CN112314325A - 一种人工蛹虫草子实体的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人工蛹虫草子实体的培养方法，该方法包括以下步骤：(1)培养基的配制：将大米、黄豆粉、水、番茄汁和无机盐混合，经湿热灭菌后，形成培养基；(2)菌丝接种；(3)暗培养；(4)光照培养：当暗培养的培养基上长出白色菌丝后，将培养室置于光照条件下进行培养，逐渐生成蛹虫草子实体；(5)蛹虫草子实体采收：将培养完成的蛹虫草子实体收集。与现有技术相比，本发明培养的蛹虫草子实体产量高、虫草素含量高、虫草多糖含量高以及腺苷含量高，进而在抗肿瘤、抗菌抗病毒、耐缺氧、抗疲劳和调节心肺等领域具有巨大的价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种人工蛹虫草子实体的培养方法。
背景技术
蛹虫草又称北虫草、北冬虫夏草，是真菌寄生于鳞翅目等昆虫的虫体上形成的虫菌复合体，具有抗肿瘤、抗炎、耐缺氧、抗疲劳等多种药力功效，它已经在各个地区被广泛作为药用菌使用。
虫草素是一些虫草属真菌的特征性成分，也是虫草属真菌中最重要的活性成分之一，其具有免疫调节、抗肿瘤、抗疲劳、调节心肺等药用功能。虫草素作为一种新型的广谱抗菌素，以其特有的抗菌抗病毒活性，它能抑制病毒的RNA合成；对枯草杆菌和鸟结核杆菌均有抑制作用；对HIV-I型病毒也有杀伤作用；尤其对多种实体恶性肿瘤有很强的抑制作用。虫草素显示出极好的药学应用前景，目前虫草素的研究现正成为药物化学中一个极其活跃的领域。
另外，虫草多糖也是一种有效的免疫调节剂，具有广泛的免疫药理学作用，可调节机体的免疫功能，其作用主要表现为免疫增强和刺激作用。腺苷也有许多类似的重要药学作用，由此可见，北虫草具有可与冬虫夏草相媲美的药用价值。
但现有技术经常忽视了提高北虫草中虫草素的含量，另外也无法兼顾高产量、高虫草素含量、高虫草多糖含量以及高腺苷含量四种要素同时兼备的人工蛹虫草子实体及其培养方法。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高产量、高虫草素含量、高虫草多糖含量以及高腺苷含量的人工蛹虫草子实体的培养方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种人工蛹虫草子实体的培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)培养基的配制：在一万级净化条件下，将大米、黄豆粉、水、番茄汁和无机盐等混合，经灭菌后，形成培养基；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒，配制操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(2)菌丝接种：在百级净化条件下，将蛹虫草菌液接种至培养基中；此步操作中，可以采用75％乙醇喷洒擦拭，接种操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(3)暗培养：在十万级净化条件下，将接种蛹虫草菌液后的培养基放置于培养室，在避光条件下进行培养，在培养过程中进行消毒灭菌；此步操作中，可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(4)光照培养：当暗培养的培养基上长出白色菌丝后，在十万级净化条件下，将培养室置于光照条件下进行培养，逐渐生成蛹虫草子实体，在培养过程中进行消毒灭菌；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(5)蛹虫草子实体采收：将培养完成的人工蛹虫草子实体收集。
进一步地，所述的培养基中大米、黄豆粉、水、番茄汁和无机盐的质量体积比为750g:(20-40)g:(900-1000)ml:(50-100)ml:(1-2)g；所述的蛹虫草菌液与大米的体积质量比为(80-90)ml:750g。番茄汁本身具有一定的酸性，可以自主调节培养基中的pH值，达到5.5左右，这样一来，在虫草子实体培养的过程中可以抑制杂菌的生长，比如芽孢杆菌等，又可以给虫草子实体本身提供足够的营养物质，例如各种维生素，可以将光培养周期缩减至20-22天，提高了产能。
进一步地，所述的无机盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰中的一种或多种。无机盐的品种和比例也非常重要。
