante la fermentación (pulverulenta o floculante).

Finalmente, para la evaluación de la producción de sulfuro de hidrógeno, se ha sembrado cada aislado en medio de agar Biggy (Bismuto Glucosa Glicina Levadura Agar: 5 g/l de citrato de bismuto y amonio, 3 g/l de sulfito de sodio, 10 g/l de glucosa, 10 g/l glicina, 1 g/l de extracto de levadura, 16 g/l de agar, pH 6,8 ± 0,2) y se ha incubado a 25°C durante 5 días, después de lo que se evaluó el color de las colonias que crecieron en las placas. La cantidad de sulfuro de hidrógeno es directamente proporcional a la intensidad del color, debido a la formación de sulfito de bismuto (marrón oscuro si está presente en cantidades significativas). La caracterización tecnológica de los aislados a partir de flores ha permitido identificar ciertas cepas de levadura Saccharomyces, que incluyen la cepa Saccharomyces bayanus subsp. uvarum SERIUS, dotada de prometedoras características enológicas.

1.6 Caracterización genética a nivel de cepa

Con el fin de lograr la caracterización a nivel de cepa se han usado dos técnicas:

- Análisis de perfiles de restricción de ADN mitocondrial;

- Análisis de microsatélites.

El análisis de los perfiles de restricción se ha realizado siguiendo el método informado en Zilio y cois. en 1998, que usa la enzima de restricción Hinf I. La separación de los fragmentos de ADN lineal se ha obtenido mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. La comparación de los perfiles de restricción se ha realizado usando el software GelComparll (Applied Maths, Bélgica) que, mediante la construcción de una matriz, es capaz de calcular el nivel de similitud entre perfiles y expresar los resultados gráficamente como un dendrograma. El perfil de restricción del ADN mitocondrial para la cepa SERIUS de la invención, obtenido usando la enzima Hinf I se muestra en la figura 2.

El análisis de microsatélites contempla el uso de la técnica de PCR con cebadores que son complementarios a las regiones del ADN conocidas como microsatélites, que son pequeñas secuencias de a Dn repetido en tándem (de una a seis bases) que varían en el número de repeticiones, y también pueden estar localizadas dentro de regiones genómicas codificadoras (Legras, 2005). Son extremadamente variables en longitud, como un resultado de errores de replicación del ADN y, por lo tanto, muestran un cierto grado de polimorfismo entre individuos de la misma especie. El análisis de polimorfismo de microsatélites es un método altamente reproducible porque se usan cebadores específicos y altas temperaturas de hibridación para su amplificación. Para la caracterización de la cepa S. bayanus subsp. uvarum SERIUS, se han considerado los ocho loci más variables descritos por Masneuf-Pomarede y cois. en 2016, y se ha realizado una reacción para cada locus denominados: SuYIL130W (16 formas alélicas), SuYHR102W (8 formas alélicas), SuYKR045C (10 formas alélicas), SuHTZ1PLB3 (7 formas alélicas), SuARS409 (5 formas alélicas), SuYHR042-043 (5 formas alélicas), SuYBR049C (5 formas alélicas), SuYGC170W (4 formas alélicas).

La reacción se ha llevado a cabo en un volumen de 20 pl usando 1 U de ADN polimerasa en tampón 1 x, con la adición de cloruro de magnesio (MgCh) a una concentración de 1,5 mM, nucleótidos trifosfato (dNTP) a una concentración de 200 pM y de 1 pM para cada uno de los cebadores de cada reacción.

La amplificación se ha realizado en un Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf) con un programa térmico único para todas las reacciones de amplificación, con la excepción de la temperatura de hibridación (Ta). El protocolo térmico usado se muestra en la tabla 2 a continuación (el número de repeticiones para cada ciclo se indica entre paréntesis).

Tabla 2

La Ta usada se ha establecido a 55°C para las reacciones de PCR relativas a los loci SuYIL130W, SuYHR102W y SuYGC170W; mientras que la Ta antes mencionada se ha establecido a 50°C para las reacciones de PCR relativas a los loci SuYKR045C, SuHTZ1 PLB3, SuARS409, SuYHR042-043 y SuYBR049C.

La amplificación y migración en electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR relacionados con los ocho loci más variables en S. bayanus var. uvarum, han hecho posible que la cepa Saccharomyces bayanus subsp. uvarum SERIUS defina el perfil único y característico que se muestra en la figura 3.

