KR20080047355A - 표적 핵산 서열 분석 방법 및 키트 - Google Patents

표적 핵산 서열 분석 방법 및 키트 Download PDF

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바이오칩 이노베이션즈 피티와이 리미티드
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Abstract

본 발명은 탐지가능한 신호를 생산하기 위해 핵산 처리 반응에서 작용하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 방법을 개시한다. 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용될 수 있는 키트를 개시한다.
표적 핵산 서열, 올리고뉴클레오티드

Description

표적 핵산 서열 분석 방법 및 키트{A method and kit for analyzing a target nucleic acid sequence}
본 발명은 일반적으로 표적 핵산 서열을 분석하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 탐지가능한 신호를 생산하기 위해 핵산 처리 반응과 협력하는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 표적 핵산 서열의 존재를 측정하기 위한 분석 방법에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 표적 핵산 서열의 정량화를 촉진한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법의 실시에 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다.
핵산 분자들은 통상적으로 프로브, 프라이머, 또는 올리고뉴클레오티드로 불리는 다른 짧은 핵산 분자에 대한 혼성화를 탐지하는 시스템을 사용하여 분석될 수 있다. 이것은 핵산 분자들이 이들의 서열, 하부서열의 일부에 의해 구별될 수 있고 핵산 분자들은 상보적인 올리고뉴클레오티드와 같은 서열들과 특이적으로 결합할 수 있기 때문에 가능하다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 효과적인 핵산 분석 시스템들 중 하나이다. 올리고뉴클레오티드와 상보적인 표적 핵산 서열 사이의 혼성화는 DNA 중합효소가 중합을 개시하는 위치를 형성하고 그곳으로부터 표적 핵산에 상보적인 새로운 DNA 가닥을 생산하기 위해 표적 핵산 주형을 복제하는 위치를 형성한다. DNA는 새로운 가닥뿐만 아니라 원래 가닥의 연속적인 복제에 의해 증폭된다. PCR 프라이머 올리고뉴클레오티드는 증폭된 생성물 DNA 속에 포함되고 증폭된 생성물 DNA는 동정된다. 통상적으로, PCR 생성물들은 겔 전기영동으로 이들을 분리하고 화학물질로 염색함으로써 눈으로 탐지된다. 선택적으로, 겔 전기영동 없이, PCR 생성물들은 염료를 이중 가닥 PCR 생성물들에 차별적으로 결합함으로써 정량적 또는 반-정량적으로 탐지될 수 있다.
또한 리가아제 연쇄반응, 올리고뉴클레오티드 리게이션 어세이(OLA), 리게이션 의존성 PCR, 가닥 치환 증폭, 브랜치드 DNA 신호 증폭, 롤링 서클 증폭, 전사 매개 증폭, 핵산 서열-기초 증폭 및 혼성화 신호 증폭을 포함하는 여러 다른 핵산 분석 방법들이 존재한다.
그러나, 여러 핵산 분석 방법이 존재함에도 불구하고, 둘 이상의 다른 핵산 표적들을 동시에 구별하거나 정량화할 수 있는 방법들이 개발되지 못했다. 일반적으로, 동시에 여러 별개의 표적 핵산 표적을 분석하기 위해 설계된 방법들은 신뢰할 수 없고 예민하지 않다. 그 결과, 예를 들어, 복합된, 다중 핵산 표적들을 동시에 분석할 수 있는 매우 적은 핵산 방법들은 현재의 의학 진단, 수의사 진단 또는 농업 진단에 일상적으로 사용된다(Yang et al., 2004, Lancet. Infectious Diseases 4:337-48; Broude et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:206-211; Chamberlain et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16:11141-11156; Edwards et al., 1994, PCR Methods Appl. 3: S65-S75; Hacia et al., 1998, Genome Res. 8:1245-1258; Li et al., 1996; Nucelic Acids Res. 24; 548 - 539; Stuven et al., 1996, Pharmacogenetics 6: 417 - 421; van Orsouw et al., 1998, Genomics 52: 27 - 36).
따라서, 단일 표적 핵산 서열을 분석할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 예를 들어, 다중 분석과 같은 다중 표적 핵산 서열을 분석할 수 있는 민감한 방법을 개발하는 것이 매우 바람직할 것이다.
한 태양에서, 본 발명은 검사 샘플에서 표적 핵산 서열을 분석하기 위한 방법들을 제공한다. 이런 방법들은 일반적으로 다음 단계를 포함한다:
- 반응 용기에서 다음을 혼합하는 단계:
(1) 표적 핵산 서열과 혼성화하지 않는 캡쳐 올리고뉴클레오티드(capture oligonucleotide)(예를 들어, 고정되거나 용액에서 자유로움)
(2) 탐지가능한 신호를 제공하고 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 시그널링 올리고뉴클레오티드;
(3) (a) 표적 핵산 서열의 서열에 혼성화하는 제 1 표적 서열; 및
(b) (i) 캡쳐 올리고뉴클레오티드; 또는
(ii) 시그널링 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 서열에 혼성화하는 캡쳐가능한 서열을 포함하는 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드
(4) (a) 제 1 표적 서열이 혼성화하는 하부서열과 다른 표적 핵산 서열의 다른 서열; 또는
(b) 표적 핵산 서열의 상보적 가닥의 하부서열 또는
(c) 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 서열에 혼성화하는 제 2 표적 서열을 포함하는 적어도 하나의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드(cooperating olignucleotide); 및
(5) 핵산을 포함하는 검사 샘플;
- 표적 핵산 서열이 검사 샘플에 존재하는 경우 반응 생성물을 형성하기 위해 반응 용기의 내용물을 핵산 처리 반응에 첨가하는 단계, 이렇게 형성된 반응 생성물은 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 가닥뿐만 아니라 적어도 하나의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 2 가닥 또는 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열의 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화를 막아서, 시그널링 올리고뉴클레오티드가 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하게 하는 이의 연장 생성물 포함한다; 및
- 검사 샘플에 표적 핵산 서열의 존재 또는 양을 나타내는 시그널링 올리고뉴클레오티드로부터 탐지가능한 신호를 탐지하는 단계.
일부 실시예에서, 핵산 처리 반응은 중합-의존성 핵산 처리 반응이며, 이의 예시적 예는 다음을 포함한다:
a) 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 키메릭 올리고뉴클레오티드의 표적 서열의 표적 핵산 서열에 대한 혼성화하는 단계(상기 표적 핵산 서열은 표적 핵산 서열의 비혼성화 부분을 한정하기 위해 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오티드를 넘어 3' 내지 5' 방향으로 연장된다);
b) 제 1 연장 생성물을 포함하는 제 1 듀플렉스(duplex)를 형성하기 위해 주형으로서 표적 핵산 서열의 비혼성 부분을 사용하는 중합제 및 뉴클레오티드 전구체의 존재하에서 제 1 혼성의 키메릭 올리고뉴클레오티드의 연장 단계;
c) 제 1 연장 생성물로부터 표적 핵산 서열을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계;
d) 제 2 하이브리드를 형성하기 위해 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 제 1 연장 생성물과 혼성화하는 단계(상기 제 1 연장 생성물은 제 1 연장 생성물의 비혼성 부분을 한정하기 위해 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 3'말단 뉴클레오티드를 넘어 3' 내지 5' 방향으로 연장된다); 및
e) 제 1 연장 생성물에 상보적인 제 1 연장 생성물과 제 2 연장 생성물을 포함하는 반응 생성물을 형성하기 위해서, 주형으로 제 1 연장 생성물을 사용하는 중합제와 뉴클레오티드 전구체의 존재하에서 제 2 하이브리드의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 연장하는 단계.
적절하게는, 단계 a) 내지 e)는 1회 이상, 일반적으로 약 1 내지 약 100회, 주로 약 10 내지 약 50회 및 더욱 주로 약 20 내지 약 40회 반복된다. 일부 실시예에서, 중합제는 프라이머 의존성 DNA 중합효소(선택적으로 열 안정성임)이고, 이의 예시적 예들은 Pyrococcus furiosis(Pfu)DNA 중합효소, Pyrococcus sp. GB-D(Psp)DNA 중합효소, Pyrococcus woesei(Pwo) DNA 중합효소, Thermus aquaticus(Taq) DNA 중합효소, Thermus brocianus(Tbr) DNA 중합효소, Thermus flavus(Tfl) DNA 중합효소, Thermococcus litoralis(Tli 또는 Vent) DNA 중합효소, Thermotoga maritima(Tma) DNA 중합효소 및 Thermus thermophilus(Tth) DNA 중합효소 및 이의 유도체를 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 b)의 중합제는 조류 골수아구증 바이러스(AMV), 치류 백혈병 바이러스(MMLV) 및 Thermus thermophilus(Tth) DNA 중합효소 및 이의 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는 프라이머 의존성 역전사효소이다.
일부 실시예에서, 단계 e)의 중합제는 DNA 중합효소이고, 적절하게 열 안정성이다.
다른 실시예에서, 중합-의존성 핵산 처리 반응은 다음을 포함한다:
i) 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 순환가능한 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이다);
ii) 표적 핵산 서열의 제 2 하부서열에 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 2 하부서열은 제 2 하이브리드를 형성하기 위해 제 1 하부서열에 인접하게 위치한다),
iii) 표적 핵산 서열의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스 및 순환하는 형태로 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 1 및 제 2 표적 서열을 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드 및 결찰제(ligation agent)의 존재하에서 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 1 및 제 2 표적 서열을 결찰하는 단계,
iv) 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계,
(v) 제 3 하이브리드를 형성하기 위해 결찰 생성물로 키메릭 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계,
(vi) 제 1 연장 생성물을 형성하기 위해, 주형으로서 결찰 생성물을 사용하여 중합제 및 뉴클레오티드 전구체의 존재하에서 제 3 하이브리드의 키메릭 올리고뉴클레오티드를 연장하는 단계,
(vii) 제 4 하이브리드를 형성하기 위해 제 1 연장 생성물에 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계, 및
(viii) 제 1 연장 생성물 및 제 1 연장 생성물에 상보적인 제 2 연장 생성물을 포함하는 반응 생성물을 형성하기 위해서, 주형으로서 제 1 연장 생성물을 사용하여 중합제(예를 들어, φ29 DNA 중합효소를 포함하나 이에 한정되지 않는 프라이머 의존성 DNA 중합효소) 및 뉴클레오티드 전구체의 존재하에서 제 4 하이브리드의 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 연장하는 단계.
다른 실시예에서, 핵산 처리 반응은 리가아제-의존성 핵산 처리 반응이며, 이의 예시적 예는 다음을 포함한다:
1. 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 혼성화하는 단계(키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이다);
2. 표적 핵산 서열의 제 2 하부서열에 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 2 하부서열은 제 2 하이브리드를 형성하기 위해 제 1 하부서열에 인접하게 위치된다);
3. 표적 핵산의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스 및 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 모두 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드 및 결찰제의 존재하에서 키메릭 올리고뉴클레오티드를 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드로 결찰하는 단계;
4. 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계; 및
5. 반응 생성물을 형성하기 위해 결찰 생성물의 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 1 코퍼레이팅 서열 부분에 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계.
다른 예시적 예에서, 리가아제-의존성 핵산 처리 반응은 다음을 포함한다:
a. 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이고 캡쳐가능한 서열의 5' 뉴클레오티드는 비-결찰성이다);
b. 제 2 하이브리드를 형성하기 위해, 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 인접한 제 2 하부서열에 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열을 혼성화하는 단계(캡쳐가능한 서열의 5' 뉴클레오티드는 비-결찰성이다);
c. 표적 핵산의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스 및 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드를 모두 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드 및 결찰제의 존재하에서 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드를 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드로 결찰하는 단계;
d. 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계; 및
e. 반응 생성물을 형성하기 위해 결찰 생성물의 제 1 및 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드에 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계.
또 다른 예시적 예에서, 리가아제-의존성 핵산 처리 반응은 다음을 포함한다:
i. 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 올리고뉴클레오티드 및 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적인 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 캡쳐가능한 서열을 포함한다);
ii. 제 2 하이브리드를 형성하기 위해, 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 인접한 제 2 하부서열에 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드는 시그널링 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 캡쳐가능한 서열을 포함한다);
iii. 표적 핵산의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스 및 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드를 모두 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드 및 결찰제의 존재하에서 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드를 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드로 결찰하는 단계; 및
iv. 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계.
일부 실시예에서, 단계 1 내지 5 또는 a 내지 e 또는 i 내지 iv는 1회 이상, 일반적으로 약 1 내지 약 100회, 주로 약 10 내지 약 50회 및 더욱 주로 약 20 내지 약 40회 반복된다.
적절하게는, 결찰제는 T4 DNA 리가아제, Escherichia coli DNA 리가아제 및 Thermus filiformis(Tfi) DNA 리가아제 및 이의 유도체로부터 선택된다.
다른 태양에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키트를 포함한다:
(1) 표적 핵산 서열에 혼성화하지 않는 캡쳐 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 고정되거나 용액에서 자유로움);
(2) 탐지가능한 신호를 제공하고 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성하는 시그널링 올리고뉴클레오티드;
(3) 다음을 포함하는 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드:
(a) 표적 핵산 서열의 하부서열에 혼성화하는 제 1 표적 서열; 및
(b) 다음으로부터 선택되는 서열에 혼성화하는 캡쳐가능한 서열:
(i) 캡쳐 올리고뉴클레오티드; 또는
(ii) 시그널링 올리고뉴클레오티드
(4) 다음으로부터 선택된 서열에 혼성화하는 제 2 표적 서열을 포함하는 적어도 하나의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드:
(a) 제 1 표적 서열이 혼성화하는 하부서열과 다른 표적 핵산 서열의 서열; 또는
(b) 표적 핵산 서열의 상보적 가닥의 하부서열, 또는
(c) 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드.
일부 실시예에서, 상기 키트는 (5) 하나 이상의 중합제 및/또는 결찰제를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 하나 이상의 성분 (1) 내지 (5)(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)는 동결건조된 형태이다. 적절하게는, 임의의 둘 이상의 성분 (1) 내지 (5)(예를 들어, 2, 3, 4 또는 5)는 혼합물의 형태이다. 선택적으로, 이들은 개별 용기에 있을 수 있다.
일부 실시예에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 고체 표면상에(예를 들어, 미세입자 또는 비드, 나노와이어, 진단 스트립 또는 반응 용기의 표면)고정된다.
일부 실시예에서, 둘 이상의 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 올리고뉴클레오티드 어레이의 형태로 고정된다.
