CN114891785B - 同时检测猫多种病原体的引物池及pcr快速检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测猫多种病原体的引物池及PCR快速检测试剂盒，所述同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒包括：PCR反应液冻干粉、引物池冻干粉和缓冲液，其中所述引物池冻干粉包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:24所示的引物对和湮灭探针。本发明试剂盒还包括微阵列qPCR检测卡盒，所述微阵列qPCR检测卡盒中的每个子检测区分别固定有与对应的湮灭探针杂交的荧光核酸，每个子检测区仅固定某一种病原体的荧光核酸，如此来区分检测样本中的病原体。本发明针对此还进行了多重PCR来检测猫多种病原体做了引物的体系优化，并设计了全新的引物和探针池，可以达到在临床上灵敏、特异性地满足对猫多种病原体的快速检测。

Description

同时检测猫多种病原体的引物池及PCR快速检测试剂盒
技术领域
本发明属于病原体核酸检测技术领域，尤其涉及一种同时检测猫多种病原体的引物池及PCR快速检测试剂盒。
背景技术
支气管败血波氏杆菌(Bordetella Bronchiseptica)，又称为支气管炎博德特氏菌，是一种需氧革兰氏阴性菌，可引起多种哺乳动物呼吸道的隐性感染及急、慢性炎症，如猪、犬、猫、马、牛、兔、鼠等动物。临床症状包括打喷嚏、眼睛出现分泌物(黄绿色)、鼻腔出现分泌物(黄绿色)、咳嗽(不是很常见) 在猫中，10周龄以下的仔猫和老年猫发病率更高一些。
支原体是一种介于细菌、病毒的原核微生物，通过寄居在宿主细胞表面的受体上吸收营养，并释放有毒物质，从而损伤细胞和组织。猫支原体感染会引起猫传染性呼吸道疾病，但相对其他病毒发生率相对较低。主要症状是咳嗽、打喷嚏、结膜炎、呼吸困难和鼻子分泌脓性粘液等。猫支原体感染没有特殊的预防方法，因此猫一旦发病，需要及时治疗。
猫免疫缺陷病毒(FIV)是一种在世界范围内影响家养的家猫的慢病毒，并且是猫科动物AIDS的致病因子。FIV传播的主要方式是深度咬伤和抓伤，在此处受感染的猫的唾液进入其它猫的血流中。FIV也可从怀孕的母猫传播至它们的在子宫内的后代。FIV可以攻击猫的免疫系统，非常类似于人免疫缺陷病毒(HIV)可以攻击人类的免疫系统。猫可以相当好地耐受FIV感染，但是最终FIV感染可以导致免疫系统的减弱，由此受感染的猫最终由于受抑制的免疫系统功能而发生慢性感染。
猫杯状病毒(Feline Calicivirus，FCV)属于猫杯状病毒科，杯状病毒属的一员，是一种无包膜有球形衣壳(衣壳上有多个杯状凹陷)的单链RNA病毒，具有高度传染性，可引起中度、自限性、多发性的口腔问题及上呼吸道疾病，是猫传染性上呼吸道疾病最常见的致病原之一，患病猫可终身带毒。主要临床症状表现为上呼吸道症状，发热，鼻腔分泌物增多，结膜炎，精神沉郁、流涎、口腔溃疡等，与猫疱疹病毒1型引发的猫传染性鼻气管炎的症状类似，临床上很难区分。除此以外，猫杯状病毒的感染还能导致幼猫跛行综合征或烈性系统性猫杯状病毒病，后者通常具有致死性。
猫疱疹病毒1型(Feline herpesvirus type1，FHV1)是猫病毒性鼻气管炎的病原，属于疱疹病毒科中的α疱疹病毒亚科、水痘属，可引起猫科动物急性、高度接触性上呼吸道疾病。幼猫对该病毒的抵抗较弱，发病率达高，病死率约50％，是目前已知最重要的猫呼吸道疾病之一。
猫泛白细胞减少症又名猫瘟、猫传染性肠炎，是猫的一种急性高度接触性传染病，主要由猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus，FPV) 引起。FPV属于细小病毒科细小病毒属成员，该病毒进入机体后，可以在肾脏上存活一年以上，因此，会给猫科动物带来严重危害。临床表现多以突然发高热、顽固性呕吐、腹泻、脱水、循环障碍及白细胞急剧减少为主要特征。如果母猫在怀孕期感染FPV，会造成死胎、流产或致使初生小猫出现神经症状，有较大的危害性。
猫衣原体感染的疾病流行率高，是猫的七大常见传染病之一，容易导致猫慢性结膜炎。衣原体感染指的是一种细胞内革兰氏阴性菌，主要引起眼部感染及上呼吸道感染。从病原性质上来讲，其不仅限于感染眼部和呼吸道，还可能会成为全身感染的病原，不及时治疗可能会发生全身性衣原体感染。
猫冠状病毒(Feline Coronavirus，FCoV)：据统计，家庭饲养的猫有25％～ 40％为冠状病毒阳性，而在大型猫舍或是繁殖猫舍中，阳性率达到80％～ 100％。虽然感染后可能完全没有临床症状，但是可能会发生死亡率非常高的猫传染性腹膜炎，本病常发于四岁以下的年轻成猫，尤其常发于群聚饲养的猫群。目前，对猫传染性腹膜炎无有效的疫苗预防，也无有效的药物治疗。因此，对于FCoV的管理与控制，准确的诊断是至关重要的。
上述几种疾病在感染后产生的临床症状相似，而且容易产生混合感染，对临床诊断带来极大的干扰性，而且，目前单一性的猫病原体检测耗时长，不能实现对多种病原进行快速和准确的检测和鉴别。因此，有必要建立一种快速的可同步实现大量不同病原的早期诊断方法，以节约诊断时间，以便尽快采取有效的防控措施。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种同时检测猫多种病原体的引物池及PCR快速检测试剂盒，能够解决单一性的猫病原体检测耗时长的问题，通过一次PCR扩增的反应体系中可同时检测出支气管败血波氏杆菌(Bb)、支原体(ClaF)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猫杯状病毒(FCV)、猫疱疹病毒1型(FHV1)、猫泛白细胞减少症(FPV)、猫衣原体(CF)和猫冠状病毒(FCoV)8种猫病原体，且具有较强的特异性和较高的灵敏度。