Además de la reacción de PCR individual, los ocho loci mencionados anteriormente también se han analizado mediante dos reacciones multiplex, capaces de amplificar simultáneamente tres y cinco loci, respectivamente. En particular, se han usado dos reacciones de PCR multiplex: la PCR1 multiplex permite el análisis del perfil de microsatélites de ADN para los loci SuYIL130W, SuYHR102W y SuYGC170W, y la PCR2 multiplex permite la consecución del perfil de microsatélites de ADN para los loci SuYKR045C, SuHTZ1 Pl B3, SuARS409, SuYHR042-043 y SuYBR049C.

Las dos reacciones de PCR multiplex se han realizado en un volumen de 20 gl, usando 1,5 U y 1 U de ADN polimerasa respectivamente en tampón 1x con la adición de cloruro de magnesio (MgCL) a una concentración de 1,5 mM y nucleótidos trifosfato (dNTP) a una concentración de 200 gM. La concentración de los cebadores se ha optimizado de la siguiente manera.

En el caso de la PCR1 multiplex, los dos cebadores para el locus SuYIL130W se han añadido a una concentración de 0,25 gM, los dos cebadores para el locus SuYHR102W a una concentración de 0,75 gM, mientras que los dos cebadores para el locus SuYGC170W a una concentración de 1 gM .

En el caso de la PCR2 multiplex, los dos cebadores para los loci SuYKR045C, SuHTZ1 PLB3, SuARS409, SuYHR042-043 y SuYBR049C se han aplicado a una concentración de 0,5 gM.

La amplificación se ha realizado en un Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf) con un programa térmico único para todas las reacciones de amplificación, con la excepción de la temperatura de hibridación (Ta). El programa térmico usado se indica en la tabla 3 a continuación (el número de repeticiones para cada ciclo se indica entre paréntesis).

Tabla 3

En el caso de la PCR1 multiplex la Ta usada ha sido de 55°C, mientras que en el caso de la PCR 2 multiplex ha sido de 50°C.

Los perfiles obtenidos del análisis antes mencionado se muestran en la figura 4.

Además, la caracterización de la cepa de la invención también se ha realizado mediante electroforesis capilar basada en la amplificación de los cuatro loci que, de acuerdo con los datos de la bibliografía, se caracteriza por un mayor número de formas alélicas.

De manera ventajosa, dicha caracterización ha hecho posible definir el tamaño exacto de los productos de PCR para los 4 loci considerados.

Los loci considerados son los siguientes: SuYIL130W, SuYHR102W, SuYKR045C y SuHTZ1PLB3. La amplificación se ha realizado de acuerdo con el protocolo indicado anteriormente, con la única variante que consiste en la modificación del extremo 5' de los cebadores directos con una molécula fluorescente. En particular, SuYIL130W-FW y SuYKR045C-FW se han marcado con Hexaclorofluoresceína (HEX), mientras que SuHTZ1PLB3-FW y SuYHR102W-FW se han marcado con 6-carboxifluoresceína (FAM).

El análisis del perfil de capilaridad se ha realizado usando el filtro D, con referencia interna ROX. La interpretación se ha realizado usando el software Peak Scanner 2.0, con los siguientes parámetros: "tamaño estándar: GS500 (-250)" y "método de análisis: tamaño predeterminado - NPP". Los resultados obtenidos, es decir, los tamaños de los fragmentos, se muestran en la tabla 4 y se expresan en pares de bases (pb) con un error de /- 1 pb.

Tabla 4

No se excluye que la implementación de dichas técnicas genéticas se pueda realizar usando métodos en sí mismos conocidos por los expertos en el sector y que, por tanto, las indicaciones técnicas mencionadas anteriormente puedan diferir de lo informado.

Ejemplo 2 - Caracterización tecnológica de la levadura

2.1 Producción de sulfuro de hidrógeno

Se ha evaluado la producción de sulfuro de hidrógeno por la cepa SERIUS por medio de la incubación a 25°C durante 5 días en medio Agar Biggy (1 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de glicina, 10 g/l de dextrosa, 5 g/l citrato de bismuto y amonio, 3 g/l de sulfito de sodio, 16 g/l de agar). Al finalizar la incubación en este medio, las colonias aparecen con diferentes colores, en función de la cantidad de sulfuro de hidrógeno que producen. Las colonias que son color marrón oscuro indican una alta producción de sulfuro de hidrógeno, las colonias que son de color marrón-beige claro indican una producción moderada, mientras que las colonias blancas se caracterizan porque son incapaces de producirlo. Después de la incubación en medio de agar Biggy, las colonias de la cepa de la invención aparecen de color blanco, por lo que, en las condiciones probadas, la cepa es incapaz de producir H2S. Las pruebas también se han repetido mediante el análisis de la producción de sulfuro de hidrógeno en medio de agar acetato de plomo (15 g/l de peptona, 5 g/l de proteosa peptona, 1 g/l de dextrosa, 0,2 g/l de acetato de plomo, 0,08 g/l de tiosulfato de sodio, 15 g/l de agar) incubado a 25°C, y los resultados obtenidos han sido análogos a los obtenidos con medio de agar Biggy.