서열들의 간략한 설명
SEQ ID NO 서열
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC-3' 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC AG(C/T) TCI TC(C/T) TT(C/T) AG(C/T) TT(C/T) GG-3' 5'-AGT AT(T/C)CTC AT(T/C)CC(T/A)GAN CC-3' 5'-GAT TTG TAT TGA TTG AGA TTA AAG-3' 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC TTG CAG CIG CIC CAC CIG-3' 5'-AIC AIA GIA GIA TGC AGT-3' 5'-AIC AIA GIA GIA TGC AGT TCA TAA GAC TCG TCA TGT CTC AGC AGC TTC TAA CGG TCA CTA ATA CGA CTC ACT ATA GG TTG CAG CIG CIC CAC CIG-3' 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC GCT GAG ACA TGA CGA GTC-3' 5'-AAT ACG ACT CAC TAT AGG-3' 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC GAI GTI AGI GAI ACI CAI GG-3'
1. 정의
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 동일한 의미를 가진다. 비록 본 발명에 기술된 것들과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기술되다. 본 발명을 위해서, 다음 용어들을 정의한다.
"하나"는 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 의미한다. 예로서, "하나의 인자"는 하나 또는 하나 이상의 인자를 의미한다.
"약"은 기준 양, 수준, 값, 주기, 퍼센트, 치수, 크기, 분량, 중량 또는 길이의 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도 변하는 기준 양, 수준, 값, 주기, 퍼센트, 치수, 크기, 분량, 중량 또는 길이를 의미한다.
"증폭" 또는 "핵산 증폭" 또는 "증폭 반응"의 용어는 특정 표적 핵산 서열의 많은 폴리뉴클레오티드 복제물을 생산하는 생화학 반응을 의미한다. 만일 표적 핵산 서열이 단일 가닥이면 상보적 서열들은 상기 반응에서 생산될 수 있다. 일부 실시예에서, 반응은 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 헬라카제-의존성 증폭(HDA), 전사 매개 증폭(TMA), 가닥 치환 증폭(SDA), 핵산 서열-기초 증폭(NASBA), 롤링 서클 증폭(RCA) 및 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)과 같은 핵산 서열을 보제하는 중합효소를 사용하는 유사 반응이다. 올리고뉴클레오티드를 표적 핵산 서열의 단일 가닥 형태에 혼성화하여 형성된 이중 가닥 영역은 반응을 준비(시작)하기 위해 필요하다. 다른 실시예에서, "증폭" 또는 "핵산 증폭" 또는 "증폭 반응"이란 용어는 리가아제연쇄반응(LCR)과 같은 두 개의 올리고뉴클레오티드 또는 두 개의 올리고뉴클레오티드 하부서열을 공유 결합하는 리가아제 또는 유사 효소를 사용하는 생화학 반응을 의미한다. 리가아제 효소들은 표적 핵산 서열에서 인접 위치에서 혼성화할 때 두 개의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 하부 서열을 결찰한다. 선택적으로, 만일 두 개의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 하부서열은 하나 이상의 핵산 잔기가 분리되는 위치에서 혼성화될 때, 즉, 올리고뉴클레오티드들이 인접하지 않을 때, 이중 가닥 영역들 사이의 단일 가닥 영역은 중합효소를 사용하여 이중 가닥 영역으로 변환되고, 그런 후에 리가아제 효소는 인접 올리고뉴클레오티드들을 연결하여 연속된 이중 가닥 영역을 형성한다.
"캡쳐가능한 서열"이란 용어는 다른 핵산 서열과 혼성화할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 일부 실시예에서, 캡쳐가능한 서열은 지지체(예를 들어, 고체 표면)에 고정되거나 용액에서 자유로운 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화한다.
"캡쳐 올리고뉴클레오티드 어레이"라는 용어는 고체 표면상의 뚜렷히 알려진 위치에서 고정된 복수의 캡쳐 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 반응 용기 또는 진단 스트립의 표면에 관해서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 2차원 공간으로 어드레스된 어레이, 예를 들어, 2 x 2 어레이에 배열될 수 있다. 선택적으로, 캡쳐 올리고뉴클레오티드들은 2차원 평면 시트가 3차원 관상 형태 속으로 회전하는 관상 어레이에 배열될 수 있다. 다른 실시예에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드들은 임의의 편리한 형태의 2차- 또는 3차원 반응 용기의 내부 또는 외부 표면에 배열된다. 핵산 어레이들은 당업계에 공지되어 있고, 여러 방식으로 분류될 수 있다; 정렬된 어레이(예를 들어, 구별된 위치에서 화학물질을 분해하는 능력) 및 무작위 어레이들이 포함된다. 정렬된 어레이들은 포토리소그래피 기술(어피메트릭스 진칩TM), 스포팅 기술(신테니 앤 아더스), 인쇄 기술(휴렛패커드 및 레세타), 3차원 "겔 패드" 어레이 등을 사용하여 만든 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 액체 어레이, 예를 들어, 유세포 분석기와 같은 3차원 어레이 방법이 사용될 수 있다. 유세포 분서기가 사용될 때, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 미세구와 같은 지지체에 적절하게 고정된다.
일부 실시예에서, 정렬된 어레이는 공지된 위치에 핵산을 함유하는 어레이를 포함한다. 즉, 개시된 대로 캡쳐가능한 서열 또는 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 기판 상에 공지된 위치에서 고정된다. "공지된" 위치는 공지되거나 공지되어진 위치를 의미한다.
"키메릭 올리고뉴클레오티드"라는 용어는 자연적으로 통상적으로 발생하지 않는 방식으로 위치하거나 연결되는 적어도 두 개의 핵산 서열 또는 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"상보적" 및 "상보성"이란 용어는 염기-짝짓기 규칙에 의해 관련된 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 예를 들어, 서열 "A-G-T-C"는 서열 "T-C-A-G"에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있고, 핵산의 염기들의 단지 일부는 염기 짝짓기 규칙에 따라 일치된다. 상보성은 완전한 필요가 없다; 제 1 서열과 제 2 서열 사이의 혼성화를 방해하게 될 염기 쌍 불일치의 임의의 숫자일 수 있다. 그러나, 돌연변이의 숫자가 매우 커서 혼성화가 최저의 엄격한 혼성화 조건하에서 발생하지 않는다면, 서열은 상보적 서열은 아니다. 따라서, "실질적으로 상보적인"은 제 1 서열이 선택된 반응 조건하에서 혼성화하기 위해 제 2 서열에 충분하게 상보적이라는 것을 의미한다. 상보성 및 특이성을 얻기에 충분한 혼성화의 엄격성 사이의 관계는 당업계에 주지되어 있다. 따라서, 실질적으로 상보적 서열들은 본 발명의 분석 방법들 중 임의의 것에서 사용될 수 있다. 이런 서열들은, 예를 들어, 완전히 상보적일 수 있거나 혼성화 조건이 표적 서열과 비-표적 서열 사이를 구별하기에 충분한 한 1 내지 많은 불일치를 함유할 수 있다. 따라서, 실질적으로 상보적인 서열들은 백분율 동일성이 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 85, 80, 75 이하의 범위일 수 있다. 핵산 서열들의 상보성의 정도는 핵산 서열들 사이의 혼성화의 효율과 강도에 대한 현저한 효과를 가진다.
본 명세서를 통해서, 문맥이 다르게 요구하지 않는다면, "포함한다(comprise )" 또는 "comprises" 또는 "comprising"은 언급된 요소 또는 전체 또는 요소들 또는 전체들의 그룹을 포함하나 임의의 다른 요소 또는 전체 또는 요소들 또는 전체들의 그룹을 제외하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
"혼성화"는 DNA-DNA, DNA-RNA 또는 DNA-PNA 혼성을 생산하기 위해 상보적 뉴클레오티드 서열들의 짝짓기를 의미하기 위해 사용된다. 상보적 염기 서열들은 염기-짝짓기 규칙에 의해 관련된 서열들이다. DNA의 경우, A는 T와 짝을 이루고 C는 G와 짝을 이룬다. RNA의 경우, U는 A와 짝을 이루고 C는 G와 짝을 이룬다. 염기 이노신(I)이 사용될 수 있다. 이노신은 C 또는 A 또는 G 또는 T와 짝을 이룰 수 있다(안정성이 감소하는 순서). 이런 점에서, "일치한다" 및 "불일치한다"라는 용어는 상보적 핵산 가닥들에서 짝을 이룬 뉴클레오티드의 혼성화 능력을 의미한다. 일치된 뉴클레오티드는 상기한 대로, 특유의 A-T 및 G-C 염기 쌍과 같이 효과적으로 혼성화한다. 불일치는 효과적으로 혼성화하지 않는 뉴클레오티드의 다른 조합이다.
"분리된"은 천연 상태에서 정상적으로 포함하는 성분들이 실질적으로 또는 필수적으로 제거된 재료를 의미한다. 예를 들어, "분리된 올리고뉴클레오티드"는 자연적으로 발생하는 상태에서 측면에 위치한 서열들로부터 정제된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 절편에 통상적으로 인접한 서열들로부터 제거된 DNA 절편을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 인산이에스터 결합(또는 관련 구조적 변형체 또는 이의 합성 유사체)을 통해 연결된 다수의 뉴클레오티드 단위(디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 관련 구조적 변형체 또는 이의 합성 유사체)로 이루어진 폴리머를 의미한다. 따라서, 통상적으로 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 및 이들 사이의 결합이 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 폴리머를 의미하는 반면, 이 용어는 또한 발명의 범위 내에서 펩타이드 핵산(PNAs), 포스포라미데이트(phosphoramidates), 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보핵산 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 유사체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 분자의 정확한 크기는 특정한 용도에 따라 변할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 통상적으로 약 10 내지 30 뉴클레오티드 짧고, 이 용어는 비록 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 통상적으로 대형 올리고뉴클레오티드에 대해 사용되지만 임의의 길이의 분자를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"이란 용어는 DNA, cDNA, RNA, mRNA, cRNA 또는 PNA를 나타낸다. 상기 용어는 통상적으로 길이가 30 뉴클레오티드 이상의 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"프라이머"는 DNA 가닥과 짝을 이룰 때, 적절한 중합제의 존재하에서 프라이머 연장 생성물의 합성을 개시할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이 프라이머는 증폭에서 최대 효과를 위해 단일 가닥인 것이 바람직하나 선택적으로 이중가닥일 수 있다. 프라이머는 중합제의 존재하에서 연장 생성물의 합성을 준비하기 위해 충분히 길어야 한다. 프라이머의 길이는 응용, 사용되는 온도, 주형 반응 조건, 다른 시약 및 프라이머 소스를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 예를 들어, 표적 서열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 통상적으로 15 내지 35 또는 더 많은 뉴클레오티드 잔기를 포함하나, 더 적은 뉴클레오티드 잔기를 함유할 수 있다. 프라이머들은 약 35 뉴클레오티드 내지 수 킬로베이스 또는 그 이상과 같은 대형 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머들은 혼성화하고 합성의 개시 부위로 작용하는 주형상의 서열과 "실질적으로 상보적"이도록 선택될 수 있다. "실질적으로 상보적"은 프라이머가 표적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는데 실질적으로 상보적인 것을 의미한다. 바람직하게는, 프라이머는 혼성화되도록 설계되나 필수적이지 않은 주형과 불일치가 없는 것을 포함한다. 예를 들어, 비상보적 핵산 잔기들은 프라이머 서열의 나머지가 주형과 상보적이 되도록 프라이머의 5'말단에 부착될 수 있다. 선택적으로, 비상보적 뉴클레오티드 잔기 또는 비상보적 뉴클레오티드 잔기의 스트레치는 프라이머 서열이 혼성화되어 프라이머의 연장 생성물의 합성용 주형을 형성하는 주형의 서열과 충분한 상보성을 가진다면 프라이머 속에 삽입될 수 있다.
둘 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩티드들 사이의 서열 관계들을 기술하는데 사용되는 용어는 "참조 서열", "비교 창", "서열 유사성", "서열 동일성", "서열 유사성의 백분율", "서열 동일성의 백분율", "실질적으로 유사한" 및 "실질적 동일성" 포함한다. "참조 서열"은 적어도 12 그러나 주로 15 내지 18개 이고 및 뉴클레오티드들 및 아미노산 잔기들을 포함하여 길이로 30단량체 단위들과 같은 종종 적어도 25 또는 그 이상이다. 두 개의 폴리뉴클레오티드들이 (1) 두 개의 폴리뉴클레오티드들 사이에서 유사한 서열(즉, 완성된 폴리뉴클레오티드 서열의 단지 일부분), 및 (2) 두 개의 폴리뉴클레오티드들 사이에서 분기하는 서열, 두 개(또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드들 사이의 서열 비교들은 전형적으로 서열 유사성의 국소 지역들을 동정하고 비교하기 위하여 "비교 창" 위로 두 개의 뉴클레오티드들의 서열들을 비교함으로써 수행된다. "비교 창"은 참조 서열과 비교되는 전형적으로 12개의 연속적인 잔기들의 개념적 절편(conceptual segment)을 의미한다. 비교 창은 두 개 서열들의 최적 배열에 대한 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 약 20% 또는 그 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭(gaps))을 포함할 수 있다. 비교 창을 배열하기 위한 서열들의 최적 배열은 알고리즘(GAP, BESTFIT,FASTA 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)의 컴퓨터를 이용한 수단 또는 정밀 검사 및 선택된 다양한 임의의 방법들에 의해 발생된 최고의 배열(즉, 비교 창에 대해 가장 높은 백분율의 상동관계를 얻음)에 의해 수행될 수 있다. 참조는 Altschul 등(Nucl. Acids Res. 25: 3389, 1997)에 의해 개시된대로 프로그램들의 BLAST 군에 대해 할 수 있다. 서열 분석의 상세한 논의는 Ausubel 등의 단원 19.3에서 볼 수 있다("Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15).