基于微阵列的POCT多重PCR检测系统具有多重性高和样本结果全自动，全封闭，一体化等优点。本申请针对此类多重PCR来检测猫多种病原体做了引物的体系优化，并设计了全新的引物对和探针组成的引物池，可以达到在临床上灵敏、特异性地满足对这猫多种病原体的快速检测。
本发明的同时检测猫多种病原体的引物池包括如下引物对：
如SEQ ID NO:1所示的Bb-F正向引物，如SEQ ID NO:2所示的Bb-R 反向引物；
如SEQ ID NO:4所示的ClaF-F正向引物，如SEQ ID NO:5所示的ClaF-R 反向引物；
如SEQ ID NO:7所示的FIV-F正向引物，如SEQ ID NO:8所示的FIV-R 反向引物；
如SEQ ID NO:10所示的FCV-F正向引物，如SEQ ID NO:11所示的 FCV-R反向引物；
如SEQ ID NO:13所示的FHV1-F正向引物，如SEQ ID NO:14所示的 FHV1-R反向引物；
如SEQ ID NO:16所示的FCV-F正向引物，如SEQ ID NO:17所示的 FCV-R反向引物；
如SEQ ID NO:19所示的CF-F正向引物，如SEQ ID NO:20所示的CF-R 反向引物；
如SEQ ID NO:22所示的FCoV-F正向引物，如SEQ ID NO:23所示的 FCoV-R反向引物。
本发明的同时检测猫多种病原体的引物池还可以包括如下湮灭探针：
如SEQ ID NO:3所示的Bb-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:6所示的ClaF-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:9所示的FIV-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:12所示的FCV-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:15所示的FHV1-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:18所示的FCV-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:21所示的CF-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:24所示的FCoV-P湮灭探针。
具体引物对和湮灭探针如表1所示
表1引物和湮灭探针
Figure RE-GDA0003730235590000041
较佳地是，本发明所述同时检测猫多种病原体的引物池还可以包括更多的引物对和湮灭探针。
本发明还公开一种同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，包括： PCR反应液、引物池和缓冲液，其中所述引物池为本发明所述的引物池。
其中，PCR反应液可以为PCR反应液冻干粉，所述引物池可以为引物池冻干粉。
本发明所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒还可以具有 PCR质控品。
所述PCR质控品由阳性质控品和阴性质控品组成。所述阳性质控品为质粒或核酸模板标准品，所述阴性质控品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水。
所述质粒核酸模板DNA标准品的序列如SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26， SEQ IDNO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32所示。
表2质粒核酸模板DNA标准品的序列
Figure RE-GDA0003730235590000051
/>
Figure RE-GDA0003730235590000061
所述PCR反应液包括耐热DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、二价镁离子(如氯化镁或硫酸镁)和三磷酸脱氧核糖核苷酸。所述缓冲液为 pH＝8.0的Tris缓冲液。
所述PCR反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的PCR反应液：耐热DNA聚合酶的浓度为0.01～1单位/μL优选0.01～0.1 单位/μL、逆转录酶100-400U/μL优选100-150U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL 优选35-45U/μL、二价镁离子(如氯化镁或硫酸镁)的浓度为1～4mmol/L优选2.5～3.5mmol/L、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为10～500μmol/L优选 100～200μmol/L、以及各引物和各湮灭探针的浓度分别为10～500nmol/L优选 100～200nmol/L；最佳地是，耐热DNA聚合酶的浓度为0.05单位/μL、逆转录酶125U/μL、RNA酶抑制剂40U/μL、二价镁离子的浓度为3mmol/L、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为200μmol/L、以及各引物和各湮灭探针的分别浓度200nmol/L。
所述试剂盒还包括微阵列qPCR检测卡盒，所述微阵列qPCR检测卡盒中的每个子检测区分别固定有与对应的湮灭探针杂交的荧光核酸。
本发明的检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒于室温避光保存。