2.2 Vigor fermentativo

El vigor fermentativo de la cepa de la invención se ha evaluado tanto en mosto sintético, cuyas características se describen en el ejemplo 1, punto 1.1, como en diversos tipos de mosto natural de uvas de fruto blanco y de uvas de fruto rojo. El inóculo se ha preparado en mosto sintético o natural (dependiendo de si la prueba de evaluación del vigor fermentativo se realizó en mosto sintético o en mosto natural), comenzando a partir de una picadura de hilo de siembra tomada de un cultivo inclinado o en placa, y luego se incubó a 25°C durante 24 horas. Posteriormente, esta se ha inoculado en torno al 10% en mosto sintético o natural con un volumen final de 200 ml, en matraces sellados con un tapón de silicona de perforación central, en los que se ha insertado una pipeta Pasteur doblada para permitir la ventilación de dióxido de carbono sin pérdida de vapor de agua. De esta forma se ha podido seguir el avance de la fermentación mediante la monitorización de la pérdida de peso debida a la producción de CO2, un indicador de fermentación de los azúcares. La incubación se ha llevado a cabo a una temperatura constante de 25°C, y la evaluación de la pérdida de peso se ha realizado cada 1-2 días, hasta alcanzar un peso constante. Usando los datos recopilados, se han preparado curvas de crecimiento y se ha comparado el vigor fermentativo de la cepa Saccharomyces bayanus var. Uvarum SERIUS con el vigor fermentativo de cepas comerciales de Saccharomyces bayanus y cerevisiae. En las distintas pruebas de fermentación, la cepa de la invención ha mostrado una buena capacidad de fermentación, con valores medios de pérdida de peso a los 2 y 7 días que son análogos a los observados con las levaduras comerciales de la especie Saccharomyces cerevisiae, y con tiempos de finalización de la fermentación que varían dependiendo del tipo de mosto usado (de 10 a 15 días).

También se ha evaluado el vigor fermentativo de la cepa en mosto natural obtenido de uvas Trebbiano, mediante incubación a temperaturas de 12, 15 y 24°C. El análisis revela que la cepa tiene una buena capacidad fermentativa, incluso a temperaturas de 12°C y 15°C.

De manera ventajosa, esta última característica de la cepa de la invención permite su uso en fermentaciones de vino a bajas temperaturas, lo que aumenta así la posibilidad de activar reacciones bioquímicas específicas que dan lugar a la producción de compuestos aromáticos que influyen positivamente en las cualidades organolépticas del vino elaborado.

2.3 Producción de glicerol

La producción de glicerol se ha evaluado mediante HPLC (detector Jasco RI 930, columna RezexTM ROA-Organic Acid H 8% (300 X 7,8 mm) en mostos naturales de uvas de fruto blanco y de uvas de fruto rojo inoculados con la cepa SERIUS, con incubación a 25°C hasta completar la fermentación.

Además, se han realizado pruebas comparativas donde se ha inoculado una cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae. Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 5, donde la cantidad de glicerol producida se expresa en g/l. Se puede observar que la cepa de la invención muestra una producción de glicerol significativa, mayor en promedio que la cantidad de glicerol producida en el mismo mosto por la levadura comercial usada como comparación.

Tabla 5

2.4 Producción de ácido málico

Se ha ensayado la capacidad de la cepa de la invención para producir ácido málico en mosto natural de fruto blanco y de fruto rojo, tras la incubación a 25 °C hasta que se completa la fermentación. En particular, se ha evaluado la cantidad de ácido málico presente en los distintos mostos antes y después de la fermentación con el uso de la cepa antes mencionada mediante un detector HPLC Jasco UV 975, columna ResexTM ROA-Organic Acid H 8% (300 X 7,8 mm). De manera análoga al ejemplo 2.3, se han llevado a cabo pruebas comparativas con un inóculo de la cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae usada anteriormente. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 6 donde la cantidad de ácido málico se expresa en g/l. Se puede observar que la cepa SERIUS es capaz de producir ácido málico, aunque con diferente eficacia, en 5 de los 6 mostos ensayados, a diferencia de la cepa comercial, que se caracteriza por la capacidad de degradar parcialmente el ácido málico.

