JP2013530982A

JP2013530982A - 気道感染症の処置のための方法及び医薬組成物

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Publication number: JP2013530982A
Application number: JP2013515977A
Authority: JP
Inventors: シラール，ジャン−クロード; シャバルゴイティ，ホセ・ア
Original assignee: アンスティチュナショナルドゥラサンテエドゥラルシェルシュメディカル; アンスティトゥーパストゥールドリール
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2013-08-01
Anticipated expiration: 2030-06-25
Also published as: US20140206601A1; KR101768118B1; BR112012033121A2; CN103037887A; WO2011161491A1; CA2800206C; KR20140005843A; BR112012033121B1; ES2690760T3; EP2585094B1; CN103037887B; US20130150286A1; US10426816B2; EP2585094A1; CA2800206A1; JP5746761B2

Abstract

本発明は、気道感染症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、気道感染症を処置するための方法における使用のための、ＴＬＲ５アゴニストに関する。

Description

気道感染症は、上気道（例えば、鼻、耳、副鼻腔及び咽喉）及び下気道（例えば、気管、気管支及び肺）に多い感染症である。上気道感染症の症状は、鼻汁又は鼻詰まり、過敏、落ち着きのなさ、食欲不振、活動レベル低下、咳及び発熱を含む。

ウイルス性気道感染症は、咽喉痛、悪寒、クループ及びインフルエンザを引き起こし、及び／又はそれらに関連する。上気道感染症及び下気道感染症を引き起こすウイルスの例は、ライノウイルス並びにインフルエンザウイルスＡ及びＢを含む。

一般的な細菌性呼吸器感染症は、例えば百日咳及び連鎖球菌性咽頭炎を引き起こし、及び／又はそれらに関連する。上気道感染症及び下気道感染症を引き起こす細菌の例は、Streptococcus pneumoniaeである。Streptococcus pneumoniae（肺炎球菌）は、世界的に、幼児及び高齢者の間に気道感染症を引き起こす。莢膜多糖類は、主な毒性因子であり、その組成は、９１個の血清型の肺炎球菌を定義する。特定の血清型は、ヒトの鼻咽頭（これは、個人間で細菌が伝染するための貯留体の代表的なものである）に無症候的に定着する。定着が肺炎球菌性肺炎及び侵襲性疾患に進行し得る者も何人かいる。対照的に、血清型１のような血清型は、定着にほとんど関連しないが、侵襲性感染症を引き起こす。

気道感染症のための現在の治療は、それぞれウイルス、細菌及び真菌性気道感染症の処置、予防又は改善のための抗ウイルス剤、抗細菌剤並びに抗真菌剤の投与を含む。不幸にも、特定の感染症に関しては、治療がないか、感染症が治療に抗療性であることが証明されたか、又は副作用の発生が被験体に治療を施す有益性を上回っている。細菌性気道感染症の処置のための抗細菌剤の使用も副作用を生じるか、又は耐性細菌株をもたらし得る。抗真菌剤の投与は、腎不全又は骨髄機能障害を引き起こし得るか、又は免疫系が抑制された被験体では真菌感染症に対して有効であり得ない。加えて、感染症を引き起こす微生物（例えば、ウイルス、細菌又は真菌）は、投与された治療剤又は治療剤の組み合わせに耐性であり得るか、又は耐性を発達させ得る。実際に、投与された治療剤に耐性を発達させる微生物は、多面性薬剤耐性又は多剤耐性（すなわち、投与された薬剤のメカニズムとは異なるメカニズムで作用する治療剤に対する耐性）を発達させることが多い。従って、薬物耐性の結果として、多くの感染症は、広範囲の標準的処置プロトコールに抗療性であることを証明している。

従って、気道感染症及びその症状の処置、予防、管理及び／又は改善のための新たな治療が必要である。

先天的防御の活性化は、肺炎球菌感染症をコントロールするのに不可欠である。ｔｏｌｌ様レセプター２（ＴＬＲ２）、ＴＬＲ４及びＴＬＲ９並びにアダプターＭｙＤ８８は、肺における肺炎球菌の早期検出及びクリアランスに関与している。Ｎｏｄ１及びＮｏｄ２を含む細胞質レセプターヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（Ｎｏｄ）も、肺炎球菌の認識に関与している。ＴＬＲシグナル伝達は、多形核好中球（ＰＭＮ）及びマクロファージのような食細胞のリクルート並びに殺菌剤の産生をもたらす先天的な粘膜反応を活性化する。このプロセスは、食作用による病原体の急速な根絶及び細胞外殺傷をトリガーする。ＭｙＤ８８欠損動物において、S. pneumoniaeは、本質的には、気道へのＰＭＮリクルートを全くトリガーできず、動物は、肺炎に対する高い感受性を有する。いくつかのＭｙＤ８８多型が、肺炎球菌感染症に対する感受性の増加に関連していることを示す最近の研究によって、ヒトにおけるＴＬＲシグナル伝達の貢献が注目されている。

生来のレセプターの活性によって免疫をモデュレーションすることは、感染症に対する防御反応を引き出す新たなコンセプトである。その論理的根拠は、病原体自体によってトリガーされる先天性反応を、規模、質及び動力において大きく上回る先天性反応を促進することである。感染症疾患の治療的処置に関するＴＬＲアゴニストの有効性は、気道感染症のモデルを含むいくつかの動物モデルにおいて実証されている（Brown, K. L., C. Cosseau, J. L. Gardy and R. E. Hancock 2007. Complexities of targeting innate immunity to treat infection. Trends Immunol 28:260-266.; Lembo, A., M. Pelletier, R. Iyer, M. Timko, J. C. Dudda, T. E. West, C. B. Wilson, A. M. Hajjar, and S. J. Skerrett. 2008. Administration of a synthetic TLR4 agonist protects mice from pneumonic tularemia. J Immunol 180:7574-7581; Romagne, F. 2007. Current and future drugs targeting one class of innate immunity receptors: the Toll-like receptors. Drug Discov Today 12:80-87）。ＴＬＲ５は、鞭毛の主な構成要素である細菌のフラジェリンを識別する。上皮細胞を含む様々な肺菅細胞がＴＬＲ５を発現しているが、気道感染症の処置に関して、ＴＬＲ５シグナル伝達経路のモデュレーションは、まだ研究されていない。

発明の詳細な説明： Streptococcus pneumoniaeは、幼児及び高齢者における肺炎の主な原因である。先天的防御は、肺炎球菌感染症をコントロールするのに不可欠であり、不完全な反応は、感受性者において疾患をトリガーし得る。本明細書において、本発明者らは、フラジェリンが、先天性免疫を局所的に活性化し、それによって急性肺炎に対する抵抗性を高め得ることを示した。フラジェリン粘膜処置は、肺におけるS. pneumoniaeクリアランスを改善し、感染症に対する生存の増加を促進した。加えて、感染マウスの処置後に、肺構造は完全に修復されたが、これは、フラジェリンが定常状態条件を回復させることを示している。ＴＬＲ５を介してシグナル伝達できないフラジェリン突然変異体を使用して、本発明者らは、ＴＬＲ５シグナル伝達が防御に不可欠であることを立証した。気道において、フラジェリンは、好中球の浸潤を気道に誘導し、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２及びＣＣＬ２０をコードする遺伝子の発現をアップレギュレーションした。枯渇抗体を使用して、本発明者らは、好中球が防御の主なエフェクターであることを実証した。さらに、本発明者らは、Ｂ及びＴ細胞欠損ＳＣＩＤマウスが、S. pneumoniaeチャレンジを免疫応答性動物と同程度までクリアすることを見出したが、これは、これらの細胞集団がフラジェリン誘導性防御に必要ではないことを示唆している。結論として、この結果は、S. pneumoniaeによって自然に引き起こされるのではなくＴＬＲによる先天性免疫の粘膜刺激が、肺炎球菌性肺炎を治癒する効能を高め得ることを強調している。また、あらゆる特定の理論に束縛されることなく、本発明者らは、ＴＬＲ５による先天性免疫の粘膜刺激が、気道感染症の処置のための関連方法も示していると考えている。例えば、分類不可能なHaemophilus influenzae溶解物のような微生物産物（これは、呼吸経路によって先天性免疫を刺激することが公知である）は、S. pneumoniae感染症（Clement CG, Evans SE, Evans CM, Hawke D, Kobayashi R, Reynolds PR, Moghaddam SJ, Scott BL, Melicoff E, Adachi R, Dickey BF, Tuvim MJ. Stimulation of lung innate immunity protects against lethal pneumococcal pneumonia in mice. Am J Respir Crit Care Med. 2008 ;177:1322-30.）を含む様々な呼吸器感染症を防御することができる（Evans SE, Scott BL, Clement CG, Larson DT, Kontoyiannis D, Lewis RE, Lasala PR, Pawlik J, Peterson JW, Chopra AK, Klimpel G, Bowden G, Hook M, Xu Y, Tuvim MJ, Dickey BF. Stimulated innate resistance of lung epithelium protects mice broadly against bacteria and fungi. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010 ;42:40-50）。このような呼吸器感染症は、細菌、ウイルス及び真菌によって誘導される疾患を含む。

従って、本発明は、気道感染症を処置するための方法における使用のための、ＴＬＲ５アゴニストに関する。

「気道感染症」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、生きている微生物によって誘導される上気道（例えば、鼻、耳、副鼻腔及び咽喉）及び下気道（例えば、気管、気管支及び肺）の指定感染症を意図する。

