CN112126590A - 一种细胞贴壁微载体接种装置及接种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞贴壁微载体接种装置及接种方法，其中方法包括：接种装置进行微载体细胞接种具体包括以下步骤：1、接种装置灭菌；2、接种装置预热；3、接种前准备；4、过滤堆积微载体细胞；5、过滤灌流过程；6、收获接种后的微载体；然后经过这6个步骤获得微载体/细胞。采用本发明的技术方案：消除了接种过程的空球率，采用双泵+同轴滤网结构装置：双泵混匀细胞/微载体按比例接触，相同浓度比例的细胞和微载体在滤网堆积，形成微载体堆积埋压细胞，实现细胞按比例接种微载体。
Description
技术领域
本发明涉及微载体接种工艺装置技术领域，尤其涉及的是，一种细胞贴壁微载体接种装置及接种方法。
背景技术
新冠疫情需要海量贴壁细胞生产的灭活疫苗，急需放大的微载体接种工艺装置。目前新冠病毒SARS-CoV2灭活疫苗国内已有四家批准临床研究，临床试验结果证明新冠灭活疫苗安全性和有效性，为适应将来全球使用降低生产成本，生产工艺需要突破细胞培养密度和病毒产量瓶颈。国内灭活新冠疫苗均使用VERO-E6细胞培养扩增新冠病毒，VERO-E6细胞是贴壁工程细胞，生长需要贴壁载体，大规模生产需要使用微载体高密度灌流培养方式。如何提高细胞密度，延长细胞存活时间，提高病毒生产效率，是新冠灭活疫苗最紧急任务。VERO细胞微载体悬浮培养可以生产十几种疫苗，是国际上疫苗贴壁培养主流生产方式，法国巴斯德十几年前成功放大VERO细胞微载体流感疫苗3000L/批规模。国内辽宁成大VERO细胞微载体灌流工艺生产狂犬疫苗至今仍是全国最大狂犬疫苗生产厂家,但成大的微载体反应器体积没有超过40升。微载体是表面带正电荷的150-180um透明微球，比重比细胞略重，在反应器中细胞粘附在微载体上，共同悬浮培养；1g微载体具有6.8x106个微球，4400cm2/g表面积，最高密度可达20g/L，每升培养体积提供8.8m2的贴附面积(40层细胞工厂面积2.6m2需要培养基5-8升)，球状微载体是各种贴壁培养方式中，能提供表面积最大的培养方式，即最高细胞密度最高产能的方式；VERO细胞球状微载体反应器悬浮培养具有搅拌均匀，传质传热传气均匀迅速高效，微载体还具有易于取样在普通显微镜下观察细胞生长状态和消化计数细胞等优点，是满足全球新冠疫苗产能的最高效的培养方式。微载体培养的难点在于细胞接种均匀度，微载体在悬浮搅拌状态下，受剪切力和微载体互相碰撞的影响，种子细胞不易粘附到微载体表面，所以生产中发现有的微载体上长满了细胞，而有的微载体还是空球(微载体上没有细胞贴附)；原因在于细胞接种时，种子细胞与微载体分配不均匀，悬浮运动状态下，种子细胞接触微载体时间短粘附不牢，容易脱落；常规细胞接种微载体多采用间歇静置/搅拌方式，希望细胞与微载体粘附和分布均匀。但由于微载体比细胞沉降速度稍快，往往微载体先沉，细胞后沉在微载体表面层，导致上层的微载体上有大量细胞接触，而深沉的微载体没有或很少有细胞贴附，停止搅拌时间长，沉积微载体中的细胞易缺氧，停止了搅拌反应器温度也不均匀，不利于细胞生长；而连续温和搅拌，慢了微载体沉底快了细胞悬浮碰撞微载体，导致接种不匀。