Tabla 6

2.5 Producción de acidez volátil

Se ha evaluado la capacidad de producir ácido acético mediante el detector HPLC Jasco RI 930, columna RezexTM ROA-Organic Acid H 8% (300 X 7,8 mm) en mosto natural de fruto blanco y de fruto rojo inoculado con la cepa SERIUS, incubado a 25°C hasta completar la fermentación. También se han establecido ensayos comparativos inoculados con una cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 7, donde se muestran los valores de producción de ácido acético, expresados en g/l, lo que demuestra que la cepa de la invención se caracteriza por la capacidad de producir poca acidez volátil.

Tabla 7

2.6 Actividad asesina

Se ha estudiado la presencia de actividad asesina en la levadura SERIUS usando medio de agar YEPD, preparado mediante la inoculación previa e incubación durante la noche de un cultivo de una cepa indicadora sensible. De forma operativa, después de haber dejado secar dichas placas que incluyen la cepa indicadora, se ha depositado sobre ellas 10 pl de un cultivo fresco de la cepa SERIUS y se han dejado incubar las mismas placas durante 48 horas a 25°C. Posteriormente, al finalizar el período de incubación, se ha detectado la actividad asesina por la aparición de "halos de inhibición" (se entiende que un halo de inhibición es un área sin crecimiento) alrededor de la colonia de la cepa bajo prueba.

Con respecto a la cepa SERIUS, se ha ensayado la actividad asesina en relación con 10 cepas enológicas de levadura pertenecientes a la especie S. cerevisiae y S. bayanus respectivamente.

El análisis ha demostrado que ninguna de las levaduras ensayadas se ha inhibido por la cepa de la invención. Además, ninguna de las 10 levaduras probadas ha demostrado la capacidad de inhibir la cepa SERIUS.

2.7 Resistencia al cobre y resistencia al dióxido de azufre

Se ha ensayado la resistencia al cobre mediante crecimiento en medio sintético YNB (Yeast Nitrogen Base), caracterizado por la ausencia de aminoácidos y la presencia de 6,7 g/l de sulfato, 20 g/l de glucosa y 20 g/l de agar, enriquecido con diversas concentraciones de CuSÜ4 (50, 100, 200, 300 pmol/l respectivamente). Con respecto a la resistencia al dióxido de azufre, esta se ha evaluado por medio del crecimiento en mosto agarizado enriquecido con metabisulfito de potasio en concentraciones tales que den una concentración final de SO2 que corresponde esencialmente a 50, 100, 200 y 300 ppm. Ambos análisis descritos anteriormente se han realizado mediante la incubación de la cepa SERIUS en medios previamente preparados durante 48 horas a 26°C, y se ha evaluado un crecimiento visible en placas.

Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 8, expresados como MTC (Concentración Máxima Tolerada, de cobre o dióxido de azufre respectivamente). Como se puede observar en la siguiente tabla, la cepa SERIUS demuestra la capacidad de crecer en presencia de 300 ppm de SO2 y de 300 pmol/l de cobre.

A modo de comparación, las pruebas antes mencionadas también se han llevado a cabo en 5 cepas comercialmente disponibles de S. cerevisiae para uso enológico.

Tabla 8

2.8 Tolerancia al etanol

La tolerancia al etanol se ha ensayado usando mosto agarizado que incluye concentraciones variables de etanol, que corresponden al 12, 14, 16 y 18% respectivamente. La cepa SERIUS se ha incubado en dicho medio durante 48 horas a 26°C, al finalizar el cual, se ha evaluado el crecimiento visible en placas.

El análisis muestra que la cepa SERIUS tiene un valor de MTC para etanol igual a 16% vol/vol.

2.9 Uso de fuentes de carbono

Se ha evaluado la capacidad de la cepa SERIUS para asimilar/fermentar varios compuestos como fuente de carbono a través del crecimiento de la cepa antes mencionada en medios que contienen extracto de levadura (10 g/l), peptona (20 g/l) y azúcar/ácido orgánico a una concentración de 20 g/l.

El análisis ha demostrado que la cepa SERIUS es capaz de usar compuestos orgánicos como galactosa, rafinosa, maltosa y ácido glucónico.

2.10 Producción de compuestos volátiles y perfil aromático

Se ha evaluado la producción de acetaldehído, acetato de metilo, acetato de etilo y alcoholes superiores al finalizar la fermentación en muestras de mosto Trebbiano inoculadas y fermentadas con la cepa SERIUS, y en muestras del mismo mosto inoculadas y fermentadas con un levadura comercial de Saccharomyces cerevisiae. La determinación de los compuestos volátiles se ha llevado a cabo mediante cromatografía de gases, inyectando muestras de vino adecuadamente destilado directamente en una columna polar ZB-WAX Plus (fase estacionaria de polietilenglicol, FID - Detector de Ionización de Llama).

