DE60216445T2 - Universelles nachweissystem für mehrere varianten - Google Patents

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Description

  • Verweis auf eine verwandte Anmeldung
  • Diese Anmeldung geht auf die U. S. Provisional Application 60/284,334, Anmeldetag 17. April 2001, zurück.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Der Nachweis von eng verwandten genetischen Varianten stellt eine erhebliche Herausforderung in der analytischen Diagnostik dar. Pathogene, z. B. Viren und Bakterien, mutieren im allgemeinen häufig und bilden derartige genetische Varianten.
  • Beispielsweise sind die Nucleinsäuresequenzen des humanen Immunschwächevirus (HIV-1) unterschiedlicher Herkunft voneinander verschieden. Die verschiedenen Typen von HIV-1 werden in Gruppen und Subtypen eingeteilt. Die Hauptgruppe M besteht aus 10 derzeit identifizierten Subtypen, die als Subtypen A bis H, J und K bezeichnet werden. Zusätzlich zu Viren der M-Gruppe wurden zwei weitere Gruppen, nämlich N und O, identifiziert (Simon et al., Nature Med., Bd. 4 (1998), S. 1032–1037). Innerhalb von Gruppen und Subtypen werden ständig neue Stämme des Virus erzeugt, und zwar aufgrund der fehleranfälligen Natur der HIV-1-Replikationsmaschinerie.
  • Gleichermaßen liegt das Hepatitis C-Virus (HCV) nicht als eine homogene RNA-Population vor. Selbst innerhalb eines einzelnen infizierten Individuums können gleichzeitig zahlreiche heterogene virale Genome (Quasispezies) vorliegen. Ferner wurden mehrfache Genotypen von HCV auf der Basis der Nucleotidsequenz-Analyse von viralen Varianten, die aus unterschiedlichen geographischen Regionen isoliert wurden, identifiziert. Es gibt derzeit sechs Haupt-HCV-Genotypen, die mit den Ziffern 1 bis 6 bezeichnet werden. Die Genotypen werden ferner je nach dem Subtyp weiter unterteilt.
  • Aufgrund dieser genetischen Variation von Pathogenen innerhalb einer Spezies ist der Umfang von diagnostischen Tests, die zuverlässige Ergebnisse liefern, hochgradig eingeschränkt. Die meisten Nachweisverfahren, die derzeit zum Nachweis von Pathogenen in einer Probe verfügbar sind, beruhen entweder auf dem Nachweis der Antigene der Pathogene, der von den Pathogenen induzierten Antikörper oder der intrinsischen Enzyme der Pathogene, z. B. der intrinsischen reversen HIV-Transkriptase. Abgesehen von ihrer Unzweckmäßigkeit sind diese Verfahren häufig nicht sehr empfindlich. Beispielsweise besteht das derzeit von Blutbanken zum Screening von HIV-1-Infektionen bei Blutspendern angewandte Verfahren im Nachweis von Antikörpern auf Virusproteine. Dieses Verfahren versagt beim Nachweis bei Individuen in der frühen akuten Phase der Infektion, in der die Individuen noch keine diagnostischen Antikörper gegen das Virus entwickelt haben.
  • Screening-Verfahren, die auf dem Nachweis von Nucleinsäuresequenzen beruhen, sind empfindlich und zweckmäßig. Jedoch sind diese Tests möglicherweise nicht immer beim Nachweis von eng verwandten genetischen Varianten zuverlässig.
  • S. K. Poddar beschreibt in Molecular and Cellular Probes, Bd. 14 (2000), S. 25–32 ein PCR-Verfahren unter Verwendung einer molekularen "Leuchtturm"-Sonde zum Nachweis eines Zielgens von Adenovirus und vergleicht die Empfindlichkeit einer symmetrischen PCR mit der Empfindlichkeit einer asymmetrischen PCR.
  • WO-00/68436 beschreibt ein Nachweissystem für das humane Immunschwächevirus auf der Basis einer Nucleinsäure-Amplifikation.
  • WO-01/07652 beschreibt ein Nachweissystem für humanes Hepatitis B-Virus auf der Basis einer Nucleinsäure-Amplifikation.
  • Barlow et al., Journal of Virological Methods, Bd. 52 (1995), S. 65–74, führen eine Analyse und Genotypisierung von PCR-Produkten, die unter Verwendung des Amplicor HIV-1-Kits erhalten worden sind, durch.
  • Jurinke et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, Bd. 14 (1998), S. 97–102, wenden eine verschachtelte PCR und die Massenspektrometrie zum Nachweis von Hepatitis B-Virus auf DNA-Basis an.
  • Bennett et al., Journal of Virological Methods, Bd. 83 (1999), S. 11–20. beschreiben ein quantitatives PCR-Verfahren zum Testen von HIV-1-Provirus-Belastungen in peripheren mononuklearen Blutzellen.
  • Eines der derzeit verfügbaren Nachweisverfahren auf der Basis von Nucleinsäuresequenzen bedient sich molekularer "Leuchttürme" (Tyagi und Kramer, Nat. Biotechnol., Bd. 14 (3) (1996), S. 303–308). Molekulare "Leuchttürme" sind einzelsträngige Oligonucleotidsonden, die eine Stamm-Schleifen-Struktur aufweisen (vergl. 1). Der Schleifenbereich des Moleküls stellt eine Sondensequenz dar, die komplementär zu einem Ziel-Nucleinsäuremolekül ist. Der Stamm wird durch Anlagern der komplementären Armsequenzen an die Enden der Sondensequenz gebildet. Ein fluoreszierender Rest ist am Ende eines Arms angebracht, und ein Quenching-Rest ist am Ende des anderen Arms angebracht. Die Hybridisierung der Arme des Stammes miteinander hält diese beiden Reste in enger Nachbarschaft, wodurch die Fluoreszenz des Fluorophors, der durch Energietransfer auszulöschen ist, hervorgerufen wird (1a). In Gegenwart des komplementären DNA-Ziels des "Leuchtturms" hybridisiert die Schleifenstruktur mit dem Ziel, wodurch die Arme des Stammes an der Aufrechterhaltung des hybridisierten Zustands gehindert werden. Das Fluorophor und der Quencher (Auslöscher) sind physikalisch voneinander getrennt und es ergibt sich eine Fluoreszenz (1b).
  • Molekulare "Leuchttürme" werden derzeit für eine quantitative Echtzeit-PCR verwendet. PCR-Primer sind so konzipiert, dass ein spezifisches DNA-Segment amplifiziert wird, üblicherweise mit einer Länge von weniger als 200 Basenpaaren. Der "Leuchtturm" ist typischerweise so konzipiert, dass eine Schleife komplementär zu einer kurzen (20–25 bp) Region an einem der amplifizierten DNA-Stränge ist. Die komplementäre Region dieser amplifizierten DNA-Stränge stellt den Bereich dieser Stränge dar, der an die Primer addiert worden ist.
  • Molekulare "Leuchttürme" sind hochgradig sequenzspezifisch. Tatsächlich bestand eine der grundlegenden Anwendungen dieser Technologie in den letzten Jahren in der Allelen-Unterscheidung oder "molekularen Genotypisierung". Die Empfindlichkeit von molekularen "Leuchttürmen" gegenüber Sequenzvariationen ermöglicht eine Unterscheidung sogar zwischen einzelnen Nucleotid-Polymorphismen in einer gegebenen Zielsequenz (Tyagi et al., Nat. Biotechnol., Bd. 16(1) (1998), S. 49–53; Kostrikis et al., Science, Bd. 279 (5354) (1998), S. 1228–1299; Marras et al., Genet. Anal., Bd. 14 (5–6) (1999), S. 151–156; Tapp et al., Biotechniques, Bd. 28(4) (2000), S. 732–738).
  • Bisher hat diese Empfindlichkeit gegenüber Sequenzvariationen die Anwendung der molekularen "Leuchtturm"-Technik auf die Diagnose von viralen Infektionen ernsthaft eingeschränkt. Die molekularen "Leuchttürme" können nicht in wirksamer Weise die varianten Sequenzen von DNA- oder RNA-Zielen nachweisen. Beispielsweise erkennt möglicherweise ein "Leuchtturm", der für die Erkennung eines PCR-Produkts aus einem HIV-Stamm A konzipiert ist, nicht ein PCR-Produkt aus einem HIV-Stamm B (vergl. 2).
  • Somit würde die derzeitige Technik mehrere verschiedene "Leuchttürme" benötigen, um den Nachweis sämtlicher unterschiedlicher Genotypen des Virus zu ermöglichen. Dies bedeutet, dass es trotz der Tatsache, dass die Existenz einiger hochgradig konservierter Regionen des Genoms von HIV-1 bekannt ist, wahrscheinlich ist, dass mehrere verschiedene "Leuchttürme" notwendig wären, um sämtliche bekannten Subtypen dieses Virus nachzuweisen. Außerdem können möglicherweise selbst bei Verwendung mehrerer verschiedener "Leuchttürme" andere Varianten von HIV-1, die noch nicht identifiziert worden sind, nicht nachgewiesen werden.
  • Somit sorgt die derzeit verfügbare Technologie nicht für einen zweckmäßigen oder effizienten diagnostischen Test zum Nachweis sämtlicher verwandter genetischer Varianten von Pathogenen.
  • Es besteht ein dringendes Bedürfnis nach empfindlichen, zweckmäßigen, auf Nucleinsäure basierenden Screeningtests, die zum Nachweis von eng verwandten genetischen Varianten befähigt sind. Beispielsweise besteht ein Bedürfnis nach Tests, die zum direkten Nachweis von Viren, Bakterien und anderen Pathogenen in kontaminiertem Blut befähigt sind. Derartige Tests sind notwendig, um Blut- oder Plasma-Einheiten von Individuen in den frühen akuten Stadien einer Pathogen-Infektion zu erfassen, d. h. bevor das Individuum diagnostische Antikörper gegen das Virus entwickelt hat.
  • Demzufolge besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Überwindung der vorgenannten Beschränkungen im Stand der Technik durch Bereitstellung eines zweckmäßigen und wirksamen diagnostischen Tests zum Nachweis von multiplen Varianten eines speziellen Ziel-Nucleinsäuremoleküls.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Diese und weitere Aufgaben, die für den Fachmann offensichtlich sind, werden durch Bereitstellung eines Verfahrens zum diagnostischen Nachweis der Varianten eines gegebenen Pathogens, z. B. HIV, Hepatitis C, Hepatitis B (HBV), Parvovirus B19 und dergl., unter Verwendung einer einzigen Nachweissonde, d. h. durch ein universelles Multivarianten-Nachweissystem, gelöst. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der einzigen Nachweissonde um einen molekularen "Leuchtturm".
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Graphische Darstellung eines molekularen "Leuchtturms". Bei der geeigneten Anlagerungstemperatur ergibt sich folgendes: (A) Entweder bildet der "Leuchtturm" in Abwesenheit einer komplementären Zielsequenz eine Stamm-Schleifen-Struktur, die bewirkt, dass der Auslöschrest (D) das Auslöschen der Lumineszenz des Reporterrestes (O) bewirkt; oder (B) der "Leuchtturm" geht in Gegenwart eines komplementären Ziels eine Bindung mit dem Ziel ein, dem Reporter die Aussendung seines Signals zu ermöglichen.
  • 2: Herkömmliche PCR unter Verwendung von molekularen "Leuchttürmen". PCR-Primer werden so konzipiert, dass ein Segment von viraler RNA amplifiziert wird. Ein molekularer "Leuchtturm" ist so konzipiert, dass seine Sondenschleife mit einem Segment des PCR-Produkts, das sich im Innern der beiden PCR-Primer befindet, hybridisiert. Der "Leuchtturm" ist zur Hybridisierung mit dem PCR-Produkt des Virusstammes A befähigt, kann jedoch nicht das PCR-Produkt des Virusstammes B nachweisen, und zwar aufgrund von Fehlpaarungen in der Zielsequenz (in Kleinbuchstaben dargestellt.
  • 3: Graphische Darstellung von einem der Prinzipien der Erfindung. (a) Reverser bzw. Rückwärts- und Vorwärts-PCR-Primer (> 30 bp) sind zur direkten "Nase-an-Nase"-Hybridisierung mit der Ziel-RNA (oder DNA) bzw. mit ihrem komplementären DNA-Strang bestimmt, so dass das erzeugte PCR-Produkt keine zwischenliegende Sequenz besitzt. Die zielspezifische Schleife des molekularen "Leuchtturms" ist so konzipiert, dass sie mit der DNA-Sequenz, die durch die Verbindung von einem der Primer und dem Komplement des anderen Primers geschaffen worden ist, hybridisiert. PCR-Primer hybridisieren mit Zielmatrizen mit Fehlpaarungsresten, die mit "X" bezeichnet sind. Punktierte Linien bezeichnen die Hybridisierung. (b) Die DNA-Sequenz des PCR-Produkts, das aus sämtlichen Matrizen amplifiziert worden ist, ist identisch mit der kombinierten Sequenz von einem der Primer und dem Komplement des anderen Primers. Der molekulare "Leuchtturm" ist somit zur Hybridisierung mit PCR-Produkten, die aus sämtlichen Matrizen erzeugt worden sind, befähigt.
