CN105713907B - 刺参itgb基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参itgb基因工程菌构建方法 - Google Patents

刺参itgb基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参itgb基因工程菌构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了刺参ITGB基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因工程菌构建方法，特点是刺参ITGB基因序列如SEQIDNO.1所示；其克隆方法为根据与ITGB基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长；刺参ITGB蛋白序列如SEQIDNO.2所示，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参ITGB蛋白；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌，优点是对内毒素脂多糖具有较强的结合能力，对肽聚糖、甘露聚糖具有较弱的结合作用。

Description

刺参ITGB基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因 工程菌构建方法
技术领域
本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种刺参ITGB基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因工程菌构建方法。
背景技术
β-整合素（β-Integrin，ITGB）为亲异性细胞粘附分子，主要介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间的相互作用。几乎存在于动植物细胞中。功能研究揭示脊椎动物的整合素发挥着维持机体完整性的功能，并在细胞识别、信号传导和传递，细胞增殖、分化、成熟、运动、游走的调控，以及炎症、创伤修复、肿瘤转移等生理和病理过程中发挥重要作用。目前，对无脊椎动物整合素（Integrin）的研究主要集中在Integrin在机体早期发育过程的作用，有关无脊椎动物Integrin参与机体免疫的研究较少。已有的相关研究主要多集中在Integrin的β-亚基（ITGB）参与的免疫防御反应。Integrin对无脊椎动物的细菌性疾病有关，Integrin可能通过与细菌上带有RGD结构域的配体结合，实现机体免疫细胞对细菌的吞噬和包囊作用，这在某种海洋无脊椎动物中已经被验证。例如虐蚊的Integrin具有吞噬大肠杆菌的功能(Ying et al., 2012), 此外，在牡蛎Integrin的研究中，病原相关分子模式（PAMPs）结合分析表明Integrin重组蛋白对脂多糖（LPS）有一定的结合活性，对肽聚糖（PGN）、甘露聚糖（Mannan）结合活性却明显偏低。通过与之前牡蛎的PAMPs结合实验对比，我们发现在相同浓度Integrin与3种内毒素孵育的条件下，刺参整合素（AjITGB）对LPS的结合活性是牡蛎结合活性的2倍，显示了更强的LPS结合活性，而刺参整合素对PGN，Mannan的结合活性也很低，表明了其也有对内毒素结合上的特异性。刺参整合素在PAMPs结合上的优越性，在刺参病害的防治中更能发挥重要的作用。
刺参（Apostichopus japanicus），是属于棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothuridea）、循手目（Aspidochirota）的重要经济种类，是一种高蛋白、低脂肪、低糖、无胆固醇的重要经济养殖水产动物。但由病原菌引发的疾病严重制约了该产业的健康持续发展。目前对刺参病害的解决办法主要是发病以后的救治，而无法做到病前的预防和发现，此类做法的结果往往会对刺参养殖业造成很大的损失，因此，筛选特异性好, 结合活性强的革兰氏阴性菌结合分子是在必行,同时，通过构建水产动物整合素基因表达工程菌，从而产生工业化、高产量的刺参整合素，通过向患病刺参的生活环境中添加目的蛋白，在刺参自身产生整合素的基础上增加了整合素对阴性致病菌的结合能力，从而提升刺参机体的免疫力，可以为刺参的发病提供一种解决手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种刺参ITGB基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因工程菌构建方法，表达的重组刺参β-整合素蛋白对脂多糖具有更强的结合活性，对肽聚糖、甘露聚糖结合活性较低。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种刺参ITGB基因，该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。
2、上述刺参ITGB基因的克隆方法，根据与ITGB基因同源的表达序列标签EST序列设计基因特异性引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体的步骤如下：
（1）通过对灿烂弧菌诱导刺参血细胞cDNA文库的表达序列标签分析，发现了多条编码ITGB基因的表达序列标签序列，选取编码刺参ITGB部分片段的表达序列标签克隆；
（2）RACE引物设计：根据编码刺参ITGB部分片段的表达序列标签克隆设计RACE的巢式引物： 3’上游特异性引物1：GGTTCATTGTCAAATCGGAG，3’上游特异性引物2：GATTACGTCGCTCTGGTCCA，5’下游特异性引物1：CCAACAATTCTGCAACCTCCG，
5’下游特异性引物2：TGCAACAAGGGGCACTTGGAG, 扩增3’接头引物Adaptor3：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT，扩增5’接头引物Adaptor5：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA ；
（3）RACE扩增获取ITGB基因全长序列，具体步骤如下：
a．总RNA提取：参照上面刺参体腔液收集体腔细胞的方法制备RNA提取液；
b． 3’-RACE扩增：将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™RTase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR 扩增，取PCR稀释后的产物1 ul作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增得到3’端目的条带；