本发明的积极进步效果在于：本发明试剂盒还包括微阵列qPCR检测卡盒，所述微阵列qPCR检测卡盒中的每个子检测区分别固定有与对应的湮灭探针杂交的荧光核酸，每个子检测区仅固定某一种病原体的荧光核酸，如此来区分检测样本中的病原体。本发明针对此还进行了多重PCR来检测猫多种病原体做了引物的体系优化，并设计了全新的引物和探针池，可以达到在临床上灵敏、特异性地满足对猫多种病原体的快速检测。本发明的检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒在包括8对病原体特异性组合引物可以同时特异灵敏地检测8种猫多种病原体的靶标。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1为Bb临床阳性样本检测结果图；
图2为ClaF临床阳性样本检测结果图；
图3为FIV临床阳性样本检测结果图；
图4为FCV临床阳性样本检测结果图；
图5为FHV1临床阳性样本检测结果图；
图6为FPV临床阳性样本检测结果图；
图7为CF临床阳性样本检测结果图；
图8为FCoV临床阳性样本检测结果图；
图9为阴性质控品检测结果图。
具体实施方式
下面将以明确易懂的方式，结合图表对一种同时检测猫多种病原体PCR 快速检测试剂盒予以进一步说明。
实施例1灵敏度检测
样本采集：质粒或核酸模板标准品由第三方公司(生工公司，浓度＝8× 108病毒/毫升)提供，共8种标准品，序列如表2所示，分别置于病毒保存液(Copan鼻咽拭子采样盒)中。将自制的8种靶标的标准品8×108copy/mL 分别使用病毒保存液梯度稀释成1.5×105copy/mL、1.5×104copy/mL、 1.5×103copy/mL。
试剂盒灵敏度检测：取100μL上述稀释后的样本加入到猫多种病原体 PCR快速检测试剂盒(闪量微阵列-qPCR试剂卡盒，即含有CN2019107011550 所述的多重连接探针微阵列)加样口内(或者利用CN201810022723X表面探针定量PCR方法，或者CN2020102299920基于通用探针芯片的多重定量 PCR检测系统也都是可以的)。一次性卡盒内含有猫多种病原体PCR快速检测试剂盒内的试剂成分，具体成分浓度如下：
耐热DNA聚合酶的浓度为0.05单位/μL、逆转录酶125U/μL、RNA酶抑制剂40U/μL、二价镁离子的浓度为3mmol/L、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为200μmol/L、以及各引物和各湮灭探针的分别浓度200nmol/L；缓冲液为 pH＝8.0的Tris缓冲液。
各引物和湮灭探针分别为：
如SEQ ID NO:1所示的Bb-F正向引物，如SEQ ID NO:2所示的Bb-R 反向引物，以及如SEQ ID NO:3所示的Bb-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:4所示的ClaF-F正向引物，如SEQ ID NO:5所示的ClaF-R 反向引物，以及如SEQ ID NO:6所示的ClaF-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:7所示的FIV-F正向引物，如SEQ ID NO:8所示的FIV-R 反向引物，以及如SEQ ID NO:9所示的FIV-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:10所示的FCV-F正向引物，如SEQ ID NO:11所示的 FCV-R反向引物，以及如SEQ ID NO:12所示的FCV-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:13所示的FHV1-F正向引物，如SEQ ID NO:14所示的 FHV1-R反向引物，以及如SEQ ID NO:15所示的FHV1-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:16所示的FCV-F正向引物，如SEQ ID NO:17所示的 FCV-R反向引物，以及如SEQ ID NO:18所示的FCV-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:19所示的CF-F正向引物，如SEQ ID NO:20所示的CF-R 反向引物，以及如SEQ ID NO:21所示的CF-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:22所示的FCoV-F正向引物，如SEQ ID NO:23所示的 FCoV-R反向引物，以及如SEQ ID NO:24所示的FCoV-P湮灭探针。
根据PCR产品使用说明书(优思达卡盒)，选择预设快速自动检测程序 45个循环。PCR荧光检测设备自动检测到该检测卡盒型号后，自动运行所选择的程序，全自动地进行扩增检测。PCR扩增检测的变性温度为92度30秒，复性65度45秒，扩增是72度45秒。系统自动测量Ct值。若Ct≤38，该样本为阳性；若38＜Ct＜40，灵敏度边缘样本，重新采样检测；若Ct≥40，该样本为阴性。
同时采用灭菌后焦碳酸二乙酯处理水作为阴性质控品，作为对照。
检测结果如表3所示，通过该实验可以观察到扩增体系能稳定地检测到较低浓度的病毒样本，即便样本浓度低到1.5×103copy/mL也依然能够检测到。
表3 8种猫病原体标准品使用本试剂盒检测灵敏度结果
Figure RE-GDA0003730235590000091
实施例2：特异性检测
按照实施例1中描述的猫多种病原体PCR快速检测试剂盒检测方法对 Bb、FCV、ClaF、CF、FHV1、FIV、FCoV、FPV、猫冠状病毒、弓形虫、滴虫临床阳性样本(以上样本均使用对比试剂盒进行验证过)和阴性质控品(灭菌后焦碳酸二乙酯处理水)进行检测并分析结果。