ウイルス感染症を引き起こすウイルスの例は、レトロウイルス（例えば、ヒトＴ細胞向性ウイルス（ＨＴＬＶ）Ｉ型及びＩＩ型、並びにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型及びＩＩ型、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、ＨＨＶ６−ＨＨＶ８、並びにサイトメガロウイルス）、アレナウイルス（例えば、ラッサ熱ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルスィルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ムンプス、ｈＭＰＶ及びニューモウイルス）、アデノウイルス、ブニアウイルス（例えば、ハンタウイルス）、コルナウイルス（ｃｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ）、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱病ウイルス及び日本脳炎ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、オルトミオウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ及びＣ、並びにＰＩＶ）、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス、エンテロウイルス、及びＡ型肝炎ウイルス）、ポックスウイルス、レオウイルス（例えば、ロタウイルス）、トガウイルス（例えば、ルベラウイルス）、並びにラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）を含むが、これらに限定されない。

細菌性気道感染症を引き起こす細菌の例は、Aquaspirillum科、Azospirillum科、Azotobacteraceae科、Bacteroidaceae科、Bartonella種、Bdellovibrio科、Campylobacter種、Chlamydia種（例えば、Chlamydia pneumoniae）、Clostridium、Enterobacteriaceae科（例えば、Citrobacter種、Edwardsiella、Enterobacter aerogenes、Erwinia種、Escherichia coli、Hafnia種、Klebsiella種、Morganella種、Proteus vulgaris、Providencia、Salmonella種、Serratia marcescens及びShigella flexneri）、Gardinella科、Haemophilus influenzae、Halobacteriaceae科、Helicobacter科、Legionallaceae科、Listeria種、Methylococcaceae科、mycobacteria（例えば、Mycobacterium tuberculosis）、Neisseriaceae科、Oceanospirillum科、Pasteurellaceae科、Pneumococcus種、Pseudomonas種、Rhizobiaceae科、Spirillum科、Spirosomaceae科、Staphylococcus（例えば、メチシリン耐性Staphylococcus aureus及びStaphylococcus pyrogenes）、Streptococcus（例えば、Streptococcus enteritidis、Streptococcus Fasciae及びStreptococcus pneumoniae）、Vampirovibr Helicobacter 科及びVampirovibrio科を含むが、これらに限定されない。

真菌感染症を引き起こす真菌の例は、Absidia種（例えば、Absidia corymbifera及びAbsidia ramosa）、Aspergillus種（例えば、Aspergillus fiavus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger及びAspergillus terreus）、Blastomyces dermatitidis、Candida種（例えば、Candida albicans、Candida glabrala、Candida kerr、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida pseudotropicalis、Candida quillermondii、Candida rugosa、Candida stellatoidea及びCandida tropicalis）、Coccidioides immitis、Conidiobolus種、Cryptococcus neoforms、Cunninghamella種、Histoplasma capsulatum、Mucorpusillus、Paracoccidioides brasiliensis、Pseudallescheria boydii、Pneumocystis carinii、Rhizopus種（例えば、Rhizopus arrhizus、Rhizopus oryzae及びRhizopus Microspores）、Saccharomyces種及びSporothrix schenckiiを含むが、これらに限定されない。

特定の実施態様では、本発明による気道感染症は、細菌気道感染症、より具体的には、鞭毛を有しない細菌によって引き起こされる気道感染症である。鞭毛を有さず、気道感染症を引き起こす細菌は、典型的には、Streptococcus pneumoniae、Haemophilus influenzae、Moraxella catarrhalis又はMycoplasma pneumoniaeを含む。さらにより好ましくは、本発明による気道感染症は、肺炎球菌感染症である。

本明細書において使用される「ｔｏｌｌ様レセプター５」又は「ＴＬＲ５」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、あらゆる種のｔｏｌｌ様レセプター５、しかし好ましくは、ヒトｔｏｌｌ様レセプター５を意味することを意図する。ＴＬＲ５は、活性化すると、一連のシグナル分子を介して伝搬する細胞内シグナルを細胞表面から核に伝達することによって、細胞性応答を誘導する。典型的には、ＴＬＲ５の細胞内ドメインは、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８をリクルートし、これが、セリン／スレオニンキナーゼＩＲＡＫ（ＩＲＡＫ−１及びＩＲＡＫ−４）をリクルートする。ＩＲＡＫは、ＴＲＡＦ６と複合体を形成し、次いで、これが、ＴＬＲシグナルを伝達するのに関与する様々な分子と相互作用する。これらの分子及びＴＬＲ５シグナル伝達経路の他の構成要素は、転写因子（例えば、ｆｏｓ、ｊｕｎ及びＮＦ−ｋＢ）の活性、並びに、ｆｏｓ、ｊｕｎ及びＮＦ−ｋＢによりアップレギュレーションされる遺伝子（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２及びＣＣＬ２０など）の遺伝子産物の対応する誘導を刺激する。

本明細書において使用される「ＴＬＲ５アゴニスト」という用語は、ＴＬＲ５を介した通常のシグナル伝達を選択的に活性化するか、又は増加させる化合物（天然又は非天然）を指す。ＴＬＲ５アゴニストは、例えば、ＴＬＲ５若しくはＴＬＲ５リガンドのネイティブなコンホメーションを改変するか、又は変化させることによって、ＴＬＲ５を介した通常のシグナル伝達を間接的に活性化し得るか、又は増加させ得る。ＴＬＲ５シグナルを介在するシグナル分子、及び、ＴＬＲ５活性化の結果として産生される分子の活性は、観察され得るか、又は測定され得るＴＬＲ５活性である。従って、ＴＬＲ５活性は、細胞内シグナル分子のリクルート、及び、ＴＬＲ５活性化によって引き起こされる下流のイベント（例えば、転写因子活性化及び免疫調節分子の産生）を含む。ＴＬＲ５発現細胞によって放出されるサイトカインは、他の免疫系細胞をレギュレーションして、被験体における免疫反応を促進するので、ＴＬＲ５細胞性応答は、被験体における先天性免疫系反応を介在する。従って、本明細書において使用される「ＴＬＲ５介在性応答」という用語は、ＴＬＲ５介在性細胞性応答を誘導するＴＬＲ５アゴニストの能力を意味することを意図する。例示的なＴＬＲ５介在性細胞性応答は、転写因子（例えば、ｆｏｓ、ｊｕｎ及びＮＦ−ｋＢ）の活性化、サイトカイン及びケモカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２及びＣＣＬ２０）の産生、並びに、被験体における免疫反応の刺激を含む。

一実施態様では、本発明によるＴＬＲ５アゴニストは、低分子量アゴニスト（例えば、有機小分子）である。「有機小分子」という用語は、薬剤において一般的に使用されている有機分子に相当する大きさの分子を指す。この用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除く。好ましい有機小分子は、最大約５０００Da、より好ましくは最大２０００Da、最も好ましくは最大約１０００Daの大きさの範囲にある。

あるいは、本発明によるＴＬＲ５アゴニストは、抗体（この用語は、「抗体フラグメント」を含む）からなり得る。特に、ＴＬＲ５アゴニストは、前記抗体がレセプターを活性化するような、ＴＬＲ５に対する抗体からなり得る。

抗体は、公知の方法に従って、数ある中でも例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びマウスから選択されるホスト動物に適切な抗原又はエピトープを投与することによって、産生され得る。当技術分野で公知の様々なアジュバントが、抗体産生を高めるのに使用され得る。本発明を実施するのに有用な抗体は、ポリクロナールであり得るが、モノクロナール抗体が好ましい。モノクロナール抗体は、連続細胞系培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製及び単離され得る。産生及び単離のための技術は、ハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を含むが、これらに限定されない。あるいは、単鎖抗体の製造に関して記載されている技術（例えば、U.S. Pat. No. 4,946,778を参照）は、抗ＴＬＲ５単鎖抗体を製造するために改変され得る。

本発明を実施するのに有用なＴＬＲ５アゴニストは、限定されないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（これは、インタクトな抗体分子のペプシン消化によって生成され得る）及びＦａｂフラグメント（これは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る）を含む抗ＴＬＲ５抗体フラグメントも含む。あるいは、ＴＬＲ５に対して所望の特異性を有するフラグメントの迅速な同定を可能にするために、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーが構築され得る。

ヒト化抗体及びその抗体フラグメントは、公知の技術に従って調製され得る。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む非ヒト（例えば、齧歯類）キメラ抗体の形態である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒトの種の超可変領域に由来する残基（ドナー抗体）で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトの残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、すべて又は実質的にすべての超可変ループは、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、すべて又は実質的にすべてのＦＲは、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含む。ヒト化抗体を作製するための方法は、例えばWinter（U.S. Pat. No. 5,225,539）及びBoss（Celltech, U.S. Pat. No. 4,816,397）により記載されている。

次いで、当業者であれば、上述のように抗体を作製した後に、ＴＬＲ５アゴニストであるものを容易に選択できる。

別の実施態様では、ＴＬＲ５アゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、分子認識に関して、抗体の代替物の代表的な分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で、実質上任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載されているように、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）により単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得られる。このライブラリーにおいて、各メンバーは、最終的には化学的に改変される、独自の配列の直鎖状オリゴマーである。このクラスの分子の考え得る改変、用途及び利点は、Jayasena S.D., 1999において概説されている。ペプチドアプタマーは、E.coliのチオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によって呈示され、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択される配座的に制限された抗体可変領域からなる。