由于微载体细胞接种均匀度，悬浮培养剪切力导致细胞脱落等工艺解决不好，现在国内最大微载体培养反应器体积没有超过300L，大大限制了国内疫苗的产量和成本，制约新冠灭活疫苗的生产规模，亟待解决。
发明内容
本发明提供一种细胞贴附微载体接种装置，可以解决VERO细胞均匀贴壁微载体，为大规模生物反应器提供贴壁均匀的种子细胞微载体，还可以应用于细胞接种病毒产生的病变后，解决细胞从微载体上脱落的问题，延长病毒扩增时间大大增加疫苗生产能力和效率。
本发明的技术方案如下：一种细胞贴壁微载体接种装置，同轴两层滤网设置在不锈钢外壳中，同轴两层滤网包括：同轴的外滤网筒及中心滤芯；不锈钢底盖上设置有两个进出口，不锈钢底盖的正中是中心滤芯的进出口，不锈钢底盖侧方是微载体/细胞进出口；不锈钢顶端有灌流进出口；：将不锈钢外壳挂在支架上，不锈钢底盖朝上固定，先放外滤网筒；再将杆状烛式滤芯拧在不锈钢底盖上；杆状烛式滤芯朝下，不锈钢底盖盖在外滤网筒和不锈钢外壳上，使用螺丝密封，翻转不锈钢外壳使不锈钢外壳的整体竖立。
上述中，所述不锈钢外壳设置360度上下翻转，便于安装及拆卸同轴两层滤网。
上述中，所述外滤网筒的滤网采用80-100um不锈钢网，外滤网筒为带有支撑架直径30cm，高45cm的上开口滤网筒，体积为31升，滤网面积超过5000cm2；外滤网筒的开口处有一圈不锈钢圈。
上述中，中芯滤芯使用杆状烛式滤芯，直径3cm，长度40cm，孔径80um；通过顶端螺丝固定在不锈钢底盖的中心。
本发明提供的另一种方案为一种细胞贴壁微载体接种方法，具体包括以下步骤：
步骤1：接种装置灭菌；磷酸盐缓冲液清洗后的接种装置的不锈钢底盖连接三条进出液蠕动泵管，蠕动泵管末端有无菌接头，无菌接头再用锡箔+纱布包裹一起置于高压灭菌锅中灭菌；
步骤2：接种装置预热；用预热37度10％血清培养液通过灌流进出口充满接种装置；
步骤3：接种前准备；微载体提前8小时用含10％小牛血清培养液换液浸泡，接种前预热到37度；12个40层细胞工厂胰酶消化，摇晃收集细胞并用含血清培养液中和；混匀取样计数细胞浓度，调整微载体培养液体积与细胞液相同，准备接种；使用双泵头蠕动泵，分别连接细胞液和微载体储存袋泵后细胞液与微载体三通混合，混合液连接到接种装置微载体/细胞进口，双泵头蠕动泵输出流速6升/分，即细胞液流速3L/min，微载体培养液流速3L/min；
步骤4：过滤堆积微载体细胞；微载体/细胞混合液从细胞接种筒底部微载体/细胞进出口进入外滤网筒及中芯滤芯之间，滤出液从中心芯网口和灌流进出口排出收集，再从灌流进出口外向内打入同轴的外滤网筒及中心滤芯中补充；
步骤5：过滤灌流过程；关闭微载体/细胞进出口，从外壳顶端的灌流进出口灌入新鲜培养液，从中心滤芯的进出口流出代谢废物；
步骤6：收获接种后的微载体；打开微载体/细胞进出口连接的300L细胞反应器,从外壳顶端灌流进出口7和中心滤芯6的进出口4交替进液，6L/min泵入100L新鲜培养基，将同轴两层滤网中的微载体/细胞洗出接种器。
