CN109010382A - 一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，涉及中药发酵类禽药，依次进行以下步骤：A种子液制备：制备种子培养基，进行灭菌后备用；挑取蛹虫草菌菌种进行接种，摇床培养后得到蛹虫草菌种子液；B发酵罐放大：取A步骤中的蛹虫草菌种子液接种到发酵培养基中，调节pH值，灭菌；当发酵培养基降温至23℃时，所述蛹虫草菌种子液按照发酵液体积百分比为5‑12%的量在无菌条件下接种，培养72‑96h；最终得到发酵蛹虫草菌混合液体；C离心固液分离：离心后得到上清和沉淀，备用；D取离心后的上清液灭菌、检查和罐装。本发明的有益效果是：将生物工程发酵技术结合中药特定培养基筛选技术，能够大幅度提高蛹虫草菌发酵的活性物质虫草素的含量。其中虫草素含量≥200μg/ml。

Description

一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，进一步是中药发酵类禽药，特别涉及一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法。
背景技术
北冬虫夏草(Cordycepsmilitaris)，又名北蛹虫草和蛹虫草，是一种药用真菌，为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、蛹虫草属的模式种。蛹虫夏草是我国特产的名贵中药材，与人参、鹿茸并列为三大名贵中药材，有着极高的美誉度。今年来，随着人们对蛹虫草多种药用价值的重新认识，关于蛹虫草的研究十分火热，并在药理学、活性成分及人工培育等各方面取得了十分明显的进展。实验证明蛹虫草比冬虫夏草有更大的优势。首先，蛹虫草属于蛹虫草属的典型菌种，分布广泛，被世界各国研究员所认识和接受；其次，是蛹虫草已在可以在人工条件下培养出来，形成完整的子实体结构；三是蛹虫草含有丰富的虫草素（Cordycepin，3′-脱氧腺苷），其独特药理作用已日益引起药学界的高度重视。近年来，北蛹虫草的液体发酵技术取得了很大进展，但虫草素的产量仍较低，如何进一步提高蛹虫草中虫草素的产量，并且降低生产成本、提高经济效益，已成为加快蛹冬虫夏草产品产业化进程亟待解决的问题。
近年来，随着中医药振兴发展计划的展开，我国进行了大量的蛹虫草菌发酵研究，但主要集中在停留在蛹虫草菌丝体固体培养方面。由于液体发酵蛹虫草菌方面极易染菌，发酵周期长，发酵参数控制难，生产成本高等特点，导致工业化生产虫草素难度。例如，2004年，钟建江等人利用两步溶氧控制液体深层发酵C.militaris制备蛹虫草菌素，积累浓度达到201μg/ml。但是这种方法生产工艺复杂，对生产条件要求高，不利于推广；公开号为CN107586811A的中国专利公开了提高虫草素含量的蛹虫草—杜仲液体发酵方法及应用，这种方法制备得到虫草素含量只有21.4μg/ml，2016年万琴等人对蛹虫草液体培养进行了优化研究，最优化的虫草素含量达到164.2μg/ml，这两种方法分别从中药培养基混合发酵与普通工艺发酵优化两个维度对蛹虫草菌发酵进行了深入研究，但是虫草素含量得率低，生产工艺复杂，不容易放大培养等，限制了其推广应用。
现阶段，蛹虫草菌丝体及其关键药效成分虫草素的产量成为阻碍蛹虫草产品应用的瓶颈。由于液体深层发酵技术生产蛹虫草具有生产周期短等特点，在特定培养基及培养参数控制下，通过液体深层发酵短时间大量培养出的菌丝体。液体发酵蛹虫草菌丝体不仅含有虫草素，还有大量次生代谢产物，是一种潜在的新途径，其生产方式具有产量高、周期短、成本低、适于工业化生产等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，它采用一种新型的中药混合培养物作为发酵培养基进行工业化深层发酵，能够显著提高蛹虫草多糖的含量，虫草素含量≥200μg/ml。