"반응 용기"라는 용어는 본 발명의 방법이 수행되는 용기를 의미한다. 반응 용기는 표준 분자 생물학 반응과 사용하기에 적합한 임의의 용기일 수 있고 따라서, 이런 용도에 적합한 재료로 제조될 것이다. 이런 재료는 천연 또는 합성일 수 있고, 또는 천연 및 합성 재료의 조합으로 형성될 수 있다. 반응 용기를 제조할 수 있는 예시적 재료들은 플라스틱(예를 들어, 폴리카보네이트, 폴리스타이렌, 및 폴리프로필렌), 유리 등으로 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 반응 용기는 통상적인 PCR 튜브 및 마이클로플레이트, 예를 들어, 96-웰 마이크로플레이트를 포함한다. 본 발명의 일부 실시예에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 반응 용기의 내부 표면상에 고정된다. 이런 실시예들에서, 반응 용기는 투명 재료로 적절하게 제조되어 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 시그널링 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 반응 용기외부에서 탐지될 수 있다. 특정한 실시예들에서, 반응 용기는 실질적으로 평면인 표면을 갖는 것을 특징으로 한다. 선택적으로, 반응 용기는 두 개의 2차원 평면 시트가 3차원 관 모양으로 감기는 실질적으로 관 모양인 표면을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 이런 모양은 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 더 큰 표면적을, 예를 들어, "플로우 스루"(flow through) 셀 속에 고정하는데 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 반응 용기는 미세 유체 장치이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성" 및 "동일성"은 서열들이 비교 창에 대해 뉴클레오티드-뉴클레오티드 염기들 또는 아미노산-아미노산 염기들에 대해 동일한 정도를 의미한다. 그래서, 예를 들어, "서열 동일성의 백분율"은 비교의 창에 대해 두 개의 최적으로 배열된 서열들을 비교하고, 일치되는 위치들의 수를 만들기 위하여 두 서열들에서 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I)가 나타나는 위치들의 수를 결정하고, 일치되는 위치들의 수를 비교의 창(즉, 창 크기)에서 위치들의 전체 수로 나누고 서열 동일성의 백분율을 만들기 위해 결과에 100을 곱함으로써 계산된다. 본 발명을 위해, "서열 동일성"은 소프트웨어에 첨부된 참조 매뉴얼에서 사용되는 표준 디폴트를 사용하는 DNASIS 컴퓨터 프로그램(원도우용 버전 2.5; 미국, 캘리포니아, 사우스 샌프란시스코, 히타치 소프트웨어 엔지니어링사에서 구입가능)에 의해 계산되는 "매치 백분율(match percentage)"을 의미하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 발명에 사용된 "엄밀도(stringency)"란 온도 조건 및 이온세기 조건과, 혼성화 동안 소정의 유기용매의 유무를 의미한다. 엄밀도가 높을수록 혼성화된 핵산 서열들 사이의 상보성의 등급은 더 높아질 것이다.
본 발명에 사용된 "엄한 조건"은 실질적으로 상보적이거나 높은 비율의 상보적 염기, 바람직하게는 정확한 상보성을 가진 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드만이 혼성되고 일부 실시예에서 증폭 생성물을 생산하는 온도 및 이온화 조건을 의미한다. 필요한 엄밀도는 뉴클레오티드 서열 의존성이고 혼성화하는 동안 존재하는 여러 성분에 의존하며 뉴클레오티드 유사체가 사용되는 경우 크게 변한다. 엄한 조건은 당업자에게 주지되어 있다. 일반적으로, 혼성 반응에서 프로브로 사용된 올리고뉴클레오티드의 경우에, 엄한 조건은 소정의 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대해 계산된 열 용융점(Tm)보다 약 10 내지 20℃ 낮게 된다. Tm은 표적 서열의 50%가 상보적 프로브가 상보적 프로브에 혼성화하는 (소정의 이온 강도와 pH 하에서의)온도이다. Tm 계산은 당업자에게 공지되어 있다. Tm은 식 Tm=4(wG + xC) + 2(yA + zT)-16.6*log10(0.050) + 16.6*log10([Na+]), 여기서 w,x,y,z는 각각 서열 속의 염기 G,C,A,T의 수이고, [Na+]는 염 농도인 상기 식을 사용하여 14 이하의 염기 잔기 길이의 올리고뉴클레오티드에 대해 최적으로 계산된다. 13 이상의 염기 잔기의 올리고뉴클레오티드의 경우에, Tm은 브레슬라우어 등(1986, Proc. Nat. Acad. Sci. 83:3746-50)에 개시된 최근접 이웃 식(nearest neighbour formulae)으로 계산하나, 수기모토 등(1996, Nucl. Acids Res. 24:4501-4505)에 의해 발표된 수치를 사용한다. RNA 열역학 특성에 대한 수치는 시아 등(1998, Biochemistry 37:14719-14735)으로부터 얻을 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 적어도 낮은 엄한 조건하에서, 바람직하게는 적어도 중간의 엄한 조건하에서 및 더욱 바람직하게는 높은 엄한 조건하에서 표적 서열에 혼성화할 것이라는 것이 이해될 것이다. 프로브 혼성 반응에 대한 낮은 엄한 조건에 대한 참조는 42℃에서 혼성의 경우 적어도 약 1% v/v부터 적어도 약 15% v/v 포름아마이드 및 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M 염, 및 42℃에서 세척의 경우 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M 염을 포함한다. 또한 낮은 엄한 조건은 65℃에서 혼성의 경우 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1mM EDTA, 0.5M NaHPO4(pH 7.2), 7% SDS를 포함하고 실온에서 세척의 경우 (i) 2 x SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1mM EDTA, 40mM NaHPO4(pH 7.2), 5% SDS를 포함함할 수 있다. 프로브 혼성 반응을 위한 중간 엄한 조건은 42℃에서 혼성의 경우 적어도 약 16% v/v부터 적어도 약 30% v/v 포름아마이드 및 적어도 약 0.5M 내지 적어도 약 0.9M 염, 및 42℃에서 세척을 위해 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M 염을 포함한다. 또한 중간 엄한 조건은 65℃에서 혼성의 경우 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1mM EDTA, 0.5M NaHPO4(pH 7.2), 7% SDS를 포함하고 42℃에서 세척의 경우 (i) 2 x SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1mM EDTA, 40mM NaHPO4(pH 7.2), 5% SDS를 포함할 수 있다. 프로브 혼성 반응을 위한 높은 엄한 조건은 42℃에서 혼성의 경우 적어도 약 31% v/v부터 적어도 약 50% v/v 포름아마이드 및 적어도 약 0.01M 내지 적어도 약 0.15M 염, 및 42℃에서 세척을 위해 적어도 약 0.01M 내지 적어도 약 0.15M 염을 포함한다. 높은 엄한 조건은 65℃에서 혼성의 경우 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1mM EDTA, 0.5M NaHPO4(pH 7.2), 7% SDS를 포함하고 65℃ 이상의 온도에서 세척의 경우 (i) 2 x SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1mM EDTA, 40mM NaHPO4(pH 7.2), 1% SDS를 포함할 수 있다. 프로브 혼성 반응을 위한 다른 엄한 조건은 당업계에 주지되어 있다. 당업자는 혼성화의 특이성을 최적화하기 위해 다양한 인자들이 조작될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 최종 세척의 엄밀도의 최적화는 높은 등급의 혼성화를 확보하는 역할을 한다. 상세한 실시예의 경우에, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(위에), 페이지 2.10.1 내지 2.10.16 및 MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL(샘브룩 등., eds.)(골드 스프링 하버 프레스 1989), 섹션 1.101 내지 1.104 참조.
"표적 핵산 서열"은 관심 있는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 이것은 전체 유전자, 이의 일부일 수 있다. 표적 핵산 서열은 뉴클레오티드 삽입, 결실 및 단일 뉴클레오티드 동질이상(SNPs)과 같으나 이에 한정되지 않는 유전자 변형을 포함하는 유전자의 일부일 수 있다. 표적 핵산 서열은 전체 유전자 또는 이의 일부에 의해 암호화된 핵산일 수 있다. 본 발명이 고려하는 표적 핵산 서열은 따라서, DNA, cDNA, RNA, mRNA 및 cRNA를 포함한다. 또한 표적 핵산 서열은 자연적으로 발생하거나 합성한 핵산 분자일 수 있다.
2. 표적 핵산 서열 분석 방법
본 발명은 분석 방법, 예를 들어, 표적 핵산 서열의 존재 또는 양을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 표적 핵산 서열의 존재하에서 탐지가능한 신호를 생산하기 위해서 핵산 처리 반응에 포함되는 복수의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 복수의 올리고뉴클레오티드는 다음을 포함한다:
(1) 고체 표면에 선택적으로 고정되고 표적 핵산 서열에 혼성화하지 않는 캡쳐 올리고뉴클레오티드;
(2) 탐지가능한 신호를 제공하고 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 시그널링 올리고뉴클레오티드;
(3) 일부 실시예에서 프라이머로 작용할 수 있는 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드는 다음을 포함한다:
(a) 표적 핵산 서열의 하부서열에 혼성화하는 제 1 표적 서열; 및
(b) (i) 캡쳐 올리고뉴클레오티드; 또는
(ii) 시그널링 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 서열에 혼성화하는 캡쳐가능한 서열
(4) (a) 제 1 표적 서열이 혼성화하는 하부서열과 다른 표적 핵산 서열의 다른 서열; 또는
(b) 표적 핵산 서열의 상보적 가닥의 하부서열 또는
(c) 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 서열에 혼성화하는 제 2 표적 서열을 포함하고, 일부 실시예에서 프라이머로 작용할 수 있는 적어도 하나의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 핵산 처리 반응은 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 가닥뿐만 아니라 적어도 하나의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 2 가닥을 포함하고, 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열의 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화를 막아서, 시그널링 올리고뉴클레오티드가 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하고 표적의 존재 또는 양을 신호화하는 반응 생성물을 생성한다. 표적 핵산 서열이 존재하지 않는 경우, 핵산 처리 반응은 발생하지 않아서, 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열이 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하고 시그널링을 막게 한다.
3. 핵산 처리 반응
상기한 대로 반응 생성물을 발생시키는 임의의 핵산 처리 반응은 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다. 예시적 핵산 처리 반응은 핵산 증폭을 포함한다. 핵산 증폭의 대표적인 방법은 당업계에 공지되어 있고, PCR(예를 들어, 사이키 등, 1985, Science, 230:1350-1354; 물리스 등., 1097, Methods Enzymol 155:335-350)), 가닥 치환 증폭(SDA 및 다중 SDA(MSDA); 예를 들어, 미국특허 제 5,422,252 및 리틀 등), 롤링 서클 증폭(RCA; 예를 들어, Liu 등, 1996, J. Am . Chem. Soc 118:1587-1594 및 미국특허 제 5,854,033 및 미국특허 제 6,642,034), 핵산 서열계 증폭(NASBA; 예를 들어, 숙나난 등., 1994, Biotechniques 17:1077-1080), 리가아제연쇄반응(LCR; 예를 들어, WO 89/09835) 및 Qβ 레플리카제 증폭(예를 들어, 티야기 등, 1996, 상기)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이런 기술들에 대한 여러 치환들은 시바넨 안-크리스틴(2001, 상기)에 의해 검토된 대로 사용될 수 있다. 본 발명에서, 다른 증폭 반응의 특징들의 임의의 유용한 조합은 방법의 민감도 및/또는 특이성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 핵산 처리 반응은 중합효소 의존 핵산 증폭을 기초로 한다. 이런 형태의 예시적 증폭은 중합효소연쇄반응(PCR)이고, 개별 올리고뉴클레오티드 쌍의 한 올리고뉴클레오티드로부터 합성된 연장 생성물은, 이의 상보체로부터 분리될 때, 상기 쌍의 다른 올리고뉴클레오티드의 연장 생성물의 합성을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 열안정 프라이머 의존 중합효소가 사용되나, 당업자에게 알려진 대로, 중합효소의 선택은 일반적으로 사용된 특정 PCR에 의존한다.
도 2에 도시된 것과 같은 이런 형태의 예시적 예에서, 제 1 하이브리드는 키메릭 올리고뉴클레오티드의 표적 서열과 표적 핵산 서열 사이에 형성된다. 그런 후에 표적 서열은 프라이머-의존 DNA 중합효소 또는 프라이머 의존 역전사효소일 수 있는 중합제로 연장된다. 이런 효소들은 표적 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오시드 서열의 5' 말단 뉴클레오티드 사이의 완전하게 일치하는 쌍을 함유하는 하이브리드를 위해 선택적으로 또는 이런 쌍들이 완전하게 일치하건 일치하지 않건 비선택적으로 뉴클레오시드 3인산(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오시드 3인산; dNTPs)을 하이브리드의 표적 서열의 연장부 속에 포함시키는 효과를 가진다. 이에 관해서, 예를 들어, 진핵 프라이머-의존 DNA 중합효소 및 조류 골수아구증 바이러스(AMV) 역전사효소와 같은 일부 효소들은 3' 에러-교정 활성(엑소뉴클라아제-(exo-))을 가지고, 따라서 올리고뉴클레오티드의 3'말단과 표적 뉴클레오티드 서열의 5'말단 뉴클레오티드 사이의 완전한 일치를 함유하는 하이브리드에 결합되는 올리고뉴클레오티드만을 연장할 것이라는 것이 주지되어 있다. 선택적으로, Escherichia coli DNA 중합효소 I의 클레나우 절편을 포함하는 원핵성의 프라이머 의존 DNA 중합효소와 같은 다른 중합제들은 에러-교정 활성(엑서뉴클리아제+(exo+)을 가지고 비록 이런 효소들의 변형물이 공급업체로부터 구입할 수 있지만 에러-교정 활성이 없기 때문에 이런 선택성을 나타내지 않는다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 연장을 위한 3' exo- 중합제를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. PCR계 핵산 처리 반응에 따라 사용될 수 있는 적절한 중합제들은 당업자에게 주지되어 있다. 추가로 DNA 중합효소를 첨가할 필요 없이 PCR을 반복적으로 순환하기 위해서, DNA 중합효소는 적절하게 열 안정성이며, Pyrococcus furiosis(Pfu)DNA 중합효소, Pyrococcus sp. GB-D(Psp)DNA 중합효소, Pyrococcus woesei(Pwo) DNA 중합효소, Thermus aquaticus(Taq) DNA 중합효소, Thermus brocianus(Tbr) DNA 중합효소, Thermus flavus(Tfl) DNA 중합효소, Thermococcus litoralis(Tli 또는 Vent) DNA 중합효소, Thermotoga maritima(Tma) DNA 중합효소 및 Thermus thermophilus(Tth) DNA 중합효소 및 이의 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 적절한 역전사효소들은 조류 골수아구증 바이러스(AMV), 치류 백혈병 바이러스(MMLV) 및 Thermus thermophilus(Tth) DNA 중합효소 및 이의 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 중합제를 선택하는 다른 요소들은 검사 샘플의 핵산이 DNA 또는 RNA를 포함한다(즉, 통상적으로 단지 역전사효소들만이 RNA 주형상의 연장 생성물 속에 데옥시뉴클레오시드 3인산을 효과적을 포함시킬 것이다).
주형으로 표적 핵산 서열을 사용하는 키메릭 올리고뉴클레오티드의 표적 서열의 연장은 제 1 연장 생성물 및 표적 핵산 서열을 포함하는 듀플럭스를 얻게 한다. 제 1 연장 생성물은 변형에 의해 표적 핵산 서열로부터 분리되어 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 제 1 연장 생성물에 혼성화될 수 있어서 제 2 하이브리드를 형성한다. 다음으로, 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 주형으로서 제 1 연장 생성물을 사용하여, 상기한 대로, 연장된다. 제 1 연장 생성물은 키메릭 올리고뉴클레오티드를 포함하기 때문에, 이 단계에서 형성된 제 2 듀플렉스는 제 1 연장 생성물 및 제 1 연장 생성물에 상보적이고, 따라서 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열에 상보적인 제 2 연장 생성물을 포함한다. 이 제 2 듀플렉스는 본 발명에 따른 반응 생성물에 해당한다. 캡쳐가능한 서열에 상보적인 서열은 "블럭" 서열이고, 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열의 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화를 막는 역할을 하여, 시그널링 올리고뉴클레오티드가 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화되게 한다.