次いで、当業者であれば、上述のようにＴＬＲ５に対するアプタマーを作製した後に、ＴＬＲ５アゴニストであるものを容易に選択できる。

別の特定の実施態様では、本発明によるＴＬＲ５アゴニストは、ポリペプチド、より具体的にはフラジェリンポリペプチドである。

本明細書において使用される「フラジェリン」という用語は、様々なグラム陽性又はグラム陰性菌種に含まれるフラジェリンを意味することを意図する。フラジェリンの非限定的な由来は、Escherichia（例えば、E. coli）、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella（例えば、Salmonella enterica serovar Typhimurium）、Serratia（例えば、Serratia marcescans）及びShigella及びBacilli（例えば、B. subtilis及びB. licheniformis）、Pseudomonas（例えば、P. aeruginosa）及びStreptomycesを含むが、これらに限定されない。これらの例は、限定というよりむしろ例示である。フラジェリンのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、NCBI Genbankにおいて公衆に利用可能であり、例えば、アクセッションナンバーＡＡＬ２０８７１、ＮＰ＿３１０６８９、ＢＡＢ５８９８４、ＡＡＯ８５３８３、ＡＡＡ２７０９０、ＮＰ＿４６１６９８、ＡＡＫ５８５６０、ＹＰ＿００１２１７６６６、ＹＰ＿００２１５１３５１、ＹＰ＿００１２５００７９、ＡＡＡ９９８０７、ＣＡＬ３５４５０、ＡＡＮ７４９６９及びＢＡＣ４４９８６を参照のこと。これら及び他種に由来するフラジェリン配列は、本明細書において使用される用語フラジェリンに包含されることを意図する。従って、種間における配列の差異は、この用語の意味に含まれる。

「フラジェリンポリペプチド」という用語は、フラジェリン、又は、ＴＬＲ５に結合して活性化する能力を保持するそのフラグメントを意図する。典型的には、本発明によるフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ５シグナル伝達に関与するフラジェリンのドメインを含む。「フラジェリンのドメイン」という用語は、天然に存在するフラジェリンのドメイン及びその機能保存変異体を含む。「機能保存変異体」は、ポリペプチドの全体のコンフォメーション及び機能を変化させずに、タンパク質又は酵素の所定のアミノ酸残基が変化したものであり、類似特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するものびよるアミノ酸の置換を含むが、これらに限定されない。類似機能の任意のタンパク質２つの間のタンパク質又はアミノ酸配列類似性パーセントは、変化してもよく、例えば、類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づいているクラスター法などによるアライメントスキームに従って測定すると、７０％〜９９％であり得るように、保存されていると示されたもの以外のアミノ酸は、タンパク質において異なっていてもよい。「機能保存変異体」は、BLAST又はFASTAアルゴリズムによって測定すると、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、特により好ましくは少なくとも９０％を有し、比較したネイティブなタンパク質又は親タンパク質と同一若しくは実質的に類似の特性又は機能を有するポリペプチドも含む。ＴＬＲ５シグナル伝達に関与するフラジェリンのドメインは、当技術分野において周知であり、例えば、Smith et al. (2003) Nat. Immunol. 4: 1247-1253（例えば、S. typhimuriumフラジェリン又はそのホモログ若しくは改変型のアミノ酸７８〜１２９、１３５〜１７３及び３９４〜４４４）を参照のこと。

フラジェリンポリペプチドの例は、U.S. Pat. Nos. 6,585,980; 6,130,082; 5,888,810; 5,618,533;及び4,886,748; U.S. Patent Publication No. US 2003/0044429 Al;並びにInternational Patent Application Publications no WO 2008097016及びWO 2009156405（これらは、参照により組み込まれる）に記載されているものを含むが、これらに限定されない。

例示的なE. coIi O157:H7フラジェリンは、配列番号１である。例示的なS. typhimuriumフラジェリンは、配列番号２又は配列番号３である。配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列は、本発明によるフラジェリンポリペプチドとして使用され得る。

別の特定の実施態様では、本発明は、International Patent Application no WO 2009156405（これは、その全体が参照により組み込まれる）に記載されているフラジェリンリコンビナントタンパク質の使用を包含する。従って、本発明のフラジェリンポリペプチドは、ａ）配列番号３の１位に位置するアミノ酸残基から開始し、配列番号３の９９〜１７３位に位置するアミノ酸残基のいずれか１つからなる群より選択されるアミノ酸残基で終了するアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＮ末端ペプチド；及びｂ）配列番号３の４０１〜４０６位に位置するアミノ酸残基のいずれか１つからなる群より選択されるアミノ酸残基で開始し、配列番号３の４９４位に位置するアミノ酸残基で終了するアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＣ末端ペプチドを含み得、前記Ｎ末端ペプチドは、前記Ｃ末端ペプチドに直接的に連結されているか、又は前記Ｎ末端ペプチド及び前記Ｃ末端ペプチドは、スペーサー鎖を介して互いに間接的に連結されている。別の特定の実施態様では、前記Ｎ末端ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列１〜９９、１〜１３７、１〜１６０及び１〜１７３からなる群より選択される。別の実施態様では、前記Ｃ末端ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列４０１〜４９４及び４０６〜４９４からなる群より選択される。別の実施態様では、前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドは、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列１〜１７３及び４０１〜４９４からなる。別の実施態様では、前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドは、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列１〜１６０及び４０６〜４９４からなる。別の実施態様では、前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドは、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列１〜１３７及び４０６〜４９４からなる。別の実施態様では、前記Ｎ末端ペプチド及び前記Ｃ末端ペプチドは、ＮＨ２−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ（配列番号４）ペプチド配列からなる中間スペーサー鎖を介して互いに間接的に連結されている。別の実施態様では、配列番号３の４８８位に位置するアスパラギンアミノ酸残基は、セリンに置換されている。別の実施態様では、上記フラジェリンポリペプチドは、Ｎ末端に追加のメチオニン残基を含む。

本発明によるフラジェリンペプチドは、そのアミノ酸配列をコードし、トランスフェクションされた細胞内でその効果的な産生を可能にする核酸でトランスフェクションされたリコンビナント細胞によって、リコンビナントに産生され得る。

本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする核酸配列は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現用の複製可能なベクターに挿入され得る。様々なベクターが一般に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形態であり得る。適切な核酸配列は、様々な手順によりベクターに挿入され得る。一般的には、当技術分野において公知の技術を使用して、ＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。

ベクターの構成要素は、一般的には、配列が分泌される場合には１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列を含むが、これらに限定されない。１つ以上のこれらの構成要素を含む適切なベクターの構築は、当業者に公知の標準的なライゲーション技術を使用する。

本発明のフラジェリンポリペプチドは、リコンビナントに直接的に生産され得るだけではなく、異種ポリペプチド（これは、シグナル配列、又は、成熟タンパク質若しくはペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドであり得る）との融合ポリペプチドとしても生産され得る。一般的には、シグナル配列は、ベクターの構成要素であり得るか、又はベクターに挿入される関心対象のポリペプチドをコードするＤＮＡの一部であり得る。シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群より選択される原核性シグナル配列であり得る。酵母分泌のためには、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（Saccharomyces及びKluyveromycesα因子リーダー（後者は、U.S. Pat. No. 5,010,182に記載されている）を含む）又は酸性ホスファターゼリーダー、C. albicansグルコミラーゼリーダー又はWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列（例えば、同じ種又は関連種の分泌ポリペプチドに由来するシグナル配列）は、ウイルス分泌リーダーと同様に、タンパク質の分泌を指示するのに使用され得る。

発現及びクローニングベクターは両方とも、１つ以上の選択ホスト細胞においてベクターが複製するのを可能にする核酸配列を含む。このような配列は、様々な細菌、酵母及びウイルスに関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に好適であり、２．ｍｕ．プラスミドの起点は、酵母に好適であり、様々なウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。

発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠損を相補するタンパク質、又は（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、Bacilliに関しては、Ｄアラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。

哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例は、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする核酸を取り込む能力がある細胞の識別を可能にするもの（例えば、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼ）である。野生型ＤＨＦＲが使用される場合に適切なホスト細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠失したＣＨＯ細胞株であり、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)により記載されているように、調製及び増殖される。酵母における使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al, Gene, 10: 157 (1980)。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を持たない酵母の突然変異体株（例えば、ＡＴＣＣＮｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１）に対して選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85: 12 (1977)。

発現及びクローニングベクターは、通常、フラジェリンポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結されて、ｍＲＮＡ合成を指示するプロモーターを含む。様々な有望なホスト細胞により認識されるプロモーターは、周知である。原核ホストと共に使用するのに好適なプロモーターは、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281 : 544 (1979)）、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776）並びにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター（deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21 -25 (1983)）を含む。細菌系における使用のためのプロモーターは、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的に連結したシャイン・ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含む。

酵母ホストと共に使用するのに好適なプロモーター作用性配列の例は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)）又は他の解糖酵素（Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのプロモーターを含む。

増殖条件によりコントロールされる転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ並びにマルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用に好適なベクター及びプロモーターは、EP 73,657にさらに記載されている。哺乳動物ホスト細胞におけるベクターからの関心対象の核酸の転写は、例えば、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたUK 2,21 1 ,504）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉種ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーターにより；異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターにより；並びに熱ショックプロモーターにより、このようなプロモーターがホスト細胞系と適合性である限りにおいて、コントロールされる。

高等真核生物による、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大され得る。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させるＤＮＡのシス作用エレメント（通常、約１０〜３００bp）である。現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン及びインスリン）に由来する多くのエンハンサー配列が公知である。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを使用する。例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（bp１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、関心対象のポリペプチドをコードする配列の５’又は３’の部位でベクターにつなぎ合わせられ得るが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。

真核ホスト細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物に由来する有核細胞）は、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核若しくはウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び場合により３’非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。

リコンビナント脊椎動物細胞培養物における本発明のフラジェリンポリペプチドの合成に適合させるのに好適な、さらに他の方法、ベクター及びホスト細胞は、Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281 : 40-46 (1979); EP 1 17,060;及びEP 1 17,058に記載されている。

ホスト細胞の選択及びトランスフォーメーション
ホスト細胞は、フラジェリンポリペプチド生産のための本明細書に記載される発現又はクローニングベクターでトランスフェクション又はトランスフォーメーションされ、プロモーターの誘導、トランスフォーマントの選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、必要に応じて改変した従来の栄養培地において培養される。

培地、温度、ｐＨなどの培養条件は、過度の実験をすることなく、当業者により選択され得る。一般的には、細胞培養物の生産性を最大化するための原理、プロトコール及び実際の技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)に見られ得る。

