CN101940611A - 蛹虫草发酵中药黄芪开发的植物源动物用免疫增强剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以蛹虫草菌作为发酵菌种发酵中药黄芪开发的植物源动物用免疫增强剂，属于动物保健品领域。其中以中药黄芪及黄芪药渣为原料，接种蛹虫草菌(Cordyceps militaris)，使其含量为≥15.7×10⁶个/g，发酵过程中温度维持为25℃-30℃，发酵时间为264小时；发酵产物经杀菌处理后可直接饲喂家禽或猪，作为动物免疫增强剂使用。本发明原料来源广，生产成本低，免疫增强效果好，生产中无环境污染，发酵产物对人畜安全，效果显著，是一种无公害植物源动物用免疫增强剂。

Description

蛹虫草发酵中药黄芪开发的植物源动物用免疫增强剂

一、技术领域

本发明涉及黄芪发酵开发的植物源动物用免疫增强剂，属于动物保健品领域，专用于药用真菌蛹虫草菌发酵黄芪开发的植物源动物用免疫增强剂。

二、背景技术

近年来，我国发酵制药业的飞速发展，而药用真菌双向发酵技术是目前开发中药最有希望的途径，药用真菌发酵技术是指以药用真菌为发酵菌种，利用中药作为药性基质，两者共同构成发酵组合，双方相适应并在一定条件下进行固体发酵的技术，掺用中药作为药性基质发酵，使发酵产物的免疫增强效果比单用其中的任何一种效果有很明显提高。经试验，以黄芪为发酵基质经蛹虫草菌发酵的产物经拌料饲喂后对动物免疫功能具有较强修复和增强作用，大大增强了动物对疾病的抵抗力。

我国药用真菌种类丰富，且应用病种面广，已涉及医院各重要病科与人体各有关系统。不少品种具有调节机体免疫功能的作用，已多研究用于抗癌、消炎等方面，近数年来对抗病毒作用、免疫增强作用备受关注，已有关于药用真菌产物对非典、艾滋、禽流感病毒等有效的报告，令人兴奋。蛹虫草菌在我国的研究历史悠久，蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种，学名为Cordyceps militaris，又名北冬虫夏草、北虫草等，中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳萎遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。

现代科学论证蛹虫草不仅具有特殊的营养价值，而且有明显的药用价值。其中尤以虫草酸、虫草素、虫草多糖和SOD等多种生物活性物质的药用价值最为显著。虫草酸(甘露醇)可以显著地降低颅压，促进机体新陈代谢，因而使脑溢血和脑血栓病症得到缓解。虫草素是一种具有抗菌活性的核苷类物质，对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。在DNA转录mRNA过程中使mRNA成熟障碍，抑制癌细胞的生长。并有降血糖的作用。虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖，它能促进淋巴细胞转化，提高血清IgG的抗体含量和机体的免疫功能，增强机体自身抗癌抑癌的能力。SOD(超氧化物歧化酶)可以消除机体内超氧自由基，具有抗衰老、抗癌抑癌的作用。此外，蛹虫草还含有丰富的硒(Se)，这种微量元素已被大家公认是人体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化酶的活性中心，以硒半胱氨酸的形式连接在酶蛋白的肽链上，保护细胞膜的稳定性的正常的通透性，并刺激免疫球蛋白和抗体的产生，增强机体免疫和抗氧化能力。同时，大量的科学实践证明硒可以明显地抑制癌细胞的生长。

其中，蛹虫草的免疫调节作用尤其突出，经过对小鼠进行淋巴转化试验、Ea及E玫瑰花试验、特异性免疫玫瑰花试验(巨噬细胞吞噬试验、抗绵羊红细胞抗体效价试验)，结果表明蛹虫草多糖具有明显的提高免疫功能作用。本发明是在蛹虫草菌的发酵活性基础上，利用黄芪作为培养基，采用固体发酵技术，发酵出效果显著的植物源动物免疫增强剂，国内外尚属首例。

同时，随着我国中药制药业的飞速发展，药品加工能力不断提高，产品种类日益繁多，药渣的排出量逐年增加。据统计，中药制药企业每年将产生数千万吨的中药药渣，并且90％以上的生产厂家均将药渣作为废料垃圾，以黄芪药渣为例，我省每年就有1000吨左右，仅仅南京中医药大学南星制药厂每年就有近300吨黄芪药渣，这在一定程度上造成了植物资源的巨大浪费，同时由于药渣未及时处理还会对周边环境造成污染，所以采用药用真菌双向性固体发酵技术对中药药渣进行发酵处理，并使之形成新的有益成分而具有新的性味功能，并作为兽用免疫增强剂被再利用将是中药药渣的最有效处理和利用方式。这也为充分利用中药材资源、使其“变废为宝”提供了很好的研究方向和产业模式，必将会为其它中药材品种的合理应用、开发奠定坚实的基础。

