CN114480127B - 一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了组织工程修复领域的一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室包括输入件、旋转件和供料件；所述输入件包括第一电机、第二电机、皮带轮和传送皮带；旋转件包括行星齿轮组、相互嵌套的内桶和外桶，行星齿轮组包括太阳轮、行星轮和内齿圈，所述太阳轮连接第一电机的输出轴，行星轮一端啮合于太阳轮，行星轮的另一端啮合内齿圈，所述行星轮的竖向中轴线处连接有搅拌轴；供料件包括位于内桶底部的载体支架本发明细胞灌注液可提高软骨细胞再生，本技术方案通过向内桶添加细胞灌注液，这种装置具有修复实质器官的作用，同时改善骨缺损原位的局部微环境、降低炎性细胞因子水平减弱氧自由基的毒性作用，在骨缺损原位重建了骨再生微环境。

Description

一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室及其使用 方法
技术领域
本发明属于组织工程修复领域，具体是一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室及其使用方法。
背景技术
大节段负重骨缺损的再生修复极为困难，采用自体骨移植会带来出血、感染及新的损伤，且来源有限。由创伤、感染、肿瘤、烧伤等引起的大块骨缺损是临床治疗的棘手问题，采用传统的自体骨或同种异体骨移植及生物材料填充，由于存在种种弊端，治疗效果均不理想，严重限制了其临床应用。
近年来，以骨髓基质干细胞(BMSC)为核心的组织工程骨移植治疗大段骨缺损已成为研究热点。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是未分化多潜能干细胞，在组织再生领域有巨大潜力，具有多向分化潜能，能够向成骨系细胞、成纤维细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞等分化。BMSC可来源于机体各部分骨髓。
但种子细胞由于面临血供重建的困难以及炎症因子、氧自由基等的毒性作用，使得细胞成活困难、成骨效率低下。大块组织工程骨血管化以及生长因子持续稳定的释放等关键性技术难题至今未找到理想的解决办法，采用常规思路对大块骨缺损进行修复遇到了巨大的挑战。为解决这些难题，我们需要将BMSC、细胞营养泵入大段骨缺损原位，同时将局部的炎症因子、氧自由基、代谢废物等排出体外，在骨缺损原位重建了骨再生微环境。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种人造大段骨培养环境的装置，并实施一种在骨缺损原位重建了骨再生微环境的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室，包括输入件、旋转件和供料件；所述输入件包括第一电机、第二电机、皮带轮和传送皮带；
旋转件包括行星齿轮组、相互嵌套的内桶和外桶，所述行星齿轮组包括太阳轮、行星轮和内齿圈，所述太阳轮连接第一电机的输出轴，行星轮一端啮合于太阳轮，行星轮的另一端啮合内齿圈，所述行星轮的竖向中轴线处连接有搅拌轴；
外桶固定连接于内齿圈，内桶的侧壁带有交换孔，且内桶与外桶之间设有仅容气体通过的半透膜；
供料件包括位于内桶底部的载体支架。
采用上述方案后实现了以下有益效果：1、相对于采用搅拌叶进行搅拌的现有技术，本技术方案中通过行星齿轮关联不同的结构，以实现控制行星轮和太阳轮的齿数比将其产生搅拌效果，此时搅拌过程中实现以下运动模式①当行星轮和太阳轮之间同步运动时，保持搅拌轴与内桶之间不存在相对运动，此时根据周向力带动流体旋转，实现物质交换的同时，降低了内部液流的剪切应力，降低了流体对于培养物质的破坏性。
②相对于相同采用行星齿轮结构的现有技术，本技术方案中利用内桶和搅拌轴的相对静止以及周向力形成的水龙卷，便于培养细胞的流动，此时由于剪切应力降到最低，此时细胞受到重力影响下细胞间存在更多联系和交换物质的可能性，提高细胞的增质量。
③相对于提高细胞增殖量的现有技术，本技术方案中可以人为控制施加变速运动，在必要时可以使搅拌轴与内桶形成相对运动，此时引入剪切应力给予细胞组织应力刺激(提供向心力)，便于细胞组织汇聚于中心处，增加中心处载体支架对于细胞截获的概率，促进载体支架表面载体的生长。