トランスフェクションの方法は、当業者に公知であり、例えば、ＣａＰＯ４処理及びエレクトロポレーションである。使用されるホスト細胞に応じて、このような細胞に適した標準的技術を使用して、トランスフォーメーションが実施される。Sambrookら（前掲）に記載される塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、又はエレクトロポレーションは、一般的には、頑丈な細胞壁バリアを含む原核細胞又は他の細胞に使用される。このような細胞壁を有しない哺乳動物細胞に関しては、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が使用され得る。哺乳動物細胞ホスト系トランスフォーメーションの一般的な態様は、U.S. Pat. No. 4,399,216に記載されている。酵母へのトランスフォーメーションは、典型的には、Van Solingen et al., J. Bact, 130: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトフラスト融合又はポリカチオン（例えば、ポリブレン又はポリオルニチン）による、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も使用され得る。哺乳動物細胞をトランスフォーメーションするための様々な方法に関しては、Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988)を参照のこと。

本明細書において、ベクターにＤＮＡをクローニング又は発現させるのに好適なホスト細胞は、原核生物、酵母又は高等真核細胞を含む。

適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性菌又はグラム陽性菌、例えばEnterobacteriaceae、例えばE. coliを含むが、これらに限定されない。様々なE. coli株が一般に入手可能であり、例えばE. coli Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；E. coli Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；E. coli株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）；及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の適切な原核ホスト細胞は、Enterobacteriaceae、例えばEscherichia（例えば、E. coli）、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella（例えば、Salmonella typhimurium）、Serratia（例えば、Serratia marcescans）及びShigella及びBacilli、例えばB. subtilis及びB. licheniformis（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたDD 266,710に開示されているB. licheniformis 41 P）、Pseudomonas（例えば、P. aeruginosa）及びStreptomycesを含む。これらの例は、限定というよりむしろ例示である。

これら原核ホスト細胞はフラジェリンを一切分泌しないので（Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 ;98:13722-7）、Salmonella typhimurium（ｆｌｉＣｆｌｊＢ）のＳＩＮ４１株は、本発明のフラジェリンポリペプチドの生産に関して特に関心が寄せられる。しかしながら、フラジェリンは、専門の分泌系：いわゆる「ＩＩＩ型分泌系」から分泌される。興味深いことに、ＳＩＮ４１株は、最適なフラジェリン分泌に必要なＩＩＩ型分泌系のすべての成分を産生する。ｆｌｉＣプロモーター下に新たなフラジェリンペプチドをコードする配列をクローニングすることにより、ＳＩＮ４１株において関心対象のフラジェリンポリペプチドの大量に分泌することが可能になる。

Ｗ３１１０株も、リコンビナントＤＮＡ産物発酵のための共通のホスト株であるので、興味深い。好ましくは、ホスト細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、ホストに内因性のタンパク質をコードする遺伝子において遺伝的突然変異をもたらすように改変され得、このようなホストの例は、完全遺伝子型ｔｏｎＡを有するE. coliＷ３１１０株１Ａ２；完全遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３を有するE. coliＷ３１１０株９Ｅ４；完全遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡＥ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｄｅｇＰｏｍｐＴｋａｎ．ｓｕｐ．ｒを有するE. coliＷ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５，２４４）；完全遺伝子型ｔｏｎａｐｔｒ３ｐｈｏＡＥ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｄｅｇＰｏｍｐＴｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎ．ｓｕｐ．ｒを有するE. coliＷ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異を有する３７Ｄ６株である、E. coliＷ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日に発行されたU.S. Pat. No. 4,946,783に開示されている突然変異型ペリプラズム性プロテアーゼを有するE. coli株を含む。E. coli株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５ＡｆｉｍＡ−Ｈ又はＭＫＳ１２、ｆｌｉＤ−及び−ｆ／ｍ＞Ａ−／−／−欠失ＭＧ１６５５株も、分泌タンパク質としてリコンビナントフラジェリンを産生させるための興味深い候補である（Nat Biotechnol. 2005; (4):475-81）。あるいは、クローニングのｉｎｖｉｔｒｏ方法、例えば、ＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適切である。

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、本発明によるフラジェリンポリペプチドをコードするベクターに好適なクローニング又は発現ホストである。Saccharomyces cerevisiaeは、一般的に使用される下等真核ホスト微生物である。

他のものは、Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981];１９８５年３月２日に公開されたEP 139,383）；Kluyveromycesホスト（U.S. Pat. No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばK. lactis（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacterid., 737 [1983]）、K. fragilis (ATCC 12,424)、K. bulgaricus (ATCC 16,045)、K. wickeramii (ATCC 24,178)、K. waltii (ATCC 56,500)、K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990))、K. thermotolerans及びK. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces、例えばSchwanniomyces occidentalis（１９９０年１０月３１日に公開されたEP 394,538）；及びfilamentous fungi、例えばNeurospora、Penicillium、Tolypocladium （１９９１年１月１０日に公開されたWO 91/00357）及びAspergillusホスト、例えばA. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 1470-1474 [1984])及びA. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）を含む。メチロトローフ酵母は、本明細書において適切であり、Hansenula、Candida、Kloeckera、Pichia、Saccharomyces、Torulopsis及びRhodotorulaからなる属より選択される、メタノール上で増殖可能な酵母を含むが、これらに限定されない。

本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする核酸の発現に好適なホスト細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、DrosophilaＳ２及びSpodopteraＳｆ９などの昆虫細胞並びに植物細胞を含む。有用な哺乳動物ホスト細胞株の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より具体的な例は、ＳＶ４０によりトランスフォーメーションしたサル腎ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓系（２９３細胞又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；並びにマウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）を含む。適切なホスト細胞の選択は、当業者の技術の範囲内である。

本発明のフラジェリンポリペプチドは、培地又はホスト細胞溶解物から回収され得る。膜結合している場合には、適切な界面活性剤溶液（例えば、ＴＲＩＴＯＮ−ＸＴＭ．１００）を使用して、又は酵素的切断によって、膜から放出され得る。

本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする核酸の発現に使用する細胞は、様々な物理的又は化学的手段、例えば凍結解凍サイクル、音波処理、機械的破砕又は細胞溶解剤により破砕され得る。リコンビナント細胞タンパク質又はポリペプチドから、関心対象のポリペプチドを精製することが望ましい場合もある。以下の手順は、適切な精製方法の例示である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上又はＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫安沈殿；例えばSephadex G-75を使用したゲルろ過；ＩｇＧなどの混入物質を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；並びに本発明のフラジェリンポリペプチドのエピトープタグ化形態に結合させる金属キレート化カラムによるもの。

タンパク質精製の様々な方法が使用され得、このような方法は当技術分野において公知であり、例えばDeutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag: New York, 1982)に記載されている。選択される精製工程は、例えば、使用される生産プロセスの性質、及び、生産される具体的なフラジェリンポリペプチドに応じて異なる。

好ましい実施態様では、フラジェリンポリペプチドは、Nempont et al. (Nempont, C. C., D.; Rumbo, M.; Bompard, C.; Villeret, V.; Sirard, J.C. 2008. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J Immunol 181:2036-2043.)に開示されているように、リコンビナントS. TyphimuriumＳＩＮ４１（ｆｌｉＣｆｌｊＢ）の上清から精製される。特に、Salmonellaをルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地において３７℃で６〜１８時間増殖させた。上清をろ過し、６０％硫酸アンモニア（Sigma Aldrich、米国）で飽和させた。沈殿した物質を遠心分離により回収し、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５に溶解させ、次いで透析した。タンパク質をハイドロキシアパタイト、陰イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィー（Bio-Rad Laboratories、米国；GE Healthcare、スウェーデン）の連続ラウンドによりさらに精製した。最後に、ポリミキシンＢカラム（Pierce、米国）を使用して、タンパク質からリポ多糖（ＬＰＳ）を枯渇させた。リムルスアッセイ（Associates of Cape Cod Inc.、米国）を使用して、残留ＬＰＳ濃度を、リコンビナントフラジェリンμgあたり３０pg未満のＬＰＳであると決定した。

さらなる実施態様では、本発明によるフラジェリンポリペプチドは、免疫アフィニティークロマトグラフィー基質での分離により精製され得る。

前記免疫アフィニティークロマトグラフィー基質は、そこに固定化された抗フラジェリン抗体を含む。「抗フラジェリン」抗体とは、本明細書において、本発明に包含されるものを含む、ネイティブなフラジェリン又は超可変領域欠失フラジェリンのいずれかに結合する抗体を意図する。

好ましくは、抗フラジェリン抗体は、マウス抗フラジェリン抗体を含むモノクローナル抗体からなる。

ある実施態様では、本発明のポリペプチドは、化学ペプチド合成の従来技術により合成され得る。

例えば、本発明のフラジェリンポリペプチド配列は、固相技術を使用する直接的なペプチド合成により作製され得る。

マニュアル技術を使用して、又は自動化により、ｉｎｖｉｔｒｏタンパク質合成が実施され得る。自動化合成は、例えば、Applied Biosystemsペプチド合成装置（フォスターシティ、カリフォルニア州）により、製造業者の使用説明書を使用して達成され得る。

関心対象のポリペプチドの様々な部分は、化学的に別個に合成され、化学的又は酵素的方法を使用して結合されて、関心対象の全長ペプチドが作製され得る。

また、本発明は、本発明によるＴＬＲ５アゴニストを含む、気道感染症を処置するための方法における使用のための医薬組成物に関する。

典型的には、本発明によるＴＬＲ５アゴニストは、薬学的に許容しうる賦形剤、及び場合により徐放性マトリックス（例えば、生体分解性ポリマー）と組み合わせられて、治療組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容しうる」は、哺乳動物、特にヒトに投与される場合に、副作用、アレルギー反応又は有害反応を生じさせない分子的実体及び組成物を指す。薬学的に許容しうる担体又は賦形剤は、あらゆる種類の非毒性である、固体、半固体若しくは液体充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤化助剤を指す。

