CN1896227A - 提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法 - Google Patents

提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法，它是按一定组分及浓度配比制成液相培养基和固相培养基，取液相培养基高压灭菌，倒入固相培养基上层，制成固－液双相培养基。它适用于对抗病无核葡萄授粉后的胚珠进行胚挽救离体培养，以获得大量成苗的杂种后代，使用本发明可使无核葡萄胚发育率达85％，成苗率可达65％，且胚发育充分，成苗整齐健壮，成活率高，极大地提高了抗病无核葡萄胚挽救育种效率，加速了无核葡萄育种的进程，使其达到世界领先地位，本发明将为培育优质、抗病无核葡萄新品种开创极为广阔的前景。

Description

提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法
                            技术领域
本发明涉及葡萄育种技术，特别是一种提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法，属于生物技术领域。
                            背景技术
葡萄因其含有丰富的营养成分和独特的保健功能已成为人们喜爱的主要水果之一，近年来栽培面积不断上升，而无核葡萄无论用于鲜食、加工或制干都受到国内外消费者的青睐，美国80％以上的鲜食葡萄都是无核品种。与此同时，在世界范围内，葡萄真菌病害的广泛发生与流行也一直受到育种科学家的关注，因此培育优质抗病的无核葡萄新品种已成为目前世界各国葡萄育种的共同目标之一，而抗病无核葡萄的育种方法是为生产提供优质品种的重要环节，自1990年美国葡萄育种学家将胚挽救技术用于无核葡萄育种以来，胚挽救技术作为一种经济、高效、快速的育种方法，已受到澳大利亚、法国、意大利、南非、阿根廷、日本、印度、土耳其等许多国家的高度重视。一个多世纪以前，国外葡萄育种者就试图将圆叶葡萄的抗病基因引入品质好但不抗病的欧洲葡萄中去，但由于二者染色体数目上的差异，很难获得成苗。胚挽救技术的应用为抗病无核葡萄育种开辟了新的途径，美国《园艺科学》杂志2000年35卷第4期732～734页报道，初选出的无核抗病葡萄新材料“C41-5”，就是从无核葡萄作母本与圆叶葡萄作父本杂交的胚挽救幼苗中获得的，由此证明无核基因与抗病基因的有效结合可以通过胚挽救育种得以实现，但是，国外利用圆叶葡萄进行抗病无核育种的过程中，其成苗率最高也仅为1％，育种效率极低。
中国是世界葡萄属植物的重要原产地之一，拥有丰富的抗病种质资源，又与欧亚种无核葡萄品种杂交亲和力好，是非常宝贵的抗病无核育种资源，西北农林科技大学从上个世纪50年代就开始收集并研究这些抗性种质资源，2000年起开始借助胚挽救技术进行无核葡萄胚挽救育种，并研制成功了具备独立知识产权的培养液(专利号ZL02139330.3)和比较系统的抗病无核葡萄聚合育种方法(专利号ZL02139331.1)，使获得优株育种时间从原来的7～9年缩短到3～4年，获得了育种效率的明显提高。但近几年来，随着无核葡萄育种技术的迅猛发展和研究的不断深入，在实现无核基因与中国野生葡萄抗病基因聚合育种的过程中，显示出该项技术还存在诸多不足，主要表现在胚挽救效率有待提高，很难满足生产上对无核葡萄新品种的大量需求。经试验研究表明，使用原(ZL02139330.3)培养液进行胚珠培养后，成苗率最高不超过20％，且多数幼苗生长势弱，定植大田不易成活，育种效率不够理想。目前，胚挽救成苗不足已经成为制约无核抗病葡萄育种效率提高的瓶颈，而缺乏更加适宜的培养基是阻碍成苗率提高的关键环节，世界各国无核葡萄育种工作者也都在为这一问题而困惑。
                            发明内容
本发明的目的是公开一种由固相和液相培养基组合而成的双相培养基及制备方法，从而有效地促进无核葡萄合子胚在离体条件下继续发育和成苗，且成苗健壮整齐，使无核抗病葡萄胚挽救育种效率获得极大地提高。
本发明的原料配比是根据无核葡萄胚胎发育的特点，通过对原有培养液中各种原料的合理取舍及重新配比，而发明了一种用于提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的新型双相培养基。
本发明各组分及浓度配比为：
硝酸钙                                           0.015～0.025％
硝酸钾                                           0.060～0.070％
氯化钾                                           0.006～0.010％
硝酸铵                                           0.025～0.035％
硫酸镁                                           0.055～0.065％
磷酸二氢钠                                       0.055～0.065％
硫酸锰                                           2.5×10-4％～3.0×10-4％
硼酸                                             4.5×10-5％～5.5×10-5％
硫酸锌                                           1.5×10-4％～2.5×10-4％
氯化钴                                           1.0×10-6％～2.0×10-6％
硫酸铜                                           1.0×10-6％～2.0×10-6％
钼酸钠                                           1.5×10-6％～2.5×10-6％
柠檬酸铁                                         7.0×10-4％～8.0×10-4％
盐酸硫胺素                                       2.2×10-5％～2.8×10-5％
盐酸吡哆辛                                       2.2×10-5％～2.8×10-5％
D-泛酸钙                                         2.2×10-5％～2.8×10-5％
烟酸                                             2.2×10-5％～2.8×10-5％
甘氨酸                                           5.0×10-4％～5.0×10-3％
肌醇                                             4.5×10-3％～5.5×10-3％
水解酪蛋白                                       0.045％～0.055％
L-半胱氨酸                                       0.010％～0.015％
活性炭                                           0.1％～0.2％
蔗糖                                             5.5％～6.5％
其余为蒸馏水。
本发明各组分及优选浓度配比为：