三、发明内容

技术问题本研究的目的在于提供了一种安全、有效、经济、无公害的植物源动物免疫增强剂及其制备方法，同时充分开发利用中药黄芪资源。

技术方案

本发明是以黄芪或黄芪药渣为主要培养基、接种蛹虫草菌(Cordyceps militaris)进行发酵而开发的植物源动物用免疫增强剂，是通过以下方法制备而成的：

发酵体系1：使用黄芪、玉米粉、麸皮、尿素进行固体发酵基的配制，其中黄芪的质量分数为58％，玉米粉质量分数为28％，麸皮质量分数10％，尿素4％，发酵条件为：发酵体系中料水比1∶2，用0.1M的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌(Cordycepsmilitaris)作为发酵菌种，使其含量为≥9.2×10⁶个/g，发酵过程中温度维持25℃-30℃，发酵时间为264小时。

发酵体系2：使用黄芪药渣、玉米粉、麸皮、尿素进行固体发酵基的配制，其中黄芪药渣的质量分数为50％，玉米粉质量比为31％，麸皮15％，尿素质量比为4％；发酵：发酵体系中料水体积比为1∶2，用0.1M的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌(Cordycepsmilitaris)作为发酵菌种，使其含量为≥15.7×10⁶个/g，发酵过程中温度维持为25℃-30℃，发酵时间为264小时；

发酵体系结束后所得发酵产物经55℃干燥烘干，然后用⁶⁰Co γ射线进行辐照杀菌处理，辐照杀菌吸收剂量范围为5-10kGy，吸收剂量不均匀度＜1.38，即得到所述的植物源动物用免疫增强剂产品。

产品检验及质量标准：将发酵样品研磨粉碎，精密称取0.3g至具塞锥形瓶中，准确加入纯甲醇30ml，并进行超声提取30min。然后4000r/min离心10min，取上清液5ml，蒸干溶剂，并以流动溶解定容至5mL，高速离心(13000r/min)备用。

以高效液相色谱法对照虫草素、虫草酸的标准曲线测定发酵产物中的虫草素、虫草酸含量，以虫草素含量在3.2mg/g、虫草酸含量在52mg/g以上为发酵成功标准，同时以葡聚糖为辅料对发酵产物虫草素、虫草酸含量进行调整，使每批发酵产品中虫草素含量为2.8mg/g、虫草酸含量为46mg/g。

有益效果本发明所提供的黄芪开发的植物源动物免疫增强剂及其制备方法与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

(1)免疫增强效果明显。试验证明，两种发酵产物经拌料饲喂后，能使受抑制的吞噬细胞和淋巴细胞功能恢复正常，并增强细胞免疫机能，促进体液免疫细胞的增殖、成熟和抗体产生，大大提高疫苗的免疫效果。

(2)生产中无环境污染，无残留，同时应用效果明显，对人畜安全，是一种无公害植物源动物免疫增强剂。

(3)同时，在已有药用真菌发酵中药材技术的基础上独创性的使用黄芪药渣作为药用基质进行发酵，一方面黄芪药渣取材较广，成本低，并达到转废为宝的目的，关键在于提取黄芪多糖后黄芪药渣中仍富含大量黄芪皂甙，植物黄酮，胆碱，亚麻酸以及多种氨基酸和微量元素，这些有益成分如添加于动物日常饲料中将更适合动物营养要求，以及免疫能力提高。

(4)采用本发明中的辐照杀菌方法可显著降低产品中各种微生物的含量，细菌总数降低到1000cfu/g以下，大肠菌群降低到30MPN/100g以下，霉菌和沙门氏菌未检出，并能够保持产品中主要营养成分以及外观色泽和口感不变。该方法操作简便，快捷，成本低，可广泛应用，在常温下贮存，保质期可达1年以上。

具体实施方式

以蛹虫草菌(Cordyceps militaris)(本菌种购得于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号5.699)为发酵菌种，利用黄芪或黄芪药渣作为培养基，两者共同构成发酵组合并进行发酵所开发的植物源动物用免疫增强剂产品(中药发酵产品)的制备：

