CN109234231A - 一种规模化扩增间充质干细胞的方法 - Google Patents

一种规模化扩增间充质干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于干细胞技术领域，具体涉及一种规模化扩增间充质干细胞的方法。本发明所提供的方法采用可生物降解的明胶微载体并结合间歇搅拌的方法进行悬浮培养，共同促进了间充质干细胞的培养；同时，在细胞培养过程中还采用无血清培养基替代动物血清培养基作为细胞培养基进行培养，不会带来任何支原体和病毒，避免了病毒感染的风险。本发明方法步骤操作简单，成本低廉，不仅可促进间充质干细胞的培养，还可以维持细胞干性及其分化潜能。

Description

一种规模化扩增间充质干细胞的方法
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种规模化扩增间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。间充质干细胞可以接受移植，而它们会成长为何种类型的细胞取决于其被注入的部位。例如，被注入心脏的间充质干细胞能够形成健康的新组织等。间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复和自身免疫性疾病等方面，并已取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。因此，规模化扩增间充质干细胞对促进间充质干细胞的临床应用具有十分重要的意义。
微载体培养是目前公认的最有发展前景的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，容易扩大细胞培养，因此，微载体培养广泛用于培养各种类型细胞。然而，目前使用的商业化微载体都不可生物降解，在大规模培养细胞时，需要耗费大量商业化微载体，花费成本较高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种规模化扩增间充质干细胞的方法，用于有效促进间充质干细胞的体外扩增培养。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种规模化扩增间充质干细胞的方法，将间充质干细胞接种于明胶微载体悬液中进行悬浮培养；
所述悬浮培养采用间歇搅拌的方式进行培养。
优选的，所述间歇搅拌为：先以30～50rpm的转速搅拌10min后停止搅拌10min，如此循环持续6h，然后再以65rpm的转速恒速进行搅拌。
优选的，所述间歇搅拌采用磁力搅拌器。
优选的，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。
优选的，所述接种的细胞密度为1×105～10×105cells/mL。
优选的，所述明胶微载体悬浮液为明胶微载体和无血清培养基的混合物。
优选的，所述明胶微载体的密度为10～20g/L。
优选的，所述明胶微载体为生物可降解微载体。
优选的，所述明胶微载体的制备方法为：将明胶水溶液采用双乳法制备明胶微球，然后使用无水乙醇进行脱水，再在京尼平～无水乙醇溶液中交联，得到所述明胶微载体。
优选的，所述京尼平的质量百分比浓度为0.5％～1％。
与现有技术相比，本发明所提供的一种规模化扩增间充质干细胞的方法采用可生物降解的明胶微载体并结合间歇搅拌的方法进行悬浮培养，不仅降低了培养成本，还协同促进了间充质干细胞的培养；同时，在细胞培养过程中还采用无血清培养基替代动物血清培养基作为细胞培养基进行培养，不会带来任何支原体和病毒，避免了病毒感染的风险。本发明方法步骤操作简单，成本低廉，不仅可促进间充质干细胞的培养，还可以维持细胞干性及其分化潜能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为在实施例5中脂肪间充质干细胞的细胞活力检测结果；
图2为在实施例6中实施例2的脂肪间充质干细胞在悬浮培养时的荧光显微镜照片；
图3为在实施例6中实施例3的脂肪间充质干细胞在悬浮培养时的荧光显微镜照片；
图4为在实施例6中实施例4的脂肪间充质干细胞在悬浮培养时的荧光显微镜照片；
图5为在实施例7中采用流式细胞仪检测细胞表面抗原的结果；
图6a为在实施例8中脂肪间充质干细胞诱导成骨分化前的检测结果；