硝酸钙                                           0.016～0.017％
硝酸钾                                           0.065～0.067％
氯化钾                                           0.007～0.008％
硝酸铵                                           0.029～0.030％
硫酸镁                                           0.060～0.062％
磷酸二氢钠                                       0.058～0.060％
硫酸锰                                           2.6×10-4％～2.8×10-4％
硼酸                                             4.8×10-5％～5.2×10-5％
硫酸锌                                           1.8×10-4％～2.0×10-4％
氯化钴                                           1.3×10-6％～1.5×10-6％
硫酸铜                                           1.5×10-6％～1.7×10-6％
钼酸钠                                           2.0×10-6％～2.2×10-6％
柠檬酸铁                                         7.2×10-4％～7.5×10-4％
盐酸硫胺素                                       2.4×10-5％～2.6×10-5％
盐酸吡哆辛                                       2.4×10-5％～2.6×10-5％
D-泛酸钙                                         2.4×10-5％～2.6×10-5％
烟酸                                             2.4×10-5％～2.6×10-5％
甘氨酸                                           0.8×10-3％～1.2×10-3％
肌醇                                             4.8×10-3％～5.2×10-3％
水解酪蛋白                                       0.048％～0.052％
L-半胱氨酸                                       0.011％～0.013％
活性炭                                           0.12％～0.15％
蔗糖                                                         5.8％～6.2％
其余为蒸馏水。
                      具体实施方式
本发明各组分及较佳浓度配比为：
硝酸钙                                      0.017％
硝酸钾                                      0.066％
氯化钾                                      0.0075％
硝酸铵                                      0.03％
硫酸镁                                      0.061％
磷酸二氢钠                                  0.059％
硫酸锰                                      2.7×10-4％
硼酸                                        5.0×10-5％
硫酸锌                                      1.9×10-4％
氯化钴                                      1.4×10-6％
硫酸铜                                      1.6×10-6％
钼酸钠                                      2.1×10-6％
柠檬酸铁                                    7.3×10-4％
盐酸硫胺素                                  2.5×10-5％
盐酸吡哆辛                                  2.5×10-5％
D-泛酸钙                                    2.5×10-5％
烟酸                                        2.5×10-5％
甘氨酸                                      1.0×10-3％
肌醇                                        5.0×10-3％
水解酪蛋白                                  0.05％
L-半胱氨酸                         0.012％
活性炭                             0.15％
蔗糖                               6.0％
其余为蒸馏水。
本发明的制备方法包括以下步骤：
a.将硝酸钙、硝酸钾、氯化钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠分别用蒸馏水溶解，搅拌条件下充分混匀，制成贮备液A；
b.将硫酸锰、硼酸、硫酸锌、氯化钴、硫酸铜、钼酸钠分别用蒸馏水溶解后充分混匀，制成贮备液B；
c.将盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、D-泛酸钙、烟酸、甘氨酸、肌醇分别用蒸馏水溶解后充分混匀，制成贮备液C；
d.将柠檬酸铁、水解酪蛋白、L-半胱氨酸、蔗糖分别用蒸馏水溶解，缓缓加入贮备液A、贮备液B、贮备液C，最后加入活性炭，用蒸馏水补足剩余体积，充分混匀后用1M的KOH准确调整PH值至6.0，制成液相培养基D；
e.在液相培养基D中加入0.55～0.75％的琼脂粉，充分搅拌后加热煮沸，分装于培养瓶内高压灭菌后平放，冷却凝固后制成固相培养基E；
f.取液相培养基D高压灭菌，无菌条件下缓缓倒入固相培养基E上层，制成固-液双相培养基。
本发明的使用方法是：
采集无核葡萄作母本的杂交幼果，果面消毒后剥出胚珠，接种在本发明的双相培养基上，离体培养8～10周后无菌条件下取出内部的胚，接种在胚萌发成苗培养基上即可获得成苗。
本发明原料中含有无核葡萄胚胎发育的多种生长促进因子，营养搭配合理，能有效促进无核葡萄合子胚在离体条件下继续发育和成苗，且成苗健壮整齐，使无核抗病葡萄胚挽救育种效率获得了极大的提高，使用本发明所获得的抗病无核葡萄杂交胚发育充分，成苗整齐健壮，成活率高，主要用于无核葡萄胚珠内胚培养，也可用于早熟葡萄和三倍体葡萄胚挽救培养，适宜进行工厂化育苗，成苗率可达65％，使无核抗病葡萄胚挽救育种效率获得了极大地提高。

Claims (5)