发酵体系1：使用黄芪、玉米粉、麸皮、尿素进行固体发酵基的配制，其中黄芪的质量分数为58％，玉米粉质量分数为28％，麸皮质量分数为10％，尿素4％，发酵条件为：发酵体系中料水比为1∶2，用0.1M的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌(Cordycepsmilitaris)(本菌种购得于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号5.699)作为发酵菌种，使其含量为≥9.2×10⁶个/g，发酵过程中温度维持为25℃-30℃，发酵时间为264小时。发酵结束后所得产物经55℃烘干，用60Co γ射线进行辐照杀菌处理，辐照杀菌吸收剂量范围为5-10kGy，吸收剂量不均匀度＜1.38。

产品检验及质量标准：将发酵样品研磨粉碎，精密称取0.3g至具塞锥形瓶中，准确加入纯甲醇30ml，并进行超声提取30min。然后4000r/min离心10min，取上清液5ml，蒸干溶剂，并以流动溶解定容至5mL，高速离心(13000r/min)备用。

以高效液相色谱法对照虫草素、虫草酸的标准曲线测定发酵产物中的虫草素、虫草酸含量，以虫草素含量在3.2mg/g、虫草酸含量在52mg/g以上为发酵成功标准，同时以葡聚糖为辅料对发酵产物虫草素、虫草酸含量进行调整，使每批发酵产品中虫草素含量为2.8mg/g、虫草酸含量为46mg/g。

发酵体系2：使用黄芪药渣、玉米粉、麸皮、尿素进行固体发酵基的配制，其中黄芪药渣的质量分数为50％，玉米粉质量比为31％，麸皮15％，尿素质量比为4％；发酵：发酵体系中料水体积比为1∶2，用0.1M的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌(Cordycepsmilitaris)(本菌种购得于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号5.699)作为发酵菌种，使其含量为≥15.7×10⁶个/g，发酵过程中温度维持为25℃-30℃，发酵时间为264小时；

发酵结束后所得两种发酵产物经55℃烘干，用60Co γ射线进行辐照杀菌处理，辐照杀菌吸收剂量范围为5-10kGy，吸收剂量不均匀度＜1.38。

产品检验及质量标准：将发酵样品研磨粉碎，精密称取0.3g至具塞锥形瓶中，准确加入纯甲醇30ml，并进行超声提取30min。然后4000r/min离心10min，取上清液5ml，蒸干溶剂，并以流动溶解定容至5mL，高速离心(13000r/min)备用。

以高效液相色谱法对照虫草素、虫草酸的标准曲线测定发酵产物中的虫草素、虫草酸含量，以虫草素含量在3.2mg/g、虫草酸含量在52mg/g以上为发酵成功标准，同时以葡聚糖为辅料对发酵产物虫草素、虫草酸含量进行调整，使每批发酵产品中虫草素含量为2.8mg/g、虫草酸含量为46mg/g。

实施例1：蛹虫草发酵黄芪(发酵体系1)所得发酵产品动物实验

1将40只14日龄健康罗曼雏鸡随机分成对照组和试验组，均按常规方法饲养，在试验前测定各组鸡的新城疫母源抗体，选取母源抗体为2⁴以下的雏鸡作为实验鸡，并进行称重，并进行ND-Lasota疫苗(南京天邦生物科技有限公司)以1羽份/只接种量接种，同时给试验组雏鸡在正常日粮中添加上述发酵产品，使发酵产品的质量分数为4％，持续添加30天，在试验后10、20、30和40d分别翅静脉采血，进行ND-HI抗体检测(用于测定发酵产品对鸡体体液免疫增强效果)、ERFC试验(用于测定发酵产品对鸡体细胞免疫增强效果)、外周血T淋巴细胞ANAE形成率测定(用于测定发酵产品对鸡体细胞免疫增强效果)，在试验结束时，每组随机取10只鸡称重后，供水禁食24h，颈静脉放血致死，分别采集法氏囊和脾脏，进行囊体比、脾体比比较。

2.1鸡新城疫HI抗体检测试验前(14日龄)各组鸡ND-HI抗体效价测定结果组间差异不显著(P＞0.05)，免疫后10、20、30和40d试验组新城疫HI抗体滴度极显著高于对照组(P＜0.01)，证明此免疫增强剂能显著增强体液免疫功能，提高ND-HI抗体滴度，结果见表1。

表1免疫增强剂对鸡新城疫HI抗体消长的影响(log2)