实验结果发现：阴阳性对照品符合要求，因此说明实验有效。Bb、FCV、 ClaF、CF、FHV1、FIV、FCoV、FPV均在相应的靶标上面有检出，含有其它病毒的样本和阴性质控品中均无扩增，说明该检测试剂盒及方法具有较好的特异性(结果如表4所示和图1～9所示)。
表4特异性反应检测列表
Figure RE-GDA0003730235590000092
Figure RE-GDA0003730235590000101
/>
序列表
<110> 深圳闪量科技有限公司
<120> 同时检测猫多种病原体的引物池及PCR快速检测试剂盒
<130> P220037
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatcgaatac gcctttaggt c 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcacgctca aggactgc 18
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccaggctcg aagtacgctt tcacac 26
<210> 4
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<212> DNA
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ttcagaatac ggatttgatg gag 23
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<212> DNA
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tgaggctccc acagatacaa 20
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<212> DNA
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aggtctcgga atccgggccg agaact 26
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<211> 18
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atgaactacc cgccaatc 18
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tcatatgcgg ctctgatg 18
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aagagcccag gccaaatcaa acac 24
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cctatatcac cgcccactat c 21
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<212> DNA
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tatgattagg gtcacgtcgg 20
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctggaatgta aaagaaggta tggtgcgg 28
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggttgcaa agacttagag 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tccggagtca gaggagtt 18
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aagcggcaag caatcctcag agtcaa 26
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgtagggaat ccagctgaac 20
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acaccaagta gcacaaggat 20
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caccttccca catagtgcca tcgattaa 28
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctatgtttt cgtgcctgaa t 21
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caggtttaag atcacttatt ccgtt 25
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atcgtaagga tcactacgtc attggtgtt 29
<210> 25
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgaaggcctg ggcgttctgg gcggcggcgt ccacgcccat ggggatcttg gtgccgttct 60
ggttggagat gcggatttgc acgccctgcg cttcgcttgc agcgatgatc gcattttggg 120
tggtggcggg gttgttgttg taggcgatcg aatacgcctt taggtcgccg gtagcgtagt 180