进一步地，所述的磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰的质量浓度之比为(2-3):(0.2-0.4):(0.03-0.05)。
进一步地，所述的灭菌方式包括湿热灭菌，湿热灭菌的温度为125-130℃，压力为0.1-0.2MPa，时间为35-40min；所述的暗培养的温度为18-20℃，空气相对湿度为60-75％，时间为5-6天。
进一步地，所述的光照培养的光源的波长为400-750nm。
进一步地，所述的光照培养的光源的波长为510-550nm。光源影响了菌株有性世代和无性世代的转化、生命周期以及生长发育，在番茄汁的存续下，不同波长的光源蕴含着不同种类的电磁波辐射，只有一定范围内波长的光源才能激发番茄汁的全部潜能，促进菌株生长，提高相应提高代谢产物的产量，达到产能和品质的协同提升。
进一步地，所述的光照培养的光照强度为200-1200lux，温度为20-23℃，空气相对湿度65-75％，光照时长为8-9h/天，培养时间为20-22天。
进一步地，所述的光照培养的光照强度为400-800lux。距离光源远的区域光照度弱，在光源正下方离光源近区域光照度强。
一种如上所述的方法培养的人工蛹虫草子实体，该蛹虫草子实体中虫草素含量可达4.24ωt％，虫草多糖含量可达19.93ωt％。含量均为不含水分的干重含量。
该蛹虫草子实体中虫草素含量为1.10-4.24ωt％，优选为4.05-4.24ωt％，腺苷含量为0.12-0.17ωt％，虫草多糖含量为15.00-19.93ωt％，优选为17.42-19.93ωt％。含量均为不含水分的干重含量。若活性成分虫草素和虫草多糖的含量不够，会导致药用作用，尤其是提高机体免疫力和抗疲劳的作用不明显，若是活性成分虫草素和虫草多糖的含量过高，超出合理范围，也会在治疗过程中产生负作用，影响疗效。因此本发明的活性成分含量需要在合理范围内。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明在培养基的配制时采用了湿热灭菌，有助于杂菌的消灭，避免后期的培养过程中影响蛹虫草的品质；
(2)本发明在培养基中加入了无机盐，内含许多微量元素，有助于蛹虫草后期的光照培养，有利于蛹虫草品质和产量的提升；
(3)本发明培养基中的黄豆和大米的比例恰到好处，有利于蛹虫草达到高虫草素含量、高虫草多糖含量以及高腺苷含量；
(4)在培养基中非常有特色地加入了番茄汁等营养成分，不仅可以促进虫草子实体的生长，还可以调节pH值，排出杂菌，提高产品质量；
(5)本发明在光照培养时，利用特定波长的光源和光照强度，在光照培养时促使虫草素、虫草多糖含和腺苷产生，进而达到高虫草素含量、高虫草多糖含量以及高腺苷含量的目的，进而在抗肿瘤、抗菌抗病毒、耐缺氧、抗疲劳和调节心肺等领域具有巨大的价值。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种人工蛹虫草子实体的培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)培养基的配制：在一万级净化条件下，每盒培养基中包括750g大米、30g黄豆粉、950ml水、75ml番茄汁和1g无机盐，经125-130℃，压力为0.1-0.2MPa，时间为35-40min湿热灭菌后，形成培养基；大米主要提供碳源、黄豆粉主要提供氮源、无机盐提供微量元素；无机盐为磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰的质量浓度之比为(2-3):(0.2-0.4):(0.03-0.05)；此步操作中，灭菌还可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒，配制操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(2)菌丝接种：在百级净化条件下，将蛹虫草菌液接种至培养基中，菌液接种量为85ml/盒；此步操作中，灭菌可以采用75％乙醇喷洒擦拭，接种操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(3)暗培养：在十万级净化条件下，将接种菌丝后的培养基放置于培养室，在避光条件下进行培养，暗培养的温度为18-20