TWI430808B

TWI430808B - 外膜蛋白ａ於治療／預防／診斷中樞神經系統與周邊血液細菌感染之用途

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Publication number: TWI430808B
Application number: TW97108555A
Authority: TW
Original assignee: Univ Taipei Medical
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2008-03-11
Publication date: 2014-03-21
Also published as: TW200938220A

Description

外膜蛋白A於治療/預防/診斷中樞神經系統與周邊血液細菌感染之用途

本發明係關於一種治療及/或預防及/或診斷哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環細菌感染之方法，其藉由投藥有效量的外膜蛋白A或其衍生物至哺乳動物。

一般而言，中樞神經系統(CNS)受到良好的保護以抵抗感染。脊椎及腦被包覆於堅韌、具保護性的膜中。最外層的膜，硬腦膜，及下一層膜，蛛網膜，完全包圍腦及脊髓。然而，這些保護並非絕對的；在一些情況，細菌得以接近CNS內的區域。細菌感染可為化膿性感染(如腦膜炎、腦膿腫、硬腦膜下膿瘍及硬腦膜外膿瘍)、肺結核、神經梅毒或痲瘋。典型地，細菌侵襲係由鄰近的感染擴散所導致；例如，慢性鼻竇炎或中耳感染可擴展遠離其起始位置。細菌亦可藉血流自遠端的感染位置而傳遞至CNS。在稀少的情況，頭部創傷或手術過程可將細菌直接導入CNS。然而，感染源經常無法被鑑定出來。

細菌感染的治療目的是終止感染，減輕症狀，預防併發症及，必要時，維持生命。一種雙軌的方法被採用以治療細菌感染。首先，開始抗生素治療對抗一系列可能的感染菌。第二階段涉及手術以清除感染位置。一旦鑑定出細菌菌種，藥物治療可改用較特定的抗生素。然而，手術在一些情況中並非好的選擇，如感染位置眾多或感染位於腦部無法接近的位置。

外膜蛋白A(outer membrane protein A，OmpA)最初由Henning及其同事描述於1975年，其具有325個胺基酸殘基且在SDS－PAGE中呈現熱修飾性(heat－modifiable)的電泳移動。OmpA的N端結構域由177個胺基酸組成且橫越外膜8次。OmpA與維持細菌形狀有關，作為噬菌體受體及F－中介接合的受體(F－mediated conjugation)，且具有限的孔形成性質。OmpA增強LPS攝入於巨噬細胞且已有報導指出其與大腸桿菌侵襲中樞神經系統有關。WO 9201001提供一種製造純選殖的外膜蛋白的方法，並提供一種使彼等復性(renaturation)的方法，以再獲得生物或免疫活性的抗原表位(antigenic epitope)，該抗原表位可誘發動物產生抗體。

然而，並無任何有關外膜蛋白A及其衍生物於治療及/或預防及/或診斷中樞神經系統及/或周邊血液循環細菌感染之新用途的報導。

本發明之一目的係提供一種治療及/或預防哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環細菌感染之方法，其包含投藥有效量的外膜蛋白A或其衍生物至該哺乳動物。換言之，本發明提供一種外膜蛋白A或其衍生物於治療及/或預防哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環細菌感染之用途。

本發明之另一目的係提供一種免疫哺乳動物以產生抗中樞神經系統及/或周邊血液循環之細菌感染之抗體之方法，其包含投藥有效量的外膜蛋白A或其衍生物至該哺乳動物。換言之，本發明提供一種外膜蛋白A或其衍生物於免疫哺乳動物以產生抗中樞神經系統及/或周邊血液循環之細菌感染之抗體之用途。

本發明之又一目的係提供一種檢測或診斷哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環細菌感染之方法，其包含塗覆一第一專一性抗OmpA抗體於一基質表面，該抗體可免疫專一性地與血液中OmpA分子或細菌細胞膜上的OmpA結合；添加取自周邊血液循環及/或中樞神經系統的樣品於該基質；添加一具標籤之第二抗－OmpA抗體；及檢測抗OmpA抗體與OmpA分子或細菌細胞膜上的OmpA的結合，其中該結合結果指出該哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環遭受細菌感染。