Los resultados obtenidos, expresados en mg/l, se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9

La cepa SERIUS produce cantidades ligeramente superiores de acetaldehído con respecto a las producidas por la levadura comercial usada para la comparación, concentraciones sin embargo que no comprometen la calidad de los vinos. De hecho, se sabe que una baja concentración de dicho compuesto en el vino da un agradable aroma afrutado, mientras que a concentraciones crecientes, el vino tiende a desprender un olor acre e irritante, de modo que se vuelve imposible de comercializar cuando la concentración de acetaldehído supera los 500 mg/l.

Con respecto a los alcoholes superiores, la cepa SERIUS produce N-propanol en mayores cantidades en comparación con la cepa de referencia comercial, mientras que produce cantidades similares de isobutanol; sin embargo, estos alcoholes no juegan un papel olfativo significativo en el vino.

Por otro lado, en comparación con la cepa comercial de S. cerevisiae, la cepa SERIUS produce una menor cantidad de alcohol isoamílico; este último alcohol superior juega un papel importante ya que da como resultado el llamado olor "amílico", que se considera muy negativo desde un punto de vista olfativo.

El perfil aromático de la cepa SERIUS se ha evaluado por medio de la técnica de extracción en fase sólida (SPE) usada en el mosto de uva Trebbiano, obtenido tras la incubación con la cepa mencionada a 25°C durante un tiempo suficiente para alcanzar la finalización de la fermentación. Además, de manera análoga, se han ensayado las dos cepas de S. cerevisiae comerciales a modo de comparación.

De forma operativa, se han diluido 10 ml de cada cepa muestreada (SERIUS y las dos cepas comerciales) con 30 ml de agua y se han pinchado con el estándar interno (1-heptanol) y se han absorbido sobre la columna SPE C18. La elución se ha realizado con diclorometano y el eluido, reducido a un pequeño volumen, se inyectó en el sistema GC/MS Shimadzu GC2010/QP2010. La identificación de los compuestos resultantes se ha realizado mediante la búsqueda de las últimas versiones de las bibliotecas Whiley y NBS disponibles en el momento de la preparación de la presente solicitud.

A partir del presente análisis, se demuestra que la cepa de la invención permite obtener un vino con concentraciones de ácidos grasos (ácido isovalérico, ácido hexanoico, ácido octanoico, ácido butanoico, ácido decanoico) que son en promedio 2-3 veces menores que las detectadas en los vinos obtenidos con las dos cepas comerciales. Se sabe que determinados ácidos grasos de cadena media y larga (C6, C8, C10, C12) pueden tener efectos inhibidores respecto a la actividad fermentativa de las levaduras. En particular, incluso a bajas concentraciones (unos pocos miligramos/litro), el ácido decanoico (C10) muestra una actividad antagonista significativa con respecto a los procesos de fermentación.

Una característica adicional que diferencia a la cepa SERIUS de las dos cepas comerciales usadas a modo de comparación es la producción significativamente mayor (30 veces mayor en promedio) de ésteres fenil etílicos de ácido octanoico, compuestos volátiles que dan el aroma típico del cacao verde. Finalmente, el vino obtenido con la levadura SERIUS presenta concentraciones reducidas de pirazina y piperazina, moléculas responsables de los aromas de hierbas y plantas.

Ejemplo 3- Caracterización enológica de la levadura, ensayos de vinificación.

La cepa de la invención se ha ensayado a través de ensayos de vinificación en bodega sobre mostos de uvas de fruto rojo y de uvas de fruto blanco.

El proceso de producción usado ha sido del tipo de alimentación discontinua, seguido de la concentración del cultivo por medio de centrifugación. Luego, se ha preparado una biomasa de levadura en forma de crema con un contenido de sustancia seca esencialmente igual al 22% y una concentración de levadura de aproximadamente 10 mil millones de UFC/g.

Para la posterior inoculación del mosto, la biomasa se ha resuspendido en una suspensión vinosa que consiste en levadura, mosto y activadores.

En particular, para su uso en un tanque de 5.000 litros, se ha suspendido 1 kg de biomasa en crema de la levadura SERIUS a una temperatura de 25°C en 200 litros de mosto, enriquecido con activadores a las concentraciones de trabajo recomendadas por el fabricante y conocidas comercialmente. La suspensión se ha mantenido en movimiento usando un agitador o una bomba de trasiego durante 2/4 horas. Posteriormente, dicha suspensión se ha añadido al mosto mediante trasiego.

3.1 Ensayo que usa mosto de uva Traminer con acidificación del mosto

La levadura de la invención se ha ensayado con mosto de uva Traminer (fruto blanco) en una bodega en un tanque de 50 hl.