다른 실시예에서, 주형으로서 원형 핵산 분자를 사용하는 제 1 연장 생성물을 합성하기 위해, 중합효소 의존 증폭은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 원형 핵산 분자에 대한 혼성이 결찰, 즉, 서큘레이션(circulation)을 허용하는 롤링 서클 증폭(RCA), 및 통상적으로 가닥 치환 활성을 가진 것인 DNA 중합효소를 포함한다. 일반적으로, 연장 생성물은 주형 원형 핵산 분자에 상보적인 서열들의 다중 반복체를 함유하는 긴 핵산 분자이다. 상보적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 존재하에서, 제 1 연장 생성물은 PCR의 관하여, 다른 연장 생성물들의 합성을 위한 주형으로 작용할 수 있고, 원형 주형 원형 핵산 분자의 증폭을 허용하게 한다.
도 3에 도시된 것과 같은 이런 형태의 예시적 예들에서, 제 1 하이브리드는 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 서열 사이에 형성되어 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 혼성에 의해 순환된다. 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 결찰가능한 단부(도 3에 도시된 E1' 및 E2')를 가지며 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 5' 및 3' 단부의 결찰은 리가아제 효소에 의해 촉매화될 수 있다(이하에서 더욱 상세하게 기술). 캡쳐가능한 서열(B')을 포함하는 키메릭 올리고뉴클레오티드는 순환된 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고 가닥 치환 중합효소에 의해 촉매화된 제 1 연장 생성물의 생산을 준비한다. 제 1 연장 생성물의 영역에 상보적인 다른 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드(F')가 첨가되고 원형 프로브의 결찰이 발생한다면 제 2 연장 생성물의 발생을 준비한다. 제 2 연장 생성물은 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열에 부분적으로 상보적이다. 캡쳐가능한 서열에 상보적인 제 2 연장 생성물의 서열은 "블러킹" 서열이고, 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열의 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성을 막아서, 시그널링 올리고뉴클레오티드가 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하게 한다.
본 발명에 의해 고려되는 RCA에 적합한 DNA-중합효소는 가닥 치환으로 불리는, 적절하게 주형 가닥에 상보적인 가닥을 치환할 수 있고 5'-3' 엑소뉴클리아제 활성이 모자란다. 가닥 치환은 결찰된 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 다중 복합체들을 합성하는데 필수적이다. 5'-3' 엑소뉴클리아제 활성은, 존재한다면, 합성된 가닥의 파괴를 일으킬 것이다.
개시된 방법에서 사용하기 위한 DNA 중합효소는 매우 반응성이 크다는 것이 바람직하다. 개시된 방법에서 사용하기 위한 DNA 중합효소의 적합성은 롤링 서클 복제를 수행하는 능력을 평가함으로써 쉽게 결정할 수 있다. 예시적인 롤링 서클 DNA 중합효소는 박테리아파아지 Φ29 DNA 중합효소(미국특허 5, 198,543 및 5,001,050), 파아지 M2 DNA 중합효소(마치모토 등., Gene 84:247(1989)), 파아지 ΦPRD1 DNA 중합효소(정 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8287(1987)), VENT.RTM.DNA 중합효소(콩 등., J. Biol. Chem. 268:1965-1975(1993)), DNA 중합효소 I의 클레나우 절편(제곱슨 등., Eur. J. Biochem. 45:623-627(1974)), T5 DNA 중합효소(차터리지 등., Gene 97:13-19(1991)), PRD1 DNA 중합효소(지후 및 이토, Biochem. Biophys. Acta. 1219:267-276(1994)), 및 T4 DNA 중합효소 홀로효소(카보드 및 벤코빅, Curr. Biol. 5:149-157(1995)). 특정 실시예에서, Φ29 DNA 중합효소가 사용된다.
가닥 치환은 헬리가제와 같은 가닥 치환 인자의 사용을 통해 촉진될 수 있다. 가닥 치환 인자의 존재하에서 롤링 서클 복제를 수행할 수 있는 임의의 DNA 중합효소는, 비록 DNA 중합효소가 이런 인자의 부존재시 롤링 서클 복제를 수행할 수 없지만, 개시된 방법에서 사용하기에 적합하다고 생각된다. RCA에 유용한 가닥 치환 인자들은 BMRF1 중합효소 보조 서브유닛(티스루미 등., J. Virology 67:7648-7653(1993)), 아데노바이러스 DNA-결합 단백질(지더벨 및 반 더 빌레트, J. Virology 68:1158-1164(1994)), 단순 헤르페스 바이러스 단백질 ICP8(보에머 및 레만, J. Virology 67:711-715(1993); 스칼리터 및 레만, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10665-10669(1994)), 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB; 리글러 및 로마노, J. Biol. Chem. 270:8910-8919(1995)), 및 소 흉선 헬리카제(시이겔 등., Biol. Chem. 267:13629-13635(1992)).
다른 실시예에서, 핵산 처리 반응은 리가아제 의존성 핵산 증폭을 기초로 한다. 올리고뉴클레오티드 결찰 측정법은 특히, 미국특허 4,883,750에 개시되어 있다. 리가아제-의존성 반응의 한 예는 리가아제연쇄반응(LCR)이고, 하나의 올리고뉴클레오티드는 제 1 표적 서열에 혼성화하고 다른 올리고뉴클레오티드는 제 1 표적 서열에 인접한 제 2 표적 서열에 혼성화한다. 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 쌍은 양 올리고뉴클레오티드를 포함하는 결찰 생성물을 생산하기 위해 결찰을 위한 기질로 작용한다. 만일 필요하다면, 결찰 생성물은 표적 서열로부터 추가 결찰 생성물의 생산을 허용하기 위해서, 예를 들어, 변형에 의해, 표적 서열로부터 이동될 것이고, 표적 핵산에 상보적인 결찰된 올리고뉴클레오티드를 증폭시킨다.
도 4에 도시된 대로, 이런 형태의 예시적 예에서, 제 1 하이브리드는 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열은 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 표적 핵산 서열의 제 1 서브서열에 혼성화함으로써 형성되며, 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 서브서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이다. 그런 후에 제 2 하이브리드는 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열을 표적 핵산 서열의 제 2 하부서열에 혼성화함으로써 형성되며, 제 2 서브서열은 제 1 서브서열에 인접하게 위치한다. 그런 후에 키메릭 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스와 키메릭 올리고뉴클레오티드와 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드 모두를 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해서 제 1 서브서열의 5'뉴클레오티드와 결찰제의 존재하에서 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드와 결찰된다. 이런 실시예들에서 사용될 수 있는 적절한 결찰제들은 당업자에게 주지되어 있고 T4 DNA 리가아제, Ecscherichia coli DNA 리가아제 및 Thermus filiformis ( Tfi ) DNA 리가아제 및 이의 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시예에서, 결찰제는 열 안정성이다. 결찰 다음에, 결찰 생성물은 변형에 의해 표적 핵산 서열로부터 분리되며, 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 키메릭 올리고뉴클레오티드와 결찰 생성물의 제 1 코퍼레이팅 서열 부분에 혼성화되어 반응 생성물을 형성한다. 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열에 상보적인 블러킹 영역, 즉, 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열의 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화를 막는 역할을 하는 블러킹 서열에 상보적인 블러킹 영역을 가져서, 시그널링 올리고뉴클레오티드가 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화되게 한다. 통상적으로, 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드가 키메릭 올리고뉴클레오티드에 결찰하지 않을 때, 즉, 표적 핵산 서열이 존재하지 않을 때, 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 블러킹 영역은 혼성화되지 않거나 캡쳐가능한 서열에 비교적 낮은 친화도로만 혼성화될 것이다. 당업자에게 공지된 대로, 이것은 (i) 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 블러킹 영역의 크기 및/또는 (ii) 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열에 대한 블러킹 영역의 상보성을 조절하고; 또는 (iii) 봉쇄 영역에 인접한 비상보적 서열들의 삽입에 의해 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드가 키메릭 올리고뉴클레오티드에 결찰될 때만 캡쳐가능한 서열에 대한 블러킹 영역의 실질적인 혼성화에 의해 가능하다.
제 1 결찰 생성물에 다소 상보적인 블러킹 서열에 인접한 비상보적 서열의 염기 조성물의 조절은 다음 방식으로 탐지 시스템의 민감성을 조절할 수 있다. 만일 비상보적 서열(도 4의 B2 및 E2 사이 절편)이 제 1 결찰 생성물에 더욱 상보적이 되게 조절(또는 "조율")된다면, 탐지 시스템의 민감도를 증가시킬 것인 반면에(즉, 표적 서열의 더 낮은 농도를 탐지할 수 있게 한다), 만일 비상보적 서열이 제 1 결찰 생성물에 덜 상보적이면, 탐지 시스템은 덜 민감해질 것이다. 이런 방식으로, 조율가능한 비상보적인 본 발명의 서열은 처리 반응의 민감도를 조절하는데 사용될 수 있다.
LCR의 사용의 다른 예시적 예는 도 5a에 도시되며 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드(E1'-B1')의 제 1 표적 서열의 표적 핵산 서열의 제 1 서브서열에 대한 혼성화를 포함하여 제 1 하이브리드를 형성하고, 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이고 캡쳐가능한 서열(캡쳐가능한 서열은 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 일부가 된다)의 5' 뉴클레오티드는 비결찰성이다. 이후에 표적 핵산 서열의 제 2 서브서열에 대한 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열(E2'-B2')의 혼성화가 이어지며, 제 2 서열은 제 1 서열에 인접하고, 제 2 하이브리드를 형성한다; 캡쳐가능한 서열(캡쳐가능한 서열은 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드의 일부가 된다)의 3' 뉴클레오티드는 결찰할 수 없다. 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열의 제 1 및 제 2 서브서열을 포함하는 제 1 듀플렉스와 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드와 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드 모두를 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해서 제 1 하부서열의 5'뉴클레오티드와 결찰제의 존재하에서 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드와 결찰된다. 이런 실시예들에서 사용될 수 있는 적절한 결찰제들은 당업자에게 주지되어 있고 T4 DNA 리가아제, Ecscherichia coli DNA 리가아제 및 Thermus filiformis ( Tfi ) DNA 리가아제 및 이의 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시예에서, 결찰제는 열 안정성이다. 그런 후에 제 1 듀플렉스는 변형되어 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 자유롭게 한다. 이런 방식으로 결찰 생성물은 캡쳐 올리고뉴클레오티드(도 5a의 B)에 혼성화하는데 사용될 수 있고, 이를 통해 시그널링 올리고뉴클레오티드(도 5a의 B")의 결합과 경쟁하게 된다. 이 실시예에서, 신호의 양은 시작 표적 서열의 양에 반비례하는 소정의 범위를 넘을 것이다. 이런 실시예의 변형에서, 제 1 키메릭 프로브(E1'-B1') 및 제 2 키메릭 프로브(E2'-B2')가 혼성화되는 표적 서열들 사이에 "갭"이 존재한다(도 5b). 혼성화 후에, 중합효소는 리가아제 효소에 의해 촉매화되는 결찰 단계 이전에 E1' 내지 E2' 사이의 갭을 채우는데 사용된다. 혼성화 후에 중합효소는 리가아제 효소에 의해 촉매화되는 결찰 단계 이전에 E1' 내지 E2' 사이의 갭을 채우는데 사용된다. 선택적으로 표적(E)에서 갭 서열에 상보적인 갭 충전 올리고뉴클레오티드는 혼성화 단계 동안 첨가되고 결찰 반응에 참여한다.
LCR 사용의 다른 예시적 예는 도 6a에 도시되며 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 표적 핵산 서열(E)의 제 1 하부서열에 대한 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열의 혼성화를 포함하며, 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 캡쳐가능한 서열(B3')을 포함하고 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이다. 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드(E2'-B4')의 제 2 표적 서열은 표적 핵산 서열(E)의 제 2 서열에 혼성화되고, 제 2 하부서열은 제 1 하부서열에 인접하여, 제 2 하이브리드를 형성한다; 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드는 시그널링 올리고뉴클레오티드(B'')에 혼성화할 수 있는 캡쳐가능한 서열(B4')을 포함한다. 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열의 제 1 및 제 2 서브서열을 포함하는 제 1 듀플렉스와 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드와 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드 모두를 포함하는 반응 생성물을 형성하기 위해서 제 1 하부서열의 5'뉴클레오티드와 결찰제의 존재하에서 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드와 결찰된다. 제 1 듀플렉스는 변형되어 표적 핵산으로부터 반응 생산물을 분리시킨다. 반응 생성물은 기질 상의 캡쳐 올리고뉴클레오티드 및 라텍스 비드, 콜로이드 금, 효소, 퀀텀 도트, 또는 시그널 증폭 기술을 포함하나 이에 한정되지 않는 탐지가능한 모이어티를 함유하는 시그널링 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 의해 탐지된다(SAT; 예를 들어, US 특허 5,902,724). 후자의 실시예에서, 신호의 양은, 최초 샘플에서 표적 서열에 비례하여 소정의 범위를 넘을 것이다. 관련 실시예(도 6b)는 E1' 내지 E2'에 상보적인 영역들 사이의 갭 서열을 채우기 위해서 중합효소의 존재 또는 효소 촉매화 결찰을 가능하게 하기 위해서 적절하게 인산화된 단부로 결찰가능한 갭 충전 올리고뉴클레오티드의 사용을 필요로 한다.
본 발명의 리가아제-의존성 실시예에 따라 생산된 결찰 생성물들은 RCA에 의해 순환되고 증폭될 수 있다.
본 발명의 핵산 처리 반응들은 측정법에 포함될 수 있는 여러 다른 시약들을 포함할 수 있다. 상기 반응들은 염, 버퍼, 알부민과 같은 천연 단백질, 세제 등과 같은 시약들을 포함하며 이 시약은 최적 혼성화, 가닥 합성 및 탐지를 촉진 및 비특이적 또는 백그라운드 상호작용을 감소하는데 사용될 수 있다. 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항균제 등과 같은 측정법의 효율을 향상시키는 시약들이 샘플 제조 방법 및 표적의 순도에 따라 사용될 수 있다.