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

2.2鸡新城疫ERFC形成试验试验前(14日龄)各组鸡新城疫ERFC形成率差异不显著(P＞0.05)，免疫后10、20、30和40d试验组新城疫ERFC形成率极显著高于对照组(P＜0.01)，证明免疫增强剂能显著增强细胞免疫功能，结果见表2。

表2免疫增强剂对鸡ERFC形成率的影响(％)

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

2.3鸡新城疫ANAE阳性率测定试验前(14日龄)各组鸡新城疫ANAE阳性率差异不显著(P＞0.05)，试验后20、30、40d试验组ANAE阳性率极显著高于对照组(P＜0.01)，表明该免疫增强剂能有效促进T淋巴细胞的诱导，协同免疫刺激作用，可提高外周血T淋巴细胞百分率，结果见表3。

表3免疫增强剂对鸡ANAE阳性率的影响(％)

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

2.4免疫器官相对重量的比较免疫增强剂具有明显的促生长作用，经t检验差异极显著(P＜0.01)；对机体的囊体比和脾体比有一定的提高，但差异不显著(P＞0.05)，结果见表4。

表4免疫增强剂对鸡免疫器官相对重量的影响

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

实施例2：蛹虫草发酵黄芪(发酵体系1)所得发酵产品动物实验

1选择日龄为(28±3)d的长×大二元断奶仔猪80头(公母各半)，试验猪为普通级试验动物。

1)随机分成2个处理组，每个处理组设5个重复，每栏为1个重复小组，每栏8头仔猪。2个处理组分别为：对照组：饲喂基础日粮；处理组：基础日粮+200mg/kg发酵产品。试验在江宁秣陵种猪育种有限公司进行，全封闭式猪舍，屋顶排气扇通风，漏缝金属地板，网上平养，舍温保持在25℃-30℃。粉料饲喂、少量多次、自由采食饮水、常规饲养和免疫，试验期为30天。

2)分别在试验进行到第14和28天时，早上喂料前每个处理组采血5头，无菌前腔静脉采血分别注入真空EDTA抗凝管和真空生化管制成抗凝血和血清。采用MTT法测定外周血淋巴细胞转化率；采用流式细胞仪法测定外周血T淋巴细胞亚群分布情况(用于测定发酵产品对猪体细胞免疫增强效果)。所有试验仔猪在25日龄进行等剂量猪瘟细胞疫苗免疫接种。在免疫接种后第7、14、21、28天每个处理组采血5头，用真空生化管前腔静脉采血，分离血清分装-80℃冻存，用美国IDEXX公司的猪瘟ELISA抗体试剂盒检测猪瘟抗体。

3)所有试验数据采用SPSS10·0软件进行ANO-VA统计处理。差异显著性进行Duncan氏比较。数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示。P＜0.05确定为差异显著。

2发酵产物对断奶仔猪外周血淋巴细胞淋巴细胞转化率的影响

由表5可知，试验第14、28天，添加发酵产物组的外周血淋巴细胞转化率均极显著高于对照组(P＜0.01)。

表5发酵产物对断奶仔猪的外周血淋巴细胞转化率的影响

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

3发酵产物对断奶仔猪外周血淋巴细胞亚群数量的影响

由表6可知，添加发酵产物14天后，仔猪外周血T淋巴细胞(CD3⁺)、CD4+T细胞、CD8⁺T细胞、自然杀伤性细胞(CD3^-CD4^-CD8⁺)、Th细胞(CD3⁺CD4⁺CD8^-)和Tc细胞数量(CD3⁺CD4^-CD8⁺)均显著高于对照组(P＜0.05)，表明发酵产物能够明显增强猪体细胞免疫效果。

表6发酵产物对断奶仔猪外周血淋巴细胞亚群数量的影响

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

4发酵产物对断奶仔猪血清中猪瘟抗体的影响

由表7可知，猪瘟疫苗免疫21天后呈现上升趋势。发酵产物可显著提高猪瘟疫苗免疫后21天、28天的抗体水平(P＜0.05)，表明发酵产物能够明显增强猪体体液免疫效果。

表7发酵产物对断奶仔猪血液中猪瘟抗体的影响(阻断率)

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

实施例3：蛹虫草发酵黄芪药渣(发酵体系2)所得发酵产品动物实验

1试验奶牛的选择和分组：

从同一牛舍的100头荷斯坦奶牛中挑选40头泌乳期的健康牛，按照年龄、日产奶量、泌乳天数、胎次相近的原则进行分组配对，然后随机分成两组每组20头。一组为试验组，一组为对照组。