本发明以蛹虫草菌种为种子菌种，经过种子液培养，发酵罐工业化生产，离心进行固液分离，最后将液体进行灭菌，检查和罐装等，得到一种兽用发酵蛹虫草菌口服液产品。此口服液中含有丰富的虫草素等活性物质。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于依次进行以下步骤：
A种子液制备：制备种子培养基，进行灭菌后备用；挑取蛹虫草菌菌种进行接种，摇床培养后得到蛹虫草菌种子液；所述种子培养基制作方法为：选取马铃薯145－155g和蚕蛹粉9－11g，加入500ml水，煮30min，过滤残渣，得到液体，加入葡萄糖10－11g，蛋白胨8－9g，酵母提取物7.5－8.5g，磷酸二氢钾1－2g，硫酸镁1－2g，维生素B10.03－0.05g与水950－1050mL混匀，调节pH值至7.0-7.5（调节pH值使用0.1mol/L氢氧化钠溶液和0.1mol/L盐酸溶液），在121℃温度下灭菌30min；所述接种方法为：挑取直径为6±0.5mm的6个蛹虫草菌菌块，接种至种子培养基装载瓶中（即用直径6±0.5mm中的6个蛹虫草菌菌块，做成6±0.5mm直径的接种环，用接种环挑取菌落）；所述摇床培养的方法为：于24-28℃温度下、黑暗环境、转速为100-150rpm的摇床培养4-7d制成蛹虫草菌种子液，备用；
B发酵罐放大：取A步骤中的蛹虫草菌种子液接种到发酵培养基中（即采用通常的液体种子液发酵接种方法进行），调节pH值至7.0-7.5，在121℃温度下灭菌30min；之后，进行培养；当发酵培养基降温至23℃时，所述蛹虫草菌种子液按照发酵液体积百分比为5-12%的量在无菌条件下接种，培养72-96h；摇床转速为110-200rpm；最终得到发酵蛹虫草菌混合液体；所述发酵培养基包括以下组成，按按重量百分比：中药混合培养物11－13%，维生素B10.02-0.04%，碳酸钙0.03-0.05%，其余为水；所述中药混合培养物组成按重量比为：党参6-10：山药6-13：麸皮5-11：芝麻饼8-25：豆粕15-22：麦芽浸粉8-18：蔗糖12-18：蛋白胨3-8：磷酸二氢钾2-4：硫酸镁2-5；制作时，将党参、山药、麸皮、芝麻饼、豆粕粉碎过筛，与其它材料混合即可；
进一步：摇床转速初始恒定，当pH值减少到特定值时降低摇床转速；具体是：当pH值大于5.0时，摇床转速为130-200rpm；当pH值降低到5.0时，将摇床转速降低至110rpm；当pH值降低至3.0，停止发酵（摇床转速减速是为了更好地富集产物，增大产量），得到发酵蛹虫草菌混合液体；
C离心固液分离：取B步骤中发酵蛹虫草菌混合液体进行固液分离，离心后得到上清和沉淀，备用；所述固液分离，采用三足式离心机，转速100-150rpm，时间5-10min；
D取离心后的上清液灭菌、检查和罐装：将步骤C离心得到的上清，进行巴氏灭菌后，检测蛹虫草多糖含量，罐装后贴标签和包装，得到成品――兽用发酵蛹虫草菌口服液。
进一步：
作为优选，步骤A中所述的种子培养基配方为：马铃薯150g和蚕蛹粉10g煮30min过滤残渣，得到液体，加入葡萄糖10.5g，蛋白胨8.5g，酵母提取物8.0g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，维生素B10.04g与水1000mL混匀，调节pH值至7.2，在121℃温度下灭菌30min。此外，作为优选的摇床培养方法为：挑取直径为6±0.3mm的6个菌块接种至种子培养基装载瓶中，于25℃、黑暗环境、130rpm摇床培养5d制成蛹虫草菌种子液。