℃，空气相对湿度为60-75％，时间为5-6天；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(4)光照培养：当暗培养的培养基上长出白色菌丝后，在十万级净化条件下，将培养室置于光照条件下进行培养，逐渐生成蛹虫草子实体；光源波长为510-530nm、光照强度为600lux，温度为21-23℃，空气相对湿度65-75％，光照时长为8-9h/天，培养时间为20-22天；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(5)蛹虫草子实体采收：将培养完成的人工蛹虫草子实体收集。
将本实施例中蛹虫草子实体进行耐缺氧和急性肝损伤保护试验，证明其药用价值，具体如下：
一、蛹虫草子实体对小鼠常压耐缺氧试验
1.试验方法
选择小鼠50只，随机分组并开始给药，蛹虫草子实体设三个剂量组(1000、500、250mg/kg)，另设正常动物组，连续给药14天，在末次给药后1小时进行常压耐缺氧试验。将各组受试小鼠分别放人250ml无色透明密闭的广口瓶内，每个瓶内放入10克钠石灰，自放入小鼠进密闭瓶内开始计时，直至呼吸停止。计算小鼠平均存活时间，比较给药组与溶剂对照组之间差异的显著性。
2.试验结果
蛹虫草子实体1000、500、250mg/kg小鼠的平均存活时间为37.29、35.12和31.86(分)，存活时间延长率分别为39.14、31.04和18.89％，经统计处理表明，蛹虫草高、中剂量组的小鼠平均存活时间与对照组比较差异显著(p<0.01)，低剂量组的小鼠平均存活时间比对照组有差异(p>0.05)。小鼠平均存活时间与对照组比较差异显著(p<0.01)，具体如下表：
蛹虫草子实体对正常小鼠常压耐缺氧的影响，x±SD
与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01
3.试验结论
试验结果表明，蛹虫草子实体1000、500、250mg/kg剂量对小鼠在常压下有耐缺氧作用，能增强机体非特异性抵抗能力，中高剂量与对照组比较，有显著差异。
二、蛹虫草子实体对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护试验
1.试验方法
选用健康小鼠70只，雄性，随机分为7组，每组10只。蛹虫草子实体设三个剂量组(1000、500、250mg/kg)，另设模型组(NS)和正常动物组，蛹虫草子实体和模型组(NS)连续给药14天，除正常动物组外，其他组小鼠末次给药后即刻腹腔注射CCl4油溶液(0.15％，10ml/kg)。
于注射CCl4后21小时全部受试动物摘眼球采血，分离血清，测定血清ALT和AST。计算平均数，比较给药组和对照组之间差异的显著性。
2.试验结果
正常组10个小鼠肝脏均正常，造模组10个动物肝脏发白，纹理变粗，边缘增厚。蛹虫草子实体三个剂量组的动物肝脏基本正常，与正常组小鼠肝脏无明显差异。
正常对照组小鼠ALT为28.60，造模组为101.40，给予北冬虫夏草子实体1000、500、250mg/kg的小鼠ALT分别为61.34、67.44、87.42，缓解率分别为39.51％、33.49％、13.79％。
正常对照组小鼠AST为65.48，造模组为110.21，给予蛹虫草子实体1000、500、250mg/kg的小鼠AST分别为95.32、101.48、106.42，缓解率分别为13.51％、7.92％、3.44％。
病理组织学检查发现，模型组动物肝细胞轻度浊肿，可见单个肝细胞坏死和炎症细胞局灶性浸润；蛹虫草子实体各组动物肝细胞变性程度明显轻于模型组，炎症细胞浸润不明显，具体结果见下表：
蛹虫草子实体对CCl4引起的小鼠急性肝损伤的影响，x±SD
与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01
3.试验结论
试验结果表明，蛹虫草子实体1000、500、250mg/kg剂量能明显对CCl4诱发的小鼠肝脏ALT、AST升高有一定的降低作用，试验结果表明蛹虫草子实体对CCl4所致小鼠急性肝损伤有一定的保护作用。
实施例2
与实施例1不同之处在于，光照培养的光源波长为400-750nm。
实施例3
与实施例1不同之处在于，光照培养的光源波长为530-550nm。
实施例4
与实施例1不同之处在于，光照培养的光源波长为550-600nm。
实施例5