本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻腔内（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜及び直腸投与を含むが、これらに限定されない。具体的な実施態様では、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内又は局所投与に適合した医薬組成物として、通常の手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張緩衝水溶液である。必要である場合、組成物は、可溶化剤、及び注射部位の痛みを緩和するために、局所麻酔薬も含み得る。

好ましくは、本発明の医薬組成物は、（すなわち、被験体の気道に）局所投与される。従って、組成物は、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルションの形態、又は当業者に周知の他の形態に製剤化され得る。非噴霧型局所剤形に関しては、局所塗布に適合する担体又は１つ以上の賦形剤を含み、好ましくは水より大きい動的粘度を有する粘性ないしは半固形又は固形の形態が、典型的には、使用される。適切な製剤は、溶液、懸濁液、エマルション、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、粉末、塗布薬、軟膏（ｓａｌｖｅ）などを含むが、これらに限定されず、これらは、所望により、滅菌されるか、又は例えば浸透圧などの様々な性質に影響を与えるために、助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤又は塩）と混合される。他の適切な局所剤形は、噴霧型エアロゾル調製物を含み、好ましくは固体又は液体の不活性担体と組み合わせた有効成分は、加圧揮発性物質（例えば、フレオンなどの高圧ガス）との混合物中、又はスクイーズボトル中にパッケージ化される。所望により、保湿剤又は加湿剤も、医薬組成物及び剤形に添加され得る。このような追加成分の例は、当技術分野において周知である。

本発明の方法が組成物の鼻腔内投与を含む場合、組成物は、エアロゾル形態、スプレー、ミスト又は滴剤に製剤化され得る。特に、本発明による使用のための予防剤又は治療剤は、加圧容器又は噴霧器から、適切な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス）の使用によって、エアロゾルスプレーの形態で、便利に送達され得る。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計測量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器又は吹送器における使用のためのカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンからなる）は、化合物と適切な粉末基剤（例えば、ラクトース又は澱粉）との混合粉末を含むように製剤化され得る。

本発明の方法は、例えば吸入器又は噴霧器の使用によって、エアロゾル化剤を用いて製剤された組成物を肺投与することを含み得る。例えば、U.S. Pat. Nos. 6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540及び4,880,078;並びにPCT Publication Nos. WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346及びWO 99/66903（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。具体的な実施態様では、本発明の医薬組成物は、Alkermes AIR（商標）肺薬物送達技術（Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.）を使用して、投与される。

従って、本発明は、気道感染症若しくは１つ以上のその症状を予防、処置、管理又は改善する方法であって、治療有効量のＴＬＲ５アゴニストを、それを必要とする被験体に投与ことを含む、方法を提供する。

本発明によれば、処置されるべき「被験体」又は「個体」という用語は、ガンに罹患しているか、若しくは罹患している可能性があるヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯類（マウス、ラット）、ネコ科動物、イヌ科動物又は霊長類）を意図する。好ましくは、被験体は、ヒトである。

「治療有効量」という用語は、任意の医療処置に対して適用可能な妥当なリスク・ベネフィット比でガンを処置するのに十分な量のポリペプチド又は核酸を意味する。しかしながら、当然のことながら、本発明のポリペプチド及び医薬組成物の１日の合計使用量は、正しい医学的判断の範囲内において、主治医により決定される。任意の特定の被験体に対する具体的な治療有効用量レベルは、処置されるべき障害及び障害の重篤度；使用されるポリペプチドの活性；使用される特定の組成物；被験体の年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食生活；投与期間、投与経路、処置期間；使用される特定のポリペプチドと組み合わせるか、若しくは同時に使用される薬物；並びに医療分野で周知の要因等を含む、様々な要因に依存する。

以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものであると決して解釈されるべきでない。

フラジェリンは、S. pneumoniaeを用いた致死的な呼吸性チャレンジからＢＡＬＢ／ｃマウスを保護する：生理的食塩水のみ（黒四角）か、又はフラジェリン１μg（ＦｌｉＣ、黒丸）を添加したか、又はトリプシンで分解したフラジェリン１μg（ＦｌｉＣ／Ｔ、白丸）を添加した４ｘｌ０^５CFUのS. pneumoniae（Ｓｐ）血清型１で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）を鼻腔内感染した。（Ａ）マウスの生存を毎日モニタリングした。ＦｌｉＣ処置グループの生存は、生理的食塩水グループ又はＦｌｉＣ／Ｔ処置グループと比較して、統計的に有意であった。結果は、３回の実験のうちの代表的な１回である。（Ｂ）チャレンジ後２４時間にマウスを屠殺し、肺におけるコロニー形成単位（CFU）の数を測定した。グループ間の有意差は、アスタリスクで印を付ける；Ｐ＜０．０５（＊）。結果は、３回の実験のうちの代表的な１回である。エラーバーは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）を表す。ＴＬＲ５シグナル伝達は、S. pneumoniae感染に対するフラジェリン介在性防御に必要である：生理的食塩水のみ（黒四角）か、又はＦｌｉＣΔ１７４−４００１μg（黒丸）を添加したか、又はＴＬＲ５シグナル伝達モチーフを持たないＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００／８９−９６＊}１μg（白丸）を添加した４ｘｌ０^５CFUのS. pneumoniae（Ｓｐ）血清型１で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）を鼻腔内感染した。マウスの生存を毎日記録した。ＦｌｉＣΔ１７４−４００処置グループの生存は、未処置グループ又はＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００／８９−９６＊}処置グループと比較して、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。結果は、２回の実験のうちの代表的な１回である。

材料と方法
細菌の調製：Streptococcus pneumoniae血清型１（臨床分離株Ｅ１５８６）を、National Reference Laboratory - Ministry of Health、ウルグアイ（３９）から入手した。ワーキングストックを以下のように調製した。Todd Hewitt Yeast Broth（THYB）（Sigma-Aldrich、セントルイス−ミズーリ州、米国）を、血液寒天培地プレートで増殖させたS. pneumoniaeの新鮮コロニーで播種し、培養物が０．７〜０．９単位のOD_600nmに達するまで３７℃でインキュベーションした。培養物を、THYB＋グリセロール１２％（v/v）中、−８０℃で最大３ヶ月保存した。マウス感染のために、ワーキングストックを解凍し、滅菌生理食塩水溶液（生理食塩水）で洗浄し、適切な濃度に希釈した。連続希釈物を血液寒天培地プレートに蒔くことによって、ストック中の細菌数を確認した。

タンパク質：以前に記載したように（２７）、Salmonella enterica Serovar TyphimuriumＳＩＮ２２に由来するネイティブなフラジェリン（ＦｌｉＣ）又はリコンビナントフラジェリン（ＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００}及びＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００／８９−９６＊}）を調製した。ＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００／８９−９６＊}は、ＴＬＲ５シグナル伝達を妨げるアミノ酸置換（８９〜９６）を保有する。すべてのタンパク質は、低量のＬＰＳ（３０pg未満のＬＰＳ／μg、リムルスアッセイによる測定）を含んでいた。いくつかの実験において、トリプシンで加水分解したＦｌｉＣ（ＦｌｉＣ／Ｔ）を、コントロールとして使用した。使用前に、ネイティブなＦｌｉＣを６５℃で５分間加熱して、タンパク質が主にモノマーであることを確認した。特に明記しない限り、S. pneumoniae懸濁液を用いて、１μgのＦｌｉＣ、ＦｌｉＣ／Ｔ、ＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００}又はＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００／８９−９６＊}を同時に鼻腔内投与した。細菌の生存に対するフラジェリンのあらゆる直接的な影響を排除するために、ｉｎｖｉｖｏアッセイに使用した同じ濃度のフラジェリンでS. pneumoniaeをインキュベーションする前後に、生存数を測定した。コントロールの条件と比較して、フラジェリンでインキュベーションした後に回収した細菌数に、有意差はなかった。

動物の感染：雌のＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及び非近交系ＮＭＲＩ系統（６〜８週齢）を、National Division of Veterinary Laboratories（ウルグアイ）又はJanvier laboratories（フランス）から入手した。雌のＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ）を、Institut Pasteur de Lille breeding facilitiesから入手した。これらのマウスは、Ｂ及びＴリンパ球を持たず、無ガンマグロブリン血症であることを特徴とする。動物を、個別に換気されたケージで維持し、感染用の垂直層流キャビネット（class II A2、ESCO、ペンシルベニア−米国）で処理した。すべての実験は、現行の国内及び施設内規則並びに倫理指針（CHEA - Universidad de la Republica、ウルグアイ及び#A59107 - Institut Pasteur de Lille）に従った。ケタミン２．２mg（Richmond-Vet Pharma、ブエノスアイレス−アルゼンチン）＋キシラジン０．１１mg（Portinco、モンテビデオ−ウルグアイ）を全容積２００μlで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって、又は、麻酔非再呼吸システム（DRE-Compact 150、DRE Veterinary、ルーイビル-米国）を使用してイソフルレン（Belamont、SAS、フランス）を吸入させることによって、マウスを麻酔した。細菌及びフラジェリンを、生理食塩水２０〜５０μlでマウスの鼻孔に投与した。マウスの生存を毎日記録した

顆粒球の枯渇に関して、S. pneumoniaeを用いた鼻腔内チャレンジ（２４）前２４時間に、抗Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）又はアイソタイプコントロール（ＨＢ１５２）１００μgを腹腔内投与した。フラジェリン鼻腔内処置後の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）において、抗Ｇｒ１注射は、ＰＭＮを９６．８±１．２％枯渇することがわかった。

肺及び脾臓における細菌ロードの測定：鼻腔内チャレンジ後に、選択時点において肺及び脾臓を採取し、UltraTurraxホモジナイザー（IKA-Werke、シュタウフェン−ドイツ）を用いて均質化した。連続希釈物を血液寒天培地プレートに蒔くことによって、生存数を測定した。