cggtggtcgg cccaggctcg aagtacgctt tcacaccatt gttcagggac gaggggcagt 240
ccttgagcgt gatcaggaag ggcgtacggc cagcttcgtc tccatccttg gccagcgcgc 300
tcttggatat cttgggcaat tgcaccacct tggtgtgcgt ggggccggcc gggtcctcga 360
tgacgcaggt ggtgtcggtg atggtgccgg tgatgacgat ggtgccgtcg tcggcgtgcg 420
ccgcggacgc aatggccgcc agagcggccc gcaagcacag gcgcagggcg cgttggaaag 480
ggacttgcat gggtaacacg 500
<210> 26
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gttgctgcaa cagatggacc aatgcctcaa acacgtgaac acattctttt atctagacaa 60
gttggtgttc ctcgtatcgt tgtcttctta aacaaatgtg atatgttaga aggtgaagaa 120
gagatgattg aacttgttga attagaagtt cgttcgcttc tttcagaata cggatttgat 180
ggagataatg ctccaattat tcgtggatct gctaaattag ctcttgatgg tgttcctcaa 240
tgagaagaaa aagttatgga attaatggat gcagttgata catacattga aactccagaa 300
aaagattttg aaaaaccatt cttaatggct gttgaagacg ttttcacaat tacaggacgt 360
ggaactgttg ctacaggacg tgttgaacgt ggaacattaa gattaaatga tgaagttgaa 420
atagttggat tacatgctac taaaaaaaca gttgttacag gaattgaaat gttccgtaaa 480
aaccttaaag aagcacttgc 500
<210> 27
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gactcatagt taaagcgcta gcagctgcct aaccgcaaaa ccacatccta tggaaagctt 60
gctaatgacg tataagttgt tccattgtaa gagtatataa ccagtgcttt gtgaaacttc 120
gaggagtctc tttgttgagg acttttgagt tctcccttga ggctcccaca gatacaataa 180
atatttgaga ttgaaccctg tcgagtatct gtgtaatctt ttttacctgt gaggtctcgg 240
aatccgggcc gagaacttcg cagttggcgc ccgaacaggg acttgattga gagtgattga 300
ggaagtgaag ctagagcaat agaaagctgt taagcagaac tcctgctgac ctaaataggg 360
aagcagtagc agacgctgct aacagtgagt atctctagtg aagcggactc gagctcataa 420
tcaagtcatt gtttaaaggc ccagataaat tacatctggt gactcttcgc ggaccttcaa 480
gccaggagat tcgccgaggg 500
<210> 28
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
attcaatggg aaaagatttg tggtctctcg ctgcaatgag gcgtctctgt ctgcattgga 60
gggcaactgt gtccaaactg cgctgggtgt gtgcatgtcc aataaggatc ttgttcattt 120
gtgtcacttc ataaggggaa agattgtcaa tgacagtgtc aggttggatg aactacccgc 180
caatcaacat gtggtaaccg ttaactcggt gtttgatttg gcctgggctc ttcgtcgaca 240
cctatcactg tcgggacagt ttcaggccat cagagccgca tatgatgtgc ttactgtccc 300
cgacaagatt cctgcaatgt tgcggcattg gatggatgaa acttcctttt cggatgagca 360
tgttgtaacc cagtttgtaa cccctggtgg catagtgatc cttgaatcat gtgttggtgc 420
tcgcatctgg gctattggtc acaatgtgat cagagctgga ggcatcaccg ccacgccaac 480
tgggggttgt gtaagattga 500
<210> 29
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcgaagtacc tggtcagagc ggatgaaaat cgaccgggat atacttacta cttcccagaa 60
ccaatgctat actggcgtag tctctttgaa actgatgttg tcggtggtat ctatgccgtc 120