2试验饲料和喂养方法

以上海种奶牛场不添加任何添加剂、自然青贮的全株玉米饲料为基础日粮，对照组：饲喂基础日粮；处理组：基础日粮+600mg/kg/d发酵产品。试验在上海种奶牛场进行，喂养方法和平时相同，自由采食饮水、常规饲养和免疫，试验期为30天。

3试验指标

试验期间，每周测定逐头日产奶量1次，并取乳样，在上海某牧场实验室分析乳成份，仪器为乳成份分析仪(浙江大学食品科学与发酵工程研究所生产，MILKYWAY-1型)。

4试验结果

4.1发酵产物对泌乳奶牛产奶量的影响

试验前各组泌乳牛的产奶量水平相近，在试验期间，各组平均产奶量均有所上升。试验组和对照组试前平均日产奶量为44.7和45.2kg，而试验期间平均为48.9和45.7，分别上升了9.4％和1.3％。

表8发酵产物对泌乳奶牛产奶量的影响

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

4.2发酵产物对泌乳奶牛乳脂率的影响

对泌乳奶牛乳脂率的影响如表9所示，试验期对照组的乳脂率平均值较试验前有所下降，而试验组则上升，且差异极显著(P＜0.01)，说明发酵产物可减缓产奶后期奶牛的乳脂率下降。

表9发酵产物对泌乳奶牛产奶乳脂率的影响

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

4.3发酵产物对泌乳奶牛乳蛋白率的影响

从表10可以看出采用发酵产物可以有效减缓泌乳后期乳蛋自率的下降，随着泌乳期的变化，牛奶中的乳蛋自率较试验前均有所下降，但试验组降低的幅度较小，对照组降低幅度较大，差异极显著(P＜0.01)。说明发酵产物能有效减缓泌乳后期乳蛋白率的下降趋势。

表10发酵产物对泌乳奶牛产奶蛋白率的影响

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

4.4发酵产物对泌乳奶牛体细胞数的影响

对照组平均体细胞数达到85.2万个/ml、而试验组奶牛的体细胞数得到了很好的控制，平均体细胞数为32.7万个/ml，降到50万个/ml以下，达到了现在牛奶收购的一个通用标准，且差异极显著(P＜0.01)，奶牛体细胞数的降低，有效地减少了产奶量的损失。说明发酵产物具有明显提高奶牛的免疫力作用。

表11发酵产物对泌乳奶牛体细胞数的影响

注：同列数据肩标有**表示差异极显著(P＜0.01)。

Claims (3)

1.一种植物源动物用免疫增强剂，是以蛹虫草菌(Cordyceps militaris)接种黄芪或黄芪药渣为主的固体培养基经发酵、杀菌处理而获得的产品。

2.根据权利要求1所述的一种植物源动物用免疫增强剂，是通过以下方法制备而成：

1)发酵体系

真菌黄芪固体发酵体系：中药黄芪的质量比为58％，玉米粉质量比为28％，麸皮10％，尿素质量比为4％；发酵体系中料水体积比为1∶2，用0.1M的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌(Cordyceps militaris)作为发酵菌种，使其含量为≥9.2×10⁶个/g，发酵过程中温度维持为25℃-30℃，发酵时间为264小时；

或者真菌黄芪药渣固体发酵体系：黄芪药渣的质量比为50％，玉米粉质量比为31％，麸皮15％，尿素质量比为4％；发酵体系中料水体积比为1∶2，用0.1M的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌(Cordyceps militaris)作为发酵菌种，使其含量为≥15.7×10⁶个/g，发酵过程中温度维持为25℃-30℃，发酵时间为264小时；

2)杀菌处理：

发酵结束后所得发酵产物经55℃干燥烘干，并用25cm*35cm透明聚乙烯PE塑料包装袋真空包装并密封，装入瓦楞纸箱封口；在原包装下用⁶⁰Co γ射线进行辐照杀菌处理，辐照杀菌吸收剂量范围为5-10kGy，吸收剂量不均匀度＜1.38，即得到所述的植物源动物用免疫增强剂产品。

3.根据权利要求1或2所述的一种植物源动物用免疫增强剂，其特征在于，以高效液相色谱法对照虫草素、虫草酸的标准曲线测定发酵产物中的虫草素、虫草酸含量，以虫草素含量在3.2mg/g、虫草酸含量在52mg/g以上为发酵产物标准。