La levadura, preparada en forma de crema fresca, se ha usado a una dosis de 20 g/hl. A la adición al mosto de 100 g/hl de autolisado de levadura y 140 g/hl de ácido tartárico ha seguido la inoculación con la cepa SERIUS, preparada previamente de acuerdo con el método descrito en la sección general. La fermentación se ha llevado a cabo a 13°C durante un período de 19 días.

La Tabla 10 presenta los datos analíticos con respecto al mosto antes de la inoculación de la levadura y el vino al finalizar la fermentación. Se puede observar cómo la cepa produce de manera ventajosa altas cantidades de ácido málico y glicerol y, al mismo tiempo, muestra una baja producción de acidez volátil.

Con respecto al perfil aromático, al finalizar la fermentación se nota una mayor complejidad floral, sinérgica con el perfil terpénico, en comparación con la levadura comercial.

Tabla 10

3.2 Ensayo que usa mosto de uva T raminer sin acidificación del mosto

La levadura SERIUS se ha probado con mosto de uva Traminer (fruto blanco) en una bodega en un tanque de 100 hl. La levadura se ha preparado en forma fresca (crema) y se ha usado a una dosis de 20 g/hl. La preparación del inóculo se ha llevado a cabo como se describió anteriormente. Antes de la inoculación se han añadido al mosto 90 g/hl de autolisado de levadura. El mosto no se ha acidificado con ácido tartárico. La fermentación se ha realizado a 17°C durante un período de 7 días.

La Tabla 11 muestra los datos analíticos con respecto al mosto antes de la inoculación de la levadura y el vino al finalizar la fermentación.

Los resultados obtenidos destacan la capacidad de la cepa SERIUS para producir altas cantidades de glicerol y baja acidez volátil. Con respecto al ejemplo anterior en el mosto Traminer, en donde se ha observado producción de ácido málico, en este caso no se observa producción de ácido málico. Cabe señalar que el mosto del ejemplo 3.1 se había acidificado con ácido tartárico, mientras que el mosto de este ejemplo no se había sometido a un suplementación con ácido tartárico. Por tanto, la producción de ácido málico por la cepa SERIUS parece estar correlacionada con la acidificación del mosto con ácido tartárico.

El análisis olfativo confirma los resultados destacados en el ejemplo descrito en el punto 3.1.

Tabla 11

3.3 Ensayo que usa mosto de uva Garganega con acidificación del mosto

La cepa SERIUS se ha probado con mosto de uva Garganega (fruto blanco) en una bodega en un tanque de 150 hl. La levadura se ha preparado en forma fresca (crema) y se ha usado a una dosis de 20 g/hl. La preparación del inóculo se ha llevado a cabo como se describe anteriormente. Antes de la inoculación se han añadido al mosto 120 g/hl de autolisado de levadura y 120 g/hl de ácido tartárico. La fermentación se ha realizado a 16°C durante 15 días.

Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 12. Se destaca la capacidad de la cepa SERIUS para producir ácido málico, altas cantidades de glicerol y baja acidez volátil.

Con respecto al perfil aromático, se informan marcadas notas florales con un toque de glicina.

Tabla 12

3.4 Ensayo que usa mosto de uva Garganega sin acidificación del mosto

La cepa SERIUS se ha probado con mosto de uva Garganega (fruto blanco) en una bodega en un tanque de 100 hl. La levadura se ha preparado en forma fresca (crema) y se ha usado a una dosis de 20 g/hl. La preparación del inóculo se ha llevado a cabo como se describe anteriormente. Antes de la inoculación se han añadido al mosto 120 g/hl de autolisado de levadura. El mosto se ha acidificado con ácido tartárico. La fermentación se ha realizado a 16°C durante un período de 12 días.

La Tabla 13 muestra los resultados obtenidos con el mosto antes de la inoculación y del vino al finalizar la fermentación.

Se puede observar cómo la cepa tiene la capacidad de producir grandes cantidades de glicerol con baja producción de acidez volátil. Nuevamente, en este caso, en ausencia de acidificación del mosto con ácido tartárico, no se informa producción de ácido málico.

El perfil aromático confirma lo observado en el ejemplo 3.3, es decir, la presencia de notas florales marcadas con un toque de glicina.

Tabla 13

3.5 Ensayos en mosto de uvas Syrah, Petit Verdot, Cabernet con acidificación del mosto

La cepa SERIUS se ha probado con mosto de uva Syrah, Petit Verdot, Cabernet (fruto rojo) en una bodega en un tanque de 100 hl. La levadura se ha preparado en forma fresca (crema) y se ha usado a una dosis de 20 g/hl. La preparación del inóculo se ha llevado a cabo como se describe anteriormente. Antes de la inoculación se han añadido al mosto 150 g/hl de autolisado de levadura y 100 g/hl de ácido tartárico. La fermentación se ha realizado a 20°C durante un período de 10 días.