图6b为在实施例8中脂肪间充质干细胞诱导成骨分化后的检测结果；
图7a为在实施例9中脂肪间充质干细胞诱导成脂分化前的检测结果；
图7b为在实施例9中脂肪间充质干细胞诱导成脂分化后的检测结果。
具体实施方式
为有效促进间充质干细胞的规模化扩增，维持细胞干性和降低成本，本发明提供了一种规模化扩增间充质干细胞的方法。
本发明提供了一种规模化扩增间充质干细胞的方法，将间充质干细胞接种于明胶微载体悬液中进行悬浮培养；
所述悬浮培养采用间歇搅拌的方式进行培养。
进一步的，所述间歇搅拌为：先以30～50rpm的转速搅拌10min后停止搅拌10min，如此循环持续6h，然后再以65rpm的转速恒速进行搅拌。
进一步的，所述间歇搅拌采用磁力搅拌器。
进一步的，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。
更进一步的，所述接种的细胞密度为1×105～10×105cells/mL。
本发明对间充质干细胞的获取渠道没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的即可，如市售来源，或者采用本领域常规技术手段进行制备。
进一步的，所述明胶微载体悬浮液为明胶微载体和无血清培养基的混合物。
更进一步的，所述明胶微载体的密度为10～20g/L。
进一步的，所述明胶微载体为生物可降解微载体。
在本发明中，所述明胶微载体的制备方法为：
以明胶为原材料，将明胶溶于水中，制得明胶水溶液；
将明胶水溶液采用双乳法制备明胶微球，然后使用无水乙醇进行脱水，再在京尼平/无水乙醇溶液中交联，得到所述明胶微载体。
进一步的，所述京尼平的质量百分比浓度为0.5％～1％。
更进一步的，所述明胶微载体的详细制备过程优选为：
称量5～10g明胶，加入超纯水50mL，在70～100℃下加热完全溶解，得到明胶溶液。
然后，按体积份数计，将1～5份的明胶溶液和1份乳化剂A混合，形成第一层油相，以100～900rpm的转速进行搅拌，形成第一乳浊液；接着，将1份第一乳浊液加入2份乳化剂B，形成第二层油相，随即以100～450rpm搅拌1～2min后采用冰水浴迅速冷却到5℃以下，再以100～450rpm的速度继续搅拌5～30min，得到第二乳浊液；最后，加入第二乳浊液2～5倍体积的20℃的脱水脱油剂，搅拌脱水，得到明胶微球。
将明胶微球初产物采用脱水脱油试剂异丙醇和丙酮交替清洗之后用无水乙醇洗涤，于60～80℃烘干，用75μm～300μm筛网依次过筛，加入明胶微球2～5倍体积的含0.5～1％京尼平的无水乙醇溶液，在4℃放置30h，随后在37℃放置36～40h。离心弃上清，再用2～5倍体积的无水乙醇清洗2～3次，100℃烘干，得到直径为75μm～300μm的明胶微载体。
其中，乳化剂A和B各自独立地选自蓖麻油、橄榄油、花生油、大豆油、可可豆脂、椰油醋、棕搁油醋、乙酸乙酯、蜂蜡或硅油，优选为乙酸乙酯、橄榄油、花生油和大豆油；脱水剂A选自无水乙醇、异丙醇、丙酮、甘油、正丁醇或叔丁醇，优选为无水乙醇、异丙醇和丙酮；脱水脱油剂B和C各自独立地选自无水乙醇、异丙醇、丙酮、甘油、二恶烷、正丁醇或叔丁醇，优选为异丙醇、丙酮和二恶烷。
下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
以下实施例中所使用的京尼平购自美国Sigma；慢速磁力搅拌器购自美国Sigma；完全培养基包含：DMEM/F12基础培养基、10％FBS、1％谷氨酰胺和1％NEAA；成骨诱导培养基包含：DMEM/F12基础培养基、10％FBS、1％谷氨酰胺、1％NEAA、200uM抗坏血酸、10mMβ～甘油磷酸和100nM地塞米松；成脂诱导培养基包含：基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mMIBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺。
实施例1微载体的制备
称量5g明胶，加入超纯水50mL，在70℃加热完全溶解，得到明胶溶液。
首先，按体积份数计，将5份明胶溶液和1份乳化剂乙酸乙酯混合，形成第一层油相，900rpm搅拌，形成第一乳浊液；然后，将1份第一乳浊液加入2份乳化剂橄榄油，形成第二层油相，450rpm搅拌1min后采用冰水浴迅速冷却到5℃以下，再以450rpm的速度继续搅拌30min，得到第二乳浊液；最后，加入第二乳浊液2倍体积的20℃的脱水脱油剂无水乙醇，搅拌脱水，得到明胶微球。
