CN1110552C - 一种体外扩增造血干细胞的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种体外扩增造血干细胞的方法，是对现有的一次性扩增方法的改进，也就是将其扩增前干细胞总数分成N等份，分N批次加入，每批扩增一周，半数收集干细胞冻存，再补入一份扩增前干细胞和补足新鲜培养液后继续扩增，如此反复，直至第N批扩增后全数收集细胞并液氮冻存。本法能提高有效造血干细胞的数量和质量，在临床治疗上为造血干细胞的供应创造了有利的条件。

Description

一种体外扩增造血干细胞的新方法

本发明属于细胞生物学细胞工程技术领域，是一种体外扩增造血干细胞的新方法。

造血干细胞移植是临床治疗白血病等多种恶性疾病的常用方法，造血干细胞也是基因治疗中较为理想的靶细胞。提供一定数量和质量的造血干细胞对造血干细胞移植和基因治疗是至关重要的。目前造血干细胞的主要来源有骨髓、外周血和脐带血等，但因数量有限，难以满足需要。所以造血干细胞体外扩增方法是造血干细胞应用于临床治疗的一项基本技术和前提条件。然而造血干细胞是一种高度特异性的细胞类型，显著不同于一般的定向分化细胞和终末分化细胞，更不同于永生性的细胞株或细胞系。其特异性一方面表现在它能向各系造血细胞和造血基质细胞分化，构成不同年龄结构的造血系统；另一方面表现在它具有高度自我更新能力，保证干细胞库的平衡。但是造血干细胞在体外培养条件下大都发生不对称分裂，这意味着在体外培养条件下干细胞很容易大量走向分化，形成大量祖细胞，不能预期得到大量的造血干细胞。而造血干细胞扩增的目的是既要有一定总量的各系造血祖细胞又要有一定数量和质量的造血干细胞，这样就存在着扩增与分化的矛盾，解决这一矛盾便成为造血干细胞扩增的关键性难题。现有的扩增方法都是将用于扩增的造血干细胞(简称扩增前干细胞)全部一次性加入培养体系中连续培养扩增数周，最后全部一次性收集(该法简称一次性扩增法)。一次性扩增法虽然加入了众多的扩增前干细胞，但其增殖高峰是在扩增的1～2周内，如果在此期间一次性收集干细胞，则扩增所得的造血干细胞和造血祖细胞数量都不足；如果继续培养而不及时收集扩增后干细胞，则有相当多的造血干细胞迅速走向分化，产生各系造血祖细胞和终末分化细胞甚至老化死亡，这种扩增的结果是造血祖细胞量多了，造血干细胞量不足，且因其它分化细胞及老化细胞过多，影响所得扩增细胞的质量，使扩增效果不理想。然而实验证明，经扩增一定时间后的培养体系，对新加入的扩增前干细胞的增殖极为有利。因为该培养体系已成为条件培养体系，它含有的各系造血祖细胞、终末分化细胞、造血基质细胞及其分泌的多种造血调控因子等，共同营造了良好的造血微环境，对新加入的扩增前干细胞起到了支持、饲养的作用，有利于其扩增。正是基于这些认识，本发明人对一次性扩增法作出了改进。

本发明的目的在于提供一种能提高有效造血干细胞数量和质量的体外扩增造血干细胞的新方法。

本发明对一次性扩增法作如下改进：

1.将扩增前干细胞一次性加入改为分批多次加入。也就是将扩增前干细胞的总量分成N等份，分批逐份加以扩增，每批间隔1周，待用各份可先置液氮冷冻保存，用前加以复苏。这就克服了所有的扩增前干细胞同时长周期扩增、分化、老化的缺陷，保证了每一批次的扩增都有新鲜加入的扩增前干细胞，使每一批次的扩增始终都处于最佳状态。且扩增前干细胞的分批多次加入，使培养体系内形成干细胞扩增梯队，扩增条件不断得到优化，对各类细胞增殖极为有利。