c．5’-RACE扩增：将上述RNA提取液用5’-Full RACE Kit试剂盒逆转录合成扩增5’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用5’下游特异性引物1和Adaptor5进行PCR 扩增，取PCR产物稀释后1 ul作为模板，再用5’下游特异性引物2和Adaptor5进行PCR得到5’端目的条带；
d. 将上述扩增产物的目的条带用胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α 后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得刺参ITGB基因全长序列，其基因序列如SEQIDNO.1所示。
上述RACE扩增反应体系：模板1.0 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度25 mM的MgCl2 2.0 μL，浓度10 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的接头引物1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：15.3 μL；扩增条件：94 ℃ 3 min、94 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
3、上述刺参ITGB基因的编码蛋白，该编码蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。
4、利用上述刺参ITGB基因编码蛋白构建重组刺参ITGB基因工程菌的方法，步骤如下：（1）设计PCR引物，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参ITGB蛋白编码序列；（2）将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-ITGB；（3）对重组质粒pET28a（+）-ITGB进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌。
具体步骤如下：
（1）ITGB基因全长克隆及重组蛋白的构建与表达
a．总RNA提取：取刺参体腔液制备得到RNA提取液；
b．cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参ITGB编码蛋白，其基因序列如SEQIDNO.2所示，其中
含BmH I位点ITGB上游扩增引物：GGATCCATGGCTGTGAGAACCCAGTT；
含Not I位点ITGB下游扩增引物：GCGGCCGCTCATGTCATGCTGTCAACTAATG ；
c．PCR扩增：cDNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度25 mM的MgCl2 2.0 μL，浓度10 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的上游引物1.0 μL，浓度10 μM 的下游引物1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：15.3 μL ；扩增条件：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、60 ℃30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min ；
d．PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；
e．重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmH I和Not I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在30KDa的目的条带，与经同样酶切的pET28a（+）原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28a（+）-ITGB重组质粒；
f．重组蛋白的表达：将阳性重组质粒pET28a（+）-ITGB转化到表达宿主BL21（DE3），再接种到卡那霉素浓度为50 ug/mL的LB培养液中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物；
（2）重组蛋白的纯化与复性
a、蛋白纯化：将100 mL细菌沉淀物用10 mL包涵体洗涤液重悬菌体，超声破碎菌体，12000 rpm离心10 min，用5 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液基本变清，再次15000 rpm离心20 min ，吸取1 mL Ni-NTA SefinoseTM Resin上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与之前上柱的Ni-NTA SefinoseTM Resin混合，4℃混匀1 h；将收集的流出液重复上柱2 次，用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次 10 mL，洗脱10次后，加入0.6 mL变性蛋白洗脱液洗脱，液体去尽；再加入1 mL变性蛋白洗脱液洗脱，收集洗脱液，重复用1 mL变性蛋白洗脱液洗脱五次，收集每次洗脱液合并，取少量洗脱液进行SDS-PAGE电泳鉴定，获得重组刺参ITGB蛋白；
b、蛋白复性：纯化后的重组刺参ITGB蛋白分别用透析液Buffer1、透析液Buffer2、透析液Buffer3透析，每步透析6-18h，最后，4 ℃ 12000r/min离心30 min，收集沉淀，即为重组刺参ITGB基因工程菌。
上述步骤（2）中，
所述的包涵体洗涤液配方：2 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.5% Triton×100，pH=7.9；
所述的包涵体溶解液配方为：8 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.2% Triton×100，30 mM咪唑，pH=7.9；
所述的杂蛋白洗涤液配方为：6 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.1% Triton×100，2 M咪唑，pH=7.9；
