CN101880648B - 一种胰腺腺泡细胞的原代培养方法 - Google Patents
一种胰腺腺泡细胞的原代培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种胰腺腺泡细胞的原代培养方法。本发明胰腺腺泡细胞的原代培养方法包括如下步骤：(1)制备胰腺腺泡细胞悬液；(2)Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化胰腺腺泡细胞。通过本发明方法可以成功培养出胰腺腺泡细胞，并可以顺利进行传代，细胞活性达96％以上，为胰腺腺泡细胞有关疾病的发病机理或药物治疗的研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种胰腺腺泡细胞的原代培养方法。
背景技术
目前虽对胰腺病的病理生理过程有一定的认识和了解，但其确切的发病机制尚不明了，尤其是重症急性胰腺炎的疗效尚欠满意。有研究发现，急性胰腺炎始发于腺泡细胞内，但在临床上，由于胰腺标本收集困难，严重影响了临床实验的进行。在实验室中，由于胰腺腺泡细胞是一种能分泌胰酶并进行自身消化的细胞，这就加大了体外原代培养腺泡细胞的难度。目前国外发表的有关原代培养胰腺腺泡细胞的文献较少，而且最长培养时间不超过20天，国内更未见报道。由此可见，成功原代培养胰腺腺泡细胞为今后进一步研究胰腺炎发病机制及新药开发提供了最便捷、有效的研究载体。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的胰腺腺泡细胞的培养中存在的体外原代培养难度大的问题，提供一种稳定的，可以顺利进行传代的胰腺腺泡细胞的原代培养方法。
本发明目的通过以下技术方案予以实现：
一种胰腺腺泡细胞的原代培养方法，包括如下步骤：(1)制备胰腺腺泡细胞悬液；(2)Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化胰腺腺泡细胞。
其中，步骤(1)中所述制备胰腺腺泡细胞悬液的方法如下：无菌条件下，将SD大鼠的胰腺取出剪碎，置于孵箱中孵育30min，过滤，用D-Hanks液洗涤2～3次得到细胞悬液，离心去上清，加入组织培养液，吹打混匀后移入细胞培养瓶，置于孵箱中培养。步骤(2)中，所述分离纯化胰腺腺泡细胞的方法如下：将步骤(1)中所得细胞接种于细胞培养瓶中，置于孵箱孵育60min后，翻转细胞培养瓶，用毛细吸管吸出细胞悬液，室温离心取沉淀物，用不含血清的DMEM培养液重悬沉淀物，反复吹打细胞悬液，将细胞悬液滴加于40％Percoll密度梯度离心液表面，离心，取出下层区带的细胞，即得到分离纯化的胰腺腺泡细胞。
作为一种优选方案，步骤(1)中所述过滤是依次用100目筛和200目筛的尼龙筛网过滤。
作为一种优选方案，步骤(1)中所述加入组织培养液的细胞悬液移入细胞培养瓶后，细胞的密度为1×107到5×107个/mL。
作为一种优选方案，步骤(2)中所述第一次离心的条件为1000rpm，10min；第二次离心的条件为2000rpm，15min。
作为一种优选方案，所述组织培养液为DMEM/F12，pH为7.35～7.45，包含的组分如下：10体积％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.25μg/mL两性霉素B，0.8mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂，5ng/mL表皮生长因子，HEPES缓冲液。
作为一种优选方案，所述孵箱中的温度为37℃，CO2含量为50mL/L。
作为一种优选方案，所述在于40体积％Percoll密度梯度离心液的制备包括如下步骤：先用9份Percoll与1份8.5wt％NaCl或1.5mol/L PBS混合达到生理性渗透压，用生理溶液稀释到40％浓度；所述生理溶液为0.85wt％NaCl或0.15mol/L PBS。