La Tabla 14 muestra los resultados obtenidos con el mosto antes de la inoculación y del vino al finalizar la fermentación. De nuevo, en este caso, se observa la capacidad de la cepa SERIUS para producir ácido málico y altas cantidades de glicerol.

Con respecto al perfil aromático, el vino elaborado con la cepa SERIUS tiene notas distintivas de arándano, frambuesa y fresa silvestre.

Tabla 14

Ejemplo 4 - Híbridos obtenidos a partir de la levadura S. bayanus subsp. uvarum SERIUS

La cepa S. bayanus subsp. uvarum SERIUS se puede usar como la cepa parental con el fin de obtener híbridos de levadura con características enológicas adicionales y mejoradas. Se ha elegido la técnica de hibridación directa y se ha seguido un protocolo estándar de conjugación espora-espora con ligeras modificaciones para obtener híbridos (Solieri y cois., 2008). Inicialmente, se realizó un estudio de esporulación en las cepas seleccionadas para la hibridación. Se han probado varios medios de cultivo para este propósito. El estudio de viabilidad de esporas y de eficiencia de esporulación ha permitido la selección del medio SP (acetato de potasio al 1%; extracto de levadura al 0,1%; glucosa al 0,05%; agar al 1,8%). El crecimiento de la cepa en SP a 25°C durante 7-10 días se ha continuado con una digestión parcial de la pared celular para permitir la posterior separación de las esporas a partir de las ascas usando una aguja micromanipuladora. Las ascas, con la pared celular semidigerida, se colocaron en un lado de una placa YPD (glucosa al 2%; peptona al 2%; extracto de levadura al 1%; agar al 2%) y luego se sometieron a micromanipulación. Las esporas de las dos cepas parentales se colocaron al azar una al lado de la otra. La observación continua ha permitido identificar una conjugación exitosa. Después de la incubación a 25°C durante 2-3 días, las colonias seleccionadas se volvieron a sembrar en medio YPD. La siguiente etapa fue la estabilización de las cepas (también realizada en medio WL). Posteriormente, se han confirmado los híbridos por medio de análisis molecular y después se han sometido a pruebas de fermentación en mosto junto con análisis fenotípico con el fin de verificar sus características fisiológicas y potencial enológico.

Ejemplo 5 - Producción de autolisados de levadura comenzando a partir de la cepa S. bayanus subsp. uvarum SERIUS

La cepa S. bayanus subsp. uvarum SERIUS se puede usar para producir un autolisado de levadura que se usará como un activador de la fermentación en la producción de vino y otras bebidas alcohólicas. Con este fin, la crema de levadura, preparada como se describió anteriormente, se somete a un tratamiento térmico apropiado (40-60°C durante 12-48 horas). El autolisado obtenido se puede usar tal cual o procesado adicionalmente por medio de una filtración/centrifugación/decantación apropiada con el objetivo de separar las fases sólida o líquida para posteriores aplicaciones adecuadas.

Por tanto, en función de lo anterior, la presente invención ha logrado todos los objetivos preestablecidos.

En particular, se alcanza el objetivo de proporcionar una cepa de levadura de la especie Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, dotada de las características tecnológicas y enológicas que permiten una buena fermentación del mosto, permitiendo la elaboración de un vino agradable.

Otro objetivo alcanzado es el de proporcionar una cepa que permita obtener un vino caracterizado por altas cantidades de ácido málico y glicerol, y al mismo tiempo que no produce sulfuro de hidrógeno durante la fermentación alcohólica.

Otro objetivo alcanzado por la presente invención se refiere a la posibilidad de usar la cepa SERIUS como cepa parental para obtener levaduras híbridas con un potencial enológico novedoso.

Otro objetivo alcanzado se refiere a la posibilidad de usar la cepa objeto de la invención para obtener un autolisado de levadura para su uso como un activador de la fermentación.