2、相对于控制流动方式的现有技术，本技术方案中将外桶内填充无菌空气，利用半透膜仅供气体交换，模拟了细胞中氧气的输入与二氧化碳的交换，提高了细胞的寿命。
3、相对于提高细胞寿命的现有技术，本技术方案中利用内桶的旋转使内桶的培养液形成水龙卷，避免了细胞沉降，扩大了细胞与空气或细胞之间的物质交换面积。
进一步，所述内桶与外桶的横截面为锥形，所述载体支架位于内桶的最底部，载体支架呈螺旋形，且载体支架表面带有颗粒球。
有益效果：1、相对于提升协调作用的现有技术而言，本技术方案通过锥形结构便于形成水龙卷从而使培养液便于集中在载体支架上。
2、相对于便于集中培养液的现有技术，当驱使外桶旋转时，利用齿圈带动行星轮，太阳轮禁止转动，此时由于内桶与外桶相互契合，因此外桶转动带动内桶旋转，内桶与搅拌轴之间的转动方向相反，内桶自转过程中生成的水龙卷和搅拌轴旋转生成的水龙卷方向相反，这两种水龙卷之间形成有失重空间，在失重空间内由于液体流向之间交错形成失重区域(浮空)，此时失重的培养细胞悬浮，而被搅拌轴旋转带动的细胞与失重区域的细胞相互滑动和碰撞提升了细胞营养交换的面积和培养细胞与不同营养物质之间的协同作用。
进一步，外桶的最下方带有驱动齿，驱动齿通过传送皮带连接皮带轮。
有益效果：便于通过驱动齿的转动，使外桶旋转，此时改变行星齿轮的转动模式，实现齿圈带动行星轮，而太阳轮连接的第一电机尚未启动，此时太阳轮处于锁止状态，以提供一种新型转动变速模式。
进一步，所述内桶的顶部开设有加料口，外桶的径向两侧带有通气支管和排气支管，搅拌轴的表面带有用于监测ph值的感应器。
有益效果：便于利用通气支管和排气支管对外桶内引入气流，同时PH值感应器便于操作人员观测培养液内的情况，以生成最佳的培养环境。
进一步，内桶的最低处带有锥形管，锥形管的最低处带有出料口，出料口表面带有旋盖。
有益效果：便于通过出料口排空内桶的培养液。
进一步，所述载体支架表面带有固定装置。
有益效果：实现对载体的固定。
进一步，包括以下步骤：
S1,将未贯通的圆桶状天然滨珊瑚放置于载体支架处；
S2，随后通过加料口向内桶中添加细胞灌注液，细胞灌注液组成的成分包括骨髓间充质干细胞、重组人碱性成纤维细胞生长因子、人重组骨形态发生蛋白、地塞米松和维生素D3；
S3,将无菌空气通过通气孔装入外桶内，随后启动第一电机，利用搅拌轴带动内桶的细胞灌注液旋转，实现与圆桶状天然滨珊瑚进行物质交换；
S4,根据实际需求控制第一电机或第二电机是否转动，从而改变内桶和外桶的旋转方式，以满足圆桶状天然滨珊瑚生合成为人工骨骼的培养条件。
进一步，圆桶状天然滨珊瑚加工成25mm、外径12mm和内径2mm。
进一步，细胞灌注液的比例为骨髓间充质干细胞(BMSC)为1×106～1×107个/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)为2ng/ml，人重组骨形态发生蛋白(rhBMP-2)为25ng/ml，地塞米松为0.25～1.0mg/ml，维生素D3为1～2mg/ml。
进一步，骨髓间充质干细胞完成提取后将骨髓间充质干细胞与等体积的PBS混合，通过离心搅拌后弃上清，骨髓间充质干细胞用PBS清洗2次；再用弃去上清液等量的培养基悬浮细胞，其有核细胞数在(1～2)×107个/ml，骨髓间充质干细胞进行消化、传代接种以及条件培养基诱导培养，扩增至第3-5代使用。
有益效果：本发明细胞灌注液可提高软骨细胞再生，具有修复实质器官的作用，同时改善骨缺损原位的局部微环境、降低炎性细胞因子水平减弱氧自由基的毒性作用，在骨缺损原位重建了骨再生微环境，该材料具有良好的治疗效果及安全性。
附图说明
图1为本发明实施例一的示意图；
图2为图1的俯视图；
图3为实施例二中骨髓细胞提取后的分层；
图4为实施例三中羊胫骨2.5cm骨缺损模型结构图；
图5为近同模型中胫骨与干骨缺损模型的构建结构图；
图6为图5的放射图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
说明书附图中的附图标记包括：第一电机1、第二电机2、皮带轮3、传送皮带4、行星齿轮组5、太阳轮501、行星轮502、内齿圈503、内桶6、外桶7、搅拌轴8、载体支架9、颗粒球10、驱动齿11、加料口12、通气支管13、排气支管14、锥形管15、旋盖16、固定装置17。