  • 4: Ein Beispiel für das Verfahren. Eine Amplifikation verschiedener Subtypen von HIV unter Verwendung von "Nase-an-Nase"-Primern und eines molekularen "Leuchtturms", der zur Erkennung einer Sequenz befähigt ist, die durch die Verbindung von einem der Primer und dem Komplement des anderen Primers erzeugt worden ist. Fehlpaarungen zwischen der Sequenz der HIV-Varianten und entweder der Primer oder der "Leuchtturm"-Schleife sind in fettgedruckten Kleinbuchstaben dargestellt.
  • 5: Darstellung von Variationen an der Primerposition. (A) Die "Leuchtturm"-Schleife kann so konzipiert werden, dass sie mit einer amplifizierten Sequenz hybridisiert, die gleichermaßen durch die beiden PCR-Primer gemäß Darstellung in (1) erzeugt worden ist. Alternativ kann der "Leuchtturm" so konzipiert sein, dass er "asymmetrisch" mit einer amplifizierten Sequenz hybridisiert, die primär entweder durch den Vorwärtsprimer oder den reversen Primer bzw. Rückwärtsprimer gemäß Darstellung in (II) bis (IV) erzeugt worden ist. (B) In einer weiteren Abänderung sind der Vorwärtsprimer und der reverse Primer bzw. Rückwärtsprimer durch eine Nucleotidlücke getrennt, die einer hochgradig konservierten Region des viralen Genoms entspricht.
  • 6: DNA-Sequenzausrichtung der V3-Schleife und der flankierenden Regionen von vier Varianten von HIV, wobei die Positionen des molekularen "Leuchtturms" und der Primer sowohl für die herkömmliche als auch für die "Nase-an-Nase"-PCR dargestellt sind. (a) Der Protein-Kodierungsstrang von HIV/RT-1 ist mit dem von 3 anderen Virusvarianten ausgerichtet, HIV/RT-10, HIV/38-1 und HIV/38-3. Fehlpaarungen mit der Sequenz von HIV/RT-1 und mit dem molekularen "Leuchtturm" sind in fettgedruckten Kleinbuchstaben dargestellt. Die relative Position von Vorwärts- und reversen Primern für die herkömmliche PCR sind punktiert (....) bzw. gestrichelt (----) dargestellt. Die relative Position von Vorwärts- und reversen Primern für die "Nase-an-Nase"-PCR sind mit Doppellinien (=) bzw. Einfachlinien (-) dargestellt. Die Position der "Leuchtturm"-Sonde ist oberhalb der Sequenz dargestellt. Sämtliche Primer und die "Leuchtturm"-Sondensequenzen leiten sich von der Sequenz von HIV/RT-1 ab. (b) Struktur des molekularen "Leuchtturms". Die Sondenschleife ist in Großbuchstaben dargestellt, während die komplementären Stammnucleotide in Kleinbuchstaben dargestellt sind. Das Fluorophor FAM ist mit dem 5'-Ende konjugiert und der Quencher DABCYL ist mit dem 3'-Ende konjugiert.
  • 7: Vergleich von quantitativen herkömmlichen und "Nase-an-Nase"-PCR-Echtzeit-Verfahren. Quantitative Echtzeit-PCR von vier verschiedenen HIV-Varianten unter Anwendung: (a) herkömmlicher oder (b) "Nase-an-Nase"-PCR-Verfahren. Die PCR-Reaktionen enthielten 106 Kopien HIV/RT-1 (•), HIV/RT-10 (o), HIV/38-1
    Figure 00060001
    HIV/38-3 (⧠), keine Matrize (+) oder 150 ng humane DNA (x).
  • 8: Agarosegel-Analyse von durch herkömmliche PCR erzeugten Produkten. Das Gel zeigt PCR-Produkte, die aus HIV/RT-1, HIV/RT-10, HIV/38-1 und HIV/38-3 durch das herkömmliche PCR-Verfahren erzeugt worden sind. Bahn 1: 50 bp-Leiter, Bahn 2: keine Matrize, Bahn 3: HIV/RT-1, Bahn 4: HIV/RT-10, Bahn 5: HIV/38-1, Bahn 6: HIV/38-3.
  • 9: Ein Beispiel für eine Standardkurve zur quantitativen Bestimmung von HCV-RNA unter Anwendung von "Nase-an-Nase"-RT-PCR mit Produktnachweis unter Verwendung eines molekularen "Leuchtturms". (a) Eine "Nase-an-Nase"-RT-PCR für HCV-RNA wurde mit einem Einsatz von 0, 10, 25, 50, 100, 103, 104, 105 oder 106 synthetischen HCV-RNA-Molekülen pro RT-PCR-Reaktion durchgeführt. Die Veränderung der Fluoreszenz (Delta Rn) wurde bei der Anlagerungstemperatur für jeden PCR-Zyklus im ABI 7700-Sequenzdetektor gemessen. Schwellenwerte (Ct) wurden sodann unter Verwendung der mit dem Gerät bereitgestellten Software berechnet. (b) Die RNA-Kopienzahl für jede Standardprobe ist gegen ihren Ct-Wert aufgetragen (•). Die Ct-Werte für unbekannte Testproben (o) sind gegen die Standardkurve aufgetragen und die RNA-Kopienzahl wird aus der X-Achse extrapoliert.
  • 10: Stufenweise Darstellung einer Amplifikationsreaktion der Erfindung.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Zielnucleinsäuremoleküls in einer biologischen Probe unter Verwendung einer einzigen Nachweissonde bereit.
  • Das Verfahren umfasst die Amplifikation eines Zielnucleinsäuremoleküls mittels einer Primererweiterungs- bzw. Primerextensions-Kettenreaktion, wobei sich bei den Primern der Reaktion um einen Satz von "Nase-an-Nase"-Primern, unter Einschluss eines Vorwärts- und reversen bzw. Rückwärts-Primers, gemäß den nachstehenden Angaben handelt (vergl. 3 und 4).
  • Beim Zielnucleinsäuremolekül handelt es sich um ein Nucleinsäuremolekül, dessen vollständige oder partielle Sequenz in ausreichendem Maße bekannt ist, um Primererweiterungs-Kettenreaktionsprimer herzustellen. Das Zielnucleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein.
  • Das Zielnucleinsäuremolekül existiert als eine Familie von hochgradig homologen Sequenzen. Diese verschiedenen Sequenzen innerhalb einer Familie werden als "Varianten" bezeichnet. Die Herkunft der Varianten umfasst beispielsweise Genmutationen und Polymorphismen.
  • Zu Nucleinsäuremolekülen, von denen bekannt ist, dass sie Varianten aufweisen, gehören beispielsweise Viren und Bakterien. Zu Beispielen für Viren gehören HIV, HCV, HBV und humanes Parvovirus B19. Zu Beispielen für Bakterien gehören E. coli, S. pneumoniae, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, M. tuberculosis und Borrelia-Spezies (Lyme-Krankheit). Bei einer biologischen Probe, aus der ein Zielnucleinsäuremolekül nachgewiesen werden kann, handelt es sich um beliebige Körperflüssigkeiten, Zellen oder Zellbruchstücke. Zu Beispielen für biologische Proben gehören Blut, Serum, Samen, muköse oder andere Körperexsudate.
  • Die vorliegende Erfindung kann auf einen beliebigen Typ der Primererweiterungs-Kettenreaktion angewandt werden, der zur Amplifikation des Zielnucleinsäuremoleküls oder einer Unterregion dieses Moleküls führt. Amplifikationsreaktionen umfassen beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einschließlich quantitative PCR; die Strangverdrängungsamplifikation (SDA); die transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA); und die auf der Nucleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA). NASBA verstärkt RNA. NASBA ist in EP-A-0 329 822 beschrieben.
  • Das Amplifikationsverfahren der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist aus dem Stand der Technik bekannt. Bedingungen, die sich zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion eignen, sind in den US-Patenten 4 683 195, 4 683 202 und 4 965 188 beschrieben. Gewerbliche Anbieter, wie Perkin Elmer (Norwalk, Conn.), vertreiben PCR-Reagenzien und veröffentlichen PCR-Verfahren. Ein PCR-Amplifikationsreaktionsgemisch enthält Reagenzien, die zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion erforderlich sind. Typischerweise enthält das Gemisch ein Mittel für die Polymerisation, z. B. eine thermostabile DNA-Polymerase; Desoxynucleosid-5'-triphosphate (dNTP'S); und ein zweiwertiges Metallkation in einem geeigneten Puffer.
  • Nach den erfindungsgemäßen Verfahren können entweder DNA- oder RNA-Zielsequenzen amplifiziert werden. Im Fall der PCR-Amplifikation eines RNA-Ziels, z. B. einer viralen, genomischen Nucleinsäure, besteht die erste Stufe in der Synthese einer DNA-Kopie (cDNA) der Zielsequenz. Die reverse Transkription kann als eine getrennte Stufe oder vorzugsweise in einer kombinierten, reversen Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) durchgeführt werden. Die RT-PCR-Amplifikation von RNA ist aus dem Stand der Technik bekannt und beispielsweise in folgenden Literaturstellen beschrieben: US-Patente 5 322 770 und 5 310 652; Myers und Gelfand, Biochemistry, Bd. 30(31) (1991), S. 7661–7666; US-Patent 5 527 669; Young et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 31(4) (1993), S. 882–886; und Young et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 33(3) (1995), S. 654–657.
  • Primer sind ebenfalls im PCR-Reaktionsgemisch enthalten. Bei einem Primer handelt es sich um ein Oligonucleotid, das bei Hybridisierung an ein Matrizennucleinsäuremolekül dazu befähigt ist, als Startpunkt der Synthese während einer Amplifikationsreaktion zu wirken. Die Matrizennucleinsäure stellen die anfänglichen Zielnucleinsäuremoleküle dar; und die Amplifikationsprodukte werden aus diesen Molekülen erzeugt.
  • Die Länge der erfindungsgemäßen Primer ist nicht kritisch. Typischerweise liegt die Primerlänge im Bereich von etwa 15 bis 55 Nucleotiden, insbesondere von etwa 20 bis 45 Nucleotiden; und ganz besonders von etwa 25 bis 35 Nucleotiden. Vorzugsweise sind die Primer so konstruiert, dass sie relativ lang sind (> 30 Basen), um die Anzahl an Fehlpaarungen, die zwischen einem Primer und dessen Matrize toleriert werden kann, auf ein Maximum zu bringen. Ein Primerpaar muss nicht die gleiche Länge aufweisen. Beispielsweise kann der Vorwärtsprimer aus 29 Nucleotiden aufgebaut sein, während der Rückwärtsprimer aus 22 Nucleotiden aufgebaut sein kann.
  • Die Primer können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Für die PCR handelt es sich bei den Primern vorzugsweise um einzelsträngige Oligodesoxyribonucleotide.
  • Unter Hybridisierung ist die Bildung einer Duplexstruktur durch zwei einzelsträngige Nucleinsäuren aufgrund der komplementären Basenpaarung zu verstehen. Eine Hybridisierung kann zwischen vollständig komplementären Nucleinsäuresträngen oder zwischen "im wesentlichen komplementären" Nucleinsäuresträngen, die untergeordnete Fehlpaarungsregionen enthalten, d. h. Varianten, erfolgen. Der Grad der tolerierten Fehlpaarungen kann durch geeignete Einstellung der Hybridisierungsbedingungen gesteuert werden. Bedingungen, unter denen nur vollständig komplementäre Nucleinsäurestränge hybridisieren, werden als "stringente Hybridisierungsbedingungen" oder "sequenzspezifische Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet. Stabile Duplexe aus im wesentlichen komplementären Sequenzen können unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen erhalten werden.
  • Die Hybridisierungsbedingungen, d. h. die Stringenz, der vorliegenden Erfindung werden so eingestellt, dass die Primer Fehlpaarungen zwischen den Primern und der Matrize tolerieren können, wodurch eine Hybridisierung mit sämtlichen genetischen Varianten ermöglicht wird. Beispielsweise können die Bedingungen so eingestellt werden, dass eine Hybridisierung zwischen einem Primer und einer Matrize auftreten kann, wobei bis zu 20 % der Basenpaare zwischen dem Primer und der Matrize nicht zusammenpassen.
  • Der Fachmann auf dem Gebiet der Nucleinsäuretechnologie kann geeignete Hybridisierungsbedingungen empirisch festlegen, wobei er eine Anzahl von Variablen berücksichtigt, einschließlich beispielsweise die Länge und die Basenpaarkonzentration der Oligonucleotide, die Ionenstärke, das Auftreten von fehlerhaften Basenpaaren und die für die Oligonucleotid-Anlagerung gewählte Temperatur, wobei er sich von den im Stand der Technik gegebenen Richtlinien leiten lässt (vergl. z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Wetmur, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol., Bd. 26 (3/4) (1991), S. 227–259; Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, (1995) in Unit 2.10; und US-Patent 5 789 550).
  • Nachstehend findet sich eine ausführliche Beschreibung eines Zyklus einer Primererweiterungs-Kettenreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung. Die beschriebene spezifische Reaktion ist eine PCR. Jedoch können auch andere Typen von Primererweiterungs-Kettenreaktionen in den erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden.
  • 10 zeigt eine stufenweise Darstellung einer erfindungsgemäßen Amplifikationsreaktion. Das Zielnucleinsäuremolekül ist durch T wiedergegeben. Die Symbole X innerhalb der Zielsequenz repräsentieren Orte von potentiellen Variationen.
  • Das Zielnucleinsäuremolekül kann als einzelsträngiges Molekül oder als Teil eines doppelsträngigen Moleküls vorliegen. In dem in 10 dargestellten Beispiel ist das Zielnucleinsäuremolekül doppelsträngig. TC bedeutet ein Nucleinsäuremolekül, das zu T komplementär ist.