caggaccgga aacgacgtgg tgaattatca gctgaagatg ctgcctatat caccgcccac 180
tatcaagcaa gatttgccgc accatacctt cttttacatt ccagactatc cacaataaca 240
ggatatcaga aagttgtatg tgaggaacac cccgacgtga ccctaatcat agatagacac 300
cctctcgcct ctctggtctg tttcccactc gcaagatatt ttgtgggtga tatgactctt 360
gggtctgtac ttagtctaat ggcaacactt ccacgagaac ctcctggtgg aaatctagtt 420
gtaacaacct tgaatatcga ggaacatttg aagcgtctca ggggacgctc aagaaccgga 480
gaacagatag acatgaagct 500
<210> 30
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gaagaaagac ctgaacatac acaaccaata agagacagaa tgttgaacat taagttagta 60
tgtaagcttc caggagactt tggtttggtt gataaagaag aatggccttt gatatgtgca 120
tggttagtta aacatggtta tgaatcaacc atggctaact atacacatca ttggggaaaa 180
gtaccagaat gggatgaaaa ctgggcggag cctaaaatac aagaaggtat aaattcacca 240
ggttgcaaag acttagagac acaagcggca aacaatcctc agagtcaaga ccaagttcta 300
actcctctga ctccggacgt agtggacctt gcactggaac cgtggagtac tccagatacg 360
cctattgcag aaactgcaaa tcaacaatca aaccaacttg gcgttactca caaagacgtg 420
caagcgagtc cgacgtggtc cgaaatagag gcagacctga gagccatctt tacttctgaa 480
caattggaag aagattttcg 500
<210> 31
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atgaaaaaac tcttaaaatc ggcattatta tttgccgctg cgggttccgc tctctcctta 60
caagccttgc ctgtagggaa tccagctgaa ccaagtttat taatcgatgg cactatgtgg 120
gaaggtgctt caggagatcc ttgtgatcct tgtgctactt ggtgtgatgc tatcagcatc 180
cgtgcaggat tctacggaga ttatgttttc gatcgtatat taaaagttga tgttaataaa 240
accatcagcg gaatggctgc ggctccaaca gcagcttctg gaactgcaag caacaccact 300
gtcgctgccg acagatcaaa ttttgcctac ggcaaacatc ttcaagatgc cgaatggtgc 360
accaatgctg cttacttagc attaaatatt tgggatcgtt ttgatgtttt ctgcacgcta 420
ggagcgtcta atggttactt caaagcaagt tctgatgcat ttaaccttgt cggattgatt 480
ggtcttgcag gaactgattt 500
<210> 32
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cggttccgcc cgtcgtagtt gggtagaccg ggttccgtcc tgtgatctcc ctcgccggcc 60
gccaggagaa tgagttccaa acaatttaag atcctcgtta atgaggacta ccaagtcaac 120
gttcctagcc ttcctttccg tgacgcactg caggaaatta agtactgcta ccgtaacggt 180
tttgatggct atgtcttcgt gcctgaatac cgtcgtgacc tagttgattg caatcgtaag 240
gatcactacg tcattggtgt tttgggtaac ggaataagtg atcttaaacc tgttctcctt 300
accgaacctt ccgtcatgtt gcagggtttc attgttagag ccaactgcaa tggcgttctt 360
gaggactttg accttaaatt cgcccgtact ggaaacggcg ccatatatgt ggaccaatac 420
atgtgtggtg ctgatggaaa gccagttatt gaaggtgagt ttaaggatta tttcggtgat 480
gaggacgtta tcatctatga 500

Claims (13)

1.一种同时检测猫多种病原体的引物池，其特征在于包括如下引物对：