采用本发明的技术方案：1、消除接种过程的空球率，采用双泵+同轴滤网结构装置：双泵混匀细胞/微载体按比例接触，相同浓度比例的细胞和微载体在滤网堆积，形成微载体堆积埋压细胞，实现细胞按比例接种微载体，随后从外网向中心径向过滤灌流补液，细胞静止不动，也可以获得溶氧和养料带走代谢废物，便于粘附细胞贴壁伸展4-8小时，同轴双层滤网上下通透结构便于接种好细胞的微载体切向流冲入细胞反应器，进行下一步细胞贴附微载体全悬浮培养，同轴双层滤网还可以作为反应器灌流培养中的微载体截留装置，用于换液以及最后消化细胞截留微载体装置。2、为避免大体积消化好的种子细胞等待时间太久，细胞聚集和缺氧，需要快速堆积微载体：设计双层筒状滤网结构增大过滤面积，提高微载体堆积流速，减少种子细胞等待过滤时间。3、防止细胞堆积状态缺氧，径向过滤灌流便于细胞贴壁伸展4-8Hr：细胞微载体堆积在同轴双层滤网中间，从外网向中心管径向过滤灌流，横截面微载体堆积成楔状梯形结构，随着新鲜培养液从外向内，楔形逐渐收窄，有效浓度提高，解决了中心深层细胞溶氧缺乏问题。4、解决卸渣后微载体残留滤器问题：筒状同轴双层滤网结构，两层滤网间上下畅通没有死角，细胞贴壁4-8hr后培养液反冲，将所有微载体切向流冲入细胞反应器。同轴双层滤网还可以作为细胞反应器灌流连续换液以及作为更大n-1反应器的种子细胞制备装置，消化细胞截留微载体装置。细胞微载体比例堆积包埋接种，过滤灌流持续换液保证细胞静止贴壁伸展，实现微载体上细胞均匀度，提高微载体培养工艺稳定性和培养生产效率；细胞在微载体球间分布均匀，提高细胞培养周期一致性，工艺稳定性,实现VERO微载体病毒疫苗生产放大可行性，提高生产效率和工艺稳定性，减低生产成本。
附图说明
图1为本发明一个实施例的示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一个实施例是，本发明提供一种细胞贴附微载体接种装置，可以解决VERO细胞均匀贴壁微载体，为大规模生物反应器提供贴壁均匀的种子细胞微载体，还可以应用于细胞接种病毒产生的病变后，解决细胞从微载体上脱落的问题，延长病毒扩增时间大大增加疫苗生产能力和效率。
细胞接种微载体粘附是一个多步骤的过程，包括最初细胞与微载体表面的接触，细胞在微载体表面的伸展，以及细胞的生长和扩增分裂。常规反应器细胞接种微载体方式，依靠微载体表面带有正电，微载体吸附细胞，间歇静置状态由于细胞微载体比重不同，停止搅拌后，微载体先沉降，细胞后沉降造成表层的微载体吸附大量细胞，而深处的微载体接触不到细胞，一旦搅拌，贴附不牢的细胞又脱落了，超过一定时间，种子细胞就不再贴附微载体随后死亡，这就造成细胞微载体不均匀，所以培养工艺有接种空球率指标，接种时不均匀，连续搅拌细胞悬浮碰撞4小时后就无法再贴附。如果反应器开始时微载体是空球，培养结束时也是空球，大大影响了微载体悬浮培养工艺的生产效率和稳定性。
为培养体积300L细胞反应器，制备3-5g/L微载体Cytodex1接种装置
1微载体Cytodex1 1500g,溶胀后体积27L
参数：1g Cytodex1微载体面积4400cm^2/g,溶胀后体积18ml/g，每克含有6.8X10^6微载体，
一般反应器微载体浓度3-10g/L,通常采用3-5g/L
推荐接种细胞浓度4000细胞/cm2，相当于2-3cell/微载体
设定微载体CYTODEX1 5g/L微载体体积90ml/L，面积2.2m^2/L
设计每个微载体接种3个细胞，一升需要3X(5X6.8X10^6)＝1.02X10^8种子细胞
一升反应器5g微载体/L需要种子细胞1E8Cell