  • Wie bei der herkömmlichen PCR werden in jedem Zyklus der Amplifikationsreaktion beliebige doppelsträngige Nucleinsäuremoleküle in einer Probe durch Denaturierung einzelsträngig gemacht. Sodann findet eine Hybridisierung zwischen den Primern und den Zielnucleinsäuremolekülen statt. 10(a) erläutert eine Hybridisierung zwischen einem reversen Primer (RP) und einer Zielnucleinsäuresequenz (T).
  • Wie in 10(b) dargestellt, werden anschließend die reversen Primer unter Verwendung der Zielnucleinsäuremoleküle als Matrizen erweitert, um reverse Primeramplifikationsprodukte (RPA) zu bilden. Die reversen Primeramplifikationsprodukte (RPA) bestehen aus dem reversen Primer (RP), der mit dem reversen Primererweiterungsprodukt (RPE) verbunden ist. Für die Zwecke dieser Beschreibung handelt es sich beim reversen Primererweiterungsprodukt um das Nucleinsäuresegment, das an den reversen Primer addiert wird.
  • Wie aus 10(b) ersichtlich ist, treten einige der Variationen (X), die in der Zielsequenz enthalten sind, im RPA nicht auf. Speziell enthält der Teil des RPA, der aus dem RP aufgebaut ist, keine Variationen.
  • Wie in 10(c) dargestellt, werden die in Stufe (b) gebildeten reversen Primeramplifikationsprodukte bzw. Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukte von ihren Matrizen denaturiert.
  • Die Vorwärtsprimer (FP) werden hybridisiert mit entweder (i) Nucleinsäuremolekülen, die mit den Zielnucleinsäuremolekülen (TC), falls vorhanden, komplementär sind; oder (ii) den reversen Primeramplifikationsprodukten bzw. Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukten (RPA). 10(d) erläutert die erstgenannte Ausführungsform. Nucleinsäuremoleküle, die zu den Zielnucleinsäuremolekülen komplementär sind, sind vorhanden, wenn die Zielnucleinsäuremoleküle Bestandteil eines doppelsträngigen Moleküls waren.
  • Die Vorwärtsprimer werden unter Verwendung der komplementären Nucleinsäuremoleküle (TC) als Matrizen oder unter Verwendung der reversen Primeramplifikationsprodukte (RPA) erweitert bzw. verlängert. 10(e) erläutert die erstgenannte Ausführungsform.
  • Wie in 10(e) dargestellt, werden die Vorwärtsprimer unter Bildung von Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukten (FPA) erweitert. Das Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukt (FPA) besteht aus dem Vorwärtsprimer (FP) in Verbindung mit dem Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukt (FPE). Für die Zwecke dieser Beschreibung handelt es sich beim Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukt um das Nucleinsäuresegment, das an den Vorwärtsprimer addiert ist.
  • Wie in 10(e) dargestellt, treten bei einem Vergleich mit der Zielsequenz einige der Variationen (X), die in der Zielsequenz enthalten sind, im FPA nicht auf. Speziell der Bereich des FPA, der aus dem FP aufgebaut ist, enthält keine Variationen.
  • Wie in 10(f) dargestellt. werden die Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukte, die in 10(e) gebildet worden sind, von ihren Matrizen denaturiert.
  • Wie in 10(g) dargestellt, hybridisieren die reversen Primer mit dem FPE-Bereich des FPA.
  • Wie in 10(h) dargestellt, werden die reversen Primer unter Verwendung des FP-Bereiches des FPA als Matrizen erweitert, wodurch zusätzliche reverse Primeramplifikationsprodukte (ARPA) gebildet werden, wobei ein reverser Primer, der mit einem zusätzlichen reversen Primererweiterungsprodukt (ARPE) verbunden ist, ein ARPA darstellt.
  • Wie in 10(i) dargestellt, werden die ARPA-Produkte von ihren Matrizen denaturiert.
  • Wie in 10(j) dargestellt, hybridisieren die Vorwärtsprimer mit dem RPE-Teil des RPA.
  • Wie in 10(k) dargestellt, werden die Vorwärtsprimer unter Verwendung des RP-Teils der RPAs als Matrizen erweitert, wodurch zusätzliche Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukte gebildet werden, während ein Vorwärtsprimer, der mit einem zusätzlichen Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukt verbunden ist, ein AFPA darstellt.
  • Wie in 10(l) dargestellt, werden die AFPA-Produkte von ihren Matrizen denaturiert.
  • Die Stufen (g) bis (l) werden unter Verwendung der zusätzlichen reversen Primeramplifikationsprodukte bzw. Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukte und der zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukte als Matrizen für die reversen und Vorwärtsprimer ausreichend oft wiederholt, um eine nachweisbare Menge an zusätzlichem reversem Primeramplifikationsprodukt und/oder zusätzlichem Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukt zu bilden. Vorzugsweise werden die Stufen unter Verwendung eines automatisierten Cyclisierungsgeräts wiederholt. Eine ausreichende Anzahl an Wiederholungsvorgängen beträgt mindestens etwa 10, vorzugsweise mindestens etwa 20, insbesondere mindestens etwa 30 und ganz besonders mindestens etwa 40.
  • Die Erfinder haben festgestellt, dass es Vorteile bietet, wenn die Primer mit den Amplifikationsprodukten in einer bestimmten Art und Weise, die von den Erfindern als "Nase-an-Nase" bezeichnet wird, hybridisieren.
  • Wie aus 10(g) ersichtlich ist, ist die Sequenz der Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukte und der zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukte so beschaffen, dass das Nucleotid am 3'-Ende des reversen Primers mit dem Nucleotid am 5'-Ende des Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukts oder des zusätzlichen Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukts hybridisiert.
  • In analoger Weise sind, wie aus 10(j) ersichtlich ist, die Sequenzen der reversen Primeramplifikationsprodukte und der zusätzlichen reversen Primeramplifikationsprodukte so beschaffen, dass das Nucleotid am 3'-Ende des Vorwärtsprimers mit dem Nucleotid am 5'-Ende des reversen Primererweiterungsprodukts oder des zusätzlichen reversen Primererweiterungsprodukts hybridisiert.
  • 10 erläutert die Primererweiterungs-Kettenreaktion von nur einer Variante. Wie vorstehend erwähnt, können sämtliche Varianten einer Familie von Pathogenen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren amplifiziert werden.
  • Die zusätzlichen Amplifikationsprodukte sind identisch, unabhängig davon, aus welcher Variante sie erzeugt worden sind. Somit weisen, wie im Beispiel von 10 dargestellt ist, die zusätzlichen reversen Primeramplifikationsprodukte die Sequenz des reversen Primers in direkter Verbindung mit dem zusätzlichen reversen Primererweiterungsprodukt auf. Das zusätzliche reverse Primererweiterungsprodukt ist komplementär zum Vorwärtsprimer (das Vorwärtsprimer-Komplement); vergl. 10(h).
  • Analog weisen die zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukte die Sequenz des Vorwärtsprimers in direkter Verbindung mit dem zusätzlichen Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukt auf. Das zusätzliche Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukt ist komplementär zum reversen Primer (reverses Primer-Komplement); vergl. 10(k).
  • Daher weisen sämtliche zusätzlichen Primeramplifikationsprodukte Sequenzen auf, bei denen es sich um Kombinationen entweder des reversen Primers und des Vorwärtsprimer-Komplements oder des reversen Primer-Komplements und des Vorwärtsprimers handelt. Da die reversen und Vorwärtsprimer alle die gleichen Sequenzen aufweisen, besitzen sämtliche zusätzlichen Primeramplifikationsprodukte die gleichen Sequenzen. Mit anderen Worten, sämtliche potentiellen Variationen sind beseitigt.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Sequenz der Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukte und der zusätzlichen Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukte so beschaffen, dass das Nucleotid am 3'-Ende des reversen Primers mit einem Nucleotid hybridisiert, das vom Nucleotid vom 5'-Ende des Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukts oder des zusätzlichen Vorwärtsprimer-Erweiterungsprodukts durch eine Lücke von Nucleotiden getrennt ist. Analog sind die Sequenzen der reversen Primeramplifikationsprodukte und der zusätzlichen reversen Primeramplifikationsprodukte so beschaffen, dass das Nucleotid am 3'-Ende des Vorwärtsprimers mit einem Nucleotid hybridisiert, das vom Nucleotid am 5'-Ende des reversen Primererweiterungsprodukts oder des zusätzlichen reversen Primererweiterungsprodukts durch eine Lücke von Nucleotiden getrennt ist.
  • In beiden Fällen umfasst die Lücke eine Sequenz, von der bekannt ist, dass sie hochgradig konserviert ist. Hochgradig konservierte Regionen von Genomen von Viren und Bakterien sind bekannt. Beispielsweise sind in der veröffentlichten Sequenz von HCV kurze Strecken von Nucleinsäuren in der 5'-Nichtkodierungsregion des viralen Genoms bekanntlich hochgradig zwischen HCV-Genotypen konserviert (Okamoto et al., J. Gen. Virol., (1991), S. 2697–2704; Smith et al., J. Gen. Virol., Bd. 76 (1995), S. 1749–1761; Simmonds et al., J. Gen. Virol., Bd. 74 (1993), S. 2391–2399).
  • Die Lücke enthält vorzugsweise nicht mehr als fünf Nucleotide. Wenn die Lücke zwei bis fünf Nucleotide enthält, können eines oder zwei der Nucleotide fehlerhaft sein und immer noch mit der Sondensequenz hybridisieren. Wenn die Lücke ein einziges Nucleotid enthält, kann dieses Nucleotid fehlerhaft sein. Vorzugsweise liegen keine Fehlpaarungen vor.
  • Nachdem die Amplifikationsreaktion beendet ist, wird das Vorliegen der zusätzlichen reversen Primeramplifikationsprodukte oder der zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukte durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren nachgewiesen.
  • Vorzugsweise beruht das Nachweisverfahren auf dem Nachweis der Nucleinsäuresequenzen der zusätzlichen reversen Primeramplifikationsprodukte oder der zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukte. Die bei einem derartigen Verfahren verwendete Nachweissonde umfasst eine Sequenz, die zur Hybridisierung mit den zusätzlichen reversen Primeramplifikationsprodukten oder mit den zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukten befähigt ist. Da diese Amplifikationsprodukte identisch sind, ist nur eine Nachweissonde nötig, um sämtliche Amplifikationsprodukte zuverlässig nachzuweisen.
  • Ferner ermöglicht die Identität der Amplifikationsprodukte die Anwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen während der für den Nachweis erforderlichen Hybridisierung. Die Anwendung von stringenten Bedingungen führt zu zuverlässigeren Ergebnissen, wobei die Möglichkeit von falschen positiven Ergebnissen aufgrund zufällig ähnlicher Nichtzielsequenzen verringert wird.
  • Bei der Nachweissonde kann es sich um DNA, RNA oder Kombinationen davon handeln. Modifizierte Nucleotide können enthalten sein, z. B. Peptidnucleinsäuren (PNA), Nucleotide auf Nitropyrrolbasis oder 2'-O-Methylribonucleotide. Die Nucleoside der Nucleinsäure- oder modifizierten Nucleinsäuremoleküle können auf übliche Weise verknüpft sein, d. h. über Phosphatbindungen. Alternativ können die Nucleoside über modifizierte Verknüpfungen, z. B. Phosphorthioate, verbunden sein.
  • Bei einer Ausführungsform hybridisiert die Sondensequenz über die Verbindung in den Amplifikationsprodukten hinweg. Dies bedeutet, dass die Sondensequenz mit einem Teil sowohl der FP-Sequenz als auch der AFPE-Sequenz des AFPA hybridisiert; oder dass die Sondensequenz mit einem Teil sowohl der RP-Sequenz als auch der ARPE-Sequenz des ARPA hybridisiert.
  • Bei dieser Ausführungsform besteht die Sondensequenz aus der Nucleotidsequenz eines Segments von einem der Primer und der Nucleotidsequenz eines Segments, das mit dem anderen Primer komplementär ist. Insbesondere umfasst die Sondensequenz entweder (i) die Nucleotidsequenz eines Segments des Vorwärtsprimers und die Nucleotidsequenz eines Segments, das mit dem reversen Primer komplementär ist; oder (ii) die Nucleotidsequenz eines Segments des reversen Primers und die Nucleotidsequenz eines Segments, das mit dem Vorwärtsprimer komplementär ist. Die Sondensequenz kann entweder vollständige oder partielle Sequenzen des Primers und das Komplement des anderen Primers umfassen.
  • Die Sondensequenz kann aus gleichen Teilen der Nucleotidsequenz von einem der Primer und der Nucleotidsequenz des Komplements des anderen Primers aufgebaut sein. In einem derartigen Fall kommt es zu einer "symmetrischen Hybridisierung" der Sondensequenz mit den Amplifikationsprodukten (vergl. 5A(I)).
  • Vorzugsweise kann für eine verbesserte Empfindlichkeit die Sondensequenz so konzipiert sein, dass sie mit den Amplifikationsprodukten "asymmetrisch hybridisiert". Insbesondere kann die Sondensequenz aus ungleichen Teilen der Nucleotidsequenz von einem der Primer und der Nucleotidsequenz des Komplements des anderen Primers aufgebaut sein (vergl. 5A(II-IV)). Beispielsweise umfassen etwa 60 bis etwa 99 % der Sondensequenz die Nucleotidsequenz von einem der Primer. Der Rest der Sondensequenz (z. B. etwa 1 bis etwa 40 %) umfasst die Nucleotidsequenz des Komplements des anderen Primers. Insbesondere beträgt der prozentuale Anteil der Sondensequenz, die der Sequenz von einem der Primer entspricht, etwa 80 bis etwa 97 %.