40％Percoll密度梯度离心液的具体制备过程如下：
Percoll浓度(％) 70 60 50 40 30 20
比重g/ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下，采用离心力为400g，时间10～20min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明胰腺腺泡细胞的原代培养方法取自大鼠胰腺，排除污染等影响可长期培养，通过多种方法鉴定细胞，证明本发明方法可使细胞保存完好的细胞活力(细胞活性达96％以上)；本发明首次通过胰腺腺泡细胞抗体鉴定细胞，培养的胰腺腺泡细胞纯度高，解决了胰腺腺泡体外原代培养难度大的问题，为胰腺腺泡细胞有关疾病的发病机理或药物治疗的研究奠定了基础。
附图说明
图1为新鲜分离的大鼠胰腺腺泡细胞在光学显微镜下的细胞形态(200倍)；
图2为采用本发明方法分离纯化的胰腺腺泡细胞在光学显微镜下的细胞形态(200倍)；
图3为采用本发明方法分离纯化的胰腺腺泡细胞培养12h后，在光学显微镜下的细胞形态(400倍)；
图4为采用本发明方法分离纯化的胰腺腺泡细胞培养24h后，在光学显微镜下的细胞形态(400倍)；
图5为台盼蓝染色分离纯化的胰腺腺泡细胞在光学显微镜下的细胞形态(400倍)；
图6～7为电镜下的胰腺腺泡细胞照片(8900倍、15500倍)；
图8为荧光显微镜下观察的经DAPI染核的胰腺腺泡细胞(200倍，微尺50μm)；
图9～12为免疫荧光镜下的胰腺腺泡细胞照片(400倍，微尺50μm)。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1 胰腺腺泡细胞的分离纯化
1.材料和方法
1.1动物
健康、清洁级SD大鼠，普通饲料喂养，雌雄不限，体重250～300g(广东省医学实验动物中心提供)。
1.2试剂
D-Hanks液；Percoll细胞分离液(Pharmacia)；生理盐水；消化液：I型胶原酶(Sigma)，使用时以新鲜配制的D-Hanks液(不含钙离子)配制0.5g/L的细胞分离液；100ml/L的小牛血清；DMEM/F12干粉培养基(Gibico)。其他成分：青霉素(Penicillin)；链霉素(Streptomycin)；两性霉素B(AmphotericinB)；大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitor，SBTI)；表皮生长因子(EpidermalGrowth Factor，EGF)；HEPES缓冲液(北京鼎国)；胰腺腺泡抗体；戊二醛；多聚甲醛；锇酸；PBS；乙醇；包埋剂；醋酸铀；丙酮；4wt％台盼蓝母液。
1.3设备
超净台；XDS-1型倒置镜(重庆光电仪器总公司)；CO2培养箱(英国，RSBiotech Laboratory Equipment Ltd.)；透射电子显微镜；超薄切片机。
1.4方法
1.4.1胰腺腺泡细胞悬液的制备
SD大鼠术前12小时禁食，不禁水。30g/L戊巴比妥钠按每100g体重0.1～0.2mL进行腹腔内注射麻醉，剪去腹部皮毛，将其浸于75体积％的乙醇中消毒30min，将实验动物在无菌条件下，腹部朝上固定于超净工作台上；充分暴露胰腺和胆总管，钳夹胰管末端，摘取大部分胰腺，将其浸于预热至37℃的D-Hanks液中，洗去血液，剃除血管、脂肪及淋巴组织，移入盛有5mL预热至37℃新鲜配制的细胞分离液的烧杯中；用眼科剪迅速将其减碎直至呈细沙样小块(约0.5～2mm)，置于37℃，50ml/L CO2孵箱中孵育30分钟，依次用100目筛和200目尼龙筛网过滤，然后吸取D-Hanks液洗涤2～3次得细胞悬液，以1000r/min的转速，离心5min，弃去上清液，重复步骤2次以清洗残留的胶原酶，加入5ml配置好的DMEM/F12组织培养液(含10体积％小牛血清；100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素；0.25μg/mL两性霉素B；0.8mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂；5ng/mL表皮生长因子；HEPES缓冲液调整PH至7.35～7.45)，吹打混匀后移入培养瓶，调整细胞密度至1×107到5×107，置入37℃，50ml/L CO2孵箱中培养。