100升5g/L需要种子细胞1E10cell,如此多的种子细胞需要4个2.5m2的40层细胞工厂提供
300升的5g/L反应器，需要3E10cell,相当于12个40层细胞工厂提供80L细胞密度约4E5 cell/ml种子细胞液。
制备微载体储存液：微载体经过等渗缓冲液溶胀，121度高压灭菌后1500gCytodex1体积为27升，微载体个数1.02E10，也浸泡于80L含10％牛血清培养液，目标是3细胞对应1个微载体。一种细胞贴附微载体接种装置，同轴两层滤网设置在不锈钢外壳1中，不锈钢外壳1可以360度上下翻转，便于安装及拆卸同轴两层滤网，同轴两层滤网包括：同轴的外滤网筒5及中心滤芯6；不锈钢底盖2上设置有两个进出口，不锈钢底盖2的正中是中心滤芯6的进出口4，不锈钢底盖2侧方是微载体/细胞进出口3；不锈钢顶端有灌流进出口7。
外滤网筒5的滤网采用80-100um不锈钢网，外滤网筒5为带有支撑架的直径30cm，高45cm的上开口滤网筒，体积为31升，滤网面积超过5000cm2,有利于高速过滤堆积微载体/细胞，30分钟完成微载体过滤堆积/细胞填埋接种，接种速度超过6L/min。保证160升消化好的细胞和微载体能够在短时间接种，防止已消化的细胞缺氧和结团。外滤网筒5的开口处有一圈不锈钢圈。
中芯滤芯6使用杆状烛式滤芯，直径3cm，长度40cm，孔径80um。通过顶端螺丝固定在不锈钢底盖2的中心。微载体/细胞堆积接种后，从外滤网筒5向中心滤芯6径向过滤灌流，径向过滤方式营养液经过的路径相同，从外向内楔形结构，保证微载体上的细胞获得充足溶氧、养料带走代谢废物。
安装时：将不锈钢外壳1挂在支架上，不锈钢底盖2朝上固定。先放外滤网筒5；再将杆状烛式滤芯6拧在不锈钢底盖2上；杆状烛式滤芯6朝下，不锈钢底盖2盖在外滤网筒5和不锈钢外壳上1，使用螺丝密封，翻转不锈钢外壳1使不锈钢外壳1的整体竖立。
运行状态：不锈钢底盖2朝下,接种时由下向上将微载体/细胞充满外滤网筒5及中芯滤芯6之间，接种完从外滤网筒5向中心滤芯6过滤灌流；收获时反冲微载体/细胞脱落外滤网筒5，从下卸出。
接种装置进行微载体细胞接种的方法，具体包括以下步骤：1、接种装置灭菌；2、接种装置预热；3、接种前准备；4、过滤堆积微载体细胞；5、过滤灌流过程；6、收获接种后的微载体；
接种装置灭菌：磷酸盐缓冲液清洗后的接种装置的不锈钢底盖2连接三条进出液蠕动泵管，蠕动泵管末端有无菌接头，无菌接头再用锡箔+纱布包裹一起置于高压灭菌锅中灭菌。
接种装置预热:用预热37度10％血清培养液通过灌流进出口7充满接种装置。
接种前准备：微载体提前8小时用含10％小牛血清培养液换液浸泡，接种前预热到37度；12个40层细胞工厂胰酶消化，摇晃收集细胞并用含血清培养液中和。混匀取样计数细胞浓度，调整微载体培养液体积与细胞液相同，准备接种。(通过细胞计数调整微载体体积，达到细胞：微载体个数比为3：1实现每个微载体上有3-5个种子细胞。)使用双泵头蠕动泵，分别连接细胞液和微载体储存袋(袋中有搅拌器，防止沉淀)泵后细胞液与微载体三通混合(3个细胞与1个微载体球混合接触并粘附)，混合液连接到接种装置微载体/细胞进口3，一般情况下细胞和微载体培养液体积接近160升左右，双泵头蠕动泵输出流速6升/分，即细胞液流速3L/min，微载体培养液流速3L/min。所有细胞+微载体共160升培养液1500g微载体，半小时内打入接种外滤网筒5及中芯滤芯6之间。