  • Wenn die Sequenz der zusätzlichen Amplifikationsprodukte ein Segment von einem der Primer in direkter Verbindung mit einem Segment des Komplements des anderen Primers enthält, kann die Sondensequenz so konzipiert sein, dass sie genau mit der Gesamtheit oder einem Teil der zusätzlichen Amplifikationsprodukte hybridisiert.
  • Wenn die zusätzlichen Amplifikationsprodukte eine dazwischen liegende Lücke enthalten, handelt es sich bei der Lücke vorzugsweise um eine bekannte Sequenz, so dass die Sondensequenz so konzipiert sein kann, dass sie vollständig komplementär zur Lücke ist. Jedoch kann eine Sondensequenz mit zusätzlichen Amplifikationsprodukten hybridisieren, die eine bestimmte Anzahl an Fehlpaarungsresten in der Lücke enthalten, wie vorstehend ausgeführt wurde.
  • Anstelle einer Hybridisierung über die Verbindungsstelle hinweg, kann die Sondensequenz auch ausschließlich mit dem Segment des zusätzlichen Erweiterungsprodukts, das zu einem Primer komplementär ist, hybridisieren. Demgemäß besteht bei dieser Ausführungsform die Sondensequenz aus entweder der Nucleotidsequenz eines Segments des Vorwärtsprimers und nicht der Nucleotidsequenz eines Segments, das mit dem Rückwärtsprimer komplementär ist; oder der Nucleotidsequenz eines Segments des reversen Primers und nicht der Nucleotidsequenz eines Segments, das mit dem Vorwärtsprimer komplementär ist.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Primererweiterungs-Kettenreaktionen werden gleiche Konzentrationen des Vorwärtsprimers und des reversen Primers verwendet. Bei dieser Ausführungsform werden die Konzentrationen als symmetrisch bezeichnet.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden "asymmetrische Konzentrationen" des Vorwärtsprimers und des reversen Primers verwendet. Insbesondere wird zur Erzielung einer verbesserten Empfindlichkeit der Primer, dessen Nucleotidsequenz Bestandteil der Sondensequenz ist, in der Probe im Vergleich zum anderen Primer in einer geringeren Konzentration bereitgestellt. "Asymmetrische Konzentrationen" der Primer werden besonders bevorzugt, wenn die Sondensequenzen eine "asymmetrische Hybridisierung" mit den zusätzlichen Amplifikationsprodukten eingehen; oder ausschließlich mit dem Segment der zusätzlichen Amplifikationsprodukte, das mit einem Primer komplementär ist, hybridisieren.
  • Wenn beispielsweise die Sondensequenz ein Segment der Nucleotidsequenz des Vorwärtsprimers umfasst, beträgt das Molverhältnis des Vorwärtsprimers zum reversen Primer (FP:RP) etwa 1:5 bis etwa 1:20. Analog beträgt dann, wenn die Sondensequenz ein Segment der Nucleotidsequenz des reversen Primers umfasst, das Molverhältnis des reversen Primers zum Vorwärtsprimer (RP:FP) etwa 1:5 bis etwa 1:20, insbesondere etwa 1:6 bis etwa 1:15 und ganz besonders etwa 1:10.
  • Nachdem die Amplifikationsreaktion in der biologischen Probe ausreichend oft stattgefunden hat, wird die Nachweissonde mit der Probe in Kontakt gebracht. Die Sondensequenz der Nachweissonde hybridisiert mit etwaigen zusätzlichen Amplifikationsprodukten, die möglicherweise in der Probe vorhanden sind. Wenn die Sondensequenz die Nucleotidsequenz eines Segments des Vorwärtsprimers umfasst (ausschließlich oder ferner die Nucleotidsequenz eines Segments des reversen Primer-Komplements umfassend), hybridisiert die Sondensequenz mit den zusätzlichen reversen Primeramplifikationsprodukten. Wenn analog die Sondensequenz die Nucleotidsequenz eines Segments des reversen Primers umfasst (ausschließlich oder ferner die Nucleotidsequenz eines Segments des Vorwärtsprimer-Komplements umfassend), hybridisiert die Sondensequenz mit den zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukten.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nachweissonde um eine sich selbst verändernde, signalerzeugende Sonde. Diese Sonde umfasst folgendes: eine erste Nucleinsäuresequenz; eine zweite Nucleinsäuresequenz, die komplementär zur ersten Nucleinsäuresequenz ist; und eine Sondensequenz, die die erste Nucleinsäuresequenz mit der zweiten Nucleinsäuresequenz verbindet. Die erste Nucleinsäuresequenz ist an einen Reporterrest angebracht, der zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist. Die zweite Nucleinsäuresequenz ist an einen interaktiven Rest angebracht, der zur Veränderung des durch den Reporterrest erzeugten Signals befähigt ist, wenn der Reporterrest und der interaktive Rest sich in ausreichender Nähe zueinander befinden. Wenn beispielsweise die erste und die zweite Nucleinsäuresequenz miteinander hybridisiert werden, was als "enge Konformation" bekannt ist, wird der Reporterrest in die Nähe zum interaktiven Rest gebracht. Daher verändert sich das Signal. Die Veränderung des Signals umfasst eine Abnahme, d. h. Auslöschen; eine Zunahme; oder eine anderweitige Veränderung des Signals, z. B. der Intensität oder der Wellenlänge des Signals. Das Auslöschen des Signals umfasst eine Verringerung oder Beseitigung des Signals.
  • Der Reporterrest und der interaktive Rest können an einem beliebigen Punkt an der Nachweissonde angebracht sein, der eine Veränderung durch den interaktiven Rest eines durch den Reporterrest erzeugten Signals für den Nachweis der zusätzlichen Amplifikationsprodukte ermöglicht. In der bevorzugten Ausführungsform sind der Reporterrest und der interaktive Rest an den distalen Termini der sich selbst verändernden, signalerzeugenden Sonde angebracht.
  • In Abwesenheit von zusätzlichen Amplifikationsprodukten befindet sich die Nachweissonde in der engen Konformation. Der Reporterrest und der interaktive Rest befinden sich nahe beieinander. Daher wird das Signal verändert. Bei Hybridisierung der Sondensequenz mit dem zusätzlichen reversen Primeramplifikationsprodukt oder mit dem zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukt werden die erste und zweite Nucleinsäuresequenz der Nachweissonde denaturiert. Dies ist als "offene Konformation" bekannt.
  • Bei der Denaturierung befindet sich der interaktive Rest nicht mehr in ausreichender Nähe zum Reporterrest, um das Signal zu verändern. Der Unterschied zwischen dem veränderten Signal und dem unveränderten Signal wird nachgewiesen. Wenn beispielsweise der interaktive Rest das Signal auslöscht, nimmt das unveränderte Signal zu; oder, wenn der Auslöschvorgang vollständig war, wird ein Signal erzeugt.
  • Die Stärke der Hybridisierung zwischen der ersten und zweiten Nucleinsäure (d. h. dem Stamm der Sonde) kann durch routinemäßiges Experimentieren eingestellt werden, um eine einwandfreie Funktion zu erreichen. Beispielsweise stellt die Stärke eine Funktion der Länge der Nucleotide dar. Die Längen der ersten und zweiten Nucleinsäuresequenz liegen vorzugsweise im Bereich von etwa 3 bis 15 und insbesondere von etwa 4 bis 7 Nucleotiden. Zusätzlich zur Länge kann die Stärke der Hybridisierung durch Verringerung des G-C-Gehalts und durch Einführen von destabilisierenden Fehlpaarungen in die Nucleotide verringert werden.
  • Die Länge der Sondensequenz ist nicht kritisch. Jedoch kann die Länge nicht so kurz sein, dass eine effektive Bindung an die zusätzlichen Amplifikationsprodukte nicht erreicht wird. Ferner kann die Länge nicht so groß sein, dass eine Trennung des Reporterrestes und des interaktiven Restes nicht erreicht wird, obwohl die Sondensequenz mit den Produkten eine Hybridisierung eingegangen ist. Vorzugsweise umfasst die Sondensequenz etwa 10 bis etwa 30 Nucleotide, insbesondere etwa 18 bis etwa 24 Nucleotide; und insbesondere etwa 19 bis etwa 22 Nucleotide. Die Sonden können sich frei in der Lösung befinden oder sie können an einer festen Oberfläche angebracht sein.
  • Beliebige Konzentrationen der Nachweissonde, die ein stabiles Signal erzeugen, können in den Verfahren angewandt werden. Beispielsweise kann die Konzentration der Nachweissonde in der Probe in etwa der gleichen Konzentration wie einer oder beide Primer bereitgestellt werden.
  • Vorzugsweise ist die Konzentration der Nachweissonde größer als die Konzentrationen der Primer. Auf diese Weise wird die Nachweissonde bei der Konkurrenz zwischen dem Primer, dessen Nucleinsäuresequenz Bestandteil der Sondensequenz ist, und der Nachweissonde um die zusätzlichen Amplifikationsprodukte begünstigt. Diese Erhöhung der Konzentration der Nachweissonde ist besonders bevorzugt, wenn die Sondensequenz einer "asymmetrischen Hybridisierung" mit den Amplifikationsprodukten unterliegt oder ausschließlich mit dem Teil der zusätzlichen Amplifikationsprodukte hybridisiert, der komplementär zu einem Primer ist, wie vorstehend beschrieben. Beispielsweise kann die Nachweissonde in einer Konzentration bereitgestellt werden, die etwa das 1,3- bis etwa 5-fache; insbesondere etwa das 1,5- bis etwa 3-fache und ganz besonders etwa das 2-fache der Konzentration des Primers, dessen Nucleinsäuresequenz nicht Bestandteil der Sondensequenz ist, beträgt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Sondensequenz beispielsweise aus mindestens 65 % der Sequenz des Vorwärtsprimers aufgebaut; wobei der Vorwärtsprimer in einer Konzentration bereitgestellt wird, die etwa 10-fach geringer als die Konzentration des reversen Primers ist; und wobei die Nachweissonde in einer Konzentration bereitgestellt wird, die etwa doppelt so groß wie die des reversen Primers ist.
  • Ein unverändertes Signal, das durch den Reporterrest erzeugt wird, stellt ein Anzeichen dafür dar, dass das Zielnucleinsäuremolekül in der Probe vorhanden ist. Die Größe des nachweisbaren unveränderten Signals, das durch die Sonde erzeugt wird, ist proportional zur Menge der Zielnucleinsäuremoleküle in der Probe.
  • Beim nachweisbaren Signal der Nachweissonden kann es sich um eine beliebige Art eines Signals handeln, z. B. um ein lumineszierendes Signal, ein Farbsignal oder ein radioaktives Signal. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim nachweisbaren Signal um ein lumineszierendes Signal. Beim lumineszierenden Signal kann es sich um ein fluoreszierendes Signal oder um ein chemilumineszierendes Signal handeln.
  • Bei einer Ausführungsform stellen der Reporterrest und der interaktive Rest der Erfindung ein "FRET"-Paar dar (P. R. Selvin, "Fluorescence Resonance Energy Transfer", Methods in Enzymology, Bd. 246 (1995), S. 300–335). FRET-Paare bedienen sich des Energietransfers für die Signalerzeugung. Der Reporterrest absorbiert Energie bei einer ersten Wellenlänge und emittiert eine zweite, längere Wellenlänge. Der interaktive Rest absorbiert einen Teil oder die Gesamtheit der emittierten Energie in dem Maße, wie sich das Spektrum des interaktiven Restes mit dem Emissionsspektrum überlappt. Wenn es sich beim interaktiven Rest um einen Quencher handelt, setzt der Quencher die Energie als Wärme frei. Wenn es sich beim interaktiven Rest um ein Fluorophor handelt, emittiert der interaktive Rest bei einer dritten, noch längeren Wellenlänge. Der Mechanismus der FRET-Paar-Wechselwirkung erfordert es, dass sich das Absorptionsspektrum des interaktiven Restes mit dem Emissionsspektrum des Reporterrestes überlappt. Der Wirkungsgrad der FRET-Wechselwirkung ist linear proportional zu dieser Überlappung.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich beim Reporterrest und beim interaktiven Rest um ein Nicht-FRET-Paar. Insbesondere muss der interaktive Rest kein Absorptionsspektrum aufweisen, das sich mit dem Emissionsspektrum des Reporterrestes überlappt. Dies bedeutet, dass die Absorptionswellenlänge des interaktiven Restes kürzer als die Wellenlänge des Anregungsmaximums und der Emission sein kann. Nicht-FRET-Paare sind im US-Patent 6 150 097 beschrieben. Beim nachweisbaren Signal in einem Nicht-FRET-Paar kann es sich um eine Veränderung im Absorptionsspektrum handeln, als eine Alternative zur Veränderung der Lumineszenz.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei den Reporterresten der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nachweissonden um Fluorophore. Beim Fluorophor kann es sich um einen Xanthenfarbstoff, einen Cyaninfarbstoff, ein Dansylderivat, EDANS, Cumarin, wie 3-Phenyl-7-isocyanatocumarin, Lucifer-Gelb, BODIPY, Cy3, Cy5, Cy7, Texas-Rot, Erythrosin, Naphthylamin, Oregon-Grün, ALEXA-Fluorfarbstoffe, Acridine, wie 9-Isothiocyanatoacridin und Acridinorange, 9-(p-(2-Benzoxazolyl)-phenyl)-maleinimid, Benzoxadiazole, Stilbene und Pyrene handeln.