Bibliografía

1. Andrighetto C., Psomas E., Tzanetakis N., Suzzi G., Lombardi A. (2000): Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) PCR for the identification of yeasts isolated from dairy products. Letters in Applied Microbiology, 30: 5-9; 2. Cai J., Roberts I.N. y Collins M.D. (1996): Phylogenetic relationships among members of the ascomycetous yeast genera Brettanomyces, Debaryomices, Dekkera, and Kluyveromyces deduced by small-subunit rRNA gene sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 542-549;

3. Castellari L., Ferruzzi M., Magrini A., Giudici P., Passarelli P., Zambonelli C. (1994): Unbalanced wine fermentation by cryotolerant vs. non-cryotolerant Saccharomyces strains. Vitis, 33, 49-52;

4. Delfini C. (1995): Scienza e tecnica di microbiologia enologica. Edizioni II Lievito, Asti;

5. Esteve-Zarzoso B, et al. (1999): Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. Int J Syst Bacteriol 49 Pt 1: 329-37;

6. Fleet G.H (2008): Wine yeasts for the future. FEMS Yeast Res 8; 979-995;

7. James S.A., Collins M.D. y Roberts I.N. (1996): Use of an rRNA internal transcribed spacer region to distinguish phylogenetically closely related species of the genera Zygosaccharomyces and Torulaspora. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 189-194;

8. Legras J. L., Ruh O., Merdinoglu D., Karst F. (2005): "Selection of hypervariable micro satellite loci for the characterization of Saccharomyces cerevisiae strains", International Journal of Food Microbiology 102: 73-83;

9. Masneuf-Pomarede I., Salin F., Borlin M., Coton E., Coton M., Jeune C.L., Legras J.L. (2016): Microsatellite analysis of Saccharomyces uvarum diversity. FEMS Yeast Res. 16 (2): fow002;

10. Suzzi G, Tofalo R. (2014): Microbiologia Enologica Edagricole;

11. Pretorius IS (2000): Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the ancient art of winemaking. Yeast 16: 675 ± 729;

12. Ribéreau-Gayon P., Dubordieu D., Doneche B., Lonvaud A. (2000): Handbook of Enology Volume 1 The Microbiology of Wine and Vinification, John Wiley & Sons Ltd;

13. Solieri L, Antúnez O, Pérez-Ortín JE, Barrio E, Giudici P. (2008): Mitochondrial inheritance and fermentative oxidative balance in hybrids between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum. Yeast. 25 (7): 485-500; 14. Vaughan-Martini A. & Martini A. (2011): Capítulo 61 - Saccharomyces Meyen ex Reess (1870). En: The Yeasts (Quinta edición). Londres: Elsevier;

15. Vincenzini M., Romano P. y Farris G.A. (2005): Microbiologia del vino. Edizioni Ambrosiana;

16. White T.J., Bruns T., Lee S. y Taylor J. (1990): PCR protocols. A guide to methods and applications. En Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, págs. 315-322. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. (Eds) Academic Press, San Diego;

17. Zambonelli C, Soli MG & Guerra D (1984): A study of H2S nonproducing strains of wine yeasts. Ann Microbiol 34: 7-15;

18. Zambonelli C., Tini V. y Castellari L. (2000). Guida all'uso dei lieviti selezionati in enologia (a cura del Centro Ricerche Produzioni Vegetali) Ed. agricole;

19. Zambonelli C. (2003): Microbiologia e Biotecnologia dei Vini. Edizioni Agricole;

20. Zilio F., Lombardi A., Galeotto A., Comi G. (1998): Profili di restrizione del DNA mitocondriale di ceppi di Saccharomyces isolati nella zona di produzione del vino Soave DOC. Riv. Vitic. Enolog. 3: 33-41.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS y depositada en el DBVPG con número de depósito 36P.

2. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque está en forma de crema, en forma desecada, liofilizada o en forma de pasta.

3. El uso de la cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS (DBVPG 36P) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, como inóculo alimentario en la elaboración de alimentos obtenidos por fermentación alcohólica.

4. El uso de la cepa de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el alimento es un vino y la fermentación alcohólica es un proceso de vinificación.

5. El uso de la cepa de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el vino es un vino elaborado a partir de uvas seleccionadas de uvas de fruto blanco o de uvas de fruto rojo.

6. El uso de la cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado porque el vino contiene glicerol y ácido málico producido naturalmente por la cepa en las siguientes concentraciones: glicerol superior a aproximadamente 8,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 9,5 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 10 g/l; ácido málico superior a aproximadamente 0,5 g/l, preferiblemente superior a aproximadamente 1 g/l, más preferiblemente superior a aproximadamente 2 g/l.

7. El uso de la cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS (DBVPG 36P) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, como probiótico en suplementos dietéticos y alimentos.

8. Inóculo alimentario que comprende la cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS y depositada en el DBVPG con número de depósito 36P.

9. Inóculo alimentario de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque dicho inóculo alimentario es un iniciador del vino.

10. Cultivo de levadura Saccharomyces bayanus subsp. uvarum SERIUS que se puede obtener mediante multiplicación de la cepa de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque es adecuado para ser usado para un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, seleccionándose dicho cultivo a partir de un cultivo en forma líquida fresca, en forma de crema o pasta o un cultivo en forma seca, desecada o liofilizada.

11. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque está en forma de un autolisado.