JP5361109B2 - A型肝炎ウイルス核酸の捕捉、検出および定量のためのオリゴヌクレオチドの同定 - Google Patents
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Description
A型肝炎は、発熱、倦怠感、食欲不振、悪心、腹部不快感、および黄疸を引き起こす、腸伝達性疾患である。A型肝炎の病因因子であるA型肝炎ウイルスは、Picornaviridae科のHepatovirus属に分類される、小さく外被のない球状のウイルスである。HAVゲノムは、一本鎖で線状の7.5kb RNA分子からなり、このRNA分子は、ウイルス複製に必要な構造タンパク質および酵素活性を生じるようにプロセシングされるポリタンパク質前駆体をコードする(Najarianら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:2627〜2632(1985))。HAVは、細胞培養中でほとんど増殖せず、細胞傷害性ではなく、そして低収量のウイルスを生じる。ビリオンから抽出されたHAV RNAは、細胞培養中で感染性である(Lacarniniら、J.Virol.37:216〜225(1981)およびSieglら、J.Gen.Virol.57:331〜341(1981))が、そのウイルスゲノムの直接操作は、そのRNA組成が原因で困難になる。
本発明は、感染している可能性がある個体由来の生物学的サンプルにおいてHAVを検出するための、感度の良い信頼できる核酸ベースの診断試験を開発することに基づく。本明細書中に記載される技術は、PCR、転写媒介性増幅(TMA)、および5’ヌクレアーゼアッセイ(例えば、TaqManTM技術)を使用して、HAV配列の保存ゲノム領域の増幅用テンプレートとして、抽出したサンプル核酸を利用する。これらの方法は、ウイルス血症サンプルにおけるHAVの検出を可能にする。特定の実施形態において、本発明は、HAVゲノムの5’UTR領域に由来するプライマーおよびプローブを使用する。さらに、これらの方法は、捕捉されたサンプル核酸が同じ容器中で増幅および検出に供され得る、ワンポット(one−pot)分析を可能にする。本発明の方法を使用して、感染したサンプルは、輸液から、および血液誘導体調製物から、同定されて排除され得る。
(a)固体支持体を、上記生物学的サンプルと、高カオトロピック塩濃度下で、または上記固体支持体と標的核酸との間で複合体が形成されるハイブリダイズ条件下で、接触させる工程;
(b)上記サンプルから(a)の固体支持体を分離する工程;
(c)標的核酸が存在する場合にその標的核酸を増幅する工程;および
(d)上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程;
を包含する。
(a)固体支持体を、上記生物学的サンプルと、高カオトロピック塩濃度下で、または上記固体支持体と標的核酸との間で複合体が形成されるハイブリダイズ条件下で、接触させる工程;
(b)上記サンプルから(a)の固体支持体を分離する工程;
(c)HAVのゲノムの5’ UTRに由来するプライマー(例えば、配列番号1を含む配列によって示されるプライマー、および配列番号2を含む配列によって示されるプライマー)を使用して、標的核酸鎖を増幅する工程;
を包含する。特定の実施形態において、この方法は、HAVゲノムの5’ UTRに由来するプローブ(例えば、配列番号3のプローブ)を使用して、上記増幅された標的オリゴヌクレオチドの存在を、上記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程をさらに包含する。
HAVを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程;
2種のプライマーを使用して、上記核酸を増幅する工程であって、
(a)上記プライマーの各々は、長さが約60ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号1からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号2からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、または
(b)上記プライマーは、(a)のヌクレオチド配列と90%配列同一性を有し、
上記2種のプライマーの各々は、それぞれ、単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;ならびに
上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程、
を包含する。
(a)結合している捕捉核酸を含む固体支持体を、標的核酸鎖が上記捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で生物学的サンプルと接触させる工程;および
(b)上記サンプルから上記固体支持体を分離する工程;
を包含する方法によって、上記生物学的サンプルから単離される。
(a)固体支持体を、1種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸と、この捕捉核酸が上記固体支持体と結合する条件下で接触させる工程であって、上記1種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14からなる群より選択される配列を含む、工程;
(b)(a)の固体支持体を、生物学的サンプルと、HAV由来の標的核酸鎖が存在する場合にはその標的核酸鎖が上記捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で接触する工程;および
(c)上記サンプルから(b)の固体支持体を分離する工程;