4. 올리고뉴클레오티드
본 발명의 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열이 검사 샘플 내에 존재하는지 않는 지에 따라 시그널링 올리고뉴클레오티드 또는 키메릭 올리고뉴클레오티드를 혼성화 또는 "캡쳐"한다. 일부 실시예에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 고체 표면상에 고정되는 반면, 용액에서는 자유롭다.
캡쳐 올리고뉴클레오티드가 고체 표면상에 고정되는 실시예에서, 상기 표면은 천연, 합성 또는 종이, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트 및 나이트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체와 같은 셀룰로오스 재료; 유리 또는 유리 섬유; 천연 또는 합성 섬유; 플라스틱; 나일론; 아가로스, 실리카겔, 덱스트린 및 젤라틴과 같은 다공성 겔; 다공성 섬유 기질; 세파덱스 가교 덱스트란 사슬과 같은 전분계 재료; 세라믹 재료; 라텍스; 폴리바이닐 클로라이드와 폴리아마이드의 필름; 폴리스타이렌; 폴리카보네이트; 및 폴리바이닐 클로라이드-실리카 등의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 합성적으로 변형된 천연적으로 발생한 재료로 구성될 수 있다.
일부 실시예에서, 고체 표면은 처리 반응이 수행되는 반응 용기의 표면을 형성한다. 다른 실시예에서, 고체 표면은 반응 용기 속에 삽입되고 신호 탐지를 위해 처리 반응의 완결 다음에 제거되는 진단 스트립의 표면일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 고체 표면은 동정을 용이하게 하기 위해 선택적으로 부착되는 미세입자 또는 비드의 표면이다. 다른 실시예에서, 표면은 반도체 나노와이어이고, 나노와이어는 나노와이어 표면에 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 핵산 서열(예를 들어, 캡쳐가능한 서열)의 결합 또는 혼성화에 따라 전기 전도도를 변화시키는 전계효과 트랜지스터로 적절하게 구성된다(예를 들어, Cui et al., 2001, Science 293: 1289-1292; Hahm and Leiber, 2004, Nano Lett. 4: 51-54; Chen et al., 2003, Proc. Natl . Acad . Sci. USA 100:4984-4989; Chen et al., 2004, J. Am . Chem . Soc. 126:1563-1568 and Patolsky et al., 2004, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101: 14017-14022).
캡쳐 올리고뉴클레오티드는 임의의 적절한 기술을 사용하여 고체 표면상에 고정될 수 있다. 예를 들어, 홀스트롬 등(1993, Anal . Biochem. 209:278-283)은 아비딘 및 스트렙타비딘의 경우 바이오틴의 친화성을 사용하고 바이오틸화된 핵산 분자를 아비딘/스트렙타비딘 코팅 지지체에 고정한다. 사용될 수 있는 다른 방법은 폴리스타이렌 또는 유리 고체상을 폴리-L-Lys 또는 폴리-L-Lys, Phe로 선코팅하고 그 후에 이중작용 가교 시약을 사용하여 아미노- 또는 설프하이드릴-변형 올리고뉴클레오티드의 공유 결합하는 것을 포함한다(Running et al., 1990, Biotechniques 8:276-277; Newton et al., 1993, Nuclecic Acids Res. 21: 1155-1162). 카와이 등(1993, Anal. Biochem. 209:63-69)는 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브가 복제 전에 파지미드 벡터 속에 이의 멀티머를 형성하기 위해 결찰된다. 올리고뉴클레오티드는 폴리스타이렌 판 위에 고정되고 254nm에서 UV 조사에 의해 고정된다. 짧은 5'-인산화 올리고뉴클레오티드 프라이머의 화학적으로 변형된 폴리스타이렌 판(코발잉크TM 판, Nunc)에 대한 직접 공유 결합을 위한 방법을 참조할 수 있다(Rasmussen et al., 1991, Anal . Biochem . 198:138-142). 스트렙타비딘-코팅 실리콘 웨이퍼 및 아이도아세트아마이드-코팅 실리콘 웨이퍼에 각각 바이오티닐화된 올리고뉴클레오티드 및 설프하이드릴화된 올리고뉴클레오티드의 고정화를 개시하는 콜로넬-말로네 등(1996, TIBTECH 14:401-407)에 의한 논문을 참조할 수 있다. 또한, 아미노-변형 올리고뉴클레오티드는 아이소티오사이네이트-코팅 유리(Guo et al., 1994, Nuclei Acids Res. 22:5456-5465) 및 실란-에폭사이드-코팅 웨이퍼(Eggers et al., 1994, BioTechniques 17: 516-5240) 상에 고정화된다. 상기한 방법은 기질에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 포스트-합성 부착을 의미한다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 마스코스 및 서든의 방법(1992, Nucleic Acids Res. 20 1679-1684) 또는 포도르 등(상기)의 방법을 사용하여 제 위치에서 합성될 수 있다.
당업자는 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 직간접적으로 고체 표면상에 고정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 고체 표면에 흡수되거나 선택적으로 고체 표면에 공유 결합된 스페이서 분자에 공유 결합될 수 있다. 스페이서 분자는 라텍스 미세입자, 소 혈청 알부민(BSA)와 같은 단백질 도는 덱스트란 또는 폴리-(에틸렌 글리콜)과 같은 폴리머를 포함할 수 있다. 선택적으로, 스페이서 분자는, 예를 들어, 올리고-dT와 같은 호모-폴리뉴클레오티드 꼬리를 포함할 수 있다.
캡쳐 올리고뉴클레오티드는 시그널링 올리고뉴클레오티드가 포획되는 경우 시그널링 올리고뉴클레오티드의 탐지를 수월하게 하는 임의의 배열로 고체 표면상에 배열될 수 있다. 어떤 실시예에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 올리고뉴클레오티드 어레이의 형태로 고체 표면상에 배열된다. 다중 반응의 결과의 탐지는 어레이 상의 특정 위치에서 특정 표적에 상응하는 캡쳐 올리고뉴클레오티드를 고정함으로써 수월해질 수 있다. 캡쳐 올리고뉴클레오티드가 미세입자 또는 비드상에 고정되는 실시예에서, 다중 반응의 결과의 탐지는 반응에서 사용된 미세입자 또는 비드의 전체 수의 구체적인 비에 대한 특정 표적에 상응하는 캡쳐 올리고뉴클레오티드를 고정화함으로써 수월하게 될 수 있다.
통상적으로, 본 발명에 따른 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 표적 특이적이지 않고, 본 발명에서 정의한 대로 키메릭 올리고뉴클레오티드 또는 시그널링 올리고뉴클레오티드 내에 함유된 각각의 (바람직하게는) 인공의 캡쳐가능한 서열들에 특이적이고, "유니버셜 어레이"로서 사용할 수 있다. 즉, 캡쳐 올리고뉴클레오티드와 같은 것 또는 유한 집합을 함유하는 어레이(고체상 또는 액체상 어레이). "액체상 어레이"는 유세포분류기에 의해 분석을 위한 용액 속의 어레이를 의미한다. 일부 실시예에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 유니버셜 표면; 즉, 임의의 용도로 제조되고 사용될 수 있는 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 유한 집합을 포함하는 표준 어레이의 형태이다. 이런 유니버셜 어레이는 표적 서열의 존재하에서 캡쳐 올리고뉴클레오티드와 결합하는 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 시그널링 올리고뉴클레오티드와 함께 사용된다. 마지막 사용자는 임의의 원하는 표적 서열을 포함하는 다른 키메릭 올리고뉴클레오티드를 설계함으로써, 당업자가 예상할 수 있는 대로 일반적으로 단순하고 저렴한 단지 어레이를 맞춤 제작할 수 있다. 일부 실시예에서, 다르고 주로 인공적인 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 어레이가 제조된다; 즉, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 공지된 표적 서열들에 상보성을 갖지 않는다. 어레이의 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 캡쳐가능한 서열은 키메릭 올리고뉴클레오티드 속에 포함될 수 있다.
본 발명의 시그널링 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열이 검사 샘플 내에 존재할 때 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하고 검사 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 나타내는 탐지가능한 신호를 적어도 일부 제공한다. 시그널링 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드와 관련된 시그널링 시약과 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
시그널링 올리고뉴클레오티드는 다음을 포함하는 것과 관련된 시그널링 시약을 가질 수 있다: (1) 시그널링 올리고뉴클레오티드에 대한 시그널링 시약의 직접 부착; (2) 시그널링 올리고뉴클레오티드에 대한 시그널링 시약의 간접 부착; (즉, 시그널링 올리고뉴클레오티드에 뒤이어 결합하는 제 2 중간체에 대한 시그널링 시약의 부착); 및 (3) 시그널링 올리고뉴클레오티드의 후속 반응 생성물에 대한 부착. 적절하게는, 시그널링 시약은 시그널링 올리고뉴클레오티드에 직접 부착된다. 시그널링 시약은 발색단, 촉매, 효소, 형광발색단, 화학발광 분자, 유로퓸(Eu34)과 같은 란타나이드 이온, 방사성 동이원소 및 직접 시각 시그널링 시약을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 직접 시각 시그널링 시약의 경우에, 콜로이드 금속성 또는 비금속성 입자, 염색 입자 또는 기질, 유기 고분자, 라텍스 입자, 리포솜 및 다른 기질 또는 신호 발생 물질을 포함하는 다른 소포로 제조될 수 있다.
시그널링 시약으로 사용하기에 적합한 다수의 효소는 미국특허 제 4,366,241호, 미국특허 제 4,843,300호 및 미국특허 제 4,849,338호에 기술되어 있다. 본 발명에 유용한 효소 시그널링 시약은 호세라디쉬 퍼록시다아제, 루시페론, β-갈락토시다아제, 글루코스 옥사다아제, 리소자임, 말레이트 디하이드로지나아제 등을 포함한다. 효소-시그널링 시약은 용액 속의 제 2 효소와 조합해서 또는 단독으로 사용될 수 있다. 선택적으로, 본 발명에 따른 적절한 시그널링 시약으로 사용될 수 있는 혈광발색단은 플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드, 루시퍼 옐로우 또는 R-피코에리트린를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 시그널링 시약(2)의 간접 부착의 경우에, 보이틴, 디곡시제닌, 스트렙타비딘 및 여러 단백질 항원과 같은 시약은 링크로 작용하고 탐지가능한 신호의 생산을 위해 제 2 중간체의 존재를 필요로 한다. 바이오틴의 경우, 제 2 중간체는 스트렙타비딘 효소 접합체를 포함할 수 있다. 항원 시그널링 시약의 경우, 제 2 중간체는 항체-효소 접합체를 포함할 수 있다.
캡쳐 올리고뉴클레오티드가 용액에서 자유로운 어떤 실시예에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 시그널링 탐지 시스템과 시그널링 올리고뉴클레오티드의 한 일부를 포함하고 시그널 탐지 시스템의 다른 일부를 포함하고, 각각의 부분은 표적 핵산 서열의 존재를 나타내거나 검사 샘플 속의 표적 서열의 부존재를 나타내는 제 1 신호를 제공하는 것을 돕는다. 예시적인 예에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 억셉터 혈광발색단을 포함하고 시그널링 올리고뉴클레오티드는 도너 형광발색단을 포함하여 시그널링 올리고뉴클레오티드가 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 때, 억셉터 및 도너 혈광발색단은 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 유도하기 위해 충분하게 밀접하게 위치한다. FRET의 탐지는 검사 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 신호화할 것이고, FRET의 부존재는 검사 샘플에서 그 서열의 부존재를 신호화할 것이다. 당업자에게 공지된 대로, FRET는 두 방식 중 적어도 하나로 탐지될 수 있다: 형광 또는 소광. 형광에서는, 형광 탐지기는 억셉터 혈광발색단의 방출 스펙트럼에 고정되어 있고 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 시그널링 올리고뉴클레오티드의 결합은 도너로부터 억셉터로의 에너지 전이 및 억셉터로부터의 형광에 의해 탐지된다. 소광에서는, 탐지기는 도너 혈광발색단의 방출 스펙트럼에 고정되어 있고 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 시그널링 올리고뉴클레오티드의 결합은 도너로부터 억셉터로의 에너지 전이 및 도너로부터의 소광 방출에 의해 탐지된다.
본 발명의 키메릭 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열의 하부서열에 혼성화하는 제 1 표적 서열 및 캡쳐 올리고뉴클레오티드 또는 시그널링 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 서열에 혼성화하는 캡쳐가능한 서열을 포함한다. 상기한 대로, 표적 핵산 서열의 부존재시에, 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열은 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하고 시그널링을 봉쇄한다. 일부 실시예에서, 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열은 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 우선적으로 혼성화된다. 이것은 키메릭 올리고뉴클레오티드가 시그널링 올리고뉴클레오티드보다 비교적 높은 농도로 존재 또는 키메릭 올리고뉴클레오티드가 변형되어 시그널링 올리고뉴클레오티드보다 더 높은 친화도를 가진 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 결과일 수 있다.
통상적으로, 캡쳐가능한 서열은 일반적으로 표적 서열에 고유하지 않은, 즉 외인성이고 표적 서열에 첨가 또는 부착되는 핵산이다. 이 내용에서, "표적 서열"은 주요 샘플 표적 서열을 포함할 수 있고 또는 상기한 반응의 반응물 또는 생성물과 같은 유도체 표적일 수 있다는 것을 알아야 한다: 따라서, 예를 들어, 표적 서열은 PCR 생성물, 제 1 결찰 프로브, OLA 반응 속의 결찰된 프로브 등일 수 있다. 캡쳐가능한 서열은 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산의 독특한 확인자로 작용한다. 일반적으로, 어레이 상의 캡쳐가능한 서열 및 상응하는 갭쳐 올리고뉴클레오티드의 세트는 표적 서열 및 표적 서열의 더 큰 핵산 서열의 외부 상의 서열(예를 들어, 게놈 DNA 내의 서열들)을 포함하는 반응 혼합물의 서로 및 다른 성분들과 교차-혼성화를 최소화하기 위해 성장한다. 일부 캡쳐가능한 또는 "어탭터" 서열들은 미국출원공개공보 20030096239에 개시된다. 예시적인 캡쳐가능한 서열들은 다음 기준을 충족하는 것이다. 이들은 게놈, 바람직하게는 인간 게놈에서 발견되지 않으며 헤어핀 루프와 같은 바람직하지 않은 구조를 갖지 않는다.
또한, 당업자가 알 수 있듯이, 캡쳐가능한 서열은 시스템의 형태에 따라, 3' 및 5' 말단 상의 키메릭 올리고뉴클레오티드 속에 또는 내부 위치에 포함될 수 있다.
당업자가 알 수 있듯이, 캡쳐가능한 서열들의 길이는 결합의 원하는 "강도" 및 원하는 다른 캡쳐가능한 서열들의 숫자에 따라, 변할 것이다. 일부 실시예에서, 캡쳐가능한 서열은 일반적으로 길이가 약 6 내지 약 500, 주로 약 8 내지 약 100 및 더욱 주로 약 10 내지 약 25 염기 쌍의 범위이다.