如SEQ ID NO:1所示的Bb-F正向引物，如SEQ ID NO:2所示的Bb-R反向引物，如SEQ IDNO:3所示的Bb-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:4所示的ClaF-F正向引物，如SEQ ID NO:5所示的ClaF-R反向引物，如SEQID NO:6所示的ClaF-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:7所示的FIV-F正向引物，如SEQ ID NO:8所示的FIV-R反向引物，如SEQID NO:9所示的FIV-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:10所示的FCV-F正向引物，如SEQ ID NO:11所示的FCV-R反向引物，如SEQID NO:12所示的FCV-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:13所示的FHV1-F正向引物，如SEQ ID NO:14所示的FHV1-R反向引物，如SEQ ID NO:15所示的FHV1-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:16所示的FCV-F正向引物，如SEQ ID NO:17所示的FCV-R反向引物，如SEQID NO:18所示的FCV-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:19所示的CF-F正向引物，如SEQ ID NO:20所示的CF-R反向引物，如SEQID NO:21所示的CF-P湮灭探针；
如SEQ ID NO:22所示的FCoV-F正向引物，如SEQ ID NO:23所示的FCoV-R反向引物，如SEQ ID NO:24所示的FCoV-P湮灭探针。
2.一种同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，包括：PCR反应液、引物池和缓冲液，其特征在于所述引物池为权利要求1所述的引物池。
3.如权利要求2所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于，PCR反应液为PCR反应液冻干粉，所述引物池为引物池冻干粉。
4.如权利要求2所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒还具有PCR质控品。
5.如权利要求4所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，，其特征在于，所述PCR质控品由阳性质控品和阴性质控品组成。
6.如权利要求5所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为质粒或核酸模板标准品，所述阴性质控品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水。
7.如权利要求6所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述质粒核酸模板DNA标准品的序列分别如SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32所示。
8.如权利要求3所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液冻干粉包括耐热DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、二价镁离子和三磷酸脱氧核糖核苷酸。
9.如权利要求2所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为pH＝8.0的Tris缓冲液。
10.如权利要求8所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的PCR反应液：耐热DNA聚合酶的浓度为0.01～1单位/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL、二价镁离子的浓度为1～4mmol/L、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为10～500μmol/L、以及各引物和各湮灭探针的浓度分别为10～500nmol/L。
11.如权利要求10所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的PCR反应液：耐热DNA聚合酶的浓度为0.01～0.1单位/μL、逆转录酶100-150U/μL、RNA酶抑制剂35-45U/μL、二价镁离子的浓度为2.5～3.5mmol/L、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为100～200μmol/L、以及各引物和各湮灭探针的浓度分别为100～200nmol/L。
12.如权利要求10所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的PCR反应液：耐热DNA聚合酶的浓度为0.05单位/μL、逆转录酶125U/μL、RNA酶抑制剂40U/μL、二价镁离子的浓度为3mmol/L、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为200μmol/L、以及各引物和各湮灭探针的分别浓度200nmol/L。
13.如权利要求2所述的同时检测猫多种病原体PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括微阵列qPCR检测卡盒，所述微阵列qPCR检测卡盒中的每个子检测区分别固定有与对应的湮灭探针杂交的荧光核酸。
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