作为优选，步骤B中药混合培养物组成按重量比为：党参8：山药9：麸皮7：芝麻饼15：豆粕19：麦芽浸粉14：蔗糖16：蛋白胨5：磷酸二氢钾3：硫酸镁4；制作时，将党参、山药、麸皮、芝麻饼、豆粕粉碎过筛，与其它材料混合即可；步骤B中的发酵培养基成分含量按重量百分比为：中药混合培养物12%，维生素B10.025%，碳酸钙0.038%，其余为水，调节pH值至7.0，在121℃温度下灭菌30min；步骤B中优选的接种和发酵条件如下，接种量为发酵液体积百分比的8%，培养88h，转速为160rpm；当pH值降低到5.0时，将转速降低至130rpm，当pH值降低至3.0，停止发酵，得到发酵蛹虫草菌的混合液体。
作为优选，步骤C发酵蛹虫草菌混合液体进行固液分离的转速为135rpm，离心时间6-10min，后备用。
作为优选，步骤D中检测虫草素含量≥200μg/ml，符合工艺要求的产品。
本发明中：
蛋白胨可以是是普通的蛋白胨，包括牛骨蛋白胨和植物蛋白胨等。
酵母提取物也称酵母味素。
麦芽浸粉别称麦芽浸汁粉，麦芽汁粉。
本发明的配置机理：本发明充分结合了生物工程发酵技术，将蛹虫草菌进行液体的深层发酵，制备出含有大量虫草素的发酵蛹虫草口服液产品（虫草素在畜牧行业中的应用处于起步阶段，虫草素的效果十分明显）。满足了畜牧行业对减少抗生素使用的要求，与此同时，该蛹虫草菌在发酵产生代谢产物的过程中，产生大量高活性生物酶系，能够将中药混合培养物中的党参和山药等分解，释放出有效的生物活性物质，为畜牧养殖行业提供优质的蛹虫草菌发酵混合口服液。其中富含多种生物活性物质，如虫草素等，多种微量元素等，从而能够提高动物的免疫力，减少疾病的发生和抗生素的用量，创造更大的经济效益。
本发明的有益效果是：（1）本方法率先将生物工程发酵技术结合中药特定培养基筛选技术，生产主要应用于畜牧产品的动保产品开发，经过多次试验研究得到试验结果较好，具有生产工艺简单、安全环保无残留、成本低廉、所得虫草素含量高，具备良好的产业化实际应用价值。（2）本发明对液体深层放大发酵培养基配方进行了优化，能够大幅度提高蛹虫草菌发酵的活性物质虫草素的含量。其中虫草素含量≥200μg/ml（目前实验室最佳优化条件得到虫草素含量≥164.2μg/ml）。所得到的产品没有污染物，环境友好。
以下根据相关试验资料说明本发明效果。
试验资料：
1、主要功效：提高采食量，稳定产蛋率。
2、使用方法：将本品每1吨饮水加本品500ml，可计算好每天总采食量一次集中投药。每个疗程3－4天，每个疗程间隔2－3天，可再用下一个疗程。一般2个疗程能明显见效。之后，再使用1个疗程，巩固效果。
3、典型案例：
（1）2018年7月洛阳市伊川县鸭岭镇金虎养鸡场，250日龄，该鸡场养殖规模是4000只。主要存在的问题是产蛋率低，蛋壳的颜色很浅，鸡采食量下滑严重，并且伴有腹泻问题。该鸡场使用发酵灵蛹虫草口服液第3天，蛋壳颜色变得加深，产蛋率增加10-12%，采食量增加20-30%，腹泻率降低至5-8%。使用5天后，采食量基本恢复正常水平。
（2）2018年7月洛阳市新安县磁间镇养鸡场，180日龄，该鸡场养殖规模是4500只。主要存在的问题是产蛋率低，蛋壳的颜色很浅薄，鸡采食量低，粪便稀，有腹泻。该鸡场使用发酵灵蛹虫草口服液第4天，蛋壳颜色变得加深并且蛋壳变厚，产蛋率增加12-15%，采食量增加25-33%，腹泻率降低至3-5%。使用5天后，采食量和腹泻率基本恢复正常水平。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，并使本发明的上述目的、特征和有点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
图1为本发明流程图。在对各实施例的解读过程中，可参考图1。
具体实施方式