일부 실시예에서, 캡쳐가능한 서열은 표적 서열이 결합하는 표적 서열을 독특하게 동정한다. 즉, 캡쳐가능한 서열은 자체로는 표적 서열에 결합할 필요가 없는 반면, 시스템은 캡쳐가능한 서열의 존재를 탐지함으로써 표적 서열을 동정한다. 따라서, 캡쳐가능한 서열의 탐지는 표적 서열의 존재를 나타내는 역할을 한다.
표적 핵산 서열의 적절한 하부서열을 동정하기 위한 방법과 알고리즘은 분자 생물학 분야의 당업자들에게 주지되어 있고 널리 사용되고 있다. 상기 방법은 서열 배열 방법(Gotoh O. Multiple sequence alignment: algorithms and applications. Adv Biophys. 1999; 36:159-206. Lecompte O, Thompson JD, Plewniak F, Thierry J, Poch O./Multiple alignment of complete sequences (MACS) in the post-genomic era. Gene. 2001 May 30;270(1-2):17-30.), 베이직 로컬 얼라인먼트 시퀀스 툴 및 FASTA 프로그램(Pearson WR. Flexible sequence similarity searching with the FASTA3 프로그램 패키지. Methods Mol Biol. 2000; 132:185-219; Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J.(1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410)과 같은 도트매트릭스 방법 및 데이타베이스 탐색 방법을 포함한다. 표적 핵산 서열의 하부서열은 핵산 서열의 집단에서 보관되는 영역일 수 있거나 특정 표적 핵산 서열에 독특한 영역일 수 있다.
표적 핵산 서열들의 하부서열에 혼성화하는 표적 서열들을 설계하는 방법은 주지되어 있고 널리 사용되고 있다. 이에 대해서는, 다음을 참조할 수 있다: Dieffenbach., 1995 PCR 프라이머: A Laboratory Manual, CSHL press, Cold Spring Harbor, USA; Erlich, 1989, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplication, Stockton Press, New York; Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York; Ellingboe et al., 1991, Critical Reviews in Biochemisty and Molecular Biology 26: 301-334; Hughes et al., 2001, Nat . Biotechnol. 19:342-347; Kane et al., 2000, Nucleic Acids Res . 28:4552-4557; Relogio et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30:e51; Wang et al., 2003, Bioinformatics 19:796-802; Chent et al., 2002, BMC Bioinformatics 3:27; Hill et al., 2002, Proceedings of Objects in Bio -& Chem -Informactics, OMG Object Management Group, Washington, DC(USA), pp 39-44; Li et al., 2001, Bioinformatics 17:1067-1076; Lipshutz et al., 1999, Nat . Genet. 21: 20-24; Nielsen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:3491-3496; Raddatz et al., 2001, Bioinformatics 17:98-99; Rahmann, 2003, Journal of Bioinformatics and Compuational Biology 1:343-361; Reymond et al., 2004, Bioinformatics 20:271-273; Rimour et al., 2003, Proceedings of the first Healthgrid Conference, Lyon, France, pp. 88-96; Rouillard et al., 2002, Bioinformatics 18:486-487; Rouillard et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:3057-3062.
일반적으로, 표적 서열은 표적 핵산 서열의 하부서열에 실질적으로 상보적이다. 예를 들어, 만일 표적 핵산 서열의 하부서열이 A-G-T-A-C-T-G인 경우, 상보적 표적 서열은 T-C-A-T-G-A-C로 발현될 것이다. 표적 핵산 서열과 이들의 상보체의 하부서열의 특성은 표적 서열들의 설계를 최적화하기 위해 계산되고 사용된다. 고려되는 특성은 올리고뉴클레오티드 길이(염기 잔기), Tm 및 자가-혼성의 경향을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특성들을 측정하기 위한 알고리즘은 당업자에게 공지되어 있고 널리 사용되고 있다. 다음을 참조할 수 있다: Jarman, 2004, Bioinformatics 20(10): 1644-1645; Gibbs et al., 1997, J. Virol . Methods 63(1-2):9-16; Gibbs et al., 1998, J. Virol . Methods, 74(1):67-76; Antoniw,1995, Mol, Biotechnol . 4(2):111-119; Le Guyader et al., 1996, Arch . Virol . 141(11):2225-22235; Chen et al., 1995, Virus Res . 39(2-3):365-375. Wilson et al., 1993, J. Clin . Microbiol . 323:1573-1580; Chen et al., 1989, FEMS Microbiol. Lett. 57:19024; Greigen et al., 1994, J. Clin . Microbiol . 32:335-351; Evertsson et al., 2000, APMS 108:385-392; Hryniewiecki et al., 2002, J. Herat Valve Dis. 11:870-874; Rothman et al., 2002, J. Infect. Dis. 186:1677-1681; McCabe et al., 1995., Pediatrics 95:165-169; Lisby et al., 2002, Infect. Dis . Clin . North Am. 16:393-412; Ley, 1998, Eur . J. Clin . Microbiol . Infect. Dis. 17:247-253.
본 발명의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 제 1 표적 서열이 혼성화하는 하부서열과 다른 표적 핵산 서열의 하부서열; 또는 표적 핵산 서열의 상보적 가닥의 하부서열 또는 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 서열에 혼성화하는 제 2 표적 서열을 포함한다. 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 반응 생성물을 형성하기 위해, 핵산 처리 반응 및 표적 핵산 서열의 존재하에서 키메릭 올리고뉴클레오티드와 협동한다. 본 발명의 내용에서, 반응 생성물은 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 가닥뿐만 아니라 적어도 하나의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 2 가닥 또는 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열의 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화를 막아서, 시그널링 올리고뉴클레오티드가 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하게 하는 이의 연장 생성물 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 나랑 등(1979, Methods Enzymol. 68:90)의 논문 및 미국특허출원 제 4,356,270에 개시된 인산삼에스터 방법과 같은 임의의 적절한 방법을 사용하여 발생할 수 있다. 선택적으로, 브라운 등(1979, Methods Enzymol. 68:109)에 개시된 인산이에스터 방법은 이런 제제를 위해 사용될 수 있다. 상기 방법의 자동화 실시예가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 이런 자동화 실시예에서, 다이에틸포스포라미디트는 출발 물질로 사용되고 비우케이지 등(1981, Teteahedron Letters 22: 1859-1862)에 개시된 대로 합성될 수 있다. 변형된 고체 지지체 상에 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 미국특허 제 4,458,066 및 4,500,707을 참조할 수 있다. 생물학적 소스(플라스미드 또는 파아지 DNA의 제한 효소 소화의 변형 가닥)로부터 분리되는 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 미국특허 제 5,424,186(포도르 등)에 개시된 방법에 따라 합성된다. 이 방법은 기판 표면상의 정확하게 알려진 위치에서 복수의 다른 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 리소그래픽 기술을 사용한다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드는 안트슨 등., 2000, Nucleic Acid Research 28(12):e58에 개시된 것과 같은 PCR-기초 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 이런 PCR-기초 방법은 통상적으로 100 뉴클레오티드 이상의 긴 올리고뉴클레오티드를 생성하는데 특히 적합하다.
본 발명에 따른 핵산 혼성화는 서로에 대해 또는 DNA 또는 RNA를 포함하는 표적 핵산에 대해 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 위한 적절한 조건하에서 수행된다. 이에 관해서, NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, A PRACITCAL APPROACH(Homes and Higgins, eds.)(IRL press, Washington D.C., 1985)를 참조할 수 있다. 일반적으로, 혼성화가 발생하는 지는 핵산의 길이, pH, 온도, 1가 및 2가 양이온의 농도, 핵산의 하이브리드-형성 영역에서 G 및 C 뉴클레오티드의 비율, 매질의 점도 및 변성체의 존재 가능성에 의해 영향을 받는다. 따라서 바람직한 조건은 특정한 용도에 따라 결정될 것이다. 그러나, 이런 실험 조건은 과도한 실험 없이 일상적으로 결정될 수 있다.
어떤 실시예에서, 높은 판별력의 혼성화 조건은 본 발명의 방법에서 사용된다. 예를 들어, 단일 내부 염기 쌍 미스매치(mismatch)를 함유하는 유사한 올리고뉴클레오티드 프로브와 비교하여 표적 서열과 완전히 일치하고 완전히 상동인 11 내지 17개 염기의 긴 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 구별하는 조건을 개시한 왈레스 등(1979, Nucl . Acids Res. 6:3543)을 참조할 수 있다. 3M 테트라메틸 염화 암모늄을 사용하는 11 내지 20개 염기의 긴 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 대한 조건을 개시하는 우드 등(1985, Proc . Natl . Acid . Sci . USA 82:1585)을 참조할 수 있고, 하이브리드의 용융점은 GC 함량과 무관하게, 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에만 의존한다. 또한, 드라마낙 등(상기)은 6-10개 뉴클레오티드 긴 올리고머의 엄밀한 혼성화를 허용하는 혼성화 조건을 개시하며 유사한 조건은 잠금 핵산(Christensen et al., 2001 Biochem J 354:481-4)과 같은 핵산 유사체를 사용함으로써 가장 쉽게 얻을 수 있다.
일반적으로, 혼성화 반응은 아이소안정화제(isostabilizing agent), 변성제 및/또는 재생 가속제와 같은 혼성화-최적화제를 선택적으로 포함하는 혼성화 버퍼의 존재하에서 수행할 수 있다. 아이소안정화제의 예는 베타인 및 저급 테트라알킬암모늄 염을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 변성제는 이중 가닥 핵산의 염기들 사이의 수소 결합 또는 핵산 분자들의 수화를 방해함으로써 이중 가닥 핵산 분자의 용융 온도를 낮추는 조성물이다. 변성제는 포름아마이드, 포름알데하이드, 다이메틸설폭사이드, 테트라에틸 아세테이트, 우레아, 구아니딘 아이소티오시아네이트, 글리세롤 및 무질서형성염(chaotropic salt)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 혼성화 가속제는 이형 뉴클리어 리보뉴클레오프로틴(hnRP) A1 및 염화 세틸트라이메틸 암모늄(CTAB) 및 브롬화 도데실 트라이메틸암모늄(DTAB)과 같은 양이온 세제, 폴리리신, 스퍼민, 스퍼미딘, 단일 가닥 결합 단백질(SSB), 파이지 T4 유전자 32 단백질 및 암모늄 아세테이트와 에탄올의 혼합물을 포함한다.
만일 본 발명의 핵산 서열들이 2개의 가닥(예를 들어, 게놈 DNA)을 포함하거나 올리고뉴클레오티드 혼성화 및/또는 연장(예를 들어, RNA)을 방해할 수 있는 제 2 구조를 가진다면, 개별 단계 또는 연장된 프라이머 분자의 합성과 동시에 핵산 서열의 가닥을 분리하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있을 것이다. 이런 가닥 분리는 물리적, 화학적 또는 효소적 수단을 포함하는 임의의 적절한 변성 방법에 의해 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 가닥을 분리하는 한 물리적 방법은 실질적으로 완전히(>99%) 변성될 때까지 핵산 서열을 가열하는 것을 포함한다. 통상적인 열 변성은 약 1 분 내지 10분 동안 약 80℃ 내지 105℃의 온도를 포함할 수 있다. 가닥 분리는 헬라카제 또는 헬라카제 활성을 가지며 riboATP(rATP)의 존재하에서 DNA를 변성하는 것으로 알려진 효소 RecA로 알려진 효소 종류의 효소에 의해 유도될 수 있다. 헬리카제로 핵산의 가닥을 분리하기 위한 적절한 반응 조건은 쿤 호프만-베릴링(1978, CSH - Quantitative Biology 43 63)에 의해 개시되고 RecA를 사용하기 위한 기술들은 라딩(1982, Ann . Rev . Genetics 16 405-437)에서 검토된다. 선택적으로, 전기적 변성은, 예를 들어, 저전압 전기를 검사 샘플을 통과하게 인가함으로써(참조로 본 명세서에 포함된 Purvis et al., 1996, 4th World Congress on Biosensors, Bangkok. p 39, Elsevier Advanced Technology, Oxford) 또는 검사 샘플을 묽은 산(7.5 내지 10분 동안 0.25M HCl(Meinkoth and Wahl. 1984, Anal . Biochem. 138 267-284))으로 처리함으로써 폴리뉴클레오티드 서열의 변성을 일으키는데 사용될 수 있다.
5. 탐지
시그널링 시약의 성질에 따라, 본 발명의 시그널링 올리고뉴클레오티들부터 탐지가능한 신호를 탐지하는 것은 시각 검사 또는 장치에 의해 수행될 수 있다. 신호는 형광 레이블에 빛을 조사하고 형광분석기에서 형광물질을 탐지함으로써; 스펙트로포토미터를 사용하여 탐지할 수 있는 염료를 생산하는 효소 시스템을 제공함으로써 반사계를 사용하여 염료 입자 또는 채색된 콜로이드 금속 또는 비 금속 입자의 탐지; 반사능 레이블 또는 방사능 카운터 또는 오토레이도그래피를 사용하는 화학발광을 사용하는 경우 기계적으로 탐지될 수 있다. 따라서, 탐지 수단은 빛이 형광, 냉광, 포커스 빔 또는 레이저 광을 포함할 수 있는 레이블과 관련된 빛을 탐지 또는 스캔하는데 적합할 수 있다. 이런 경우에, 전하 결합 소자(CCD) 또는 포토셀은 어레이의 각 위치로부터의 캡쳐 올리고뉴클레오티드/시그널링 올리고뉴클레오티드 하이브리드로부터 빛의 방출을 스캔하고 디지털 컴퓨터에 직접 데이터를 기록하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 캡쳐 올리고뉴클레오티드가 미세 입자 또는 비드 상에 고정화된다면, 시그널링 시약은 형광 활성화 셀 소팅(FACS) 기술을 사용하여 탐지할 수 있다. 일부 경우에, 신호의 장치 탐지는 필수적이지 않을 수 있다. 예를 들어, 어레어 포멧과 관련된 콜로이드성 금속 입자들 또는 효소적으로 발생된 색 점들에 의해, 어레이의 시각 검사는 어레이 상의 패턴의 해석을 가능하게 할 것이다.