所述的变性蛋白洗脱液配方为：1.2 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，2 M咪唑，pH=4.5。
所述的透析液Buffer1配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，3 M尿素，50 mL甘油，50 ul 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；
所述的透析液Buffer2配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，1 M 尿素，50 mL甘油，50 ul 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；
所述的透析液Buffer3配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，50 mL甘油，定容于1L，pH=7.9。
5、上述重组刺参ITGB基因工程菌的应用，其表达的重组刺参β1-整合素对内毒素脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖具有不同程度显著的结合作用，对内毒素脂多糖具有更强的结合活性，对肽聚糖、甘露聚糖的结合能力偏低。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明利用基因工程技术，通过3’端cDNA快速扩增（3’-RACE）以及5’端cDNA快速扩增（5’-RACE）的方法，首次从刺参中克隆得到了ITGB基因cDNA序列，同时对刺参ITGB 蛋白质进行重组质粒的构建和表达，获得了一株具有对脂多糖具有较强结合活性的重组β-整合素的基因工程菌，本发明优点在于：
a、利用基因工程技术获得的重组蛋白与化学合成法相比具有成本低的优点；
b、该重组蛋白具有高效的、特异性的内毒素结合活性，通过本研究的方法将工程菌产生的整合素蛋白投放于刺参养殖环境中，在刺参自身产生整合素的基础上增加了整合素对阴性致病菌的结合能力，从而提升刺参机体的免疫力，可以为刺参的发病提供一种解决手段。
附图说明
图1为刺参重组β-整合素的SDS-PAGE分析，M泳道为蛋白质分子量标准，1为杂蛋白，2为变性蛋白洗涤液，3为重组蛋白；
图2为重组刺参β-整合素蛋白(ITGB)基因工程菌对内毒素脂多糖的结合活性分析图；
图3为重组刺参β-整合素蛋白(ITGB)基因工程菌对内毒素肽聚糖的结合活性分析图；
图4为重组刺参β-整合素蛋白(ITGB)基因工程菌对内毒素甘露聚糖的结合活性分析图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
ITGB基因克隆与序列分析
a、通过前期对灿烂弧菌诱导刺参血细胞cDNA文库的EST（表达序列标签）分析，发现了多条编码ITGB基因的EST序列（Pengjuan Zhang, Chenghua Li, Lin Zhu, XiurongSu, Ye Li, Chunhua Jin, Taiwu Li. De Novo assembly of the sea cucumberApostichopus japonicus hemocytes transcriptome to identify miRNA targetsassociated with skin ulceration syndrome. Plos ONE 2013. 8(9):e73506.），对其中一个EST克隆进行测序分析，表明该克隆编码刺参ITGB的部分片段；
b、RACE引物设计：对上述步骤a中所述的部分ITGB片段设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：GGTTCATTGTCAAATCGGAG，3’上游特异性引物2：GATTACGTCGCTCTGGTCCA；5’下游特异性引物1：CCAACAATTCTGCAACCTCCG,
5’下游特异性引物2：TGCAACAAGGGGCACTTGGAG, 扩增3’接头引物Adaptor3：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT, 扩增5’接头引物Adaptor5：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA ;
c、RACE扩增获取ITGB基因全长序列，具体步骤如下：
（1）总RNA提取：取刺参体腔液1.0 mL，800 g离心5 min，收集血细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至EP管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇水溶液1 mL，4℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
（2）3’-RACE扩增：将上述RNA提取液用3’-Full RACE Core Set withPrimeScript™ RTase试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增3’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物Adaptor3进行PCR 扩增，取PCR稀释产物1 ul作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物Adaptor3进行PCR得到3’端目的条带；
（3）5’-RACE扩增：将上述RNA提取液用5’-Full RACE Kit试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增5’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用5’下游特异性引物1和Adaptor5进行PCR 扩增，取PCR稀释产物1 ul作为模板，再用5’下游特异性引物2和Adaptor5进行PCR得到5’端目的条带；
（4）将上述扩增产物3’端目的条带和5’端目的条带用胶回收试剂盒（BioTeke）回收，回收产物与载体pMD18-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生工生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到全长序列；