1.一种提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法，其特征在于它是由固相培养基和液相培养基组合而成。
2.根据权利要求1所述的一种提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法，其特征在于它是由下述原料组分及浓度配比而成：
硝酸钙                  0.015～0.025％
硝酸钾                  0.060～0.070％
氯化钾                  0.006～0.010％
硝酸铵                  0.025～0.035％
硫酸镁                  0.055～0.065％
磷酸二氢钠              0.055～0.065％
硫酸锰                  2.5×10-4％～3.0×10-4％
硼酸                    4.5×10-5％～5.5×10-5％
硫酸锌                  1.5×10-4％～2.5×10-4％
氯化钴                  1.0×10-6％～2.0×10-6％
硫酸铜                  1.0×10-6％～2.0×10-6％
钼酸钠                  1.5×10-6％～2.5×10-6％
柠檬酸铁                7.0×10-4％～8.0×10-4％
盐酸硫胺素              2.2×10-5％～2.8×10-5％
盐酸吡哆辛              2.2×10-5％～2.8×10-5％
D-泛酸钙                2.2×10-5％～2.8×10-5％
烟酸                    2.2×10-5％～2.8×10-5％
甘氨酸                  5.0×10-4％～5.0×10-3％
肌醇                    4.5×10-3％～5.5×10-3％
水解酪蛋白              0.045％～0.055％
L-半胱氨酸              0.010％～0.015％
活性炭                  0.1％～0.2％
蔗糖                    5.5％～6.5％
其余为蒸馏水。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法，其特征在于各组分及优选浓度配比为：
硝酸钙                  0.016～0.017％
硝酸钾                  0.065～0.067％
氯化钾                  0.007～0.008％
硝酸铵                  0.029～0.030％
硫酸镁                  0.060～0.062％
磷酸二氢钠              0.058～0.060％
硫酸锰                  2.6×10-4％～2.8×10-4％
硼酸                    4.8×10-5％～5.2×10-5％
硫酸锌                  1.8×10-4％～2.0×10-4％
氯化钴                  1.3×10-6％～1.5×10-6％
硫酸铜                  2.0×10-6％～2.2×10-6％
柠檬酸铁                7.2×10-4％～7.5×10-4％
盐酸硫胺素              2.4×10-5％～2.6×10-5％
盐酸吡哆辛              2.4×10-5％～2.6×10-5％
D-泛酸钙                2.4×10-5％～2.6×10-5％
烟酸                    2.4×10-5％～2.6×10-5％
甘氨酸                      0.8×10-3％～1.2×10-3％
肌醇                        4.8×10-3％～5.2×10-3％
水解酪蛋白                  0.048％～0.052％
L-半胱氨酸                  0.011％～0.013％
活性炭                      0.12％～0.15％
蔗糖                        5.8％～6.2％
其余为蒸馏水。
4.根据权利要求1或2所述的一种提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法，其特征在于各组分及较佳浓度配比为：
硝酸钙                  0.017％
硝酸钾                  0.066％
氯化钾                  0.0075％
硝酸铵                  0.03％
硫酸镁                  0.061％
磷酸二氢钠              0.059％
硫酸锰                  2.7×10-4％
硼酸                    5.0×10-5％
硫酸锌                  1.9×10-4％
氯化钴                  1.4×10-6％
硫酸铜                  1.6×10-6％
钼酸钠                  2.1×10-6％
柠檬酸铁                7.3×10-4％
盐酸硫胺素              2.5×10-5％
盐酸吡哆辛              2.5×10-5％
D-泛酸钙                2.5×10-5％
烟酸                        2.5×10-5％
甘氨酸                      1.0×10-3％
肌醇                        5.0×10-3％
水解酪蛋白                  0.05％
L-半胱氨酸                  0.012％
活性炭                      0.15％
蔗糖                        6.0％
其余为蒸馏水。
5.一种提高抗病无核葡萄胚挽救育种效率的双相培养基及制备方法，其特征在于制备方法包括以下步骤：
5.a将硝酸钙、硝酸钾、氯化钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠分别用蒸馏水溶解，搅拌条件下充分混匀，制成贮备液A；
5.b将硫酸锰、硼酸、硫酸锌、氯化钴、硫酸铜、钼酸钠分别用蒸馏水溶解后充分混匀，制成贮备液B；
5.c将盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、D-泛酸钙、烟酸、甘氨酸、肌醇分别用蒸馏水溶解后充分混匀，制成贮备液C；
5.d将柠檬酸铁、水解酪蛋白、L-半胱氨酸、蔗糖分别用蒸馏水溶解，缓缓加入贮备液A、贮备液B、贮备液C，最后加入活性炭，用蒸馏水补足剩余体积，充分混匀后用1M的KOH准确调整PH值至6.0，制成液相培养基D；
5.e在液相培养基D中加入0.55～0.75％的琼脂粉，充分搅拌后加热煮沸，分装于培养瓶内高压灭菌后平放，冷却凝固后制成固相培养基E；
5.f取液相培养基D高压灭菌，无菌条件下缓缓倒入固相培养基E上层，制成固-液双相培养基。
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