  • Beim Xanthenfarbstoff kann es sich um Fluorescein oder Rhodamin handeln. Vorzugsweise handelt es sich beim Fluorescein um 5- Carboxyfluorescein (5-FAM); 6-Carboxyfluorescein (6-FAM); 2',4',1,4-Tetrachlorfluorescein (TET); 2',4',5',7',1,4-Hexachlorfluorescein (HEX); Eosin; Calciumgrün; Fluoresceinisothiocyanat (FITC); oder NED. Vorzugsweise handelt es sich beim Rhodaminfarbstoff um Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA); Tetrapropano-6-carboxyrhodamin (ROX); 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyrhodamin (JOE) oder Tetramethylrhodamin (TMR). Zahlreiche geeignete Formen dieser Verbindungen sind handelsüblich, wobei verschiedene Substituenten an ihren Xanthenringen vorliegen, die als Bindungsstelle oder als Bindungsfunktionalität für das Anbringen eines Oligonucleotids dienen können.
  • Beim Fluorophor kann es sich auch um eine Naphthylaminverbindung handeln. Die Naphthylaminverbindungen weisen eine Aminogruppe in der α- oder R-Position auf. Zu derartigen Naphthylaminverbindungen gehören 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalinsulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalinsulfonat.
  • Beim Fluorophor kann es sich auch um ein Kombinationsfluorophor handeln. Beispiele für ein Kombinationsfluorophor sind Fluorescein-Rhodamin-Dimere, die beispielsweise von Lee et al., Nucleic Acids Research, Bd. 25 (1997), S. 2816, beschrieben werden. Fluorophore können so gewählt werden, dass sie im sichtbaren Spektrum oder außerhalb des sichtbaren Spektrums, z. B. im UV- oder IR-Bereich, absorbieren und emittieren.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei den interaktiven Resten der Nachweissonden, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um Quencher. Beim Quencher kann es sich um DABCYL, Anthrachinon, Nitrothiazol, Nitroimidazol oder Malachitgrün handeln. Varianten von DABCYL, wie DABSYL, DABMI oder Methylrot, sind ebenfalls geeignet. Ferner können die asymmetrischen Cyaninfarbstoffverbindungen, die im US-Patent 6 080 868 beschrieben sind, als Auslöschrest verwendet werden.
  • Ferner können Fluorophore ebenfalls als die Quencher verwendet werden. Beispielsweise können Fluorophore, die im Nachweisbereich nicht fluoreszieren, wenn sich die Sonde in der offenen Konformation befindet, die Fluoreszenz auslöschen, wenn sie sich in der Nähe von bestimmten anderen Fluorphoren befinden.
  • Ein Beispiel für eine sich selbst verändernde, signalerzeugende Sonde ist eine molekulare "Leuchtturm"-Sonde. Die Schleife einer molekularen "Leuchtturm"-Sonde entspricht der Sondensequenz, wie vorstehend beschrieben. Nucleotidsequenzen, die als "Arme" bezeichnet werden, entsprechen der ersten und zweiten Nucleotidsequenz, wie vorstehend ausgeführt. Molekulare "Leuchtturm"-Sonden sind in folgenden Literaturstellen beschrieben: US-Patent 5 925 517; PCT-Anmeldung WO-95/13399; PCT-Anmeldung WO-97/39008; und Tyagi und Kramer, Nature Biotechnology, Bd. 14 (1996), S. 303.
  • Ferner können die molekularen "Leuchtturm"-Sonden in einer beliebigen Weise modifiziert werden, die den Nachweis der Amplifikationsprodukte ermöglicht. Modifizierte Sonden umfassen beispielsweise die "Wellenlängen-verschiebenden" molekularen "Leuchtturm"-Sonden gemäß US-Patent 6 037 130. Insbesondere weisen diese modifizierten Sonden die grundlegende molekulare "Leuchtturm"-Sondenstruktur auf, nämlich eine Schleife; einen Stamm-Duplex; einen Quencher an einem Ende; und einen Reporterrest, typischerweise ein Fluorophor, gegenüber dem Quencher am anderen Ende. Der Reporter wird als "Erntereporter" bezeichnet. Diese Modifikation der Sonde besteht darin, dass die Sonde eine Erweiterung von mehreren Nucleotiden nach dem "Erntereporter" umfasst. Die Erweiterung endet in einem Nucleotid, das mit einem "Emitterreporter" verbunden ist, typischerweise einem anderen Fluorophor. In Gegenwart des Zielnucleinsäuremoleküls trennt sich der Quencher von den Reportern. In dieser offenen Konformation absorbiert der "Erntereporter" Energie aus der Anregungsquelle, überträgt aber einen erheblichen Teil der Energie (bei einigen Konstruktionen den Großteil der Energie) auf den "Emitterreporter", der die übertragene Energie empfängt und sie in einer charakteristischen, längeren Wellenlänge emittiert.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die Nachweissonde ein Paar von Oligodesoxynucleotiden, die komplementär zu benachbarten Regionen der zusätzlichen Amplifikationsprodukte sind (Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 85 (1988), S. 8790–8794, und Heller et al., EP-0 070 685). Ein Oligodesoxynucleotid enthält den Reporterrest an seinem 5'-Ende und das andere Oligodesoxynucleotid enthält den interaktiven Rest am 3'-Ende. Wenn die Sonde mit der Zielsequenz hybridisiert, gelangen die beiden Reste in sehr enge Nachbarschaft zueinander. Wenn die Probe durch Licht einer geeigneten Frequenz stimuliert wird, kommt es zu einem Fluoreszenzresonanz-Energietransfer von einem Rest auf den anderen, wodurch eine messbare Veränderung der spektralen Reaktion der Reste erfolgt, was ein Signal für die Anwesenheit von Zielen darstellt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Nachweissonde ein Paar von Oligodesoxynucleotiden. Das Paar ist zueinander komplementär. Ferner weist einer der Bestandteile des Paars die Sequenz des Zielnucleinsäuremoleküls auf und der andere Bestandteil des Paars weist die Sequenz auf, die mit dem Zielnucleinsäuremolekül komplementär ist (Morrison und Stols, "Sensitive Fluorescence-Based Thermodynamic and Kinetic Measurements of DNA Hybridization in Solution", Biochemistry, Bd. 32 (1993), S. 3095–3014; und Morrison, EP-0 232 967 A2, worin die Priorität der US-Anmeldung SN 817,841, Anmeldetag 10. Januar 1986, beansprucht wird). Jedes Oligodesoxynucleotid der Sonde umfasst einen mit ihrem 3'-Ende konjugierten Reporterrest und einen mit ihrem 5'-Ende konjugierten interaktiven Rest. Wenn die beiden Oligonucleotide der Sonde aneinander angelagert werden, wird der Reporterrest von jedem Oligonucleotid in enger Nähe zum interaktiven Rest des anderen Oligonucleotids gehalten. Bei dieser Konformation der Sonde wird dann, wenn der Reporter durch Licht einer geeigneten Wellenlänge stimuliert wird, das Signal durch den interaktiven Rest verändert, vorzugsweise ausgelöscht. Wenn jedoch ein Sondenmolekül an ein Ziel gebunden ist, fehlt die Veränderungswirkung des komplementären Oligodesoxynucleotids der Sonde. In dieser Konformation wird ein Signal erzeugt. Die Oligodesoxynucleotide der Sonde sind für eine Selbstauslöschung durch FRET in der zielgebundenen Konformation zu lang.
  • Das durch die Nachweissonde erzeugte Signal kann durch beliebige bekannte Maßnahmen nachgewiesen und gemessen werden, die einen zuverlässigen Nachweis und eine zuverlässige Messung ermöglichen.
  • Beispielsweise ist das Gerät ABI 7700 (Produkt der Fa. Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) zur Messung der Signalemission, typischerweise von Fluoreszenzemissionen, geeignet. Das Gerät ABI 7700 bedient sich einer Faseroptik, die mit jeder Vertiefung in einer Amplifikationsreaktion-Röhrchenanordnung mit 96 Vertiefungen verbunden ist. Das Instrument umfasst einen Laser zur Anregung der Reporterreste und ist zur Messung der Signalintensität, typischerweise der Intensität des Fluoreszenzspektrums, eines jeden Röhrchens bei kontinuierlicher Aufzeichnung während der Amplifikation befähigt.
  • Die zusätzlichen Amplifikationsprodukte lassen sich durch Endpunkt- und Echtzeitmessungen quantitativ bestimmen. Beim Endpunktmodus wird die Signalmessung nach beendeter Amplifikationsreaktion durchgeführt, z. B. nachdem alle oder im wesentlichen alle Zyklen einer Amplifikationsreaktion beendet worden sind. Im Echtzeitmodus wird die Signalmessung mehrfach während der Amplifikationsreaktion durchgeführt, z. B nach jedem Thermozyklus einer Amplifikationsreaktion. Der Echtzeitmodus wird bevorzugt, wenn eine quantitative Messung der Anfangsmenge des Zielnucleinsäuremoleküls benötigt wird, z. B. die Kopienzahl von viralen oder bakteriellen Nucleinsäuren in einer Probe.
  • Die absolute Menge eines in einer Testprobe vorhandenen Zielnucleinsäuremoleküls vor der Amplifikation kann unter Anwendung einer Standardkurve bestimmt werden. Beispielsweise lässt sich eine Standardkurve aus den Ergebnissen aufstellen, die aus einer Serie von parallelen Primererweiterungs-Kettenreaktionen erhalten worden sind. Diese parallelen Reaktionen werden an einer Reihe von Standardproben durchgeführt, die eine bekannte Menge eines Nucleinsäuremoleküls enthalten, das eine Ähnlichkeit mit dem Zielnucleinsäuremolekül besitzt. Eine Reihe von etwa 5 bis etwa 20 Standardproben mit unterschiedlichen bekannten Mengen wird verwendet. Die parallelen Erweiterungsreaktionen bedienen sich der gleichen Reaktionsbedingungen und Reagenzien, wie sie bei der Erweiterungsreaktion des Zielnucleinsäuremoleküls verwendet werden.
  • Bei jeder parallelen Reaktion wird die Zunahme der Signalintensität im Vergleich mit der Basislinien-Signalintensität (Delta Rn) bei der Anlagerungstemperatur für jeden Amplifikationszyklus gemessen. Der Basislinienwert ist die Größe des Signals, das vor der Bildung der zusätzlichen Amplifikationsprodukte nachgewiesen wird. Schwellenwerte (Ct) werden für jede Reaktion berechnet. Ct ist die Amplifikationszykluszahl, bei der die erzeugte Signalintensität von der Basislinien-Signalintensität unterscheidbar ist. Die Ausgangsmenge der Nucleinsäure in jeder Standardprobe kann gegen ihren entsprechenden Ct-Wert aufgetragen werden. Dieses Diagramm stellt die Standardkurve dar.
  • Im allgemeinen muss der Schwellenwert ausreichend hoch sein, dass er sich statistisch vom Basislinienwert unterscheidet, jedoch geringer als das Signal ist, das für die Sättigungserscheinung in Verbindung mit Amplifikationsreaktionen erhalten wird. Typischerweise wird der Schwellenwert auf etwa 10 Standardabweichungen oberhalb der durchschnittlichen Basislinien-Signalintensität eingestellt (vergl. beispielsweise Heid, et al., Genome Research, Bd. 6 (1996), S. 986–994).
  • Der Ct-Wert für die Probe, einschließlich des Zielnucleinsäuremoleküls, wird ebenfalls berechnet. Dieser Ct-Wert kann gegen die Standardkurve aufgetragen werden. Unter Verwendung der Standardkurve kann anschließend die Menge des Zielnucleinsäuremoleküls in der Testprobe quantitativ durch Extrapolation ermittelt werden. 9 erläutert dieses Verfahren der quantitativen PCR-Zielbestimmung (im Fall von HCV-RNA) unter Verwendung der "Nase-an-Nase"-PCR-Primer und unter Anwendung der Reaktionsbedingungen, wie sie im nachstehenden Beispiel beschrieben sind.
  • Die mit Nachweisinstrumenten, z. B. mit dem Gerät ABI 7700, bereitgestellte Computer-Software ist dazu in der Lage, die Signalintensität über den Verlauf einer Amplifikation hinweg aufzuzeichnen. Diese aufgezeichneten Werte können zur Berechnung der Zunahme der Signalintensität auf kontinuierlicher Basis verwendet werden. Obgleich das Gerät ABI 7700 typischerweise zur Aufzeichnung von Fluoreszenz verwendet wird, müssen die Ct-Werte nicht aus Fluorszenzmessungen ermittelt werden. Ct-Werte können auch aus Messungen einer Vielzahl unterschiedlicher Signaltypen bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits, d. h. Mehrfachbehälter-Einheiten, die geeignete Komponenten zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens umfassen. Das Kit umfasst einen Satz von "Nase-an-Nase"-Primern für die Amplifikation der Varianten eines bestimmten Pathogens; und eine Sonde, z. B. die vorstehend beschriebenen, sich selbst verändernden, signalemittierenden Sonden. In einigen Fällen werden die Sonden an eine geeignete Trägermembran fixiert. Weitere fakultative Komponenten des Kits umfassen beispielsweise ein Mittel zur Katalyse der Synthese der Primererweiterungsprodukte, die Substrat-Nucleosidtriphosphate, entsprechende Puffer für die Amplifikations- und/oder Hybridisierungsreaktionen, einen Nucleinsäure-Referenzstandard, der die quantitative Bestimmung von Matrizenmolekülen in Testproben erlaubt, und Anweisungen zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens.