实施例1：
一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于依次进行以下步骤：
A种子液制备：选取马铃薯148g和蚕蛹粉9.5g，加入500ml水，煮（可以采用煮沸后文火）30min过滤残渣，得到液体，加入葡萄糖10g，蛋白胨8g，酵母提取物8.0g，磷酸二氢钾1.4g，硫酸镁1.4g，维生素B10.04溶解后，用水定容至1000ml，调节pH值至7.5，121℃灭菌30min。方法为：挑取直径为6±0.4mm大小的5个菌块接种至种子培养基装载瓶中（可以是装载量为100mL/500mL的三角瓶），于24℃、黑暗环境（充分避光）、100rpmpm摇床培养4d制成蛹虫草菌种子液，备用。
B发酵罐放大：取A步骤中的蛹虫草菌种子液接种（即采用通常的液体种子液发酵接种方法进行）到发酵培养基中，进行培养，得到发酵蛹虫草菌的混合液体；所述发酵培养基包括以下组成，按重量（质量）百分比计：中药混合培养物12%，维生素B10.02%，碳酸钙0.03%，其余为水；调节pH值至7.0，在121℃温度下灭菌30min；当发酵培养基降温至23℃时，将蛹虫草菌种子液按照发酵液体积百分比为6%的量进行接种，培养72h（指总时间），初始时转速恒定为130rpm；当pH值降低到5.0±0.2时，将转速降低至110rpm，当pH值降低至3.0±0.2，停止发酵，得到发酵蛹虫草菌混合液体。其中中药混合培养物组成按重量比为：党参6：山药6：麸皮11：芝麻饼25：豆粕15：麦芽浸粉8：蔗糖12：蛋白胨8：磷酸二氢钾4：硫酸镁5，制作时，将党参、山药、麸皮、芝麻饼、豆粕粉碎过筛，与其它材料混合即可。
C离心固液分离：发酵蛹虫草菌混合液体进行固液分离，采用三足式离心机，转速100rpm。离心6min后得到上清和沉淀，备用。
D离心后的上清液灭菌、检查和罐装：将步骤C离心得到的上清，进行巴氏灭菌后，检查蛹虫草多糖含量，虫草素的含量为212μg/ml，罐装后贴标签和包装。
实施例2：
一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于依次进行以下步骤：
A种子液制备：选取马铃薯152g和蚕蛹粉10.5g，加入500ml水，煮沸后，文火维持30min，过滤残渣，得到液体，加入葡萄糖10.6g，蛋白胨8.6g，酵母提取物8.2g，磷酸二氢钾1.6g，硫酸镁1.6g，维生素B10.04充分混匀溶解后用水定容至1000ml，调节pH值至7.5，121℃灭菌30min；方法为：挑取直径为6±0.4mm大小的5个菌块接种至种子培养基装载瓶中（可以是装载量为100mL/500mL的三角瓶），于28℃温度下、黑暗环境（充分避光）、150rpm摇床培养7d制成蛹虫草菌种子液，备用。
B发酵罐放大：取A步骤中的蛹虫草菌种子液接种（即采用通常的液体种子液发酵接种方法进行）到发酵培养基中，进行培养，得到发酵蛹虫草菌的混合液体；所述发酵培养基包括以下组成，按重量（质量）百分比计：中药混合培养物12%，维生素B10.04%，碳酸钙0.05%，其余为水；调节pH值至7.0，在121℃温度下灭菌30min；当发酵培养基降温至23℃时，将蛹虫草菌种子液按照发酵液体积百分比为12%的量进行接种，培养96h（指总时间），初始时转速恒定为200rpm；当pH值降低到5.0±0.2时，将转速降低至130rpm，当pH值降低至3.0±0.2，停止发酵，得到发酵蛹虫草菌的混合液体。其中中药混合培养物组成按重量比为：党参10：山药13：麸皮10：芝麻饼8：豆粕22：麦芽浸粉12：蔗糖18：蛋白胨3：磷酸二氢钾2：硫酸镁2；制作时，将党参、山药、麸皮、芝麻饼、豆粕粉碎过筛，与其它材料混合即可。