本發明未預期地發現外膜蛋白A(OmpA)可用於治療及/或預防及/或診斷中樞神經系統及/或周邊血液循環之細菌感染。此外，業已發展與OmpA結合的抗體以分析生物樣品中的OmpA的量及檢測或診斷中樞神經系統及/或周邊血液循環之細菌感染。

本發明提供一種治療及/或預防哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環細菌感染之方法，其包含投藥有效量的外膜蛋白A或其衍生物至該哺乳動物。換言之，本發明提供一種外膜蛋白A或其衍生物於治療及/或預防哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環細菌感染之用途。

用於本文中的「中樞神經系統」意指由腦及脊髓所組成的神經系統部份。「周邊血液循環」意指全身循環中的血液。

用於本文中的「細菌感染」意指革蘭氏陰性菌所引起的感染。較佳地，該細菌感染係由腸桿菌科(Enterobacteriaceae )或其他革蘭氏陰性菌所引起。更佳地，該細菌感染係由志賀氏菌屬(Shigella )、沙門氏菌屬(Salmonella )、克雷白氏菌屬(Klebsiella )、埃希氏菌屬(Escherichia )、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter )或腸內菌屬(Enterobactor )所引起。最佳地，該細菌感染由大腸桿菌(Escherichia coli )所引起。

用於本文中的「外膜蛋白A(OmpA)」意指任何得自革蘭氏陰性菌的OmpA及任何重組OmpA。OmpA是一種富含於革蘭氏陰性菌外膜上的結構蛋白。該「OmpA衍生物」意指衍生自OmpA的蛋白質。例如，具有與OmpA相同功能的OmpA重組體為OmpA衍生物。較佳地，OmpA或其衍生物係得自腸桿菌科(Enterobacteriaceae )或其他革蘭氏陰性菌。更佳地，OmpA或其衍生物係得自志賀氏菌屬(Shigella )、沙門氏菌屬(Salmonella )、克雷白氏菌屬(Klebsiella )、埃希氏菌屬(Escherichia )、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter )或腸內菌屬(Enterobactor )。最佳地，OmpA或其衍生物係得自大腸桿菌(Escherichia coli )。

根據本發明，本發明之治療上有效量的OmpA或其衍生物的可投藥至罹患中樞神經系統及/或周邊血液循系統之細菌感染之哺乳動物(包括人類或非人類哺乳動物)。根據本發明，本發明OmpA或其衍生物之投藥可藉各種一般方式進行。適合於口服投藥的投藥形式為彼等根據前案狀態作用及以快速及/或修飾方式遞送本發明OmpA或其衍生物，例如，錠劑(未包覆或包覆錠劑，例如抵抗胃酸或緩慢溶解或不溶性塗層或控制本發明化合物釋出的塗層)、於口中迅速崩解的錠劑、或膜狀藥物/薄片、膜狀藥物/凍乾片、膠囊(例如硬或軟膠囊)、糖衣錠、顆粒、丸劑、粉末、乳劑、懸浮液、氣霧劑或溶液。

非經腸投藥包括靜脈內點滴或灌注、皮下注射、腹腔內注射或肌肉內注射、肺部投藥(如藉由吸入或吹入)或脊髓腔或腦室內投藥。適合於非經腸投藥的投藥形式為溶液、懸浮液、乳劑、凍乾劑或滅菌粉末形式的注射及灌注製備物。

口服或非經腸投藥係為較佳，特別是口服及靜脈內投藥。特佳為靜脈內劑型，例如治療急性中樞神經系統感染。

根據本發明之OmpA或其衍生物可轉變成適合的醫藥組合物，其可藉混合惰性、無毒性之醫藥上適合的賦形劑以已知的方式達成。此等賦形劑包括載劑(例如微結晶纖維素、乳糖、甘露糖醇)、溶劑(例如液態聚乙二醇)、乳劑及分散劑或濕潤劑(例如十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)、polyoxysorbitan oleate)、結合劑(例如聚乙烯比各啶酮)、合成及天然聚合物(例如白蛋白)、安定劑(如抗氧化劑，如抗壞血酸)、著色劑(例如無機色素，如氧化鐵)及遮蔽劑及/或香料。