其中，RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度25mM的MgCl2 2.0 μL，浓度10 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的Adaptor 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：15.3 μL；扩增条件：94 ℃ 3min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
最终得到的刺参ITGB基因cDNA序列如SEQIDNO.1所示，该序列全长1038 bp，包括738 bp的开放阅读框，编码246个氨基酸，5’非编码区长196 bp，3’非编码区长104 bp， 有多聚腺苷酸信号，mRNA末端不稳定信号以及序列末端含有典型的polyA尾；刺参ITGB蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，该蛋白分子量为26.36KDa，等电点为4.67，其中编码序列的1-30为信号肽序列，31位为S-甘油二酯半胱氨酸或N-棕榈半胱氨酸，可以与RGD ( Arg-Gly-Asp) 配体结合位点。该蛋白定位于刺参的细胞膜上，含有1个原核生物脂质结合位点。
具体实施例二
ITGB基因全长克隆及重组蛋白的构建与表达
a、总RNA提取：取刺参体腔液1.0 mL，800 g离心5 min，收集血细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至EP管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇水溶液1 mL， 4℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（Takara）转录cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，然后用带酶切位点的引物对合成的cDNA进行PCR扩增，即如下所示：
ITGB F(BmH I)上游引物：GGATCCATGGCTGTGAGAACCCAGTT；
ITGB R (Not I)下游引物：GCGGCCGCTCATGTCATGCTGTCAACTAATG；
c、PCR扩增：cDNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度25 mM的MgCl2 2.0 μL，浓度10 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的上游引物1.0 μL，浓度10 μM 的下游引物1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：15.3 μL ；扩增条件：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、60 ℃30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min ；
d、PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒（BioTeke）回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD18-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的阳性克隆质粒；
e、重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmH I和Not I（New England Biolabs，NEB）限制性内切酶双酶切，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体连接，转化Escherichia coliDH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-ITGB，将阳性重组质粒pET28（a）-ITGB转化到表达宿主BL21（DE3）（Novagen公司），再接种到卡那霉素浓度为50 μg/mL的LB培养液（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，得到细菌沉淀物。
具体实施例三
重组蛋白的纯化与复性
a、蛋白纯化：离心收集细菌后，每100 mL培养物用10 mL包涵体洗涤液重悬菌体，超声破碎菌体，12000 rpm离心10 min，用5 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液基本变清，再次15000 rpm离心20 min ，吸取1 mL Ni-NTA SefinoseTM Resin（上海生工，编号：BSP033）上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次。将上清液与之前上柱的Ni-NTA SefinoseTM Resin混合，4℃混匀1 h。收集的流出液重复上柱2 次，用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次 10 mL，洗脱10次后，加入0.6 mL变性蛋白洗脱液洗脱，液体去尽；再加入1mL变性蛋白洗脱液洗脱，收集洗脱液，重复用1 mL变性蛋白洗脱液洗脱五次，收集每次洗脱液合并，取少量洗脱液进行SDS-PAGE电泳鉴定（图1），获得重组刺参ITGB蛋白（图1，箭头所示即为目的蛋白）；
b、蛋白复性：纯化后的重组刺参ITGB蛋白分别用透析液Buffer1、透析液Buffer2、透析液Buffer3透析，每步透析6-18h，最后，4 ℃ 12000r/min离心30 min，收集沉淀，即为重组刺参ITGB基因工程菌，溶解至所需的浓度用于刺参重组蛋白的内毒素结合活性分析。
上述包涵体洗涤液配方为：2 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.5% Triton×100，pH=7.9；
上述包涵体溶解液配方为：8 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.2% Triton×100，30 mM咪唑，pH=7.9；
上述杂蛋白洗涤液配方为：6 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.1% Triton×100，2 M咪唑，pH=7.9；