与实施例1不同之处在于，光照培养的光源波长为600-750nm。
实施例6
与实施例1不同之处在于，光照培养的光源波长为400-510nm。
实施例7
与实施例1不同之处在于，光照培养的光源波长为450-700nm。
实施例8
与实施例1不同之处在于，光照培养的光照强度为200lux。
实施例9
与实施例1不同之处在于，光照培养的光照强度为400lux。
实施例10
与实施例1不同之处在于，光照培养的光照强度为800lux。
实施例11
与实施例1不同之处在于，光照培养的光照强度为1000lux。
实施例12
与实施例1不同之处在于，光照培养的光照强度为1200lux。
对比例1
与实施例1不同之处在于，光照培养的光照强度为150lux。
对比例2
与实施例1不同之处在于，培养基的配制时省略净化过程。
对比例3
与实施例1不同之处在于，培养基的配制时不加入无机盐。
实施例13
与实施例1不同之处在于，培养基中番茄汁的体积为50ml。
实施例14
与实施例1不同之处在于，培养基中番茄汁的体积为100ml。
对比例4
与实施例1不同之处在于，培养基中番茄汁的体积为30ml。
对比例5
与实施例1不同之处在于，培养基中番茄汁的体积为120ml。
实施例1-7的培养结果如表1所示，通过调整光的波长来改变光源，并保持其他参数不变。从结果中看出，以虫草素含量作为第一参考，虫草多糖含量作为第二参考，单盒干重作为第三参考，光源波长范围为510-550nm时，虫草子实体的培养效果最佳，其他波长的光源培养效果稍差，但依然比现有技术优越，需要注意的是，利用宽波长范围的光的培养效果也无法达到最佳，这意味着虫草子实体的培养与光源波长的关系确实是密不可分的。
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | |
| 单盒干重/g·盒<sup>-1</sup> | 55.1 | 58.4 | 55.7 | 53.2 | 55.4 | 56.1 | 54.0 |
| 虫草素含量/ωt％ | 4.18 | 2.06 | 4.12 | 2.66 | 2.18 | 2.33 | 2.10 |
| 腺苷/ωt％ | 0.15 | 0.15 | 0.16 | 0.16 | 0.18 | 0.17 | 0.17 |
| 虫草多糖/ωt％ | 19.93 | 17.42 | 17.54 | 19.31 | 18.36 | 18.85 | 19.33 |
实施例1、8-12，对比例1的培养结果如表2所示，通过调整光源离培养基的距离来改变光强，并保持其他参数不变。从结果中看出，以虫草素含量作为第一参考，虫草多糖含量作为第二参考，单盒干重作为第三参考，光照强度在200lux以下时，培养难以进展，产量很低，到达400lux时，产量出现突破性的提升，再提升光照强度，会使培养温度上升，不利于培养，也提高了培养成本。
表2
| 实施例1 | 实施例8 | 实施例9 | 实施例10 | 实施例11 | 实施例12 | 对比例1 | |
| 单盒干重/g·盒<sup>-1</sup> | 55.1 | 50.2 | 52.4 | 53.5 | 56.1 | 54.0 | 34.0 |
| 虫草素含量/ωt％ | 4.18 | 4.15 | 4.24 | 4.16 | 3.07 | 3.18 | 1.44 |
| 腺苷/ωt％ | 0.15 | 0.16 | 0.15 | 0.16 | 0.15 | 0.16 | 0.17 |
| 虫草多糖/ωt％ | 19.93 | 18.42 | 19.31 | 18.36 | 17.93 | 17.98 | 16.42 |
实施例1和对比例2-3的培养结果如表3所示，从结果中看出，对比例2没有经过净化的培养基，在培养过程中有许多杂菌引入，影响了产量，更影响了产品质量，表明了净化的重要性。对比例3中未加入无机盐，未引入微量元素，虽然产量影响不大，但对于活性成分的含量影响巨大。
表3
| 实施例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
| 单盒干重/g·盒<sup>-1</sup> | 55.1 | - | 55.7 |
| 虫草素含量/ωt％ | 4.18 | 1.10 | 1.59 |
| 腺苷/ωt％ | 0.15 | 0.12 | 0.13 |
| 虫草多糖/ωt％ | 19.93 | 16.35 | 16.78 |