本發明所述之投藥形式包括0.0001%至10%以重量計之OmpA或其衍生物，較佳為0.5%至5%以重量計之OmpA或其衍生物。以本發明醫藥組合物治療的時間係基於擬治療疾病的嚴重性及個別病患的狀況來決定。醫生應決定以本發明醫藥組合物治療的足夠時間。

本發明亦提供一種免疫哺乳動物以產生抗中樞神經系統及/或周邊血液循環之細菌感染之抗體之方法，其包含投藥有效量的外膜蛋白A或其衍生物至該哺乳動物。換言之，本發明提供一種外膜蛋白A或其衍生物於免疫哺乳動物以產生抗中樞神經系統及/或周邊血液循環之細菌感染之抗體之用途。基於發現OmpA可治療及/或預防及/或診斷中樞神經系統及/或周邊血液循環之細菌感染，OmpA被用於導入動物體而用於免疫。本發明已發現OmpA可誘導專一性抗體的產生。

本發明抗體可藉技藝中已知的方法產生。抗OmpA的多株抗體及單株抗體可藉技藝中已知的各種製程產生。例如，可將OmpA投藥於各種宿主動物(其包括，但不限於，兔子、小鼠、大鼠等)以誘導包含對OmpA具專一性的多株抗體的產生。視宿主種類而定，亦可使用不同佐劑以增加免疫反應；該等佐劑包括，但不限於，弗氏佐劑(Freund's adjuvant)(完全及不完全)、礦物凝膠(如氫氧化鋁)、界面活性物質(如溶血卵磷脂(lysolecithin)、複合多元醇 (Pluronic polyols)、聚陰離子)、肽、油性乳劑、血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、二硝基酚及可能的人類佐劑(如BCG(bacilli Calmette－Guerin))及短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum )。此等佐劑均為技藝中已知。

本發明抗體可用於分析生物樣品中OmpA的量，使用如本文中所述的血清學及免疫組織學方法或使用技藝中已知的方法。其他用於檢測蛋白質基因表現的基於抗體的方法包括免疫分析，如酵素連結免疫吸附法(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)及放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)。適合的抗體分析標籤係為技藝中已知及包括酵素標籤，如葡萄糖氧化酶、放射性同位素(如碘(125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H))、銦(121In)及鎝(99Tc))、冷光標籤(如魯米諾(luminol))及螢光標籤(如fluorescein及rhodamine)及生物素。

本發明另提供一種檢測或診斷哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環細菌感染之方法。在一具體實施例，該檢測或診斷包括：塗覆一第一專一性抗OmpA抗體於一基質表面(如ELISA盤或磁奈米顆粒)，該抗體可免疫專一性地與血液中OmpA分子或細菌細胞膜上的OmpA結合；添加取自周邊血液循環及/或中樞神經系統的樣品於該基質；添加一具標籤之第二抗－OmpA抗體；及檢測抗OmpA抗體與OmpA分子或細菌細胞膜上的OmpA的結合，其中該結合結果指出該哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環遭受細菌感染。

根據本發明，該第一專一性抗OmpA抗體係使用技藝中已知的方法及商業塗覆緩衝液塗覆於基質表面，且任何適合的基質可用於本發明方法。該基質較佳為ELISA盤或磁奈米顆粒。該抗OmpA抗體可專一性與血液中的OmpA分子或細菌膜上的OmpA結合。為使結合可被檢測，該專一性與OmpA分子結合的抗OmpA抗體藉由使用具標籤的第二抗－OmpA抗體來檢測。根據本發明，用語「標籤」為具有可檢測性質或特性的分子或基團。一標籤可被直接檢測(如放射線同位素、螢光物質(fluorophore)、或化學冷光物質(chemilumiphores)；或一標籤可被不直接地檢測(如半抗原(hapten)或聚核苷酸)。當不直接標籤使用於檢測或訊號目的，彼等係用於與訊號體複合物接合。該「訊號體」為提供可檢測性質或特性的分子或基團。該訊號體可為直接地(如膠體粒子(如膠體金或硒))；或可為不直接地(如酶(如鹼性磷酸酶、β－半乳糖苷酶或辣根過氧化酶))。不直接的訊號體可能需要技藝中已知的額外成分(如基質(substrate))。該「訊號體複合物」包括與特定結合伴體(如抗體或聚核苷酸)結合的訊號體。此等結合物可根據任何已知的結合方法製備。