2.将扩增后干细胞的一次性收集相应地改为分批多次收集。即扩增一批，收集一批，及时把扩增后干细胞收集保存起来，防止造血干细胞走向分化。本法通常在扩增后1周收集细胞，即在造血干细胞的扩增高峰期内及时收集并保存起来。

3.将扩增后干细胞由一次性全数收集改为(N-1)次半数收集及第N次全数收集。即除了最后一批扩增后干细胞的全数收集外，其余每批次的收集量仅为该培养体系细胞数的一半。所留下的另一半培养液和各系造血细胞，在补充了新鲜的培养液及加入了另一份扩增前干细胞后，一起继续培养扩增。这样就带来几方面的好处：一方面是及时保存优质的扩增后干细胞；另一方面留下的一半细胞就可以和新加入的另一份扩增前干细胞继续扩增，产生足够数量的各系造血祖细胞以满足造血干细胞扩增的另一目的；更为有利的是，随着扩增批次的增多，形成扩增梯队，各类不同年龄的造血细胞相互支持，使造血微环境得到优化，有利于造血干细胞的培养扩增。所以整个造血干细胞分批扩增的过程，也就是造血微环境不断得到改善的过程，也就是培养体系不断得到优化的过程，这样随批次的递增，每批所收集的扩增后干细胞和祖细胞数也随着递增。

本发明所用的扩增前干细胞总数虽然与一次性扩增法相同，但所得的造血干细胞的数量却数倍于一次性扩增法，质量也大大地得到了提高。只要用足够量的扩增前干细胞培养扩增足够的批次，就可以得到实际所需数量和质量的造血干细胞。

本发明的具体做法是：

1.制备扩增前干细胞：

按常规从骨髓、外周血或脐带血中，根据需要和实际情况按常规用密度梯度离心法分离制备一定数量的单个核细胞，该组份富含造血干细胞(参见唐佩璇等主编《造血细胞培养方法》)，其为扩增前干细胞。以含10％AB型脐带血血清的IMDM培养液悬浮细胞，配制成适当的细胞浓度备用(通常为每毫升1×10⁷个细胞)。由于临床成功的造血干细胞移植中的细胞成分既要有造血干细胞又要有造血祖细胞，才能使造血功能快速恢复又能使造血功能长期重建，所以没有必要纯化造血干细胞；但对于作为基因治疗的靶细胞而言，则应在扩增后按常规进行分离纯化；

2.扩增：

(1)采用的细胞培养体系可参照一次性扩增法，包括各种不同细胞因子组合体系、依赖基质细胞体系、生物反应器体系等(详见沈柏均等主编《脐血基础与临床》)；

(2)将上述制备的扩增前干细胞分为N等份(N在4～16之间取值较好)，将其中一份加入到培养体系中进行第一批扩增，其余(N-1)份则置液氮冷冻保存(参见刘作斌等主编《深低温冷冻保存》)；

(3)待第一批细胞扩增一周后，先收集一半数量扩增后干细胞，并置液氮冷冻保存，在剩下的另一半的培养体系中加入第二份已复苏的扩增前干细胞，并按常规补足培养液和细胞因子，继续培养扩增。这样，造血干细胞在得到优化的细胞培养体系中进一步扩增；

(4)如此重复，造血干细胞在不断得到优化的培养条件下连续扩增N批次，最后一批次造血干细胞培养一周后，收集所有细胞。将所收集的N批次细胞汇总，就可得到足够量的优质造血干细胞。

实施例：脐带血造血干细胞的体外扩增

1.制备脐带血细胞悬液  常规无菌条件下取正常足月顺产胎儿脐带血一份，约100毫升，肝素抗凝，4℃下2小时内经检测无溶、凝血现象，无病原体，用100毫升IMDM培养液稀释制成200毫升细胞悬液。