实施例一
实施例基本如附图1所示：一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室包括：输入件、旋转件和供料件；输入件包括第一电机1、第二电机2、皮带轮3和传送皮带4，第二电机2转动连接于皮带轮3；
旋转件包括行星齿轮组5、相互嵌套的内桶6和外桶7，内桶6的顶部开设有加料口12，内桶6的最低处带有锥形管15，锥形管15延伸出外桶7，锥形管15的最低处带有出料口，出料口表面带有旋盖16，外桶7的径向两侧带有通气支管13和排气支管14，内桶6与外桶7的横截面为锥形，内桶6的最底部带有载体支架9，外桶7的最下方带有驱动齿11，传送皮带4位于驱动齿11和皮带轮3之间，驱动齿11通过传送皮带4连接皮带轮3。
请参考图2，行星齿轮组5包括太阳轮501、行星轮502和内齿圈503，所述太阳轮501连接第一电机1的输出轴，行星轮502一端啮合于太阳轮501，行星轮502的另一端啮合内齿圈503，所述行星轮502的竖向中轴线处连接有搅拌轴8，搅拌轴8的表面带有用于监测ph值的感应器。
外桶7固定连接于内齿圈503，内桶6的侧壁带有交换孔，且内桶6与外桶7之间设有仅容气体通过的半透膜；
供料件为位于内桶6底部的载体支架9，载体支架9呈螺旋形，且载体支架9表面带有颗粒球10，支架表面带有固定装置17。
具体实施过程如下：
包括以下步骤：
S1,将未贯通的圆桶状天然滨珊瑚放置于载体支架9处，圆桶状天然滨珊瑚加工成25mm、外径12mm和内径2mm；
S2，随后通过加料口12向内桶6中添加细胞灌注液，细胞灌注液组成的成分包括骨髓间充质干细胞、重组人碱性成纤维细胞生长因子、人重组骨形态发生蛋白、地塞米松和维生素D3。
更具体的细胞灌注液的比例为骨髓间充质干细胞(BMSC)为1×106～1×107个/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)为2ng/ml，人重组骨形态发生蛋白(rhBMP-2)为25ng/ml，地塞米松为0.25～1.0mg/ml，维生素D3为1～2mg/ml。
S3,将无菌空气通过通气孔装入外桶7内，随后启动第一电机1，利用搅拌轴8带动内桶6的细胞灌注液旋转，实现与圆桶状天然滨珊瑚进行物质交换；
S4,根据实际需求控制第一电机1或第二电机2是否转动，从而改变内桶6和外桶7的旋转方式，以满足圆桶状天然滨珊瑚生合成为人工骨骼的培养条件。
本技术方案中通过行星齿轮关联不同的结构，以实现控制行星轮502和太阳轮501的齿数比将其产生搅拌效果，此时搅拌过程中实现以下运动模式
①当行星轮502和太阳轮501之间同步运动时，保持搅拌轴8与内桶6之间不存在相对运动，此时根据周向力带动流体旋转，实现物质交换的同时，降低了内部液流的剪切应力，降低了流体对于培养物质的破坏性。
②相对于相同采用行星轮502结构的现有技术，本技术方案中利用内桶6和搅拌轴8的相对静止以及周向力形成的水龙卷，便于培养细胞的流动，此时由于剪切应力降到最低，此时细胞受到重力影响下细胞间存在更多联系和交换物质的可能性，提高细胞的增质量。
③相对于提高细胞增殖量的现有技术，本技术方案中可以人为控制施加变速运动，在必要时可以使搅拌轴8与内桶6形成相对运动，此时引入剪切应力给予细胞组织应力刺激(提供向心力)，便于细胞组织汇聚于中心处，增加中心处载体支架9对于细胞截获的概率，促进载体支架9表面载体的生长。
④相对于便于集中培养液的现有技术，当驱使外桶7旋转时，利用内齿圈503带动行星轮502，太阳轮501禁止转动，此时由于内桶6与外桶7相互契合，因此外桶7转动带动内桶6旋转，内桶6与搅拌轴8之间的转动方向相反，内桶6自转过程中生成的水龙卷和搅拌轴8旋转生成的水龙卷方向相反，这两种水龙卷之间形成有失重空间，在失重空间内由于液体流向之间交错形成失重区域(浮空)，此时失重的培养细胞悬浮，而被搅拌轴8旋转带动的细胞与失重区域的细胞相互滑动和碰撞提升了细胞营养交换的面积和培养细胞与不同营养物质之间的协同作用。
实施例二