所述的变性蛋白洗脱液配方为：1.2 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，2 M咪唑，pH=4.5。
上述透析液Buffer1配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，3 M尿素，50 mL甘油，50 ul 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；
上述透析液Buffer2配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，1 M 尿素，50 mL甘油，50 ul 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；
上述透析液Buffer3配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，50 mL甘油，定容于1 L，pH=7.9。
具体实施例四
刺参重组蛋白的内毒素结合活性分析
a、将3种内毒素脂多糖（Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111：B4，LPS, Sigma），肽聚糖（PGN,源叶），甘露聚糖（Mannan from Saccharomyces cerevisiae，Sigma）分别溶于50mmol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液，终浓度为0.2mg/mL。取3种内毒素各20μL加入96孔板，每组设置5个重复，4℃孵育过夜；
b、将孵育过夜的3种内毒素分别用PBST缓冲液洗3次后，用200μL，5%BSA缓冲液封闭，37℃，静置1h；
c、倒掉上一步的BSA缓冲液，用PBST缓冲液洗3次，3种内毒素中分别加入具体实施例三获得的重组刺参β-整合素蛋白(ITGB)基因工程菌、加His标签的对照蛋白 (细胞外信号调节激酶ERK)、空白对照（0.05M，pH7.4 Tris-HCl缓冲盐溶液TBS）各100μL，根据β-整合素蛋白浓度（7.08μg/μL），设置5个不同的浓度组，分别为20%，40%，60%，80%，100%蛋白浓度，37℃孵育1h；
d、用PBST缓冲液洗3次，每孔加入100μLMouse Anti-His Tag单抗（1：1000）, 37℃孵育1h；
e、将上一步溶液轻轻倒出，PBST洗3次，加入100μL的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1:3000），37℃孵育1h；
f、将上一步溶液轻轻倒出，PBST洗4次，加入100μL PNPP显色液（北京赛驰生物科技公司），室温孵育30min；
g、向上一步的96孔板中加入50μL，3mol/L NaOH终止液，孵育15min终止反应，405nm波长测定溶液的吸光度。
结果显示，如图2、图3和图4所示，刺参重组粘附性蛋白β整合素对脂多糖有显著地结合活性，对肽聚糖以及甘露聚糖结合活性较弱。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.一种刺参ITGB基因，其特征在于该基因为SEQIDNO.1所示的cDNA序列。
2.一种权利要求1所述的刺参ITGB基因的克隆方法，其特征在于：根据与ITGB基因同源的表达序列标签EST序列设计基因特异性引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体的步骤如下：
(1)通过对灿烂弧菌诱导刺参血细胞cDNA文库的表达序列标签分析，发现了多条编码ITGB基因的表达序列标签序列，选取编码刺参ITGB部分片段的表达序列标签克隆；
(2)RACE引物设计：根据编码刺参ITGB部分片段的表达序列标签克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：GGTTCATTGTCAAATCGGAG，3’上游特异性引物2：GATTACGTCGCTCTGGTCCA，5’下游特异性引物1：CCAACAATTCTGCAACCTCCG，
5’下游特异性引物2：TGCAACAAGGGGCACTTGGAG,扩增3’接头引物Adaptor3：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT，扩增5’接头引物Adaptor5：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA；
(3)RACE扩增获取ITGB基因全长序列，具体步骤如下：
a.总RNA提取：取刺参体腔液制备得到RNA提取液；
b.3’-RACE扩增：将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR扩增，取PCR稀释后的产物1ul作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增得到3’端目的条带；
c.5’-RACE扩增：将上述RNA提取液用5’-Full RACE Kit试剂盒逆转录合成扩增5’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用5’下游特异性引物1和Adaptor5进行PCR扩增，取PCR产物稀释后1ul作为模板，再用5’下游特异性引物2和Adaptor5进行PCR得到5’端目的条带；
d.将上述扩增产物的目的条带用胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得刺参ITGB基因全长序列，其基因序列如SEQIDNO.1所示，其中LB平板培养基配方为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。
3.根据权利要求2所述的一种刺参ITGB基因的克隆方法，其特征在于RACE扩增反应体系：模板1.0μL，10×PCR缓冲液2.5μL，浓度25mM的MgCl2 2.0μL，浓度10mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的特异性引物1.0μL，浓度10μM的接头引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水：15.3μL；扩增条件：94℃3min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
4.一种权利要求1所述的刺参ITGB基因的编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。