根據本發明，抗OmpA抗體與周邊血液或中樞神經系統中的OmpA分子的結合可被用於檢測OmpA分子的存在。如該OmpA分子存在於一個體的周邊血液或中樞神經系統，代表該個體被具有OmpA分子的細菌感染。

實施例實例1 附著性及侵襲性分析(Adhesion and Invasion Assay)

針對C6膠質瘤細胞－相關細菌研究，融合性細胞單層分別與細菌菌株E.coli E44、E91及MG1655一起培養於37℃一段設定的時間間隔。E.coli E44為K1菌株E.coli E44RE218(O18：K1：H7)且其衍生自腦膜炎嬰兒的腦脊髓液。E.coli E91為衍生自菌株E44且缺乏完整OmpA基因的突變株。E.coli MG1655為非病理性菌株且對血腦障壁為非侵襲性，因此使用其作為控制組。

在附著性分析中，以上述細菌菌株於設定的時間間隔感染C6膠質瘤細胞(MOI(bacteria－to－cell)＝10)。接者以培養基清洗C6膠質瘤細胞單層3次並以0.5% Triton X－100溶裂細胞。釋出的細菌藉塗覆於綿羊血瓊脂培養盤(sheep blood agar plate)計數。以附著分析的結果所示(圖1)，E.coli E44的數目依時間而大幅增加。然而，E.coli E91及MG1655的數目則小於E.coli E44。

在侵襲性分析(慶大霉素保護分析，gentamicin protection assay)中，針對細胞內細菌研究，以上述細菌菌株於於37℃設定的時間間隔感染膠質瘤C6融合細胞單層(MOI(bacteria－to－cell)＝10)。接者以培養基清洗C6膠質瘤細胞單層3次並進一步以含有慶大霉素(gentamicin)(100 μg/ml)的培養基培養2小時以殺死細胞外細菌。再次清洗單層3次並以0.5% Triton X－100溶裂細胞。釋出的細菌藉塗覆於綿羊血瓊脂培養盤(sheep blood agar plate)計數。如圖2之侵襲性分析所示，E.coli E44的數目遠大於E.coli E91及MG1655的數目。在侵襲性抑制分析中，以具4 μg或40 μg OmpA的E.coli E44感染C6膠質瘤細胞單層2小時。接著以培養基清洗細胞單層3次並進一步以含有慶大霉素(gentamicin)(100 μg/ml)的培養基培養2小時以殺死細胞外細菌。釋出的細菌藉塗覆於綿羊血瓊脂培養盤(sheep blood agar plate)計數。如圖3所示，E.coli E44及OmpA的混合物確實可抑制E.coli E44的侵襲。OmpA可抑制大於55%(4 μg)及80%(40 μg)的E.coli E44的侵襲。

實例2 動物實驗

C57BL/6小鼠係由國家實驗動物中心取得，並飼養於無病原狀態下。動物的處理程序係根據台北醫學大學的經許可的試驗計劃書。

將8至12周大的C57BL/6小鼠隨機分成數組，每一組包含5至10隻小鼠。以腹腔內注射巴比妥酸鈉鹽(50 mg/kg)麻醉小鼠，接著藉腦內注射以5×10⁵ E.coli 菌株E44、E91或MG1655於20 μl PBS或5 μg LPS於20 μl PBS感染每一小鼠的腦脊髓。使用20 μl PBS作為控制組。E.coli 菌株感染C57BL/6小鼠後的存活於投藥8天後進行評估。如圖4所示，所有以E.coli E44感染的小鼠於2天後死亡。