(d)配列番号1を含むセンスプライマーと配列番号2を含むアンチセンスプライマーとを使用して上記核酸を増幅する工程であって、上記センスプライマーおよび上記アンチセンスプライマーは、それぞれ、上記単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;ならびに
(e)上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程;
を包含する。
(a)配列番号1、配列番号2、および配列番号3からなる群より選択される配列からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列;
(b)(a)のヌクレオチド配列に対して90%配列同一性を有するヌクレオチド配列;または
(c)(a)の相補体および(b)の相補体;
を含む。
1種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸であって、これらのオリゴヌクレオチドの各々は、長さが約60ヌクレオチド以下であり、かつこれらのオリゴヌクレオチドの各々は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群より選択される配列の少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、捕捉核酸;
少なくとも2種のプライマーであって、これらのプライマーの各々は、長さが約60ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号1からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、もう一方のプライマーは、配列番号2からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、プライマー;および
HAV感染を同定するための指示書
を備える。
本発明の実施は、他のように示されない限り、当業者の範囲内にある従来の化学、生化学、組換えDNA技術およびウイルス学の方法を使用する。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Fundamental Virology、第2版、第I巻および第II巻(B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,現行版);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989);Methods In Enzymology(S.ColowickおよびN.Kaplan編、Academic Press,Inc.);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編、1984);A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)を参照のこと。
アラニン:Ala(A) アルギニン:Arg(R)
アルパラギン:Asn(N) アスパラギン酸:Asp(D)
システイン:Cys(C) グルタミン:Gln(Q)
グルタミン酸:Glu(E) グリシン:Gly(G)
ヒスチジン:His(H) イソロイシン:Ile(I)
ロイシン:Leu(L) リジン:Lys(K)
メチオニン:Met(M) フェニルアラニン:Phe(F)
プロリン:Pro(P) セリン:Ser(S)
スレオニン:Thr(T) トリプトファン:Trp(W)
チロシン:Tyr(Y) バリン:Val(V)。
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、この以下の用語は、下記に示されるように定義されることが意図される。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物にもプロセスパラメーターにも限定されず、従って、当然変化し得ることが、理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載するためだけのものであり、この用語は、限定することは意図されないこともまた、理解されるべきである。
下記に、本発明を実行するための具体的な実施形態の例が存在する。これらの実施例は、例示目的のためだけに提供され、本発明の範囲をいかなる様式でも限定することは意図されない。
生物学的サンプルからのHAV RNAの抽出)
HAV核酸陽性血清を、BioClinical Partners(Berkeley,CA)から購入した。2つのアプローチを使用して、サンプルから核酸を単離した。具体的には、RNAを、(a)シリカに結合することによって、および(b)標的特異的オリゴヌクレオチドにアニールすることによって、抽出した。
RNAを、Boom,R.ら(1990)「Rapid and simple method for purification of nucleic acids」J.Clin.Microbiol.28;495〜503により記載される方法を使用して、シリカに結合することによって抽出した。高濃度のカオトロピック塩(例えば、グアニジニウムイソチオシアネート)の存在下で、核酸は、シリカに結合する。サイズ分けした小さな核酸は、酸性pH条件下、シリカにより効率的に結合する。結合した核酸を、高温にて、低塩、アルカリpH緩衝剤中で、効率的に溶出する。通常のシリカを帯磁シリカで置換すると、核酸単離の洗浄工程および溶出工程が非常に容易になる。磁気ベースを使用して、核酸が結合したシリカ粒子を捕捉するために使用し、それにより、通常のシリカ粒子を沈降するために必要な遠心分離を排除した。