일부 실시예에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드가 고정되는 고체 표면은, 예를 들어, 어레이로부터의 신호의 패턴을 평이한 언어 유전자 프로파일로 변환하기 위해 패턴 인식 장치 및 소프트웨어와 결합될 수 있다. 어떤 실시예에서, 에러이 상의 시그널링 시약으로부터 발생된 신호의 탐지는 '칩 리더'를 사용하여 수행된다. '칩 리더'에 의해 사용될 수 있는 탐지 시스템은 피렁 등(미국특허 제 5,143,854)에 의해 개시된다. 상기 칩 리더는 특정 어레이 위치 또는 형태에서 신호가 진짜호이거나 가짜 신호인 지를 결정하는 신호 처리를 포함할 것이다. 예시적인 칩 리더는 예를 들어, 포도르 등(미국특허 제 5,925,525)에 의해 개시되었다.
특정한 실시예에서, 본 발명의 탐지가능한 신호는 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화되는 시그널링 올리고뉴클레오티드의 양에 따라, 표적 핵산 서열의 존재를 나타낼 뿐만 아니라 표적 핵산 서열의 양을 나타낸다. 이에 대해서는, 표적 핵산의 정량화는 공지된 농도를 가진 표준 핵산 샘플을 참조하는 것과 같이 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 탐지가능한 시그널의 해석은 양성 및 음성 대조군의 산입에 의해 도움을 받을 수 있다. 당업자는 적절한 대조군을 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 양의 대조군은 검사 샘플, 예를 들어, β-액틴 서열에 존재할 수 있는 서열에 특이적인 제 1 하부서열을 가진 키메릭 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 음성 대조군은 제 1 표적 특이적 하부서열이 부족하거나 표적 핵산 서열에 실질적으로 혼성화되지 않는 표적 특이적 하부서열을 가진 키메릭 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
6. 검사 샘플들
본 발명에 따라 사용될 수 있는 적절한 검사 샘플들은 단일 또는 이중 가닥 핵산의 추출물, 또는 임의의 유기체로부터 얻은 이의 복제물을 포함한다. 추출물은 용해물, 세포, 조직 또는 바이러스, 곰팡이, 박테리아, 식물 및 동물로부터 유도된 다른 재료들을 포함하나 이에 한정되지 않는 유기물로부터 임의의 소스로부터 얻을 수 있다.
DNA 또는 RNA과 같은 핵산의 샘플 추출물은 SDS, 삼투압 충격, 초음파 분해, 구아니디늄 아이소티오시아네이트 및 리소자임에 의한 처리에 의해 영향을 받은 세표 용해를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포 용해 단계에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 적절한 DNA는 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함한다. 이런 DNA는 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel et al., eds.)(John Wiley & Sons, Inc. 1995) 및 MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL(Sambrook. et al., eds.)(Cold Spring Habor Press, 1989)에 개시된 여러 개의 통상적으로 사용된 프로토콜 중 임의의 하나에 의해 제조될 수 있다. RNA의 샘플 추출물은 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(상기) 및 MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL(상기) 및 Chomczynski and Sacchi(1987, Anal . Biochem. 162:156).
당업자가 알 수 있듯이, 샘플 추출물은 체액(실제로 임의의 유기체의 혈액, 소변, 혈청, 림프, 타액, 항문 및 질 분비물, 땀, 및 정액); 환경 샘플(공기, 농업, 물 및 토양 샘플); 생물학 무기 샘플; 연구 샘플; DNA, RNA, 단백질 등과 같은 정제 샘플; 원료 샘플(박테리아, 바이러스, 게놈 DNA 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 수의 것들을 포함할 수 있다. 또한 샘플은 서로 혼합된 다른 원료들의 둘 이상의 샘플과 같은 샘플들의 조합을 포함할 수 있다. 당업자가 알 수 있듯이, 실제로 임의의 실험 조작이 샘플에 가해졌다.
7. 반응 형식
본 발명의 분석 방법은 튜브, 마이크로웰, 웨이퍼(즉, 칩) 및 마이크로유체 디바이스를 포함하는 임의의 적절한 반응 용기에서 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 용기는 캡쳐 올리고뉴클레오티드, 키메릭 올리고뉴클레오티드, 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드, 시그널링 올리고뉴클레오티드, 반응 버퍼, 효소, 시그널링 시약 및 뉴클레오티드 전구체의 적어도 하나로 제조 또는 미리 제조된다. 적절하게는, 반응 성분은 본 발명의 분석 방법을 수행하기 위해 미리 최적화된 양으로 용액 속에 또는 동결건조 형태로 반응 용기 또는 용기들에 포함된다. 이런 형태의 예시적 예에서, 마지막 사용자는 분석을 수행하기 위해서 이런 반응 용기에 핵산 샘플, 핵산 처리 효소, 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나를 첨가한다.
일부 실시예에서, 반응 용기는, 예를 들어, 열 사이클러, 인큐베이터 등과 같은 열 제어가능한 환경에 놓이게 된다. 다른 실시예에서, 반응 용기는 이런 분석 방법에서 사용하기 위해 하나 이상의 작업을 수행할 수 있다. 이런 작업은 혼합; 여과; 핵산 추출; 핵산 정제; 결합; 용리; 혼성화, 핵산 처리 반응의 수행(예를 들어, PCT, LCR, OLA, RCA 등) 및 핵산 하이브리드의 변형을 위한 열 제어; 시그널링 올리고뉴클레오티드의 탐지를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이런 형태의 예시적 장치는 예를 들어, 미국특허출원공보 2002/0115200, 2002/0173032, 2003/0008286 및 2005/0142565에 개시된다.
8. 키트
본 발명의 방법에 따른 검사 샘플에서 표적 핵산 서열을 분석하기 위해 필요한 모든 필수 구성요소들은 키트에 함께 결합될 수 있다. 이 키트는 시그널링 시약, 양성 및 음성 대조군, 희석 버퍼 등을 시각화하기 위한 적절한 성분을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한 핵산이 핵산 처리 반응을 받게 하는데 적합한 성분을 포함할 수 있다. 이런 성분은 Taq 중합효소, 역전사효소, DNA 리가아제 등(사용된 핵산 처리 반응 기술에 따라), 뉴클레오티드 전구체 및 버퍼 용액과 같은 다양한 중합효소를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이런 키트는 개별 성분을 위한 구별된 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시사항을 포함한다.
특정한 실시예에서, 본 발명의 키트는 반응 용기에 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드를 가지며 섹션 7에서 개시한 대로, 바람직하게는 동결건조 형태로 시약의 미리 제조한 혼합물을 함유하는 반응 용기를 포함한다.
본 발명을 쉽게 이해하고 실행하기 위해서, 특히 바람직한 실시예들은 다음 비제한적인 예들에 의해 기술될 것이다.
도 1은 호주 인플루엔자 A의 PB2 유전자 절편으로부터 RT-PCR에 의해 발생한 생성물들을 나타내는 아가로스 겔이 H5N3(+), H5N3, H11N6, H7N7, H12N9, HH7N7, H4N4, H6N5 및 H9N2를 분리하는 사진이다.
도 2는 중합효소연쇄반응(PCR)을 사용하는 본 발명의 방법의 한 실시예의 개략도이다. (도 2a) 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드(B);(도 2b) 시그널링 시약(C)을 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오티드(B'');(도 2c) 캡쳐가능한 서열(B') 및 표적 서열(E') & 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드(F')를 포함하는 키메릭 올리고뉴클레오티드; (도 2d) 표적 핵산 서열(E);(도 2e) 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 1 연장 생성물(F)을 포함하는 표적 핵산 서열의 혼성화; (도 2f) 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 연장 생성물을 포함하는 표적 핵산 서열과 제 2 연장 생성물(G)을 포함하는 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 혼성화; (도 2g) 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드 및 시그널링 시약(예를 들어, 양의 신호)을 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오티드의 혼성화; (도 2h) 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드 및 키메릭 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 음의 신호)의 혼성화.
도 3은 롤링 서클 증폭(RCA)을 사용하는 본 발명의 방법의 한 실시예의 개략도이다.
도 4는 결찰 사슬 반응(LCR)을 사용하는 본 발명의 방법의 한 실시예의 개략도이다.
도 5는 결찰 사슬 반응(LCR)을 사용하는 본 발명의 방법의 한 실시예의 개략도이다.
도 6은 결찰 사슬 반응(LCR)을 사용하는 본 발명의 방법의 한 실시예의 개략도이다.
도 7은 종결점 탐지를 사용하는 H7N7 인플루엔자 A cDNA의 분석을 나타내는 그래프이다. 흡수도는 50㎕의 0.5pmol의 PCR-TAG를 사용하여 PCR의 35 사이클 후 450nm에서 측정하였다.
도 8은 본 발명의 방법의 한 실시예에서 최적 양의 PCR-TAG 프라이머를 측정하기 위한 적정 시험의 결과를 도시하는 그래프이고, 종결점 탐지 단계를 사용한다. 샘플들의 흡수도는 PCR 증폭의 35 사이클 후 450nm에서 측정하였다. 더 어두운 점들은 PCR 표적이 존재할 때의 흡수도를 나타내고 더 밝은 점들은 기본 흡수도를 나타낸다.
도 9는 최적 양의 PCR-TAG 프라이머를 측정하기 위해, 도 8에서 참조한 동일한 평가법에 따라 증폭된 PCR 생성물들의 아가로스 겔 전기영동 및 브롬화 에티듐 염색을 도시하는 사진이다. 각각의 경우에 리버스 프라이머는 PCR-TAG 프라이머의 양의 4배를 사용하였다. 음성 대조군들은 출발 주형을 함유하지 않았고 전체 PCR 반응 부피는 50㎕이었다. 레인 번호는 다음을 지정한다: M, Hyper Ladder II; (1) 1pmol의 PCT-TAG 및 H7N7 주형을 사용하는 PCR 생성물; (2) 0.50pmol의 PCR-TAG 프라이머 및 H7N7 주형을 사용하는 PCR 생성물; (3) 0.25pmol의 PCR-TAG 프라이머 및 H7N7 주형을 사용하는 PCR 생성물; (4) 1pmol의 PCR-TAG 프라이머 음성 대조군을 사용하는 PCR 생성물; (5) 0.5pmol의 PCR-TAG 프라이머 음성 대조군을 사용하는 PCR 생성물; 및 (6) 0.25pmol의 PCR-TAG 프라이머 음성 대조군을 사용하는 PCR 생성물.
실시예 1
중합효소 유전자 절편 PB2 의 RT - PCR 탐지
프라이머 디자인:
RT-PCR 프라이머는 인플루엔자 A 바이러스의 PB2 절편의 일부를 증폭하도록 디자인된다. 이노신 또는 혼합된 염기는 여러 다른 바이러스의 중합효소 유전자가 증폭될 수 있도록 하기 위해 여러 위치에 사용된다. 프라이머들의 하나는 PCR 프라이머의 5' 말단이 캡쳐가능한 서열 또는 "태그"를 포함하는 한 키메릭이다. 이 실시예에서 사용된 캡쳐가능한 서열은 도 2에 B'로 표지화된 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC-3'9([SEQ ID NO:1]이고 디자인인 미국특허 제 6,027,884에 개시된 서열들 중 하나이다. 표적 서열(인플루엔자 A 바이러스)에서 발견되지 않는 임의의 다른 서열일 수 있다.
키메릭 인플루엔자 포워드 프라이머 Ch-PB2(1)F는 서열 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC AG(C/T) TCI TC(C/T) TT(C/T) AG(C/T) TT(C/T) GG-3'[SEQ ID NO:2]를 포함하였다. 인플루엔자 리버스 프라이머 PB(2)R은 서열 5'-AGT AT(T/C) CTC AT(T/C) CTC AT(T/C) CC(T/A) GAN CC-3'[SEQ ID NO:3]을 포함한다. 이런 프라이머로부터 얻은 생성물의 예상 크기는 대략 1010bp이다. 그러나, 이 크기는 PB2 Z 코딩 서열이 분리물들(isolates) 사이에서 약간 변할 수 있기 때문에 바이러스가 대상 샘플에 존재하는 지에 따라 변할 수 있다(도 1).
샘플로부터 RNA 의 추출:
바이러스 RNA는 이하의 제조사의 지시에 따라 QLAGEN RNA 이지 추출 키트를 사용하여 샘플(예를 들어, 양수 또는 임상 샘플)로부터 추출하였다. 100μL의 샘플을 QUAGEN 추출 프로토콜에서 사용하기 전에 600μL의 구아니듐 변형물과 6μL의 2-머캡토에탄올의 첨가에 의해 불활성화하였다. 추출된 RAN는 50μL의 Rnase 제거수(QIAGEN)에 재현탁하였다. 2μL의 재현탁된 RNA는 RT-PCR 반응에서 사용하였다.
정량화:
대략 100 피코몰의 캡쳐 올리고뉴클레오티드(도 2에서 B로 표지화됨)(스페이서 5'-GAT TTG TAT TGA TTG AGA TTA AAG-3'; [SEQ ID NO:4])를 96 웰 플레이트의 벽 상에 또는 열 순환 장치에서 사용하기에 적합한 모양의 튜브의 긴 조각에 고정하였다. 캡쳐 올리고뉴클레오티드를 기질에 결합하는 것은 5'변형 그룹(예를 들어, 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 아미노기와 5'말단 사이의 (CH2)6 "스페이서" 서열(또는 유사)을 가진 아미노기)을 사용하여 성취될 수 있다. 선택적으로, 비공유적으로 결합할 수 있으나 스트렙타비딘으로 코팅된 플레이트에 매우 높은 친화력을 가진 5' 비오틴 모이어티는 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 한 말단에 포함된다.
시그널링 올리고뉴클레오티드는 시그널링 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 올리고뉴클레오티드로 미리 코팅된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 첨가된 탐지 모이어 티(예를 들어, 라텍스 마이크로비드)에 컨쥬케이트된 서열 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC-3'(도 2에 B''로 표지화된 [SEQ ID NO:1])을 함유하게 디자인된다. 시그널링 올리고뉴클레오티드는 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 질량과 대략 동일한 질량으로 첨가된다. 첨가되는 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 정확한 질량은 시약의 각 평가법과 각 배치를 위한 적정에 의해 실험적으로 결정되어야 한다.
정량화에 대한 기준:
PB2 유전자의 986bp 절편은 플라스미드 PCR TOPO2.1(인비트로겐) 속에 복제되었다. 이 플라스미드("대조군 플라스미드"로 불림)는 포워드 프라이머 Ch-PB2(1)F 및 리버스 프라이머 PB2(2)R의 바이러스 서열 보상적 부분에 상보적인 서열들을 가진다. 대조군 플라스미드는 평가법에서 정량화 기준으로 RT-PCR 반응을 위한 시약 대조군으로 연속 희석에 사용될 수 있다. 웰 당 0 내지 10,000 피코몰의 범위에서 플라스미드의 연속 희석은 정량화 및 시약 대조군을 사용될 수 있다. 대략 100 피코몰의 캡쳐 프라이머가 웰 당 고정될 때, 정량화 기준을 위한 농도 범위는 웰 당 0, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 및 10,000 피코몰을 포함하는 웰 당 0 내지 10 나노몰의 범위이어야 하며, 표준의 각 농도에 대해 복제물 웰을 가진다.