本实施例与上述实施例的区别在于，将改善骨缺损原位的局部微环境，从而在体内培养节省体外培养的步骤，本实施例中首先将骨髓间充质干细胞的提取及培养方法：BMSCs提取过程在层流无菌手术室进行，对患者进行局部麻醉后，选取患者双侧髂后上棘部位进行穿刺，用含有肝素抗凝液的注射器抽取骨髓血200ml，将抽取的骨髓血打入医用无菌采血袋中。如上获得的骨髓细胞，与等体积的PBS混合，室温条件下静置30min。在1000r/min，弃上清，细胞用PBS清洗2次；再用弃去上清液等量的培养基悬浮细胞，其有核细胞数在(1～2)×107个/ml。分离程序如下：吸取密度位1.073g/ml Percoll溶液上，使其与分离液比例为1：1；用水平离心机2000r/min离心20～40min，使离心管内液体分为三层(如图3：上层为血小板、中层为分离液、底层为红细胞和多核白细胞，在上、中层液体界面处可见乳白色混浊的单个核细胞层)；将吸管轻轻插入到上、中层液体界面处的单个核细胞层，沿试管边缘吸取有核细胞移入另一离心管中；用≥5倍的培养基悬浮细胞，2000r/min离心10min，弃上清液；用培养基再悬细胞，计数，用2％苔盼蓝测定细胞活力，调节细胞浓度为1×106个/ml；按1.5×105个/cm2底面积接种到培养皿，在37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱培养。培养48h后，可见少量细胞贴壁，2w后达到85％细胞融合，即可进行消化、传代接种以及条件培养基诱导培养，扩增至第3-5代使用。
无菌条件下，按照比例在使用时进行混合，依次取重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)为2ng/ml，人重组骨形态发生蛋白(rhBMP-2)为25ng/ml，地塞米松为0.25～1.0mg/ml，维生素D3为1～2mg/ml，混匀；随后注入患者体内，将获得的骨髓间充质细胞加入到细胞灌注液中，通过细胞计数后重悬，调整到每ml细胞灌注液中含间充质干细胞1×106～1×107个/ml。
实施例三
有效性动物验证实验
实验方法：实验动物为健康中国青山羊16只，12月龄以上，体重14.5-15.5Kg的成年山羊。左后肢前外侧弧形切开皮肤，沿胫前肌与胫骨间隙分开进入。于胫骨外侧第8孔重建钢板内固定，除第4、5孔外，骨折远近端各三枚螺钉固定。环形剥离并切除胫骨中段骨膜，于钢板第3、4及5、6孔之间分别以线锯锯断胫骨，移除游离骨段，大段骨缺损动物模型构建完成(骨与骨膜缺损长度为2.5cm，如图4)。术后常规换药，高蛋白青饲料圈养，术后14d拆线。
单纯材料组(对照组)：将健康中国青山羊胫骨干骨缺损模型8只，分别将NC直接嵌入骨缺损处。
近同构模型的建立：准备健康中国青山羊8只，建羊胫骨干骨缺损模型，将圆桶状的未贯通的复合有BMSC的NC直接嵌入骨缺损处(如图5、6)，在此基础上安装双泵组成的灌注系统联合组成，体内使用的泵系统为皮下植入式给药装置(KL-Ⅱ型，陕西省科联新技术开发中心)；体外使用的泵系统为便携式微量注射泵(AJ5805型，上海安洁电子设备有限公司)。
皮下植入式给药装置由注射座和硅橡胶导管二部分组成，管的一头插入呈圆桶状的未贯通的NC中央。插入到NC内的导管长20mm，管道插入部分有多个侧孔。管道的另一头为埋植在左侧臀部皮下的注射座。灌注药物时，由有经验的医护人员执行，首先找准穿刺窗口，然后消毒皮面，将针头通过皮肤垂直刺入注射座，直到针头与泵体底部接触，再注入药物。针头与体外的AJ5805便携式微量注射泵相连通，该注射泵是一种操作方便、便于携带的给药装置，由于其推注速度可以调控，如使用10ml一次性注射器的流量范围在0.1ml/h～20ml/h，故可实现持续、缓慢低剂量地输入DMEM培养液以及rhBMP-2、rhbFGF等细胞因子(美国peprotech公司)。
观察方法：近同构模型体内外灌注情况；X线观察：分别于术后、8w摄片观察骨愈合与NC吸收情况；组织学检查：两组动物均取植入骨缺损部位行石蜡切片、HE染色，观察新生组织的组织学形态。
结果：实验动物中仅有1只手术过程中因麻醉意外而意外死亡并加以补充，其余动物术后1w完全站立，2w可自由活动。其中一只山羊因放养不当，针头滑落一次，经及时消毒，并更换一次性无菌针管和灌注液后继续灌注。连续观察各实验动物手术切口周围组织均无红肿、渗出等炎性表现。未观察到复合物支架周围液体潴留而出现的肿胀、渗出等现象，伤口愈合良好。
讨论：本动物实验通过研究复合间充质干细胞灌注液，在骨缺损模型使用该生物复合材料协助复合物骨架，诱导骨缺损区域血管再生及干细胞分化成为成骨细胞，从而促进骨再生。该生物复合材料可模拟组织再生的最佳微环境，既可保持病灶局部的干细胞浓度，也可诱导组织生长和组织再生特异性基因的活性信号表达。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (5)