过滤堆积微载体细胞：微载体/细胞混合液从细胞接种筒底部微载体/细胞进出口3进入外滤网筒5及中芯滤芯6之间，滤出液从中心芯网口4和灌流进出口7排出收集。6升/min流速在5000cm2中心滤芯6内的外滤网筒5上形成涂敷力，微载体被截留在滤网表面形成密集涂层，随后细胞/微载体逐层堆积，细胞被埋压在微载体表面，强制细胞静态吸附，解决了悬浮贴壁细胞易脱落问题。滤层刚形成时，透出滤网培养液带有少量细胞，收集的透出液可以在微载体/细胞过滤堆积后，再从灌流进出口7外向内打入同轴的外滤网筒5及中心滤芯6中补充。
过滤灌流过程：关闭微载体/细胞进出口3，从外壳顶端的灌流进出口7灌入新鲜培养液，从中心滤芯6的进出口4流出代谢废物。流速1L/min持续8小时，实现细胞完成贴壁并充分伸展。细胞埋压在微载体中贴壁3E10cell/27L微载体，1E6cell/ml，此时的细胞体积密度很高，几乎是收获时的细胞密度；细胞密度高的好处是解决了悬浮培养接种细胞数量少，细胞不易生长、静止期长、易脱落的问题，缺点是，细胞密度高，细胞需要的溶氧和养料多，所以需要径向过滤灌流，提供新鲜培养基，外滤网筒5及中芯滤芯6的截面楔形结构，外向内径向体积变小，保证了内层细胞也可以获得充足的氧气营养，带走废物。
收获接种后的微载体：打开微载体/细胞进出口3连接的300L细胞反应器,从外壳顶端灌流进出口7和中心滤芯6的进出口4交替进液，6L/min泵入100L新鲜培养基，将同轴两层滤网中的微载体/细胞洗出接种器。
结果：经生产测试，使用细胞微载体接种装置接种VERO细胞，细胞收获时微载体空球率由间歇搅拌接种方式的10-20％减少到<5％,提高了10％生产效率，微载体细胞均匀度大为提高，利用后期病毒接种。
采用本发明的技术方案：1、消除接种过程的空球率，采用双泵+同轴滤网结构装置：双泵混匀细胞/微载体按比例接触，相同浓度比例的细胞和微载体在滤网堆积，形成微载体堆积埋压细胞，实现细胞按比例接种微载体，随后从外网向中心径向过滤灌流补液，细胞静止不动，也可以获得溶氧和养料带走代谢废物，便于粘附细胞贴壁伸展4-8小时，同轴双层滤网上下通透结构便于接种好细胞的微载体切向流冲入细胞反应器，进行下一步细胞贴附微载体全悬浮培养，同轴双层滤网还可以作为反应器灌流培养中的微载体截留装置，用于换液以及最后消化细胞截留微载体装置。2、为避免大体积消化好的种子细胞等待时间太久，细胞聚集和缺氧，需要快速堆积微载体：设计双层筒状滤网结构增大过滤面积，提高微载体堆积流速，减少种子细胞等待过滤时间。3、防止细胞堆积状态缺氧，径向过滤灌流便于细胞贴壁伸展4-8Hr：细胞微载体堆积在同轴双层滤网中间，从外网向中心管径向过滤灌流，横截面微载体堆积成楔状梯形结构，随着新鲜培养液从外向内，楔形逐渐收窄，有效浓度提高，解决了中心深层细胞溶氧缺乏问题。4、解决卸渣后微载体残留滤器问题：筒状同轴双层滤网结构，两层滤网间上下畅通没有死角，细胞贴壁4-8hr后培养液反冲，将所有微载体切向流冲入细胞反应器。同轴双层滤网还可以作为细胞反应器灌流连续换液以及作为更大n-1反应器的种子细胞制备装置，消化细胞截留微载体装置。细胞微载体比例堆积包埋接种，过滤灌流持续换液保证细胞静止贴壁伸展，实现微载体上细胞均匀度，提高微载体培养工艺稳定性和培养生产效率；细胞在微载体球间分布均匀，提高细胞培养周期一致性，工艺稳定性,实现VERO微载体病毒疫苗生产放大可行性，提高生产效率和工艺稳定性，减低生产成本。