  • Beispiele
  • Die nachstehend vorgelegten Beispiele der vorliegenden Erfindung dienen nur der Erläuterung und beschränken den Schutzumfang der Erfindung nicht. Für den Fachmann ergeben sich beim Studium der vorstehenden Beschreibung und der folgenden Beispiele zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung innerhalb des Schutzumfangs der Patentansprüche.
  • Nachweis von HCV-Varianten
  • Es wurde ein Vergleich von drei verschiedenen Verfahren für den Nachweis auf Nucleinsäurebasis von acht HCV-Stämmen, die Prototypen für die hauptsächlichen HCV-Genotypen und -Subtypen sind, durchgeführt. Es handelte sich um die folgenden drei Nachweisverfahren: (A) Die erfindungsgemäße "Nase-an-Nase-Leuchtturm"-RT-PCR; (B) die herkömmliche "Leuchtturm"-RT-PCR; und (C) die COBAS AMPLICOR HCV MONITOR-Testversion 2.0 (COBAS HCM-2; Roche Diagnostic Systems Inc., Branchburg, NJ). COBAS HCM-2, bei dem es sich um einen Test auf RT-PCR-Basis handelt, wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Herkömmliche "Leuchtturm"-RT-PCR- und "Nase-an-Nase-Leuchtturm"-RT-PCR-Verfahren wurden folgendermaßen durchgeführt:
    PCR-Primer wurden konstruiert, um ein Segment der 5'-Nichtkodierungsregion der genomischen HCV-RNA zu amplifizieren. Die Nucleinsäuresequenz dieser Region des Genoms ist relativ hochgradig unter HCV-Genotypen und -Subtypen konserviert.
  • Herkömmliche Primer für "Leuchtturm"-PCR wurden konstruiert, um ein 101 bp-Segment von DNA, entsprechend den Nucleotiden 66 bis 166 der veröffentlichen Sequenz von HCV-H zu amplifizieren (Inchauspe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 88 (1991), S. 10292–10296; Genbank M67463). Die zwischenliegende Lücke zwischen zwei herkömmlichen RT-PCR-Primern weist eine Länge von 61 bp auf. Es handelt sich um folgende Primer:
    Vorwärtsprimer: 5'-ACGCAGAAAGCGTCTAGCCA-3' (SEQ ID NO: 1);
    Reverser Primer: 5'-GTACTCACCGGTTCCGCAGA-3' (SEQ ID NO: 2).
  • Die Primer für die erfindungsgemäße "Nase-an-Nase"-RT-PCR wurden so konstruiert, dass keine dazwischenliegende Nucleotidlücke zwischen den beiden Primern bestand. Bei der amplifizierten Region handelt es sich um ein 51 bp-Segment entsprechend den Nucleotiden 83 bis 133 der veröffentlichten Sequenz von HCV-H. Es handelt sich um folgende Primer:
    Vorwärtsprimer: 5'-CCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 3);
    Reverser Primer: 5'-CCCGGGAGGGGGGGTCCTGGAG-3' (SEQ ID NO: 4).
  • Sowohl für die herkömmliche als auch für die "Nase-an-Nase"-PCR handelte es sich beim molekularen "Leuchtturm", der für den Nachweis des PCR-Produkts verwendet wurde, um 5'-FAM-ccgggcTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTgcccgg-DABCYL-3' (SEQ ID NO: 5).
  • Die Stammnucleinsäuren sind in Kleinbuchstaben angegeben und die Sondenschleifen-Nucleinsäuren (entsprechend den Nucleotiden 91 bis 113 der HCV-H-Sequenz) sind in Großbuchstaben angegeben.
  • Komplementäre DNA wurde revers aus der extrahierten Plasma-RNA unter Verwendung entweder des herkömmlichen reversen Primers oder des vorstehend beschriebenen reversen "Nase-an-Nase"-Primers transkribiert. Jeweils 20 μl Reaktionsgemisch enthielten 2,5 μM reversen Primer, 1 Einheit reverse Mo-MuLV-Transkriptase (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 1X reversen Transkriptase-Puffer (GIBCO BRL), 5 mM Dithiothreit (DTT), 0,06 Einheiten RNasin (Promega, Madison, WI) und 0,5 mM dNTPs, d. h. dATP, dTTP, dCTP und dGTP (Pharmacia, Piscataway, NJ). Die Reaktionsgemische wurden 45 Minuten bei 42 °C inkubiert. Anschließend wurde die reverse Transkriptase durch weitere 2-minütige Inkubation bei 95 °C inaktiviert.
  • Für die PCR-Amplifikation und den Nachweis wurden die Produkte der reversen Transkription in einem Endvolumen von 50 μl Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an Vorwärtsprimer (0,1 μM für die "Nase-an-Nase"-PCR und 1 μM für die herkömmliche PCR), 1 μM reversem Primer, 1,25 Einheiten AmpliTaq Gold-Polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1X AmpliTaq Gold Puffer II (Applied Biosystems), 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs und 10 ng molekularem "Leuchtturm" inkubiert. Die PCR-Amplifikation wurde im Applied Biosystems 7700-Sequenzdetektor unter Anwendung der folgenden Zyklisierungsparameter durchgeführt: 95 °C für 10 Minuten (Enzymaktivierung), gefolgt von 44 Zyklen (95 °C, 30 Sekunden (Denaturierung), 60 °C, 1 Minute (Anlagerung); 72 °C (Erweiterung)). Die relative Fluoreszenz des molekularen "Leuchtturms" wurde bei der Anlagerungstemperatur gemessen. Die quantitative Bestimmung der HCV-Matrizenmoleküle wurde durch Aufnahme einer RNA-Standardkurve in jedes RT-PCR-Experiment erreicht. Die Standardkurve wurde unter Verwendung von 10, 25, 50, 102, 103, 104, 105 oder 106 Molekülen von synthetischem HCV-RNA-Transkript bei Verdünnung in 1 μg/ml Hefe-tRNA (Ambion, Austin, TX) konstruiert.
  • Tabelle 1 zeigt einen Vergleich der drei verschiedenen Methoden zum Nachweis von acht Stämmen von HCV. Diese Stämme sind Prototypen für die Haupt-HCV-Genotypen und -Subtypen. Der "Nase-an-Nase-Leuchtturm"-Test der vorliegenden Erfindung (A) weist sämtliche acht Genotypen/Subtypen nach, während die herkömmliche "Leuchtturm"-PCR (B) beim Nachweis der Genotypen 4a und 5a versagt.
  • Ergebnisse des COBAS-HCM-2-Tests werden in internationalen Einheiten (IU) angegeben. Obgleich verschiedene Umwandlungsfaktoren vorgeschlagen worden sind (Saldanha et al., Vox Sang, Bd. 76(3) (1999), S. 149–158; Cuijpers et al., Bd. 81(1) (2001), S. 12–20), wird die genaue Beziehung zwischen IU und HCV-RNA-Kopienzahl immer noch diskutiert, insbesondere für andere HCV-Genotypen als 1a und 1b. Aufgrund dieser Tatsache schlägt Roche Diagnostic Systems derzeit keinen Umwandlungsfaktor für Ergebnisse, die mit dem COBAS-HCM-2-Test erhalten worden sind, vor. Für analytische Zwecke wird daher angenommen, dass der IU-Wert und die RNA-Kopienzahl gleichwertig sind. Im Vergleich zum COBAS-HCM-2-Test ist der "Nase-an-Nase-Leuchtturm"-RT-PCR-Test gleich empfindlich oder geringfügig empfindlicher in Bezug auf die Genotypen 1a, 1b, 2b und 6a, ist aber 10-fach (1 log) empfindlicher in Bezug auf den Genotyp 4a, 3,2-fach (0,5 log) empfindlicher in Bezug auf die Genotypen 2a und 5a und 2-fach (0,3 log) empfindlicher in Bezug auf den Genotyp 3a. Eine statistische Analyse, die die relative Empfindlichkeit der beiden Tests vergleicht, ist in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 1
    Figure 00280001
    • 1. Bei den getesteten Proben handelte es sich um Plasma von Schimpansen, die jeweils mit den Prototyp-HCV-Stämmen infiziert waren: H-Stamm (Inchauspe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 88 (1991), S. 10292–10296; Genbank M67463), HC-J4/91 (Okamoto et al., Virology, Bd. 190 (1992), S. 899–899; Genbank D10750), HC-J6 (Okamoto et al., J. Gen. Virol., Bd. 72 (1991), S. 2697–2704; Genbank D00944), HC-J8 (Okamoto et al., Virology, Bd. 188 (1992), S. 331–341; Genbank D10988), S52 (Bukh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 89 (1992), S. 4942–4946; Genbank M84837), ED43 (Chamberlain et al., Bd. 78 (1997), S. 1391–1347; Genbank Y11604), SA13 (Bukh et al., J. Infect. Dis., Bd. 178, S. 1193–1197; Genbank AF064490), HK6a (Adams et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 234 (1997), S. 393–396; Genbank Y12083).
    Tabelle 2 Nachweis von HCV-Genotypen durch "Nase-an-Nase-Leuchtturm"-PCR- und COBAS-HCM-2-Tests
    Figure 00290001
    • 1. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte +/– Standardabweichung von (n) Wiederholungstests angegeben. Die Ergebnisse des COBAS-HCM-2-Tests werden in internationalen Einheiten (IU) angegeben.
    • 2. Der Faktor des Empfindlichkeitsunterschieds der beiden Tests wird als arithmetisches Verhältnis der Werte, die durch die "Nase-an-Nase-Leuchtturm"-PCR erhalten worden sind, zu den Werten, die durch den Roche-Monitor-Test erhalten worden sind, berechnet. Zweiseitige P-Werte wurden unter Verwendung der GraphPad InStat-Software berechnet.
  • Screening von Plasmaproben von Personen mit Infektionen mit verschiedenen HCV-Genotypen
  • Die erfindungsgemäße "Nase-an-Nase"-PCR wurde zum Screening einer Untergruppe von Patienten-Plasmaproben aus dem ICBS-HCV-Master-Panel verwendet. Dieses Panel, das ständig erweitert wird, wird vom Centers for Disease Control (CDC) in Zusammenarbeit mit dem International Consortium for Blood Safety (ICBS) erstellt. Das Panel besteht aus Plasmaproben, die aus verschiedenen geographischen Regionen erhalten worden sind. Sämtliche Proben werden einem Screening auf HCV-Antikörper und der Genotyp-Analyse in zwei unabhängigen Testlaboratorien beim CDC und bei Visible Genetics Inc. (VGI) unterworfen.
  • Insgesamt 192 Proben, die in Ägypten, Vietnam und Indonesien gewonnene Plasmaproben umfassten, wurden vom CDC bereitgestellt. Davon waren 134 als eindeutig positiv auf HCV-RNA auf der Basis der PCR-Genotypisierungsdaten, die vom CDC, vom VGI oder von beiden erhalten worden waren, bezeichnet. Für 5 Proben waren zweideutige oder widersprüchliche PCR-Genotypdaten angegeben. 35 Proben waren als nicht genotypisierbar (d. h. negativ auf HCV-RNA) bezeichnet.
  • Die gesamte RNA wurde von 70 μl frisch aufgetautem Plasma unter Anwendung eines automatisierten Extraktionsverfahrens extrahiert, wobei RNA an PVDF-Membranen in einem Format mit Platten mit 96 Vertiefungen gebunden und eluiert wurden (Lee und Prince, Transfusion, Bd. 41 (2001), S. 483–487). Die gesamte RNA wurde in einem Volumen von 50 μl nucleasefreiem Wasser gewonnen. 10 μl davon (entsprechend 14 μl Plasma) wurden sodann der reversen Transkription und der PCR unter Verwendung der "Nase-an-Nase"-Primer (SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4) und des molekularen "Leuchtturms" (SEQ ID NO: 5) gemäß den vorstehenden Ausführungen unterworfen.
  • Tabelle 3 zeigt die RT-PCR-Ergebnisse für die 134 unzweideutig HCV-positiven Proben, die im Panel vorhanden waren. Mit der "Nase-an-Nase"-PCR wurde in erfolgreicher Weise die weit überwiegende Mehrzahl der HCV-Isolate aus sämtlichen Genotypen nachgewiesen. Von den 53 Proben, die sich bei den Genotyptests nicht positiv auf HCV-RNA erwiesen, ergab nur eine Probe ein schwach positives PCR-Signal (103,1 RNA-Moleküle pro ml).
  • Proben mit einer Virusbelastung von weniger als 700 Kopien/ml (9,9 Kopien pro 14 μl Plasma) werden unter Anwendung der Kombination aus automatischer Extraktion und "Nase-an-Nase"-RT-PCR gemäß den vorstehenden Ausführungen nicht nachgewiesen. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen klar, dass die vorliegende Erfindung den Nachweis von verschiedenen HCV-Genotypen mit einem einzigen Satz von "Nase-an-Nase"-Primern und einem molekularen "Leuchtturm" ermöglicht. Tabelle 3
    Figure 00310001
    • *** Proben, für die die Genotyp-Analyse eine gemischte Infektion oder eine unbestimmte Klassifikation ergab, sind getrennt aufgeführt.