1.一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室，其特征在于：包括输入件、旋转件和供料件；所述输入件包括第一电机、第二电机、皮带轮和传送皮带，第二电机转动连接于皮带轮；
旋转件包括行星齿轮组、相互嵌套的内桶和外桶，所述行星齿轮组包括太阳轮、行星轮和内齿圈，所述太阳轮连接第一电机的输出轴，行星轮一端啮合于太阳轮，行星轮的另一端啮合内齿圈，所述行星轮的竖向中轴线处连接有搅拌轴；
外桶固定连接于内齿圈，内桶的侧壁带有交换孔，且内桶与外桶之间设有仅容气体通过的半透膜；
供料件包括位于内桶底部的载体支架；
所述内桶与外桶的横截面为锥形，所述载体支架位于内桶的最底部，载体支架呈螺旋形，且载体支架表面带有颗粒球；
外桶的最下方带有驱动齿，传送皮带位于驱动齿和皮带轮之间，驱动齿通过传送皮带连接皮带轮；
所述内桶的顶部开设有加料口，外桶的径向两侧带有通气支管和排气支管，搅拌轴的表面带有用于监测ph值的感应器；
内桶的最低处带有锥形管，锥形管的最低处带有出料口，出料口表面带有旋盖；
所述载体支架表面带有固定装置。
2.根据权利要求1所述的一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室，其特征在于：还包括使用方法，使用方法包括以下步骤：
S1,将未贯通的圆桶状天然滨珊瑚放置于载体支架处；
S2，随后通过加料口向内桶中添加细胞灌注液，细胞灌注液组成的成分包括骨髓间充质干细胞、重组人碱性成纤维细胞生长因子、人重组骨形态发生蛋白、地塞米松和维生素D3；
S3,将无菌空气通过通气孔装入外桶内，随后启动第一电机，利用搅拌轴带动内桶的细胞灌注液旋转，实现与圆桶状天然滨珊瑚进行物质交换；
S4,根据实际需求控制第一电机或第二电机是否转动，从而改变内桶和外桶的旋转方式，以满足圆桶状天然滨珊瑚生合成为人工骨骼的培养条件。
3.根据权利要求2所述的一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室，其特征在于：圆桶状天然滨珊瑚加工成25mm、外径12mm和内径2mm。
4.根据权利要求3所述的一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室，其特征在于：细胞灌注液的比例为骨髓间充质干细胞（BMSC）为1×106~1×107个/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）为2ng/ml，人重组骨形态发生蛋白（rhBMP-2）为25ng/ml，地塞米松为0.25~1.0mg/ml，维生素D3为1~2mg/ml。
5.根据权利要求4所述的一种用于大段负重骨缺损原位修复的再生反应室，其特征在于：骨髓间充质干细胞完成提取后将骨髓间充质干细胞与等体积的PBS混合，通过离心搅拌后弃上清，骨髓间充质干细胞用PBS清洗2次；再用弃去上清液等量的培养基悬浮细胞，其有核细胞数在（1~2）×107个/ml，骨髓间充质干细胞进行消化、传代接种以及条件培养基诱导培养，扩增至第3-5代使用。
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CN1846793A (zh) * 2005-04-14 2006-10-18 南方医院 一种组织工程骨及其构建与应用
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RU2757157C1 (ru) * 2020-08-06 2021-10-11 Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") Восстановление диафиза трубчатых костей клеточными технологиями с применением способа аутотрансплантации сосуда

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