帯磁シリカを使用すると、洗浄工程および溶出工程の間の迅速かつ容易な取扱いが非常に容易になるが、核酸の単離は、なお労力がかかり、かつ時間がかかる。従って、磁気ビーズを使用して、血漿または血清からの特定の核酸標的の一工程捕捉を、使用した。これを広範な種類のウイルス核酸捕捉試験に適用可能にするために、オリゴdTに結合した包括的磁気ビーズを、使用した。約14bpの長さのオリゴdTを備える血清−Mag磁気オリゴ(dT)ビーズ(Seradyn,Indianapolis,IN)を、3’末端にHAV特異的配列と連続して(下記に特定される配列の末端にて示される)ポリAテールを含む捕捉オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用した。
(TaqManTMによるHAV RNAの検出)
TaqManTM技術を、捕捉した標的RNAを増幅するために使用した。このために、増幅オリゴヌクレオチドは、HAV特異的プライマーからなった。これらのプライマーは、以下の通りであった:
5’非翻訳領域における増幅プライマーおよび検出プローブ:
(増幅効率および捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせの試験)
HAVの5’ UTRヌクレオチド配列を、NCBI登録番号K02990の配列に基づいて合成によって構築した。この配列をM13プラスミド中にクローニングして、一本鎖NDAを得、このDNAを精製した。
クローニングして精製した上記のDNAの濃度を、分光光度法によって決定し、1反応当たり10,000〜0.5コピーに対応するDNAの希釈物を、TaqManTMアッセイにおいて増幅し、上記の方法、プライマー、およびプローブを使用して検出した。代表的には、>0.2の閾値にて<45サイクルにて認識したサンプルからのシグナルを、陽性であると見なした。表1が、結果を詳説する。
捕捉/プライマーの組み合わせの効率を、25コピー/反応のssDNAを使用して試験した。配列番号4、5、6、7、8、および9の配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせが、最も効率的であった。
Claims (37)
- 生物学的サンプル中のA型肝炎ウイルス(HAV)を検出する方法であって、該方法は、
HAVを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、該生物学的サンプルが、固相磁気ビーズ支持体と接触される、工程;
該HAVのゲノムの5’ UTRに由来する少なくとも2種のプライマーを使用して、該単離された核酸を増幅する工程であって、該プライマーの各々は、長さが20ヌクレオチド〜60ヌクレオチドであり、かつ該プライマーの各々は、それぞれ、該単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;および
該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程;
を包含し、
該単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施され、
該核酸は、結合している60ヌクレオチド以下の6種の捕捉核酸を含む該固相磁気ビーズ支持体を、標的核酸鎖が該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で該生物学的サンプルと接触させることによって、該生物学的サンプルから単離され、
該6種の捕捉核酸は、配列番号10を含む第1の種の捕捉核酸、配列番号11を含む第2の種の捕捉核酸、配列番号12を含む第3の種の捕捉核酸、配列番号13を含む第4の種の捕捉核酸、配列番号14を含む第5の種の捕捉核酸、および配列番号15を含む第6の種の捕捉核酸を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
(a)前記プライマーのうちの一方は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むか、または
(b)前記プライマーは、(a)のヌクレオチド配列と90%配列同一性を有し、そして
前記増幅された核酸の存在を、前記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記サンプルから前記固相磁気ビーズ支持体を分離することが、磁気的手段によって実施される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、3’末端または5’末端のいずれかに、長さが15ヌクレオチド〜25ヌクレオチドのホモポリマー鎖をさらに含み、該ホモポリマー鎖は、ポリA、ポリT、ポリG、ポリCおよびポリUからなる群より選択される、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記ホモポリマー鎖は、ポリA鎖である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記増幅する工程は、PCR、転写媒介性増幅(TMA)またはTaqMan(登録商標)を含む、方法。
- 請求項6に記載の方法であって、前記増幅する工程は、TMAを含む、方法。
- 請求項6に記載の方法であって、
検出可能な標識を含むプローブオリゴヌクレオチドを、前記増幅された配列を検出するために使用する工程
をさらに包含し、ここで、該プローブオリゴヌクレオチドは、長さが60ヌクレオチド以下であり、かつ該プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号3からなるヌクレオチド配列を含む、方法。 - 請求項8に記載の方法であって、前記プローブは、検出可能な標識を5’末端および3’末端に含む、方法。
- 請求項9に記載の方法であって、前記検出可能な標識は、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、テトラメチルローダミン(TAMRA)、および2’,4’,5’,7’−テトラクロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン(TET)からなる群より選択される蛍光標識である、方法。