C离心固液分离：发酵蛹虫草菌混合液体进行固液分离，采用三足式离心机，转速150rpm。离心8min后得到上清和沉淀，备用。
D离心后的上清液灭菌、检查和罐装：将步骤C离心得到的上清，进行巴氏灭菌后，检查蛹虫草多糖含量，蛹虫草多糖的含量为208μg/ml，罐装后贴标签和包装。
实施例3：
一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于依次进行以下步骤：
A种子液制备：选取马铃薯150g和蚕蛹粉10g，加入500ml水，煮沸后，文火维持30min，过滤残渣，得到液体，加入葡萄糖10.5g，蛋白胨8.5g，酵母提取物8.0g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，维生素B10.04g充分混匀溶解后用水定容至1000ml，调节pH值至7.2，在121℃温度下灭菌30min。摇床培养方法为：挑取直径为6±0.3mm的6个菌块接种至种子培养基装载瓶中（可以是装载量为100mL/500mL的三角瓶），于25℃、黑暗环境（充分避光）、130rpm摇床培养5d制成蛹虫草菌种子液。
B发酵罐放大：取A步骤中的蛹虫草菌种子液接种（即采用通常的液体种子液发酵接种方法进行）到发酵培养基中，进行培养，得到发酵蛹虫草菌的混合液体；所述发酵培养基包括以下组成，按重量（质量）百分比计：中药混合培养物12%，维生素B10.025%，碳酸钙0.038%，其余为水，调节pH值至7.0，在121℃温度下灭菌30min；当发酵培养基降温至23℃时，将蛹虫草菌种子液按照发酵液体积百分比为12%的量进行接种，培养88h（指总时间），初始时转速恒定为160rpm；当pH值降低到5.0时，将转速降低至130rpm，当pH值降低至3.0，停止发酵，得到发酵蛹虫草菌的混合液体。其中，中药混合培养物组成按重量比为：党参8：山药9：麸皮7：芝麻饼15：豆粕19：麦芽浸粉14：蔗糖16：蛋白胨5：磷酸二氢钾3：硫酸镁4；制作时，将党参、山药、麸皮、芝麻饼、豆粕粉碎过筛，与其它材料混合即可。
C离心固液分离：发酵蛹虫草菌混合液体进行固液分离的转速为135rpm，离心10min后备用。
D离心后的上清液灭菌、检查和罐装：将步骤C离心得到的上清，进行巴氏灭菌后，检查蛹虫草多糖含量，蛹虫草多糖的含量≥220μg/ml，罐装后贴标签和包装。
本发明各实施例所得的兽用发酵蛹虫草菌口服液，虫草素含量≥200μg/ml。
本发明中，所述种子培养基制作物还可以为以下组合之一种：
（1）马铃薯145g和蚕蛹粉11g加入500ml水，煮30min，过滤残渣，得到液体，加入葡萄糖10g，蛋白胨9g，酵母提取物7.5g，磷酸二氢钾1.2g，硫酸镁1.3g，维生素B10.03g与水980mL混匀；
（2）马铃薯155g和蚕蛹粉9g加入500ml水，煮30min，过滤残渣，得到液体，加入葡萄糖11g，蛋白胨8g，酵母提取物7.8g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.4g，维生素B10.04g与水1000mL混匀；
（3）马铃薯152g和蚕蛹粉10g加入500ml水，煮30min，过滤残渣，得到液体，加入葡萄糖10.3g，蛋白胨8.6g，酵母提取物8.2g，磷酸二氢钾1.6g，硫酸镁1.6g，维生素B10.05g与水1050mL混匀。
本发明中，中药混合培养物组成还可以为以下组合之一种：
（1）按重量份：党参6：山药9：麸皮11：芝麻饼19：豆粕17：麦芽浸粉9：蔗糖13：蛋白胨7：磷酸二氢钾3：硫酸镁4；
（2）按重量份：党参8：山药12：麸皮10：芝麻饼10：豆粕21：麦芽浸粉13：蔗糖16：蛋白胨4：磷酸二氢钾3：硫酸镁3；