2.制备扩增前干细胞分别在8个容量为50毫升的离心管内，预先铺好25毫升Ficoll-Hypaque(密度为1.077g/cm³)淋巴细胞分离液，然后各加入25毫升脐带血细胞悬液，按常规进行密度梯度离心法分离制备单个核细胞，得到约1.5×10⁸个细胞，悬浮于30毫升含10％AB型脐带血血清的IMDM培养液中，此即为扩增前干细胞悬液，其中CD34⁺造血干细胞比例约为1～2％，CD34⁺CD38^-造血干细胞比例约为0.4％。该细胞悬液可用于不同培养体系进行扩增。为简便起见，本实施例用24孔组织培养板扩增细胞，故仅取其中的1毫升扩增前干细胞。

3.分装扩增前干细胞  取上述扩增前干细胞悬液1毫升，加4毫升IMDM培养液，混匀后，分为5等份，每份1毫升，约含1×10⁶个细胞，取一份直接用于扩增，其余4份按常规用DMSO冻存液置液氮冷冻保存备用。

4.分批扩增

(1)配制细胞因子培养体系、制备细胞悬液  方法为：在10亳升试管中，加入SCF(干细胞生长因子)500ng、TPO(血小板生成素)100ng、IL-3(白介素-3)20ng、GM-CSF(粒单系生长因子)250ng、1毫升AB型脐带血血清、1毫升扩增前干细胞悬液，再以IMDM培养液补足至总量为5毫升(所用试剂均购自Sigma)，充分混匀。

(2)培养扩增  采用24孔组织培养板(Costar)进行培养扩增：用吸管将上述制备的干细胞悬液，分别加入到培养板上的5个复孔中，每孔1毫升，细胞数约为2×10⁵个，置二氧化碳孵箱(Hereaus)培养一周(5％CO₂，37℃，饱和湿度)。

(3)收集细胞用吸管将每孔中的细胞轻轻吹散成细胞悬液，混匀后，分别吸取0.5毫升收集于同一离心管中，按常规离心沉淀细胞，弃上清，加3毫升新鲜IMDM培养液重新悬浮细胞，按常规方法计数细胞，再用新鲜IMDM培养液调整细胞浓度，使每毫升含2×10⁷个细胞，按常规，将细胞置液氮冷冻保存。

(4)再扩增取一份液氮冷冻保存的扩增前干细胞，按常规方法复苏、洗涤、离心沉淀细胞后，加入按上述4(1)步骤配制的细胞因子培养液2.5毫升。充分混匀后，用吸管分别吸取0.5毫升，加入到原5个复孔中，即每孔补充新鲜的扩增前干细胞2×10⁵个，继续培养扩增。扩增一周后，再半量收集细胞，如此重复，直致第5批扩增一周后，全数收集细胞。计数结果表明，扩增5周，细胞数扩增500多倍。本发明与一次性扩增比较，虽然所用扩增前干细胞数相同，所得扩增后细胞总数相当，但本法所得CD34⁺造血干细胞总数、CD34⁺CD38^-造血干细胞总数分别是一次性扩增法的3倍和5倍，本法显著优于一次性扩增法。如果按本法进行大容量的全份脐带血造血干细胞扩增，那么一份脐带血扩增所得造血干细胞可以满足移植一个成人的需要。

优点和积极效果：

1.本法既促进了造血干细胞的增殖又抑制了分化，既提高了造血干细胞的产量又保证了质量，效果要优于一次性扩增法；

2.本发明可望解决“一份脐带血满足不了一个成人的需要的难题”，对脐带血干细胞移植和脐带血库的建立具有重大的实际意义，真正使脐带血“变废为宝”，具有明显的社会和经济价值；

3.本发明同样可适用于其他一些在发生增殖的同时又走向分化的细胞的体外扩增，如：某些免疫活性细胞(树突状细胞、自然杀伤细胞等)、胚胎干细胞等。

Claims (1)

1、一种体外扩增造血干细胞的方法，包括扩增前干细胞的制备、造血干细胞的培养扩增和扩增后细胞的收集保存，其特征在于将扩增前造血干细胞总量分成4～16等份后分批多次扩增，每批扩增1周后收集半量细胞液氮冻存，再补入一份扩增前造血干细胞和补足新鲜培养液后继续扩增，如此反复，直到扩增细胞全数收集后置液氮冻存。