- 生物学的サンプル中のA型肝炎ウイルス(HAV)を検出する方法であって、該方法は、
HAVを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程;
該HAVのゲノムの5’ UTRに由来する少なくとも2種のプライマーを使用して、該単離された核酸を増幅する工程であって、該プライマーの各々は、長さが20ヌクレオチド〜60ヌクレオチドであり、かつ該プライマーの各々は、それぞれ、該単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;および
該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程;
を包含し、
前記核酸は、
(a)結合している60ヌクレオチド以下の6種の捕捉核酸を含む固体支持体を、標的核酸鎖が該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で生物学的サンプルと接触させる工程;および
(b)該サンプルから該固体支持体を分離する工程;
を包含する方法によって、前記生物学的サンプルから単離され、
前記6種の捕捉核酸は、配列番号10を含む第1の種の捕捉核酸、配列番号11を含む第2の種の捕捉核酸、配列番号12を含む第3の種の捕捉核酸、配列番号13を含む第4の種の捕捉核酸、配列番号14を含む第5の種の捕捉核酸、および配列番号15を含む第6の種の捕捉核酸を含む、方法。 - 請求項11に記載の方法であって、
(a)前記プライマーのうちの一方は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むか、または
(b)前記プライマーは、(a)のヌクレオチド配列と90%配列同一性を有し、そして
前記増幅された核酸の存在を、前記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する、方法。 - 請求項11に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、3’末端または5’末端のいずれかに、長さが15ヌクレオチド〜25ヌクレオチドのホモポリマー鎖をさらに含み、該ホモポリマー鎖は、ポリA、ポリT、ポリG、ポリCおよびポリUからなる群より選択される、方法。
- 請求項13に記載の方法であって、前記ホモポリマー鎖は、ポリA鎖である、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記増幅する工程は、PCR、転写媒介性増幅(TMA)またはTaqMan(登録商標)を含む、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記増幅する工程は、TMAを含む、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、
検出可能な標識を含むプローブオリゴヌクレオチドを、前記増幅された配列を検出するために使用する工程
をさらに包含し、ここで、該プローブオリゴヌクレオチドは、長さが60ヌクレオチド以下であり、かつ該プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号3からなるヌクレオチド配列を含む、方法。 - 請求項17に記載の方法であって、前記プローブは、検出可能な標識を5’末端および3’末端に含む、方法。
- 請求項18に記載の方法であって、前記検出可能な標識は、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、テトラメチルローダミン(TAMRA)、および2’,4’,5’,7’−テトラクロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン(TET)からなる群より選択される蛍光標識である、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記固体支持体は、ビーズを含む、方法。
- 請求項20に記載の方法であって、前記ビーズは、磁気ビーズである、方法。
- 請求項21に記載の方法であって、前記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される、方法。
- 請求項1〜22のうちのいずれか1項に記載の方法であって、前記プライマーのうちの一方は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含む、方法。
- 生物学的サンプルにおけるA型肝炎ウイルス(HAV)感染を検出するための方法であって、該方法は、
(a)固相磁気ビーズ支持体を、60ヌクレオチド以下の6種の捕捉核酸と、該捕捉核酸が該固相磁気ビーズ支持体と結合する条件下で接触させる工程であって、該6種の捕捉核酸は、配列番号10を含む第1の種の捕捉核酸、配列番号11を含む第2の種の捕捉核酸、配列番号12を含む第3の種の捕捉核酸、配列番号13を含む第4の種の捕捉核酸、配列番号14を含む第5の種の捕捉核酸、および配列番号15を含む第6の種の捕捉核酸を含む、工程;
(b)(a)の固相磁気ビーズ支持体を、該生物学的サンプルと、HAV由来の標的核酸鎖が存在する場合には該標的核酸鎖が該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で接触させる工程;および
(c)該サンプルから(b)の固相磁気ビーズ支持体を分離する工程;
(d)配列番号1を含むセンスプライマーと配列番号2を含むアンチセンスプライマーとを使用して該捕捉核酸とハイブリダイズした核酸を増幅する工程であって、該アンチセンスプライマーおよび該センスプライマーは、それぞれ、該HAV由来の標的核酸鎖のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;ならびに
(e)該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程;