（3）按重量份：党参9：山药7：麸皮8：芝麻饼16：豆粕20：麦芽浸粉14：蔗糖14：蛋白胨5：磷酸二氢钾4：硫酸镁3。
本发明各实施中，中药混合培养物组成还可以添加其它中药材料。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于依次进行以下步骤：
A种子液制备：制备种子培养基，进行灭菌后备用；挑取蛹虫草菌菌种进行接种，摇床培养后得到蛹虫草菌种子液；
B发酵罐放大：取A步骤中的蛹虫草菌种子液接种到发酵培养基中，调节pH值至7.0-7.5，在121℃温度下灭菌30min；之后，进行培养；当发酵培养基降温至23℃时，所述蛹虫草菌蛹虫草菌种子液按照发酵液体积百分比为5-12%的量在无菌条件下接种，培养72-96h；摇床转速为110-200rpm；最终得到发酵蛹虫草菌混合液体；
C离心固液分离：取B步骤中发酵蛹虫草菌混合液体进行固液分离，离心后得到上清和沉淀，备用；
D取离心后的上清液灭菌、检查和罐装：将步骤C离心得到的上清，进行巴氏灭菌后，检测蛹虫草多糖含量，罐装后贴标签和包装，得到成品。
2.根据权利要求1所述的兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于步骤A：所述种子培养基制作方法为：选取马铃薯145－155g和蚕蛹粉9－11g，加入500ml水，煮30min，过滤残渣，得到液体，加入葡萄糖10－11g，蛋白胨8－9g，酵母提取物7.5－8.5g，磷酸二氢钾1－2g，硫酸镁1－2g，维生素B10.03－0.05g与水950－1050mL混匀，调节pH值至7.0-7.5，在121℃温度下灭菌30min。
3.根据权利要求1所述的兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于步骤A：所述接种方法为：挑取直径为6±0.5mm的6个蛹虫草菌菌块，接种至种子培养基装载瓶中。
4.根据权利要求1所述的兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于步骤A：所述摇床培养的方法为：于24-28℃温度下、黑暗环境、转速为100-150rpm的摇床培养4-7d制成蛹虫草菌种子液，备用。
5.根据权利要求1所述的兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于步骤B：所述发酵培养基包括以下组成，按按重量百分比：中药混合培养物11－13%，维生素B10.02-0.04%，碳酸钙0.03-0.05%，其余为水；所述中药混合培养物组成按重量比为：党参6-10：山药6-13：麸皮5-11：芝麻饼8-25：豆粕15-22：麦芽浸粉8-18：蔗糖12-18：蛋白胨3-8：磷酸二氢钾2-4：硫酸镁2-5；制作时，将党参、山药、麸皮、芝麻饼、豆粕粉碎过筛，与其它材料混合即可。
6.根据权利要求1所述的兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于步骤B：所述摇床转速为110-200rpm，进一步：摇床转速初始恒定，当pH值减少到特定值时降低摇床转速；具体是：当pH值大于5.0时，摇床转速为130-200rpm；当pH值降低到5.0时，将摇床转速降低至110rpm；当pH值降低至3.0，停止发酵。
7.根据权利要求1所述的兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法，其特征在于步骤C：固液分离分离采用三足式离心机，转速100-150rpm，时间5-10min。
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