  • Vergleich der "Nase-an-Nase"-PCR und der herkömmlichen PCR in Bezug auf den Nachweis von HIV-1-Gruppe M-Subtyp B-Varianten
  • 6a zeigt eine Ausrichtung von proviralen DNA-Sequenzen entsprechend der V3-Region und von flankierenden Sequenzen von vier verschiedenen HIV-Varianten, alle aus der Gruppe M (Major) Subtyp B (HIV/RT-1, HIV/RT10, HIV/38-1 und HIV/38/3). Die V3-Region stellt das variabelste Segment des HIV-Genoms dar. Ein molekularer "Leuchtturm" wurde mit einer Sonden-Schleifen-Struktur in genau identischer Weise zur Variante HIV/RT-1 (Nucleotide 76–97 an der dargestellten V3-Sequenz) konstruiert. Diese Sondensequenz weist 1, 3 oder 4 Fehlpaarungen zu den Varianten HIV/RT-10, HIV/38-1 bzw. HIV/38-3 auf (6a).
  • PCR-Primer für die "Nase-an-Nase"-PCR wurden folgendermaßen konstruiert. Der Vorwärtsprimer (5'-acaatacaagaaaaaggataactatgggac-3') (SEQ ID NO: 6) entspricht den Nucleotiden 65–94 der Sequenz von HIV/RT-1, die in 6a dargestellt ist. Der Vorwärtsprimer ist als NBF bekannt. Der reverse Primer (5'-tttctcctgttgtataaagtactctccccg-3') (SEQ ID NO: 7) entspricht den Nucleotiden 95–124 der gleichen Sequenz. Der reverse Primer ist als NBR bekannt.
  • Primer für die herkömmliche PCR wurden folgendermaßen zur Erzeugung eines 177b-PCR-Produkts konstruiert. Der Vorwärtsprimer (5'- taatagtacagctgaatgaatctg-3') (SEQ ID NO: 8) entspricht den Nucleotiden 14–37 der Sequenz HIV/RT-1 gemäß Darstellung in 6a. Der reverse Primer (5'-gttttaaagtgttattccatgc-3') (SEQ ID NO: 9) entspricht den Nucleotiden 168–190 der gleichen Sequenz.
  • 7 zeigt die Ergebnisse eines Experiments zum Vergleich der Fähigkeit der herkömmlichen "Leuchtturm"-PCR mit der "Nase-an-Nase"-PCR zum Nachweis der einzelnen vier HIV-Varianten, die in 6a dargestellt sind. Die PCR-Reaktionen enthielten 106 Matrizenmoleküle von HIV/RT-1, HIV/RT-10, HIV/38-1 oder HIV/38-3, den in 6b dargestellten molekularen "Leuchtturm" und entweder den herkömmlichen Primer oder den "Nase-an-Nase"-Primer gemäß den vorstehenden Angaben. Die Kontroll-PCR-Reaktion enthielt entweder keine Matrize oder 150 ng humane genomische DNA. Eine Amplifikation wurde im Gerät Perkin Elmer 7700 unter Anwendung der folgenden Cyclisierungsparameter durchgeführt: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 30 Sekunden (Denaturierung), 50 °C für 1 Minute (Anlagerung) und 72 °C für 30 Sekunden (Erweiterung). Die Fluoreszenz des molekularen "Leuchtturms" wurde bei einer Anlagerungstemperatur von 50 °C gemessen. Die Fluoreszenz wurde sodann graphisch gegen die PCR-Zykluszahl aufgetragen. Der Wirkungsgrad der PCR-Amplifikation/Nachweis wird durch den "Schwellenzyklus" bestimmt, d. h. die niederste Anzahl an PCR-Zyklen, die zur Erzeugung eines positiven Fluoreszenzsignals erforderlich waren.
  • Wie in 7a dargestellt, war die herkömmliche "Leuchtturm"-PCR-Technik zum Nachweis sowohl von HIV/RT-1 (exakte Übereinstimmung mit dem "Leuchtturm") als auch von HIV/RT-10 (eine Fehlpaarung) mit einem gleichwertigen Schwellenzyklus (Zyklus 23) befähigt, obgleich der maximale Fluoreszenzwert, der im letztgenannten Fall erzielt wurde, etwa 2-fach geringer als bei der exakt übereinstimmenden Matrize war. Die herkömmliche "Leuchtturm"-PCR-Technik versagte beim Nachweis von HIV/38-1 (3 Fehlpaarungen) oder von HIV/38-3 (4 Fehlpaarungen), und zwar trotz der Tatsache, dass das PCR-Produkt von sämtlichen vier Varianten erzeugt worden war, wie durch Gelanalyse (8) gezeigt wird.
  • Im Gegensatz dazu war die "Nase-an-Nase"-PCR-Technik zum Nachweis sämtlicher vier HIV-Varianten (0, 1, 3 oder 4 Fehlpaarungen) mit einem vergleichbaren Schwellenzyklus befähigt (7b). Wichtig ist, dass kein Signal in Reaktionsröhrchen nachgewiesen wurde, die entweder keine Matrize oder 150 ng humane genomische DNA enthielten.
  • Nachweis von verschiedenen Subtypen von HIV-1 (Gruppe M)
  • PCR-Primer wurden zur Amplifikation eines Segments des gag-Gens der genomischen HIV-1-RNA, die zwischen verschiedenen Subtypen von HIV-1 (Gruppe M) relativ gut konserviert ist, konstruiert. Trotz dieser relativen Konservierung zeigen einzelne HIV-1-Subtypen innerhalb dieser Region des Genoms bis zu 20 % Abweichungen der Nucleotidsequenz (Roberton et al., Human Retroviruses and AIDS, (1999), 5. 492–505, Hrsg. Kuiken et al., Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico).
  • Herkömmliche Primer für die "Leuchtturm"-PCR wurden konstruiert, um ein 94 bp-Segment von RNA, das den Nucleotiden 1478 bis 1571 der veröffentlichten Sequenz des Subtyps B-HIV-1-Isolats HXB2 entsprach, zu amplifizieren (Ratner et al., Nature, Bd. 313 (6000) (1985), S. 277–284; Genbank K03455). Die Lücke zwischen den beiden herkömmlichen RT-PCR-Primern beträgt 53 bp. Es handelte sich um folgende Primer:
    Vorwärtsprimer: 5'-AACCAAGGGGAAGTGACATA-3' (SEQ ID NO: 10);
    Reverser Primer: 5'-ATTTCTCCTACTGGGATAGGT-3' (SEQ ID NO: 11).
  • Die Primer für die erfindungsgemäße "Nase-an-Nase"-RT-PCR wurden konstruiert, um ein 57 bp-Segment entsprechend den Nucleotiden 1502 bis 1558 der veröffentlichten Sequenz von HIV-1-HXB2 zu amplifizieren. Zwischen den beiden Primern bestand keine Lücke. Es handelte sich um folgende Primer:
    Vorwärtsprimer: 5'-GAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAG-3' (SEQ ID NO: 12);
    Reverser Primer: 5'-GGATAGGTGGATTATTTGTCATCCATC-3' (SEQ ID NO: 13).
  • Sowohl für die herkömmliche als auch für die "Nase-an-Nase"-PCR handelte es sich bei dem für den Nachweis des PCR-Produkts verwendeten molekularen "Leuchtturm" um 5'-FAM-cgcctTACCCTTCAGGAACAAATAGaggcg-DABCYL-3' (SEQ ID NO: 14). Die Stamm-Nucleinsäuren sind in Kleinbuchstaben dargestellt und die Sondenschleifen-Nucleinsäuren (entsprechend den Nucleotiden 1512 bis 1530 der HIV-1-HXB2-Sequenz) sind in Großbuchstaben dargestellt.
  • Virusisolate der HIV-1-Subtypen A, B, C, D, F und G wurden als zellfreie Kulturüberstände vom AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH, erhalten. RNA wurde aus 140 μl frisch aufgetautem Kulturüberstand extrahiert. Komplementäre DNA wurde revers aus der extrahierten RNA unter Verwendung entweder des herkömmlichen reversen Primers oder des vorstehend beschriebenen reversen "Nase-an-Nase"-Primers transkribiert. Die Reaktionsbedingungen sowohl für die cDNA-Synthese als auch für die PCR-Amplifikation entsprachen im wesentlichen den vorstehenden Angaben für HCV. Sämtliche Tests wurden im Dreifachversuch durchgeführt. Eine quantitative Bestimmung der HIV-Matrizenmoleküle wurde durch Aufnahme einer RNA-Standardkurve in jedes RT-PCR-Experiment erreicht. Die Standardkurve wurde unter Verwendung von 1, 10, 102, 103, 104, 105 oder 106 Molekülen HIV-1-RNA in Verdünnung in 1 μg/ml Hefe-tRNA (Ambion, Austin, TX) erstellt.
  • Tabelle 4 zeigt einen Vergleich der herkömmlichen RT-PCR und der "Nase-an-Nase"-RT-PCR zum Nachweis von HIV-1-Subtypen. Der erfindungsgemäße "Nase-an-Nase"-Test (A) weist sämtliche getesteten 6 HIV-1-Subtypen nach, während der herkömmliche Test bei den Subtypen A, D und G versagt. Tabelle 4
    Figure 00340001
    • 1. Bei den Testproben handelte es sich um Virusisolate, die als zellfreie Kulturüberstände vom AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH, erhalten worden waren.
    • 2. Isolate vom The UNAIDS Network for HIV Isolation and Characterization, und dem DAIDS, NIAID.
    • 3. Abimiku et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, Bd. 10(11) (1994), S. 1581–1583.
  • Anpassung des Verfahrens auf den gleichzeitigen Nachweis sowohl von HIV-1-Gruppe M- als auch von HIV-1-Gruppe O-Varianten
  • Virusisolate der HIV-1-Gruppe 0 (Outlier) zeigen eine ausgeprägte Sequenzvariation gegenüber Mitgliedern der HIV-1-Gruppe M (Major). Obgleich Gruppe O-Viren hauptsächlich in Teilen von Afrika vorherrschen, erscheint ihre Frequenz in Proben, die in Blutbanken außerhalb von Afrika gesammelt worden sind, im Steigen begriffen (Jaffe und Schochetman, Infect. Dis. Clin. North. Am., Bd. 12(1) (1998), S. 39–46; Couturier et al., AIDS, Bd. 14(3) (2000), S. 289–296; Fed. Regist., Bd. 62 (184) (23. September 1997), S. 49695). Die vorliegende Erfindung erlaubt den Nachweis von Mitgliedern sowohl der Gruppe M als auch der Gruppe 0 unter Verwendung eines einzigen Satzes von "Nase-an-Nase"-Primern und eines molekularen "Leuchtturms".
  • Die Primer für die erfindungsgemäße "Nase-an-Nase"-RT-PCR wurden konstruiert, um ein 64 bp-Segment des pol-Gens der genomischen HIV-1-RNA entsprechend den Nucleotiden 4750 bis 4813 der veröffentlichen Sequenz von HIV-1-HXB2 zu amplifizieren. Zwischen den beiden Primern besteht keine Lücke. Es handelte sich um folgende Primer:
    Vorwärtsprimer: 5'-CAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTT3' (SEQ ID NO: 15);
    Reverser Primer: 5'-CTGTATCCCCCAATCCCCCCTTTTCTTTTA-3' (SEQ ID NO: 16).
  • Bei dem für den Nachweis des PCR-Produkts verwendeten molekularen "Leuchtturm" handelte es sich um 5'-FAM-cgcacgGCAGTATTCATTCACCAATTTTcgtgcg-DABCYL-3' (SEQ ID NO: 17).
  • Die Stamm-Nucleinsäuren sind in Kleinbuchstaben dargestellt und die Sondenschleifen-Nucleinsäuren sind in Großbuchstaben dargestellt.
  • Die neuen Primer und der "Leuchtturm" wurden sodann auf ihre Fähigkeit zur Amplifikation und zum Nachweis von Virusisolaten von HIV-1-Gruppe M (Subtypen A, B, C, D, F und G) und Gruppe 0 getestet, wobei diese Isolate als zellfreie Kulturüberstände vom AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID/NIH, erhalten worden waren. Vor der RNA-Extraktion wurden sämtliche Zellüberstände 1000-fach in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. Die RNA-Extraktion wurde am verdünnten Überstand im wesentlichen gemäß den vorstehenden Angaben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass nach der Isolation sämtliche RNA-Proben mit RNase-freier DNase behandelt wurden (Ambion, Austin, TX), um eine Entfernung von verunreinigender proviraler DNA zu gewährleisten. Die komplementäre DNA wurde revers aus extrahierter RNA unter Verwendung des vorstehend beschriebenen reversen "Nase-an-Nase"-Primers (SEQ ID NO: 16) extrahiert. Die Reaktionsbedingungen sowohl für die cDNA-Synthese als auch für die PCR-Amplifikation waren im wesentlichen identisch mit den vorstehenden Angaben. Eine quantitative Bestimmung der HIV-1-Matrizenmoleküle wurde durch Aufnahme einer RNA-Standardkurve in jedes RT-PCR-Experiment erreicht.
  • Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse der RT-PCR unter Verwendung der erfindungsgemäßen pol-Region-"Nase-an-Nase"-Primer und einen Vergleich mit dem COBAS AMPLICOR-HIV-1-Monitor Assay Version 1.0-Test (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ). Der "Nase-an-Nase"-RT-PCR-Test war zum Nachweis sämtlicher getesteten Gruppe M- und Gruppe O-Isolate befähigt, wobei die Empfindlichkeit gleich (Gruppe M, Subtypen B und C) oder größer (Gruppe M, Subtypen A, D und F) als beim COBAS AMPLICOR HIV-1-Monitor Assay (1.0) war. Der letztgenannte Test versagte zum Nachweis der getesteten Gruppe O-Virusisolate und auch zum Nachweis der Gruppe M-Subtyp G. Diese Daten stehen in Übereinstimmung mit einem neuen Bericht, dass weder der COBAS AMPLICOR HIV-1-Monitor Assay (1.0) noch seine verbesserte Version (1.5) zum Nachweis von Gruppe O-Viren befähigt sind (Yang et al., Transfusion, Bd. 41 (2001), S. 643–651). Im Gegensatz dazu ermöglicht die vorliegende Erfindung den Nachweis sämtlicher Virusisolate mit einem einzigen Satz von "Nase-an-Nase"-Primern und einem molekularen "Leuchtturm". Tabelle 5
    Figure 00360001
    • 1. Vor der RNA-Extraktion wurden sämtliche zellfreien Überstände 1000-fach entweder in PBS (für die "Nase-an-Nase"-RT-PCR) oder in normalem humanem Plasma (für COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Version 1.0) verdünnt.
    • 2. Die Virusisolate entsprechen den Angaben in Tabelle 3; Isolat L20571, L. G. Gurtler et al., J. Virol., Bd. 68 (1994), S. 1581; Isolat Y14496, I. Loussert-Ajaka et al., J. Virol., Bd. 69 (1995), S. 5640.
    • 3. "Nase-an-Nase"-PCR oder RT-PCR wurden ferner an 100 ng humaner DNA oder RNA durchgeführt, um sicherzustellen, dass die beobachteten Signale auf eine Virusamplifikation und nicht auf eine Amplifikation mit verunreinigenden humanen Nucleinsäuren zurückzuführen waren.

Claims (35)

  1. Primer-Extension-Kettenreaktionsverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Zielnucleinsäuremoleküls in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) das Hybridisieren eines Rückwärtsprimers mit dem Zielnucleinsäuremolekül unter Bedingungen, die sich zur Durchführung einer Primer-Extension-Kettenreaktion eignen; (b) das Verlängern des Rückwärtsprimers unter Verwendung des Zielnucleinsäuremoleküls als eine Matrize zur Bildung eines Rückwärtsprimer-Extensionprodukts, wobei der mit dem Rückwärtsprimer-Extensionprodukt verbundene Rückwärtsprimer ein Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukt darstellt; (c) das Denaturieren des Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukts von seiner Matrize; (d) das Hybridisieren eines Vorwärtsprimers mit: (i) einem Nucleinsäuremolekül, das komplementär mit dem Zielnucleinsäuremolekül ist, falls dieses vorhanden ist; oder (ii) dem Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukt; (e) das Verlängern des Vorwärtsprimers unter Verwendung des komplementären Zielnucleinsäuremoleküls, falls dieses vorhanden ist, oder dem Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukt als Matrize, wobei der mit dem Vorwärtsprimer-Extensionprodukt verbundene Vorwärtsprimer ein Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukt darstellt; (f) das Denaturieren des Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukts von seiner Matrize; (g) das Hybridisieren des Rückwärtsprimers mit dem Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukt; (h) das Verlängern des Rückwärtsprimers unter Verwendung des Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukts als eine Matrize zur Bildung eines zusätzlichen Rückwärtsprimer-Extensionprodukts, wobei der mit dem zusätzlichen Rückwärtsprimer-Extensionprodukt verbundene Rückwärtsprimer ein zusätzliches Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukt darstellt; (i) das Denaturieren des zusätzlichen Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukts von seiner Matrize; (j) das Hybridisieren des Vorwärtsprimers mit dem Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukt; (k) das Verlängern des Vorwärtsprimers unter Verwendung des Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukts als eine Matrize zur Bildung eines zusätzlichen Vorwärtsprimer-Extensionprodukts, wobei der mit dem zusätzlichen Vorwärtsprimer-Extensionprodukt verbundene Vorwärtsprimer ein zusätzliches Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukt darstellt; (l) das Denaturieren des zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukts von seiner Matrize; (m) das Wiederholen der Stufen (g) bis (l) unter Verwendung des zusätzlichen Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukts und des zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukts als Matrizen für den Vorwärtsprimer bzw. den Rückwärtsprimer für eine ausreichende Anzahl von Wiederholungsvorgängen, um eine nachweisbare Menge eines zusätzlichen Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukts oder eines zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukts zu erzeugen; und (n) das Nachweisen der Anwesenheit des zusätzlichen Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukts oder des zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukts; wobei das Nucleotid am 3'-Ende des Rückwärtsprimers hybridisiert mit: (i) dem Nucleotid am 5'-Ende des Vorwärtsprimer-Extensionprodukts oder des zusätzlichen Vorwärtsprimer-Extensionprodukts; oder (ii) einem Nucleotid, das vom Nucleotid am 5'-Ende des Vorwärtsprimer-Extensionprodukts oder des zusätzlichen Vorwärtsprimer-Extensionprodukts durch eine Lücke von Nucleotiden getrennt ist, wobei die Lücke eine Sequenz umfasst, von der bekannt ist, dass sie hochgradig konserviert ist und wobei die Lücke etwa 1 bis 5 Nucleotide umfasst; und wobei das Nucleotid am 3'-Ende des Vorwärtsprimers hybridisiert mit: (i) dem Nucleotid am 5'-Ende des Rückwärtsprimer-Extensionprodukts oder des zusätzlichen Rückwärtsprimer-Extensionprodukts; oder (ii) einem Nucleotid, das vom Nucleotid am 5'-Ende des Rückwärtsprimer-Extensionprodukts oder des zusätzlichen Rückwärtsprimer-Extensionprodukts durch eine Lücke von Nucleotiden getrennt ist, wobei die Lücke eine Sequenz umfasst, von der bekannt ist, dass sie hochgradig konserviert ist, und wobei die Lücke etwa 1 bis etwa 5 Nucleotide umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei von den Zielnucleinsäuremolekülen bekannt ist, dass sie variante Sequenzen aufweisen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Primer-Extension-Kettenreaktion um eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) handelt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich beim Zielnucleinsäuremolekül um ein Virus handelt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Virus um humanes Immunschwächevirus (HIV) handelt.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Virus um Hepatitis C-Virus (HCV) oder Hepatitis B-Virus (HBV) handelt.
  7. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Lücke eine hochgradig konservierte Region des Genoms des Virus umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lücke etwa 2 Nucleotide umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Nucleinsäuremolekül, das mit dem Zielnucleinsäuremolekül von Stufe (d) (i) komplementär ist, getrennt als die cDNA des Zielnucleinsäuremoleküls bereitgestellt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis der Anwesenheit des zusätzlichen Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukts oder des zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukts umfasst: (A) das Bereitstellen einer sich selbst verändernden, signalerzeugenden Sonde, wobei die Sonde folgendes umfasst: (i) eine erste Nucleinsäuresequenz, die an einen Reporterrest gebunden ist, der zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist; (ii) eine zweite Nucleinsäuresequenz, die (a) komplementär mit der ersten Nucleinsäuresequenz ist, und (b) an einen interaktiven Rest gebunden ist, der zur Veränderung des Signals des Reporterrestes befähigt ist, wenn die erste Nucleinsäuresequenz und die zweite Nucleinsäuresequenz miteinander hybridisiert werden; und (iii) eine Sondensequenz, die die erste Nucleinsäuresequenz und die zweite Nucleinsäuresequenz verbindet; wobei die Sondensequenz folgendes umfasst: entweder (a) die Nucleotidsequenz eines Segments des Vorwärtsprimers; oder (b) die Nucleotidsequenz eines Segments des Rückwärtsprimers; und (B) das Kontaktieren der Amplifikationsprodukte mit der Sonde; wobei dann, wenn die Sondensequenz der Sonde mit dem zusätzlichen Rückwärtsprimer-Amplifikationsprodukt oder dem zusätzlichen Vorwärtsprimer-Amplifikationsprodukt hybridisiert, die erste und zweite Nucleinsäuresequenz denaturiert werden, wodurch ein Signal vom Reporterrest erzeugt wird; und wobei das vom Reporterrest erzeugte Signal die Anwesenheit des Zielmoleküls anzeigt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Sondensequenz folgendes umfasst: (a) entweder die Nucleotidsequenz eines Segments des Vorwärtsprimers und nicht die Nucleotidsequenz eines Segments, die mit dem Rückwärtsprimer komplementär ist; oder (b) die Nucleotidsequenz eines Segments des Rückwärtsprimers und nicht die Nucleotidsequenz eines Segments, die mit dem Vorwärtsprimer komplementär ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Sondensequenz folgendes umfasst: (a) entweder die Nucleotidsequenz eines Segments des Vorwärtsprimers und die Nucleotidsequenz eines Segments, die mit dem Rückwärtsprimer komplementär ist; oder (b) die Nucleotidsequenz eines Segments des Rückwärtsprimers und die Nucleotidsequenz eines Segments, die mit dem Vorwärtsprimer komplementär ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Niveau des von der Sonde erzeugten nachweisbaren Signals proportional zur Menge des Zielnucleinsäuremoleküls in der Probe ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei etwa 60 bis etwa 95 % der Sondensequenz folgendes umfassen: (i) entweder die Nucleotidsequenz eines Segments des Vorwärtsprimers; oder (ii) die Nucleotidsequenz eines Segments des Rückwärtsprimers.
  15. Verfahren nach Anspruch 10, wobei, dann, wenn die Sondensequenz die Nucleotidsequenz eines Segments des Rückwärtsprimers umfasst, das Molverhältnis des Rückwärtsprimers zum Vorwärtsprimer im Bereich von etwa 1:5 bis etwa 1:20 liegt; oder dann, wenn die Sondensequenz die Nucleotidsequenz eines Segments des Vorwärtsprimers umfasst, das Molverhältnis des Vorwärtsprimers zum Rückwärtsprimer im Bereich von etwa 1:5 bis etwa 1:20 liegt.
  16. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Sondensequenz etwa 10 bis etwa 30 Nucleotidreste umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Sondensequenz etwa 18 bis etwa 24 Nucleotidreste umfasst.
  18. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich beim nachweisbaren Signal um ein lumineszierendes Signal handelt.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das lumineszierende Signal ein fluoreszierendes Signal ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das lumineszierende Signal ein chemilumineszierendes Signal ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Reporterrest an das 5'-Ende oder das 3'-Ende der sich selbst verändernden, signalerzeugenden Sonde gebunden ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der interaktive Rest an das 5'-Ende oder das 3'-Ende der sich selbst verändernden, signalerzeugenden Sonde gebunden ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich beim Reporterrest um ein Fluorophor handelt.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich beim Fluorophor um einen Xanthenfarbstoff, einen Cyaninfarbstoff, ein Dansylderivat, EDANS, Cumarin, Luzifer-Gelb, BODIPY, Cy3, Cy5, Cy7, Texas-Rot, Erythrosin, Naphthylamin, Oregon-Grün oder Kombinationen davon handelt.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei es sich beim Xanthenfarbstoff um ein Fluorescein oder ein Rhodamin handelt.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Fluorescein aus der Gruppe 5-Carboxyfluorescein (5-FAM); 6-Carboxyfluorescein (6-FAM); 2',4',1,4-Tetrachlorfluorescein (TET); 2',4',5',7',1,4-Hexachlorfluorescein (HEX); Eosin; Calcium-Grün; und NED ausgewählt ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Rhodamin aus der Gruppe Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA); Tetrapropano-6-carboxyrhodamin (ROX); 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxythodamin (JOE); und Tetramethylrhodamin ausgewählt ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich beim interaktiven Rest um einen Quencher handelt.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei es sich beim Quencher um DABCYL, Anthrachinon, Nitrothiazol, Nitroimidazol oder Malachitgrün handelt.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei es sich beim DABCYL um DABSYL, DABMI oder Methylrot handelt.
  31. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich beim interaktiven Rest um ein Fluorophor handelt.
  32. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikationsprodukte durch Endpunktanalyse gemessen und quantitativ bestimmt werden.
  33. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikationsprodukte durch Echtzeitanalyse gemessen und quantitativ bestimmt werden.
  34. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikationsprodukte unter Verwendung einer Eichkurve, die von einer Reihe von Schwellen-Zyklusmessungen abgeleitet ist, gemessen werden.
  35. Kit zum Nachweis von Zielnucleinsäuremolekülen in einer Probe, wobei von den Zielnucleinsäuremolekülen bekannt ist, dass sie variante Sequenzen aufweisen, umfassend: (i) einen Satz von Primern, die im Verfahren von Anspruch 1 geeignet sind; (ii) Reagenzien zur Durchführung einer Primer-Extension-Kettenreaktion und; (iii) eine sich selbst verändernde, signalerzeugende Sonde, die die Anwesenheit von Primer-Amplifikationsprodukten nachweist, wobei die Sonde umfasst: eine erste Nucleinsäuresequenz, die an einen Reporterrest gebunden ist, der zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist; eine zweite Nucleinsäuresequenz, die an einen interaktiven Rest gebunden ist, der zur Veränderung des Signals des Reporterrestes befähigt ist; und eine Sondensequenz, die die erste und die zweite Nucleinsäuresequenz miteinander verbindet.
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