实施例1、13-14，对比例4-5的培养结果如表4所示，通过调整番茄汁的体积来改变培养基中的成分，并保持其他参数不变。从结果中看出，以虫草素含量作为第一参考，虫草多糖含量作为第二参考，单盒干重作为第三参考，番茄汁过多，虽然营养成分足够，但会导致培养基中pH值严重下降，影响了培养效果，番茄汁太少，不仅营养成分不足，还无法降低pH值，阻碍了活性成分的合成也无法排除杂菌干扰。
表4
| 实施例1 | 实施例13 | 实施例14 | 对比例4 | 对比例5 | |
| 单盒干重/g·盒<sup>-1</sup> | 55.1 | 55.4 | 53.2 | 56.1 | 54.0 |
| 虫草素含量/ωt％ | 4.18 | 4.07 | 4.05 | 1.61 | 1.85 |
| 腺苷/ωt％ | 0.15 | 0.12 | 0.13 | 0.12 | 0.13 |
| 虫草多糖/ωt％ | 19.93 | 17.42 | 18.85 | 16.54 | 16.85 |
在实施例1-14中，由于每个步骤均严格执行了灭菌、净化步骤，使得实施例的产品能够达到色泽、气味和形状均质美观，杂质少，有害成分含量低，杂菌少等一系列优点，具体指标如表5所示：
表5本发明虫草子实体性能指标
Claims (10)
1.一种人工蛹虫草子实体的培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)培养基的配制：在一万级净化条件下，将大米、黄豆粉、水、番茄汁和无机盐混合，经灭菌后，形成培养基；
(2)菌丝接种：在百级净化条件下，将蛹虫草菌液接种至培养基中；
(3)暗培养：在十万级净化条件下，将接种蛹虫草菌液后的培养基放置于培养室，在避光条件下进行培养，在培养过程中进行消毒灭菌；
(4)光照培养：当暗培养的培养基上长出白色菌丝后，在十万级净化条件下，将培养室置于光照条件下进行培养，逐渐生成蛹虫草子实体，在培养过程中进行消毒灭菌；
(5)蛹虫草子实体采收：将培养完成的人工蛹虫草子实体收集。
2.根据权利要求1所述的一种人工蛹虫草子实体的培养方法，其特征在于，所述的培养基中大米、黄豆粉、水、番茄汁和无机盐的质量体积比为750g:(20-40)g:(900-1000)ml:(50-100)ml:(1-2)g；所述的蛹虫草菌液与大米的体积质量比为(80-90)ml:750g。
3.根据权利要求1所述的一种人工蛹虫草子实体的培养方法，其特征在于，所述的无机盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁或硫酸锰中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种人工蛹虫草子实体的培养方法，其特征在于，所述的无机盐为磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，所述的磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰的质量浓度之比为(2-3):(0.2-0.4):(0.03-0.05)。
5.根据权利要求1所述的一种人工蛹虫草子实体的培养方法，其特征在于，所述的灭菌方式包括湿热灭菌，湿热灭菌的温度为125-130℃，压力为0.1-0.2MPa，时间为35-40min；所述的暗培养的温度为18-20℃，空气相对湿度为60-75％，时间为5-6天。
6.根据权利要求1所述的一种人工蛹虫草子实体的培养方法，其特征在于，所述的光照培养的光源的波长为400-750nm。
7.根据权利要求6所述的一种人工蛹虫草子实体的培养方法，其特征在于，所述的光照培养的光源的波长为510-550nm。
8.根据权利要求1所述的一种人工蛹虫草子实体的培养方法，其特征在于，所述的光照培养的光照强度为200-1200lux，温度为20-23℃，空气相对湿度65-75％，光照时长为8-9h/天，培养时间为20-22天。
9.根据权利要求8所述的一种人工蛹虫草子实体的培养方法，其特征在于，所述的光照培养的光照强度为400-800lux。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的方法培养的蛹虫草子实体，其特征在于，该人工蛹虫草子实体中虫草素含量可达4.24ωt％，虫草多糖含量可达19.93ωt％。
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