5.一种刺参ITGB基因的重组工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)ITGB基因全长克隆及重组蛋白的构建与表达
a.总RNA提取：取刺参体腔液制备得到RNA提取液；
b.cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参ITGB蛋白的编码基因，其蛋白序列如SEQIDNO.2所示，其中
含BamH I位点ITGB上游扩增引物：GGATCCATGGCTGTGAGAACCCAGTT；
含Not I位点ITGB下游扩增引物：
GCGGCCGCTCATGTCATGCTGTCAACTAATG；
c.PCR扩增：cDNA 1.0μL，10×PCR缓冲液2.5μL，浓度25mM的MgCl2 2.0μL，浓度10mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的上游引物1.0μL，浓度10μM的下游引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水：15.3μL；扩增条件：94℃3min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；
d.PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50ug/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；
e.重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BamH I和Not I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在30KDa的目的条带，与经同样酶切的pET28a(+)原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28a(+)-ITGB重组质粒；
f.重组蛋白的表达：将阳性重组质粒pET28a(+)-ITGB转化到表达宿主BL21(DE3)，再接种到卡那霉素浓度为50ug/mL的LB培养液中，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-6h，收集菌液，经12000r/min离心5min，弃上清液，获得细菌沉淀物；
(2)重组蛋白的纯化与复性
a、蛋白纯化：将100mL细菌沉淀物用10mL包涵体洗涤液重悬菌体，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，用5mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液基本变清，再次15000rpm离心20min，吸取1mL Ni-NTA SefinoseTMResin上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与之前上柱的Ni-NTA SefinoseTMResin混合，4℃混匀1h；将收集的流出液重复上柱2次，用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10mL，洗脱10次后，加入0.6mL变性蛋白洗脱液洗脱，液体去尽；再加入1mL变性蛋白洗脱液洗脱，收集洗脱液，重复用1mL变性蛋白洗脱液洗脱五次，收集每次洗脱液合并，取少量洗脱液进行SDS-PAGE电泳鉴定，获得重组刺参ITGB蛋白；
b、蛋白复性：纯化后的重组刺参ITGB蛋白分别用透析液Buffer1、透析液Buffer2、透析液Buffer3透析，每步透析6-18h，最后，4℃12000r/min离心30min，收集沉淀，即为重组刺参ITGB蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种刺参ITGB基因的重组工程菌的构建方法，其特征在于上述步骤(2)中，
所述的包涵体洗涤液配方：2M尿素，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，0.5％Triton×100，pH＝7.9；
所述的包涵体溶解液配方为：8M尿素，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％β-巯基乙醇，0.2％Triton×100，30mM咪唑，pH＝7.9；
所述的杂蛋白洗涤液配方为：6M尿素，1M Tris-HCl，2.5M NaCl，0.1％β-巯基乙醇，0.1％Triton×100，2M咪唑，pH＝7.9；
所述的变性蛋白洗脱液配方为：1.2M尿素，1M Tris-HCl，2.5M NaCl，2M咪唑，pH＝4.5；
所述的透析液Buffer1配方为：1M Tris-HCl，2.5M NaCl，0.614g还原型谷胱甘肽，0.0122g氧化型谷胱甘肽，2M咪唑，3M尿素，50mL甘油，50ul吐温-20，定容于1L，pH＝7.9；
所述的透析液Buffer2配方为：1M Tris-HCl，2.5M NaCl，0.614g还原型谷胱甘肽，0.0122g氧化型谷胱甘肽，2M咪唑，1M尿素，50mL甘油，50ul吐温-20，定容于1L，pH＝7.9；
所述的透析液Buffer3配方为：1M Tris-HCl，2.5M NaCl，50mL甘油，定容于1L，pH＝7.9。
7.一种权利要求5-6中任一项所述的刺参ITGB基因的重组工程菌的应用，其特征在于：其表达的重组刺参β1-整合素对内毒素脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖具有不同程度显著的结合作用，对内毒素脂多糖具有更强的结合活性，对肽聚糖、甘露聚糖的结合能力偏低。
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Denomination of invention: Stichopus japonicus ITGB gene, coding protein, cloning method, and construction method of recombinant Stichopus japonicus ITGB genetic engineering strain

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License type: Common License

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