需要说明的是，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；并且，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种细胞贴壁微载体接种装置，其特征在于，同轴两层滤网设置在不锈钢外壳中，同轴两层滤网包括：同轴的外滤网筒及中心滤芯；不锈钢底盖上设置有两个进出口，不锈钢底盖的正中是中心滤芯的进出口，不锈钢底盖侧方是微载体/细胞进出口；不锈钢顶端有灌流进出口；将不锈钢外壳挂在支架上，不锈钢底盖朝上固定，先放外滤网筒；再将杆状烛式滤芯拧在不锈钢底盖上；杆状烛式滤芯朝下，不锈钢底盖盖在外滤网筒和不锈钢外壳上，使用螺丝密封，翻转不锈钢外壳使不锈钢外壳的整体竖立。
2.如权利要求1所述的接种装置，其特征在于，所述不锈钢外壳设置360度上下翻转，便于安装及拆卸同轴两层滤网。
3.如权利要求1所述的接种装置，其特征在于，所述外滤网筒的滤网采用80-100um不锈钢网，外滤网筒为带有支撑架直径30cm，高45cm的上开口滤网筒，体积为31升，滤网面积超过5000cm2；外滤网筒的开口处有一圈不锈钢圈。
4.如权利要求1所述的接种装置，其特征在于，中芯滤芯使用杆状烛式滤芯，直径3cm，长度40cm，孔径80um；通过顶端螺丝固定在不锈钢底盖的中心。
5.一种细胞贴壁微载体接种方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1：接种装置灭菌；磷酸盐缓冲液清洗后的接种装置的不锈钢底盖连接三条进出液蠕动泵管，蠕动泵管末端有无菌接头，无菌接头再用锡箔+纱布包裹一起置于高压灭菌锅中灭菌；
步骤2：接种装置预热；用预热37度10％血清培养液通过灌流进出口充满接种装置；
步骤3：接种前准备；微载体提前8小时用含10％小牛血清培养液换液浸泡，接种前预热到37度；12个40层细胞工厂胰酶消化，摇晃收集细胞并用含血清培养液中和；混匀取样计数细胞浓度，调整微载体培养液体积与细胞液相同，准备接种；使用双泵头蠕动泵，分别连接细胞液和微载体储存袋泵后细胞液与微载体三通混合，混合液连接到接种装置微载体/细胞进口，双泵头蠕动泵输出流速6升/分，即细胞液流速3L/min，微载体培养液流速3L/min；
步骤4：过滤堆积微载体细胞；微载体/细胞混合液从细胞接种筒底部微载体/细胞进出口进入外滤网筒及中芯滤芯之间，滤出液从中心芯网口和灌流进出口排出收集，再从灌流进出口外向内打入同轴的外滤网筒及中心滤芯中补充；
步骤5：过滤灌流过程；关闭微载体/细胞进出口，从外壳顶端的灌流进出口灌入新鲜培养液，从中心滤芯的进出口流出代谢废物；
步骤6：收获接种后的微载体；打开微载体/细胞进出口连接的300L细胞反应器,从外壳顶端灌流进出口7和中心滤芯6的进出口4交替进液，6L/min泵入100L新鲜培养基，将同轴两层滤网中的微载体/细胞洗出接种器。
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