定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）：UltraTurraxホモジナイザーを用いて、Trizol試薬（Invitrogen、カリフォルニア州−米国）中で肺を均質化し、−８０℃で保存した。製造業者の使用説明書に従って、ＲＮＡ抽出を実施した。ｃＤＮＡ合成の前に、総ＲＮＡ１μgをＤＮＡｓｅ−Ｉ（Invitrogen）で処理し、ランダムプライマー（Invitrogen）及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Invitrogen）を使用して、第一鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成を行った。以下のプロトコールに従って、Rotor-Gene 6000（Corbett、シドニー−オーストラリア）でQuantiTect（登録商標）SYBR（登録商標）Green PCR Kit（Qiagen、ヒルデン−ドイツ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを実施した：９５℃１５分、続いて９５℃１５秒及び６０℃１分を４０サイクル。０．９μMの最終濃度でプライマーを使用した。βアクチンをハウスキーピング遺伝子として使用して、関心対象の遺伝子の発現を標準化した。結果を、生理食塩水処置グループと比較したｍＲＮＡレベルの倍増加として示す。

気道及び肺へのＰＭＮ浸潤の測定：気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）のために、サンプリング気管にカニューレを挿入し、１mlのＰＢＳ＋１mMＥＤＴＡを６回注入し、穏やかに吸引して回収した；このプロセスを２回繰り返した。細胞を、ＦＡＣＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％アジド、１％ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich製）＋５mMＥＤＴＡ）に懸濁した。以前に記載したようにコラゲナーゼ／ＤＮＡｓｅ処理（３４）した後に、肺細胞を単離し、４０μm細胞ろ過器によってろ過した。免疫細胞を、パーコール二層（Sigma-Aldrich）勾配で分離した。つまり、細胞を、３５％等張パーコール液に懸濁し、７０％等張パーコール液の上に慎重に載せ、ブレーキなしで２６００ｇで３０分間遠心分離した。上皮細胞に主に相当する細胞の最上部のリングを廃棄し、７０％パーコール層に最も近い細胞のリングから免疫細胞を回収した。１００μm細胞ろ過器を使用して細胞をろ過し、洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために染色した。BD Biosciences又はBioLegend（カリフォルニア州−米国）製のＰＥ−又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７結合抗Ｌｙ−６Ｇ（クローン１Ａ８）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５結合抗Ｌｙ−６Ｃ（クローンＨＫ１．４）又はＰＥ結合抗ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）のＦＳＣ−ＳＳＣ及びポジティブ染色法によって、好中球を同定した。ＰＦＡ４％で固定した後に、CellQuest 3.3ソフトウェア（BD Biosciences）を用いたFACS Calibur血球計算器で、フローサイトメトリーデータ収集を実施した。

組織学的分析：４％ホルマリン（Sigma- Aldrich）中で肺を２４時間固定し、次いで、パラフィンに包埋した。Leicaミクロトーム（Leica Microsystems、ウェッツラー−ドイツ）を使用して、肺の塊を５μmに切断し、シラン化処理したスライドに付着させた。Nikon Eclipse 80i顕微鏡及びNikon DS-Ri1デジタルカメラを使用して、ヘマトキシリン／エオシン染色切片を分析し、Laboratory ImagingのNIS-Elements BR 3.0ソフトウェアを使用して、加工した。

統計的分析：生存曲線の分析のために、Log-rank（Mantel-Cox）検定を実施した。２つのグループ間の比較のために、Mann-Whitney検定を実施した。すべての場合において、Ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。GraphPad Prismプログラム（GraphPad Software、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して、統計的分析を行った。

結果
フラジェリンの鼻腔内送達は、S. pneumoniaeを用いた致死的チャレンジからマウスを保護する：最初に、本発明者らは、鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与でＢＡＬＢ／ｃマウスを１００％死亡させるS. pneumoniaeの最小用量を決定した。S. pneumoniae血清型１の臨床分離株を漸増用量で動物に感染させ、生存を毎日評価した。本発明者らは、４ｘ１０^５CFUを、７２〜１２０時間以内に動物を殺す最小致死用量（ＭＬＤ）と定義した。

次いで、S. pneumoniaeで鼻腔内チャレンジしたマウスと、フラジェリン（ＦｌｉＣ）及びS. pneumoniaeを注入したマウスの生存を比較することによって、肺炎球菌性肺炎をコントロールするフラジェリンの能力を評価した。コントロールとして、S. pneumoniae及びトリプシンで予め加水分解したフラジェリン（ＦｌｉＣ／Ｔ）でもマウスをチャレンジした。図１Ａに示されるように、ＦｌｉＣ処置マウスは、７５％の生存率であったが、未処置又はＦｌｉＣ／Ｔ処置動物は、チャレンジ後３〜４日以内に死亡した。フラジェリンによって誘導される防御は、独立した異なる実験の間で、７５〜１００％の範囲であった。フラジェリンをS. pneumoniaeと同時投与することによって、S. pneumoniaeを単独で投与した動物と比較して、２４時間以内に肺の細菌数が８０倍減少した（図１Ｂ）。本発明者らは、フラジェリンが、感染の前後に投与した場合に、肺炎球菌感染症に対する防御反応を引き出すか否かも評価した。肺炎球菌チャレンジ前１２〜２４時間にフラジェリンを鼻腔内投与したすべての動物は生存したが、すべてのコントロールマウスは４日目までに死亡した。また、チャレンジ後２４時間にフラジェリンを投与した場合に、１００％の防御も達成した。従って、フラジェリンは、肺炎球菌性肺炎に予防及び治療効果を示す。

Ｃ５７ＢＬ／６及び非近交系ＮＭＲＩ系統においても、防御を誘導するフラジェリンの能力を評価した。両系統に関するS. pneumoniae血清型１のＭＬＤが２ｘｌ０^６CFUであることを見出し、フラジェリン介在性防御を５ｘＭＬＤで評価した。細菌チャレンジ前１２時間のフラジェリン投与は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、８０％の防御を誘導した；同様に、ＮＭＲＩ動物において、チャレンジ前３２時間〜６時間にフラジェリンを投与した場合に、１００％の防御を達成した。フラジェリンは、Ｃ５７ＢＬ／６及びＮＭＲＩ系統において、S. pneumoniaeと同時投与した場合も、防御的であったが、程度は弱かった（４０％）。つまり、これらの結果は、フラジェリン処置が異なるマウス系統において防御的であることを示している。

次いで、本発明者らは、ＴＬＲ５シグナル伝達が、フラジェリン処置によって誘発される防御に必要であるか否かを検討した。このために、本発明者らは、リコンビナントフラジェリンＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００}及びＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００／８９−９６＊}（２７）を使用した。ＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００}は、ネイティブなフラジェリンと同じように、粘膜のＴＬＲ５シグナル伝達を促進する能力を有するが、ＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００／８９−９６＊}は、ＴＬＲ５シグナル伝達を妨げる突然変異を保有する。ＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００}及びS. pneumoniaeを投与したすべてのマウスは、チャレンジを生き延びたが、突然変異体ＦｌｉＣ_{Δ１７４−４００／８９−９６＊}を投与したものはいずれも、チャレンジを生き延びなかった（図２）。これらの結果は、ＴＬＲ５シグナル伝達が防御に必要であることを強く示唆している。

フラジェリン処置は、肺炎球菌性肺炎中に、炎症性遺伝子発現を促進し、肺への一時的な細胞浸潤を悪化させる：次いで、本発明者らは、フラジェリン処置が、肺炎球菌感染症に対する肺の転写応答を改変するか否かを分析した。前述のように、S. pneumoniae又はS. pneumoniae＋フラジェリンでマウスをチャレンジした。コントロールとして、フラジェリンを単独で別のグループに投与した。処置及び感染後２４時間に、肺を回収して、選択遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。フラジェリンの単独投与又はS. pneumoniaeとの併用投与は、肺炎球菌チャレンジと比較して、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２及びＣｃｌ２０ｍＲＮＡレベルの劇的な増加を引き起こした。フラジェリン処置は、Ｔｎｆの発現も増加させた；差異は一貫していたが、統計的に有意ではなかった。フラジェリン又はS. pneumoniaeを単独投与した動物ではなく、チャレンジ及びフラジェリン処置した動物において、Ｉｌ６の発現は増加したが、これは、Ｉｌ６発現に対するフラジェリンと肺炎球菌感染症との間の相乗効果を示唆している。すべてのグループの間で、Ｔｇｆｂ１、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ１７ｆ、Ｉｌ２３及びＩｌ４遺伝子のｍＲＮＡレベルは、モック動物と比較して、変わらないままであった。

炎症性遺伝子の発現が、炎症及び気道への細胞浸潤と相関するか否かを評価するために、本発明者らは、フラジェリン処置及び感染後２４時間に得た肺組織の組織学的分析を実施した。S. pneumoniaeは、特定の細気管支及びこれらの細気管支の近くのいくつかの血管周囲領域に限定された穏やかな細胞浸潤を誘導した。反対に、フラジェリンの単独処置又は肺炎球菌との同時処置は浮腫を誘導し、そして、血管周囲及び気管支周囲領域だけでなく、肺実質の周囲の一部の領域にも影響を与える広範囲の細胞浸潤を誘導した。注目すべきことに、７日目において、フラジェリン及び肺炎球菌を投与したマウスに由来する肺は、細胞浸潤又は浮腫が見られず、炎症の完全な消散を示した。これらの結果は、フラジェリンが、肺の形態又は機能の不可逆的変化を引き起こさずに、細菌クリアランスを促進する一時的だが強い炎症反応を誘導することを示唆している。