為探究重組OmpA於經腦內E44投藥的C57BL/6小鼠之存活的角色，以腹腔內注射巴比妥酸鈉鹽(50 mg/kg)麻醉8－12周大的C57BL/6小鼠。接著藉腦內注射以5×10⁵ E.coli 菌株E44於20 μl PBS(含或不含預先混合的8 μg或20 μg重組 OmpA)感染每一小鼠的腦脊髓。使用30 μl PBS作為控制組。E.coli 菌株感染C57BL/6小鼠後的存活於投藥8天後進行評估。圖5顯示OmpA延長以腦內注射E.coli E44的小鼠的存活。含8 μg OmpA之E.coli E44及含20 μg OmpA之E.coli E44處理的小鼠分別約有40%及80%的存活率。

實例3 免疫細胞化學

以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定C6膠質瘤細胞單層。樣品以1%BSA封阻並接著以含有雞抗－OmpA IgY多株抗體(稀釋1：100及1：1000)的溶液培養。取自非免疫的雞的多株IgY抗體作為負控制組。最後，以FITC標示的抗－IgY二級抗體(稀釋1：500)培養樣品。玻片以50%甘油－PBS固定並接著以TCS SP5共軛焦光譜顯微鏡影像系統(Confocal Spectral Microscope Imaging System)(Leica)檢測。圖6顯示所產生的抗－OmpA抗體與E44結合，然而得自非免疫雞的IgY未顯示任何結合活性。

實例4 免疫分析

用於本分析的C57BL/6小鼠與實例2相同。第1週，小鼠以30 μg於弗氏佐劑之OmpA免疫作為第1次免疫作用。第2週，小鼠以30 μg於不完全弗氏佐劑之OmpA免疫作為第2次免疫作用。第3週，小鼠以30 μg於不完全弗氏佐劑之OmpA免疫作為第3次免疫作用。第4週，小鼠以30 μg於不完全弗氏佐劑之OmpA免疫作為第4次免疫作用。此後，自免疫小鼠分離多株抗體並用於檢測固定於硝基纖維素紙的OmpA分子。圖7顯示OmpA分子可使用誘發於小鼠的多株抗體以西方墨點分析(western blot analysis)檢測。

圖1顯示大腸桿菌(E.coli )菌株之附著性分析結果。

圖2顯示大腸桿菌(E.coli )菌株之侵襲性分析結果。

圖3顯示OmpA抑制E.coli E44對C₆ 膠質瘤細胞之侵襲。

圖4顯示經腦內注射E.coli 菌株之C57BL/6小鼠之存活情形。

圖5顯示OmpA延長經腦內注射E.coli E44之小鼠之存活。

圖6顯示使用共軛焦光譜顯微鏡影像系統之抗-OmpA IgY抗體對E.coli E44之結合情形。

圖7顯示抗OmpA抗體之電泳圖。

Claims

一種大腸桿菌(Escherichia coli )外膜蛋白A(OmpA)之用途，其係用於製備治療及/或預防哺乳動物之中樞神經系統及/或周邊血液循環之大腸桿菌感染之藥物。
根據請求項1之用途，其中該哺乳動物為人類。
根據請求項1之用途，其中該OmpA為重組OmpA。
根據請求項1之用途，其中該藥物係經口服或靜脈內注射投予。
根據請求項1之用途，其中該藥物係用於投予0.0001%至10%以重量計之OmpA。
根據請求項1之用途，其中該藥物係用於投予0.5%至5%以重量計之OmpA。
一種大腸桿菌外膜蛋白A(OmpA)之用途，其係用於在哺乳動物中製備抗中樞神經系統及/或周邊血液循環之大腸桿菌感染之抗體，其中該抗體為對OmpA具專一性之多株抗體。
根據請求項7之用途，其中該哺乳動物為人類。
根據請求項7之用途，其中該OmpA為重組OmpA。
根據請求項7之用途，其中該OmpA之量為0.0001%至10%以重量計。
根據請求項7之用途，其中該OmpA之量為0.5%至5%以重量計。