1.4.2 Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化胰腺腺泡细胞
利用差速黏附法进行腺泡细胞的分离纯化，即将细胞悬液接种到培养瓶内，置37℃培养箱内孵育60min，使细胞悬液中黏附能力较强的成纤维细胞先行黏附。翻转培养瓶，用毛细吸管吸出处理后的细胞悬液，用于进一步的细胞分离。将腺泡细胞悬液于室温下，1000r/min离心10min，取沉淀物于不含血清的DMEM培养液中重新制成细胞悬液1.5mL，反复吹打。15mL离心管中制备40体积％Percoll密度梯度离心液，将细胞悬液轻轻滴加于细胞分离液表面，2000r/min，15min离心。离心后，取出下层区带的细胞即得纯化的腺泡细胞。
实施例2 胰腺腺泡细胞的鉴定
1 胰腺腺泡细胞形态学观察
胰腺腺泡细胞纯化前后、培养12h、1d、3d、5d、9d、15d、30d的胰腺腺泡细胞均在光镜下观察其细胞形态并拍照。
新鲜分离的大鼠胰腺腺泡细胞在光学显微镜下呈圆形或椭圆形，夹杂不规则形间质细胞及细胞碎片(图1)。采用Percoll细胞分离液分离纯化细胞后可见绝大多数的圆形或椭圆形悬浮生长的腺泡细胞，细胞质与核比例较大，核圆形，偏于一侧，细胞间杂质较少(图2)。12h后可见细胞聚集成串珠样，个别细胞体形变大，细胞拉长，呈分裂状态。(图3)。24h后可见细胞数有所增加，细胞聚集明显，可见多数细胞正处增殖中。2～3d换液后观察细胞，细胞活性好，细胞数目明显增多，传代良好(图4)。
2 台盼蓝染色鉴定细胞活力
称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨后加双蒸水至100mL，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4体积％。制备单细胞悬液，调整细胞密度至1×106/mL，取9mL细胞悬液移入试管中，加1mL 0.4wt％台盼蓝溶液，混匀后于镜下观察。
台盼蓝染色测定细胞活性达96％以上，符合进一步实验要求(图5)。
3 透射电子显微镜技术观察胰腺腺泡细胞亚显微结构
取原代培养的腺泡细胞悬液，1000r/min离心5min，弃去上清，用PBS洗2次，浸于固定液中，4℃中固定，吸取固定液，1M PBS缓冲液漂洗3次，每次7分钟后固定，1质量％锇酸固定90min，吸去溶液，1M PBS缓冲液漂洗3次，每次7分钟后分别于30体积％乙醇-50体积％乙醇-70体积％乙醇-80体积％乙醇-95体积％乙醇中脱水，每次10min，后用丙酮冲洗3次，每次10分钟。加入等体积的丙酮和包埋剂室温渗透1小时。吸去溶液，加入包埋剂3次，每次1h，最后一次更换包埋剂后室温放置过夜。用牙签挑起样品放入包埋块的尖端部分，并在其中渗透5小时后将包埋块放入70℃烘箱上层聚合15小时。取出包埋块，冷却，修块，切片厚度约为60nm左右，用铜网捞片，干燥后经铀染、水洗、铅染、水洗、干燥等步骤后在透射电子显微镜下观察腺泡细胞。
电镜下，大量的酶原颗粒位于细胞顶部的胞质内，直径600～900nm，细胞核圆形，多靠近细胞基底部，细胞内可见发达的粗面内质网，呈板层状分布于整个细胞基质中，在酶原颗粒聚集的区域可见高尔基复合体(图6、7)。
4 免疫荧光组化法鉴定腺泡细胞