フラジェリン誘導性防御は、Ｇｒ−１発現細胞を必要とするが、Ｂ及びＴリンパ球から独立している：気道への好中球のリクルートは、肺炎球菌感染症及びフラジェリン鼻腔処置の両方のランドマークであり、本発明者らは、本明細書において、フラジェリン処置及び感染症が、好中球のリクルートに関与する遺伝子の発現を活性化したことを示した。従って、本発明者らは、S. pneumoniaeでチャレンジし、かつ、フラジェリンで処置したか、又は処置していない動物における好中球浸潤の動態を比較することを目的とした。チャレンジ後の異なる時点において、ＢＡＬ及び肺を採取し、抗Ｌｙ６Ｇ抗体で染色した。肺炎球菌チャレンジは、すべての動物において、ＰＭＮのリクルートを誘導した。しかしながら、チャレンジ時にフラジェリンで処置したマウスは、S. pneumoniae単独でチャレンジしたマウスと比較して、気道へのより急速かつ顕著なＰＭＮ浸潤を示した。２４時間の時点で、ＰＭＮ浸潤はすべてのグループにおいてピークとなり、グループ間の差異が最大となった。しかしながら、４８時間までに、ＰＭＮ数は、グループ間に有意差がもはやなくなった。従って、フラジェリンと肺炎球菌の同時投与は、多数の好中球を気道に急速かつ一時的にリクルートすることを促進した。

続いて、本発明者らは、好中球が、フラジェリン介在性防御に重要であるか否かを決定した。この目的のために、チャレンジ前２４時間に、顆粒球レセプター１（Ｇｒ−１又はＬｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ）に特異的なモノクローナル抗体又はアイソタイプコントロール抗体を動物に腹腔内注射した。アイソタイプコントロールを投与し、ＦｌｉＣで処置した動物は、チャレンジを生き延びた。対照的に、抗Ｇｒ−１処置は、９５％超の好中球を気道から枯渇させ、S. pneumoniaeに対するフラジェリン介在性防御を無効にした。これらの結果は、ＰＭＮのようなＧｒ−１発現細胞が、肺炎球菌感染症におけるフラジェリン誘導性防御の重要なエフェクターであることを示した。

Ｂ及びＴリンパ球は、肺炎球菌感染症の初期に関与するので、本発明者らは、フラジェリン誘導性防御におけるそれらの役割を評価した。ＳＣＩＤマウス（抗体、Ｂ及びＴ細胞が欠損している）及び免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２ｘｌ０^７CFUのS. pneumoniae又はS. pneumoniae＋フラジェリンでチャレンジした。感染後３６時間に肺及び脾臓を採取して、細菌数を測定した。フラジェリン同時投与は、ＳＣＩＤマウスの肺における細菌クリアランスを、ＢＡＬＢ／ｃマウスと同程度に促進した。ＳＣＩＤ及びＢＡＬＢ／ｃマウスは両方とも、フラジェリン処置によって、脾臓におけるより少ない細菌数も示したが、これは、それらが、局所感染症だけでなく全身感染症もコントロールできたことを意味している。ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較した場合、ＳＣＩＤマウスは、フラジェリンの注入後１６時間に、ほぼ同数のＰＭＮを肺及び肺胞腔にリクルートした。つまり、これらの結果は、フラジェリン誘導性防御をトリガーするために、Ｇｒ−１発現細胞が、Ｂ細胞及びＴリンパ球のいずれも必要としないことを示している。

考察：
S. pneumoniaeによる気道の早期コロニー形成を防ぐためのＴＬＲ及びＭｙＤ８８要件によって示されるように、先天性免疫は、肺炎球菌感染症をコントロールするのに不可欠である（Albiger, B., Sandgren A., Katsuragi H., Meyer-Hoffert U., Beiter K., Wartha F., Hornef M., Normark S. and Normark B. H. 2005. Myeloid differentiation factor 88-dependent signalling controls bacterial growth during colonization and systemic pneumococcal disease in mice. Cell Microbiol 7:1603-1615.; Khan, A. Q., Q. Chen, Z.-Q. Wu, J. C. Paton, and C. M. Snapper. 2005. Both innate immunity and type 1 humoral immunity to Streptococcus pneumoniae are mediated by MyD88 but differ in their relative levels of dependence on Toll-Like Receptor 2. Infect. Immun. 73:298-307．）。気道の肺炎球菌感染症に対する免疫反応は、好中球の大量かつ活発な肺へのリクルートによって特徴付けられ、ＰＭＮによる肺炎球菌の食作用殺傷は、主な防御機構であると考えられる。それにもかかわらず、S. pneumoniaeは、食細胞の補体沈着及び呼吸バーストを阻害するか、又は遅らせることによって、ホストの先天的防御から逃れることができる。従って、血清型特異的抗体が産生され、補体沈着阻害を回避して、オプソニン食作用を増強するまで、好中球の流入は、感染症を排除するのに効果がないことが多い。本研究において、本発明者らは、S. pneumoniaeによって通常は捕捉されないＴＬＲのアゴニスト（すなわち、ＴＬＲ５アゴニストフラジェリン）の外因性投与が、先天性免疫を強化して、気道の急性肺炎球菌感染症をコントロールできるか否かを評価した。本発明者らは、フラジェリンの局所投与が、局所的及び全身的な細菌クリアランスを増強することによって、致死用量のS. pneumoniae血清型１でチャレンジしたマウスの生存を促進することを見出した。フラジェリン処置は、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６及びＮＭＲＩマウスにおいて、感染を確立する前、感染を確立する間及び感染を確立した後に実施した場合に、効果的であった。

フラジェリンのｉｎｖｉｖｏ投与は、炎症性サイトカインの発現をアップレギュレーションすることが実証された。本明細書において、本発明者らは、S. pneumoniaeチャレンジ時におけるフラジェリンの同時投与も、ＰＭＮ特異的ケモカイン／アクチベーター遺伝子Ｃｘｃｌ１及びＣｘｃｌ２、そしてさらにＴｎｆ及びＣｃｌ２０の肺における発現をアップレギュレーションするが、S. pneumoniaeは単独で、これらの遺伝子をほとんど誘導しないことを示している。ケモカイン及びサイトカイン発現プロファイルに一致して、肺組織切片の分析は、気管支周囲及び血管周囲領域における広範囲の細胞浸潤（これは、未処置の感染動物よりもフラジェリン処置動物の肺において、顕著であった）を示した。注目すべきことに、フラジェリンによって誘導された顕著な炎症性反応にもかかわらず、肺組織は７日目までに完全に回復したが、未処置動物は感染症で死亡した。ＢＡＬサンプルの分析は、肺炎球菌チャレンジ時におけるＴＬＲ５アゴニストの投与が、急速かつより顕著なＰＭＮリクルートを誘導することを示唆した。ＰＭＮ浸潤は一時的であり、２４時間の時点でピークとなり、消退して、４０時間の時点で安定状態レベルとなった。Ｇｒ−１発現細胞（ＰＭＮの可能性が最も高い）の枯渇は、防御を無効にしたが、これは、これらの細胞が肺の肺炎球菌感染症をコントロールするのに必要であることを実証している。炎症の悪化は、肺のバリア及び機能の障害に関連し得るので、フラジェリン介在性炎症性反応の自己限定的な性質は、非常に関連する知見である。ＴＬＲ５反応をコントロールする分子機構は、炎症性遺伝子をアップレギュレーションするだけでなく、反応終了もトリガーする。従って、フラジェリン粘膜処置は、好中球浸潤及びそれと同時に起こる限定的な炎症を増強する、肺炎球菌性肺炎に対する治療と考えられ、臨床試験においてさらに評価する価値がある。

ＰＭＮに加えて、いくつかの研究は、Ｔ及びＢリンパ球並びに自然抗体が、肺炎球菌性肺炎の早期コントロールにおいて重要な役割を果たし得ることも報告している。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を持たないＭＨＣクラスＩＩ欠損マウスは、それらの野生型マウスと比較して、感染症により感染しやすいので、Ｔリンパ球は、免疫反応の初期段階において、気管支周囲の炎症領域に蓄積し、肺炎球菌に対する防御に関与することが示された。Ｂ１ａ細胞及び自然抗体産生の発達障害を有するＣＤ１９欠損マウスは、肺炎球菌感染症に対する感受性が増加している。ことが示された。しかしながら、本明細書において示される結果は、Ｔ及びＢ細胞のいずれも、フラジェリンによって誘導される局所的及び全身的な細菌クリアランスに必要ではないことを示している。まとめると、本発明者らの結果は、ＰＭＮ動態を変化させることが、Ｂ及びＴリンパ球の非存在下でさえ、肺炎球菌の効果的な殺傷をもたらすことを強く示唆している。

本発明者らの結果は、ＴＬＲ５シグナル伝達が、フラジェリンによって誘導される防御に必要であることも示している。気道において、ＴＬＲ５は、肺胞マクロファージ及び上皮細胞によって発現されており、これは、これらの常在細胞が、フラジェリン処置による、S. pneumoniaeから保護する先天的防御の誘導におけるキープレーヤーであり得ることを示唆している。これと一致して、最近の研究は、気道上皮が、有鞭毛細菌に対するケモカイン産生及びＰＭＮリクルートに関与するＴＬＲ５活性化組織であることを示唆している。他方、マウスの好中球はＴＬＲ５を発現しており、従って、ＴＬＲ５シグナル伝達も、ＰＭＮを直接的に活性化し、それらのS. pneumoniae殺傷能力を増強する可能性がある。同様にして、熱殺菌されたHaemophilus influenzaeは、Ｎｏｄ１依存的な方法で、肺炎球菌を殺傷するＰＭＮの能力を特異的に増加させ得ることが以前に確立された。

S. pneumoniae感染症の予防及び処置に関する現在の治療は、肺炎球菌疾患を予防又は治癒するのに限界があり、従って、免疫介入の新たな戦略が依然として必要である。いくつかの報告は、細菌溶解物及び熱殺菌された全細菌の投与が、感染症に対する防御反応を刺激することを示している。しかしながら、これらの調製物の不明確な性質は、通常、ヒトが使用するための薬物を設計する場合に問題である。本発明者らの結果は、よく特徴付けられた単一分子、具体的にはフラジェリンを用いた局所的な刺激が、肺の先天性免疫防御を増加させ、肺炎球菌性肺炎をコントロールするのに十分であることを示したが、これは、抗菌薬治療を開発するための基礎として、微生物関連分子パターンを使用することの利点を強調している。