を包含し、
該(b)の接触させる工程、分離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される、方法。 - 生物学的サンプルにおけるA型肝炎ウイルス(HAV)感染を検出するためのキットであって、該キットは、
60ヌクレオチド以下の6種の捕捉核酸を含む固相磁気ビーズ支持体であって、該6種の捕捉核酸は、配列番号10を含む第1の種の捕捉核酸、配列番号11を含む第2の種の捕捉核酸、配列番号12を含む第3の種の捕捉核酸、配列番号13を含む第4の種の捕捉核酸、配列番号14を含む第5の種の捕捉核酸、および配列番号15を含む第6の種の捕捉核酸を含む、固相磁気ビーズ支持体;
少なくとも2種のプライマーであって、該プライマーの各々は、長さが60ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含み、もう一方のプライマーは、配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含む、プライマー;および
HAV感染を同定するための指示書
を備える、キット。 - 請求項25に記載のキットであって、ポリメラーゼと緩衝液とをさらに備える、キット。
- 請求項25に記載のキットであって、プローブオリゴヌクレオチドをさらに備え、該プローブオリゴヌクレオチドは、長さが60ヌクレオチド以下であり、かつ配列番号3からなるヌクレオチド配列を含む、キット。
- 請求項27に記載のキットであって、前記プローブは、検出可能な標識を5’末端および3’末端にさらに含む、キット。
- 請求項28に記載のキットであって、前記検出可能な標識は、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、テトラメチルローダミン(TAMRA)、および2’,4’,5’,7’−テトラクロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン(TET)からなる群より選択される蛍光標識である、キット。
- 請求項25〜29のうちのいずれか1項に記載のキットであって、前記プライマーのうちの一方は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなり、かつもう一方のプライマーは、配列番号2に示されるヌクレオチド配列からなる、キット。
- 生物学的サンプルにおけるA型肝炎ウイルス(HAV)感染を検出するための方法であって、該方法は、
(a)固体支持体を、60ヌクレオチド以下の6種の捕捉核酸と、該捕捉核酸が該固体支持体と結合する条件下で接触させる工程であって、該6種の捕捉核酸は、配列番号10を含む第1の種の捕捉核酸、配列番号11を含む第2の種の捕捉核酸、配列番号12を含む第3の種の捕捉核酸、配列番号13を含む第4の種の捕捉核酸、配列番号14を含む第5の種の捕捉核酸、および配列番号15を含む第6の種の捕捉核酸を含む、工程;
(b)(a)の固体支持体を、該生物学的サンプルおよび内部コントロール配列と、HAV由来の標的核酸鎖が存在する場合には該標的核酸鎖と該内部コントロール配列とが該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で接触させる工程であって、該内部コントロール配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、および配列番号15からなる群より選択される配列と相補的である配列Aと;配列番号1またはその相補体と少なくとも90%同一である配列Bと;配列番号2またはその相補体と少なくとも90%同一である配列Cと;HAV配列ではない配列Dと;を含む、工程;および
(c)該サンプルから(b)の固体支持体を分離する工程;
(d)配列番号1を含む60ヌクレオチド以下のセンスプライマーと配列番号2を含む60ヌクレオチド以下のアンチセンスプライマーとを使用して該捕捉核酸とハイブリダイズした核酸を増幅する工程であって、該アンチセンスプライマーおよび該センスプライマーは、それぞれ、該HAV由来の標的核酸鎖のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;
(e)増幅された核酸の存在を、該サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として、HAV特異的プローブを使用して検出する工程;ならびに
(f)該配列Dに対して特異的な内部コントロールプローブを使用して、増幅された内部コントロール配列の存在を検出する工程;
を包含する、方法。 - 請求項31に記載の方法であって、前記内部コントロール配列は、配列番号17のヌクレオチド配列からなる、方法。
- 請求項32に記載の方法であって、前記内部コントロールプローブは、配列番号18または配列番号19の配列からなる、方法。
- 請求項25に記載のキットであって、
内部コントロール配列
をさらに含み、該内部コントロール配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、および配列番号15からなる群より選択される配列と相補的である配列Aと;配列番号1またはその相補体と少なくとも90%同一である配列Bと;配列番号2またはその相補体と少なくとも90%同一である配列Cと;HAV配列ではない配列Dと;を含む、キット。 - 請求項34に記載のキットであって、前記内部コントロール配列は、配列番号17のヌクレオチド配列からなる、キット。
- 請求項35に記載のキットであって、
前記配列Dに対して特異的な内部コントロールプローブ
をさらに含む、キット。 - 請求項36に記載のキットであって、前記内部コントロールプローブは、配列番号18または配列番号19の配列からなる、キット。
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