取胰腺组织做冰冻切片2张，PBS冲洗3次，每次3min，用10体积％山羊血清封闭15min，每份加胰腺腺泡细胞抗体25μL，于湿盒中孵育1h，用PBS液冲洗3次，每次3min后FITC标记二抗结合35min，注意避光(DAPI染核)，用PBS液冲洗3次，每次1min，于荧光显微镜观察结果。
结果(图8)可见，胰腺腺泡细胞染成绿色荧光，而中间的胰腺β细胞不染色，说明此抗体可以很好的结合胰腺腺泡细胞，对其敏感性高，可用于鉴别胰腺腺泡细胞和胰腺β细胞。
取两瓶培养细胞，甩片机中每一小孔分别加入100μL细胞悬液，以1000转甩片4min，取出玻片，分别加入胰腺腺泡细胞抗体，设胰腺腺泡细胞(+)组、自身抗体阴性对照组，10体积％山羊血清封闭15分钟后每张玻片上加一抗25μL，湿盒中孵育后PBS液冲洗3次，每次1min，取出玻片，擦干水分，每标本中加入二抗(含DAPI)，填满标本表面，暗室内放置30min，PBS液冲洗3次，每次1min，取出玻片，擦干水分，光学树脂封片后于免疫荧光镜下观察。免疫荧光镜下鉴定腺泡细胞可见大量绿色荧光的腺泡细胞(图9)，与DAPI核染色一致(图10)，自身抗体阴性对照组(图12)未见绿色荧光细胞。图11是图9和图10的重叠照片。
Claims (1)
1.一种胰腺腺泡细胞的原代培养方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)制备胰腺腺泡细胞悬液；(2)Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化胰腺腺泡细胞；
其中，步骤(1)中所述制备胰腺腺泡细胞悬液的方法是：SD大鼠术前12小时禁食，不禁水，30g/L戊巴比妥钠按每100g体重0.1～0.2mL进行腹腔内注射麻醉，剪去腹部皮毛，将其浸于75体积％的乙醇中消毒30min，将实验动物在无菌条件下，腹部朝上固定于超净工作台上；充分暴露胰腺和胆总管，钳夹胰管末端，摘取大部分胰腺，将其浸于预热至37℃的D-Hanks液中，洗去血液，剃除血管、脂肪及淋巴组织，移入盛有5mL预热至37℃新鲜配制的细胞分离液的烧杯中；用眼科剪迅速将其减碎直至呈细沙样小块，置于37℃，50ml/L CO2孵箱中孵育30分钟，依次用100目筛和200目尼龙筛网过滤，然后吸取D-Hanks液洗涤2～3次得细胞悬液，以1000r/min的转速，离心5min，弃去上清液，重复步骤2次以清洗残留的胶原酶，加入5ml DMEM/F12组织培养液，吹打混匀后移入培养瓶，调整细胞密度至1×107到5×107，置入37℃，50ml/L CO2孵箱中培养；
所述DMEM/F12组织培养液的pH为7.35～7.45，包含的组分如下：10体积％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.25μg/mL两性霉素B，0.8mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂，5ng/mL表皮生长因子，HEPES缓冲液；
所述细胞分离液是以新鲜配制的不含钙离子的D-Hank液和I型胶原蛋白酶配制而成的细胞分离液，其中I型胶原蛋白酶在细胞分离液中的浓度为0.5g/L；
步骤(2)中所述Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化胰腺腺泡细胞具体步骤如下：将细胞悬液接种到培养瓶内，置37℃培养箱内孵育60min，使细胞悬液中黏附能力较强的成纤维细胞先行黏附；翻转培养瓶，用毛细吸管吸出处理后的细胞悬液，用于进一步的细胞分离，将腺泡细胞悬液于室温下，1000r/min离心10min，取沉淀物于不含血清的DMEM培养液中重新制成细胞悬液1.5mL，反复吹打；15mL离心管中制备40体积％Percoll密度梯度离心液，将细胞悬液轻轻滴加于细胞分离液表面，2000r/min，15min离心，离心后，取出下层区带的细胞即得纯化的腺泡细胞。
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