参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が属する最先端技術を説明している。これらの参考文献の開示は、本明細書によって参照により本開示に組み込まれる。

Claims

気道感染症を処置するための方法における使用のための、ＴＬＲ５アゴニスト。
有機小分子；抗体、アプタマー又はポリペプチドからなる群より選択される、請求項１記載のＴＬＲ５アゴニスト。
フラジェリンポリペプチドである、請求項１又は２記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記フラジェリンポリペプチドが、エシェリキア（Escherichia）、例えばイ・コリ（E. coli）、エンテロバクター（Enterobacter）、エルビニア（Erwinia）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、サルモネラ（Salmonella）、例えばサルモネラエンテリカセロバチフィムリウム（Salmonella enterica serovar Typhimurium）、セラシア（Serratia）、例えばセラチアマルセッセンス（Serratia marcescans）、シゲラ（Shigella）、バシリ（Bacilli）、例えばＢ．スブチリス（B. subtilis）及びＢ．リチェニホルミス（B. licheniformis）、シュードモナス（Pseudomonas）、例えばＰ．エルギノーサ（P. aeruginosa）、及びストレプトミセス（Streptomyces）からなる群より選択される細菌から単離される、請求項３記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記フラジェリンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項３又は４記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記フラジェリンポリペプチドがａ）配列番号３の１位に位置するアミノ酸残基から開始し、配列番号３の９９〜１７３位に位置するアミノ酸残基のいずれか１つからなる群より選択されるアミノ酸残基で終了するアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＮ末端ペプチド；及びｂ）配列番号３の４０１〜４０６位に位置するアミノ酸残基のいずれか１つからなる群より選択されるアミノ酸残基で開始し、配列番号３の４９４位に位置するアミノ酸残基で終了するアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＣ末端ペプチドを含む請求項３記載のＴＬＲ５アゴニストであって、前記Ｎ末端ペプチドは、前記Ｃ末端ペプチドに直接的に連結されているか、又は前記Ｎ末端ペプチド及び前記Ｃ末端ペプチドは、スペーサー鎖を介して互いに間接的に連結されている、ＴＬＲ５アゴニスト。
前記Ｎ末端ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列１〜９９、１〜１３７、１〜１６０及び１〜１７３からなる群より選択される、請求項６記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記Ｃ末端ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列４０１〜４９４及び４０６〜４９４からなる群より選択される、請求項６又は７記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドが、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列１〜１７３及び４０１〜４９４からなる、請求項６〜８のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドが、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列１〜１６０及び４０６〜４９４からなる、請求項６〜８のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記Ｎ末端及びＣ末端ペプチドが、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列１〜１３７及び４０６〜４９４からなる、請求項６〜８のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記Ｎ末端ペプチド及び前記Ｃ末端ペプチドが、ＮＨ２−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ（配列番号４）ペプチド配列からなる中間スペーサー鎖を介して互いに間接的に連結されている、請求項６〜１１のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニスト。
配列番号３の４８８位に位置するアスパラギンアミノ酸残基が、セリンに置換されている、請求項６〜１２のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記フラジェリンポリペプチドが、Ｎ末端に追加のメチオニン残基を含む、請求項６〜１３のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記気道感染症が、ウイルス感染症、細菌感染症又は真菌感染症からなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記ウイルス感染症が、レトロウイルス、例えばヒトＴ細胞向性ウイルス（ＨＴＬＶ）Ｉ型及びＩＩ型並びにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、例えば単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型及びＩＩ型、エプスタイン−バーウイルス、ＨＨＶ６−ＨＨＶ８並びにサイトメガロウイルス、アレナウイルス、例えばラッサ熱ウイルス、パラミクソウイルス、例えば麻疹ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ムンプス、ｈＭＰＶ及びニューモウイルス、アデノウイルス、ブニアウイルス、例えばハンタウイルス、コルナウイルス、フィロウイルス、例えばエボラウイルス、フラビウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱病ウイルス及び日本脳炎ウイルス、ヘパドナウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、オルトミオウイルス、例えばインフルエンザウイルスＡ、Ｂ及びＣ並びにＰＩＶ、パポバウイルス、例えばパピローマウイルス、ピコルナウイルス、例えばライノウイルス、エンテロウイルス及びＡ型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、例えばロタウイルス、トガウイルス、例えばルベラウイルス、並びにラブドウイルス、例えば狂犬病ウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１５記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記細菌感染症が、アクワスピリルム（Aquaspirillum）科、アゾスピリルム（Azospirillum）科、アゾトバクター（Azotobacteraceae）科、バクテロイデス（Bacteroidaceae）科、バルトネラ（Bartonella）種、ブデロビブリオ（Bdellovibrio）科、カンピロバクター（Campylobacter）種、クラミジア（Chlamydia）種、例えばクラミジアニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、クロストリジウム（Clostridium）、エンテロバクター（Enterobacteriaceae）科、例えばシトロバクター（Citrobacter）種、エドワードシエラ（Edwardsiella）、エンテロバクターアエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エルウィニア（Erwinia）種、エシェリキアコリ（Escherichia coli）、ハフニア（Hafnia）種、クレブシエラ（Klebsiella）種、モルガネラ（Morganella）種、プロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）、プロビデンシア（Providencia）、サルモネラ（Salmonella）種、セラチアマルセッセンス（Serratia marcescens）及びシゲラフレキシネル（Shigella flexneri）、ガルジネラ（Gardinella）科、ヘモフィルスインフルエンザ（Haemophilus influenzae）、ハロバクテリウム（Halobacteriaceae）科、ヘリコバクター（Helicobacter）科、レジオネラ（Legionallaceae）科、リステリア（Listeria）種、メチロコッカス（Methylococcaceae）科、マイコバクテリア（mycobacteria）、例えばマイコバクテリウムツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ナイセリア（Neisseriaceae）科、オセアノスピリルム（Oceanospirillum）科、パスツレラ（Pasteurellaceae）科、ニューモコッカス（Pneumococcus）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、リゾビウム（Rhizobiaceae）科、スピリルム（Spirillum）科、スピロソマ（Spirosomaceae）科、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、例えばメチシリン耐性スタフィロコッカスアウレウス（Staphylococcus aureus）及びスタフィロコッカスピロゲネス（Staphylococcus pyrogenes）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、例えばストレプトコッカスエンテリティデス（Streptococcus enteritidis）、ストレプトコッカスファシア（Streptococcus Fasciae）及びストレプトコッカスニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、バンピロビブルヘリコバクター（Vampirovibr Helicobacter）科及びヴァムピロビブリオ（Vampirovibrio）科からなる群より選択される細菌によって引き起こされる、請求項１５記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記細菌感染症が、鞭毛を有しない細菌例えば、ストレプトコッカスニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルスインフルエンザ（Haemophilus influenzae）、モラクセラカタラリス（Moraxella catarrhalis）又はマイコプラズマニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）によって引き起こされる、請求項１７又は１８記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記細菌感染症が、肺炎球菌感染症である、請求項１７〜１９のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニスト。
前記真菌感染症が、アブシディア（Absidia）種、例えばアブシディアコリムビフェラ（Absidia corymbifera）及びアブシディアラモサ（Absidia ramosa）、アスペルギルス（Aspergillus）種、例えばアスペルギルスフラブス（Aspergillus fiavus）、アスペルギルスフミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルスニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスぺルギルスニガー（Aspergillus niger）及びアスペルギルステレウス（Aspergillus terreus）、ブラストミセスデルマチヂス（Blastomyces dermatitidis）、カンジダ（Candida）種、例えばカンジダアルビカンス（Candida albicans）、カンジダグラブラタ（Candida glabrala）、カンジダケル（Candida kerr）、カンジダクルセイ（Candida krusei）、カンジダパラプシロシス（Candida parapsilosis）、カンジダシュードトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、カンジダキレルモンジイ（Candida quillermondii）、カンジダルゴサ（Candida rugosa）、カンジダステラトイデア（Candida stellatoidea）及びカンジダトロピカリス（Candida tropicalis）、コクシジオイデスイミティス（Coccidioides immitis）、コニディオボラス（Conidiobolus）種、クリプトコックスネオホルムス（Cryptococcus neoforms）、クニンガメラ（Cunninghamella）種、ヒストプラスマカプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ムコルプシルス（Mucorpusillus）、パラコクシジオイデスブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、プソイダレスケリアボイジイ（Pseudallescheria boydii）、ニューモシスチスカリニ（Pneumocystis carinii）、リゾプス（Rhizopus）種、例えばリゾプスアリズス（Rhizopus arrhizus）、リゾプスオリザ（Rhizopus oryzae）及びリゾプスミクロスポルス（Rhizopus Microspores）、サッカロミセス（Saccharomyces）種及びスポロトリキススケンッキイ（Sporothrix schenckii）からなる群より選択される真菌によって引き起こされる、請求項１５記載のＴＬＲ５アゴニスト。
請求項１〜１４のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニストを含む、気道感染症を処置するための方法における使用のための医薬組成物。
鼻腔内投与又は肺内投与などの局所投与に適合するように製剤化されている、請求項２１記載の医薬組成物。
エアロゾル形態、スプレー、ミスト又は滴剤に製剤化されている、請求項２２記載の医薬組成物。
気道感染症若しくは１つ以上のその症状を予防、処置、管理又は改善する方法であって、治療有効量の請求項１〜１４のいずれかに記載のＴＬＲ５アゴニストを、それを必要とする被験体に投与ことを含む、方法。