将明胶微球初产物采用脱水脱油试剂异丙醇和丙酮交替清洗之后用无水乙醇洗涤，80℃烘干，用75μm～300μm筛网依次过筛，加入明胶微球5倍体积的含0.5％京尼平的无水乙醇溶液，在4℃放置30h，随后在37℃放置36h。离心弃上清，再用5倍体积的无水乙醇清洗2～3次，100℃烘干，得到直径为75μm～300μm的明胶微载体。
将明胶微载体用不含钙、镁离子的PBS溶液4h膨胀后，吸取多余的PBS溶液，用PBS清洗2次，去清洗液，加入3倍微载体体积的PBS溶液，混匀，高温高压蒸汽灭菌30min后，吸取PBS上清，加入新配置PBS，将微载体分装到无菌的离心管中，于4℃保存。在接种细胞前，用细胞培养基重悬明胶微载体，然后置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中活化孵育3h。
实施例2
以Life A1033201MSC SFM CTSTM人间充质干细胞无血清培养基作为细胞培养基，分别制备微载体密度为10～20g/L的明胶微载体悬液和细胞密度为4×105cells/mL的P3代脂肪间充质干细胞悬液，然后将P3代脂肪间充质干细胞接种于含有微载体悬液的细胞培养瓶中，置于5％CO2、37℃、95％湿度的细胞培养箱内培养。
在细胞培养过程中，首先采用慢速磁力搅拌器以30rpm的转速转动10min，再静止20min，如此循环重复持续6h，然后再以65rpm的转速恒速进行搅拌培养，隔天进行半量换液。
待贴附于微载体上的细胞生长汇合度至80％～90％时，去掉培养液，用PBS～EDTA清洗2次，然后加入0.25％胰酶～EDTA消化30min，使得明胶微载体降解，再200g离心5min，收集细胞沉淀，用无血清培养基重悬细胞，待用。
实施例3
以Life A1033201MSC SFM CTSTM人间充质干细胞无血清培养基作为细胞培养基，分别制备微载体密度为10～20g/L的明胶微载体悬液和细胞密度为9×105cells/mL的P3代脂肪间充质干细胞悬液，然后将P3代脂肪间充质干细胞接种于含有微载体悬液的细胞培养瓶中，置于5％CO2、37℃、95％湿度的细胞培养箱内培养。
在细胞培养过程中，首先采用慢速磁力搅拌器以50rpm的转速转动2min，再静止20min，如此循环重复持续12h，然后再以65rpm的转速恒速进行搅拌培养，隔天进行半量换液。
待贴附于微载体上的细胞生长汇合度至80％～90％时，去掉培养液，用PBS～EDTA清洗2次，然后加入0.25％胰酶～EDTA消化30min，使得明胶微载体降解，再200g离心5min，收集细胞沉淀，用无血清培养基重悬细胞，待用。
实施例4
以Life A1033201MSC SFM CTSTM人间充质干细胞无血清培养基作为细胞培养基，分别制备微载体密度为10～20g/L的明胶微载体悬液和细胞密度为1×105cells/mL的P3代脂肪间充质干细胞悬液，然后将P3代脂肪间充质干细胞接种于含有微载体悬液的细胞培养瓶中，置于5％CO2、37℃、95％湿度的细胞培养箱内培养。
在细胞培养过程中，首先采用慢速磁力搅拌器以45rpm的转速转动5min，再静止20min，如此循环重复持续6h，然后再以65rpm的转速恒速进行搅拌培养，隔天进行半量换液。
待贴附于微载体上的细胞生长汇合度至80％～90％时，去掉培养液，用PBS～EDTA清洗2次，然后加入0.25％胰酶～EDTA消化30min，使得明胶微载体降解，再200g离心5min，收集细胞沉淀，用无血清培养基重悬细胞，待用。
实施例5
分别收集实施例2～4得到的脂肪间充质干细胞并加入台盼蓝溶液按照1:1的混合体积比进行染色，然后放入自动细胞计数仪中，检测脂肪间充质干细胞的细胞活力。图1为检测结果，如结果所示，本发明方法培养得到的细胞活率高达90％，说明本发明方法能够促进细胞增殖，增强细胞活力。
实施例6
分别收集实施例2～4中脂肪间充质干细胞培养培养至第4～5天的明胶微载体悬浮液1mL，去掉培养液，加入DAPI染色15秒后用PBS清洗2次，然后再荧光显微镜上拍照观察细胞贴壁明胶微载体的情况。如图2～图4所示，说明了各实施例细胞贴壁效果良好，基本上每个微载体均有细胞贴壁及增殖，且细胞增殖明显。说明本发明中细胞接种密度与微载体使用量搭配适宜，间隙搅拌的方式有利于细胞贴壁及增殖。
实施例7
收集实施例2得到的脂肪间充质干细胞进行流式检测，具体为：每管加入1×106个细胞，加入PBS溶液洗涤1次，1000rpm离心5min，弃上清，用PBS溶液吹打混匀细胞，然后分别加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA～DR抗体各2μL，设一管作为空白对照；接着，在4℃下避光反应15～20min，加入PBS染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min，弃上清，再避光加入500μL的含5％FBS的PBS上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品后采用流式细胞仪检测细胞表面抗原。
图5为检测结果，如图所示，阴性表面标志CD34、CD45、HLA～DR为均呈现阴性，间充质干细胞表面阳性标记物CD73、CD90，CD105均呈阳性，说明采用本发明方法能够有效的保持细胞的干细胞特性。
实施例8
收集实施例2得到的脂肪间充质干细胞进行诱导成骨分化鉴定，具体为：将收集后的细胞按照5×103个/cm2的细胞密度接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2～3天换液，28天后进行茜素红染色，然后观察染色结果。
如图6a和图6b所示，本发明方法培养得到的脂肪间充质干细胞经过成骨诱导4周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过本发明收集后的间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。
实施例9
收集实施例2得到的脂肪间充质干细胞进行诱导成脂分化鉴定，具体为：将收集后的细胞后按照5×103个/cm2的细胞密度接种于六孔板中，加入完全培养基24h后，加入成脂诱导培养基进行培养，每三天换一次液。四周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况。
由图7a和图7b所示，收集后的间充质干细胞经过成脂诱导4周后，由油红O染色可见红色油滴，说明经过本发明收集后的间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。

Claims (10)

1.一种规模化扩增间充质干细胞的方法，其特征在于，将间充质干细胞接种于明胶微载体悬液中进行悬浮培养；
所述悬浮培养采用间歇搅拌的方式进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间歇搅拌为：先以30～50rpm的转速搅拌2～10min后停止搅拌10～20min，如此循环持续6～12h，然后再以65rpm的转速恒速进行搅拌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间歇搅拌采用磁力搅拌器。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种的细胞密度为1×105～10×105cells/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述明胶微载体悬浮液为明胶微载体和无血清培养基的混合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述明胶微载体的密度为10～20g/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述明胶微载体为生物可降解微载体。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述明胶微载体的制备方法为：将明胶水溶液采用双乳法制备明胶微球，然后使用无水乙醇进行脱水，再在京尼平～无水乙醇溶液中交联，得到所述明胶微载体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述京尼平的质量百分比浓度为0.5％～1％。
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