RT - PCR 반응:
1. 열 순환기를 cDNA 합성 후에 PCR 증폭되도록 프로그램하였다:
cDNA 합성:
1 사이클: 46℃에서 30분 더하기 60℃에서 10분
변형:
1 사이클: 2분 동안 94℃
PCR 증폭:
다음으로 이루어진 스텝 다운 PCR의 8 사이클:
94℃에서 15s 변형
연속된 "스텝 다운 사이클"의 각각에서 56℃, 54℃, 50℃, 48℃, 46℃, 44℃, 42℃에서 30s 어닐링
68℃에서 75s 연장
이후에:
36 사이클: 15s 동안 94℃(변형)
30s 동안 40℃(어닐링)
75s 동안 68℃(연장)
최종 연장(선택적):
1 사이클: 5분 동안 68℃
2. 얼음 상의 0.2mL, 뉴클레아제-제거, 박벽 PCR 튜브(벽에 미리 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드를 가짐):
2 x 반응 믹스 25μL
주형 RNA 2μL 또는 대조군 플라스미드의 일련의 희석(정량화 기준)(2μL)
센서 프라이머 Ch-PB2(1)F 2μL(160 피코몰)
안티-센스 프라이머 2μL(160 피코몰)
슈퍼스크립트 III RT/백금 Taq 믹스(인비트로겐) 2μL
2μL의 시그널링 올리고뉴클레오티드(100 피코몰 또는 적절에 의해 미리결정된 다른 양)
50μL의 RNAse 제거 수
3. 모든 성분들이 증폭 튜브의 바다에 있게 하기 위해 부드럽게 혼합하고 간략히 원심분리한다. 상기한 대로 프로그램된 미리 가열된 열 순환기 속에 반응 판 또는 튜브를 놓는다.
4. 반응 진행함에 따라, 키메릭 인플루엔자 포워드 프라이머 Ch-PB2(1)F 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC AG(C/T) TCI TC(C/T) TT(C/T) AG(C/T) TT(C/T) GG-3'[SEQ ID NO:2]를 이중 가닥 PCR 생성물 속에 포함되고 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드(스페이서-5'-GAT TTG TAT TGA TTG AGA TTA AAG-3'; [SEQ ID NO.4]) 및 시그널링 올리고뉴클레오티드 사이에서 결합을 위해 경쟁하지 않도록 격리된다.
이렇게 각 PCR 사이클의 "어닐링" 단계에서 결합된 시그널링 올리고뉴클레오티드의 양은 반응이 진행함에 따라 증가한다.
미지의 물질을 함유하는 튜브/웰에서의 신호의 강도는 표준 곡선을 만들기 위해서 연속적으로 희석된 플라스미드 기준으로 증폭된 튜브/웰에서의 신호의 강도와 비교한다. 표준 곡선과 비교함으로써, 샘플 속의 표적 바이러스 서열의 농도는 계산될 수 있다.
표준 곡선을 생성하기 위해 개별 튜브/웰을 사용하는 것이 의무는 아니다. 후자에서 "내부 기준"은 서열 미관련 표준 RNA 또는 플라스미드의 공지된 양은 RNA 또는 플라스미드만을 탐지하는 다른 키메릭 프라이머 및 시그널링 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하는 미지의 샘플로서 동일한 반응 튜브에서 공동-증폭될 수 있게 사용될 수 있다. 미지의 샘플에 의해 발생된 신호의 양은 동일한 튜브에서 내부 표준 RNA 또는 플라스미드에 의해 발생된 신호와 비교할 수 있다.
신호의 강도의 측정은 PCR 반응의 모든 사이클의 말단에서 수행될 수 있거나 PCR 반응의 각 사이클에서 판독 장치에 의해 확인될 수 있다.
다른 실시예에서, 시그널링 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 주형 RNA 이외의 모든 성분들과 함께 반응 튜브 속에 미리 포함될 수 있다(예를 들어, 동결 건조에 의함). 반응 믹스는 물의 첨가에 의해 재조합될 수 있다.
실시예 2
"종점" 탐지
이 실시예는 증폭 단계로부터 분리된 "종점" 탐지 단계를 사용한다. 탐지 시약과 시그널링 시약은 96 웰 플레이트에 존재하며 실시예 1에서 개시된 대로 웰 당 고정된 대략 100 피코몰의 캡쳐 올리고뉴크레오티드를 가진다. 캡쳐가능한 키메릭 RT-PCR 프라이머는 실시예 1에 주어진 (Ch-PB2(1)F 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC AG(C/T)-TCI TC(C/T) TT(C/T) AG(C/T) TT(C/T) GG-3')[SEQ ID NO:2]이다. 시그널링 올리고뉴클레오티드는 실시예 1과 같지만 바이오티닌일화되고 캡쳐 올리고뉴클레오티드와 대략 동일한 몰 양으로 탐지 웰에 존재한다(비록 각 다른 분석물을 위해 적정될 것이다). RT-PCR 프라이머는 실시예 1에 사용된 것과 동일하다.
RT-PCR 반응은 실시예 1과 같이 수행되나, RT-PCR 동안 캡쳐 올리고뉴클레오 티드와 시그널링 올리고뉴클레오티드의 삽입 없이 수행된다. 연속적으로 희석된 플라스미드 대조군은 정량화 기준으로 포함된다. RT-PCR 반응이 완결되자마자, 반응 생성물은 젖은 얼음에서 5분 동안 94℃로 가열하고 탐지 판으로 운반된다.
PCR 반응이 진행함에 따라, 키메릭 캡쳐가능한 PCR 프라이머는 이중 가닥 생성물 속에 포함되고 시그널링 올리고뉴클레오티드와 결합하기 위해 캡쳐 올리고뉴클레오티드와 덜 효과적으로 경쟁한다. PCR 생성물의 양이 반응의 종료시에 많이 존재하면 할수록, 시그널링 올리고뉴클레오티드의 결합을 위한 경쟁은 줄어든다.
37℃에서 20분 후에, 탐지 판은 1 X SSC pH 7.2의 웰 당 300μL에서 3회 세척하고 그런 후에 스트렙타비딘 퍼록시다아제 켄쥬케이트(Roche Cat. No. 1089153)를 PBS/0.1% Tween/0.5% BSA에 1:10,000로 희석하여 웰에 첨가하고 30분 동안 37℃에서 배양하고 PBS/Tween에서 3회 세척한다. 판을 뒤집어서 배수하고 기질을 각 웰에 첨가한다. 그런 후에 100mM 아세트산 나트륨/시트르산, pH 4.9 속에 0.42mM TMB((Roche Cat. No. 11484281001), 0.004% H202(v/v)를 첨가한다. 2M H2SO4로 반응을 종결한다. 형성된 생성물은 처음에는 파란색이고 멈춘 후에는 노란색이고 물에 용해된다. 흡수도는 참조 파장 650nm에 대해 450nm에서 ELISA 판 리더 상에서 측정한다.
실시예 3
리가아제 -의존 반응
본 예시적 실시예에서 사용된 DNA는 인플루엔자 A PB2 유전자 절편의 코팅 영역의 이중 가닥 DNA 복제물을 함유하는 대조군 플라스미드 DNA이다. 이 플라스미드에서, PB2 유전자의 986bp 절편은 플라스미드 PCR TOP02.1(인비트로겐) 속에 삽입되었다.
키메릭 결찰 올리고뉴클레오티드 서열:
결찰가능한 올리고뉴클레오티드는 코돈 627을 포함하는 인플루엔자 A의 영역(또는 인플루엔자 A에서 PB2의 서열에서 위치 동일 수 위치)에 상보적이게 디자인된다. Ch-PB2U 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC TTG CAG CIG CIC CAC CIG-3'(도 4에 도시된 B'-E1'로 표지화된 [SEQ ID NO:5]). PB2D-5'-AIC AIA GIA GIA TGC AGT-3'(도 4에 E2'로 표지화된 [SEQ ID NO:6]). 상부 키메릭 결찰 올리고뉴클레오티드에 사용된 캡쳐가능한 서열은 실시예 1에 사용된 서열과 동일하다.
예를 들기 위해서, 리가아제 의존 반응은 표적으로 상기한 기준 플라스미드 DNA를 사용하고, 열 안정성 DNA 리가아제를 사용하여 수행된다. 대조군 플라스미드(상기) 속의 인플루엔자의 PB2 절편의 일부를 증폭하고 탐지하는 공정은 다음과 같이 수행된다(벨그라더 등으로부터 변형된 프로토콜., 1995, Genetic Identity Conference Proceedings, Sixth International Symposium on Human Identification):
플라스미드의 5μL 분취량을 50mM Tris/HCl pH8.5, 50mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM NAD+, 10mM DTT, LCR 올리고뉴클레오티드 세트(각 프라이머, Ch-PB2U 및 PB2D의 50 피코몰) 및 Taq DNA 리가아제의 10 반복단위를 함유하는 20μL의 LCR 믹스에 희석한다. 열 순환은 변형을 위해 2분 동안 95℃의 1 사이클 동안 수행하며, 그런 후에 변형을 위해 30초 동안 95℃ 및 결찰을 위해 4분 동안 65℃의 20 내지 25 사이클 동안 수행한다.
리가아제 매개 반응을 위한 반응 용기는 제 2의 특별히 디자인된 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드(도 4에서 B2-E2로 표지화됨)를 포함하는 탐지 시스템을 포함한다.
탐지 시스템의 경우, 대략 50 피코몰의 캡쳐 올리고뉴클레오티드(스페이서-5'-GAT TTG TAT TGA TTG AGA TTA AAG-3')(도 4에 B로 표지된 [SEQ ID NO:4])가 96 웰 플레이트의 벽 상에 또는 열 순환 장치에서 사용하기에 적합한 모양의 튜브의 긴 조각에 고정하였다. 캡쳐 올리고뉴클레오티드를 기질에 결합하는 것은 5'변형 그룹(예를 들어, 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 아미노기와 5'말단 사이의 (CH2)6 "스페이서" 서열(또는 유사)을 가진 아미노기)을 사용하여 성취될 수 있다. 선택적으로, 비공유적으로 결합할 수 있으나 스트렙타비딘으로 코팅된 플레이트에 매우 높은 친화력을 가진 5' 비오틴 모이어티는 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 한 말단에 포함된다.
시그널링 올리고뉴클레오티드는 시그널링 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 올리고뉴클레오티드로 미리 코팅된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 첨가된 탐지 모이어티(예를 들어, 라텍스 비드)에 컨쥬케이트된 서열 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC-3'[SEQ ID NO:1]을 함유하게 디자인된다. 첨가되는 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 정확한 질량은 시약의 각 평가법과 각 배치를 위한 적정에 의해 실험적으로 결정되 어야 한다.
리가아제 매개 반응은 다음을 포함한다:
1. 2분 동안 95℃에서 표적 플라스미드 DNA를 변형시키는 단계
2. 제 1 하이브리드를 형성하기 위해, 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 혼성화하는 단계, 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이다.
3. 제 2 하이브리드를 형성하기 위해, 표적 핵산 서열의 제 2 하부서열에 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드(PB2D)의 제 2 표적 서열을 혼성화하는 단계, 제 2 하부 서열은 제 1 하부서열에 인접하게 위치한다.
4. 표적 핵산 서열의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스와 키메릭 올리고뉴클레오티드와 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드 모두를 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해 효소 Taq DNA 리가아제를 사용하여 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드의 존재하에서 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드와 키메릭 올리고뉴클레오티드를 결찰하는 단계.
5. 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 자유롭게 하기 위해 30초 동안 95℃에서 제 1 듀플럭스를 변형시키는 단계.
6. 반응 생성물을 형성하기 위해 결찰 생성물의 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 1 코퍼레이팅 서열 일부에 제 2의 특별히 디자인된 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계. 제 2의 특별히 디자인된 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 리가아제 매개 순환 공정의 마지막에 첨가될 수 있고 또는 공정의 초기부터 반응 믹스에 존재할 수 있다.
7. 상기에 형성된 반응 생성물은 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드(도 4에 B2-E2로 표지화됨) 내에 함유된 블러킹 올리고뉴클레오티드의 격리를 초래한다. 블러킹 서열의 격리는 시그널링 올리고뉴클레오티드가 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드와 혼성화하게 하고 표적 서열의 양과 정량적으로 관련이 있는 (라텍스 마이크로비드의 국소 농도에 의한) 신호를 최종 발생시킨다.
발생된 신호는 대조 플라스미드의 공지된 시작 농도 및 미공지된 샘플의 시작 농도의 연속적 희석에 의한 리가아제 매개 탐지 공정에 의해 발생된 기준 곡선과 비교된다.
실시예 4
롤링 서클 증폭 반응
이 실시예는 코돈 627을 포함하는 인플루엔자의 PB2 유전자 절편의 영역의 탐지 및 증폭을 개시한다. 이 실시예에서, PB2 유전자 절편의 986bp DNA 인서트를 가진 플라스미드 PCR-TOPO2.1(인비트로겐)가 표적으로 사용된다. 최초 결찰과 RCA 단계를 위한 프로토콜은 미국특허 제 5,854,033에 개시된다.
1. 각 희석에서 1 나노그램으로부터 300 나노그램 범위의 플라스미드의 여러 연쇄 희석은 97℃에서 4분 동안 개별 플라스틱 튜브에서 열 변형되고 5' 및 3' 말단이 결찰 올리고뉴클레오티드 CH-PB2U 및 PB2D의 표적 특이적 일부와 동일한 5' 인산화된 오픈 사이클 프로브의 존재하에서 결찰 조건하에서 배양된다. 95 뉴클레오티드의 오픈 서클 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드는 다음 서열 5'-AIC AIA GIA GIA TGC AGT TCA TAA GAC TCG TCA TGT CTC AGC AGC TTC TAA CGG TCA CTA ATA CGA CTC ACT ATA GG TTG CAG CIG CIC CAC CIG-3'[SEQ ID NO:7]과 함께 사용된다. T4 DNA 리가아제(뉴잉글랜드바이오랩)는 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.20M NaCl, 10mM MgCl2, 2mM ATP로 이루어진 버퍼 속에 μL 당 5 유닛의 농도로 반응 믹스에 존재한다. 오픈 서클 프로브의 농도는 80mM이다. 전체 반응 부피는 40 마이크로리터이다. 결찰은 37℃에서 25분 동안 수행된다.
2. 25μL은 각 튜브로부터 취하고 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM의 dTTP, dATP, dGTP, dCTP로 이루어지며, 0.2μM의 농도로, 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC GCT GAG ACA TGA CGA GTC-3'[SEQ ID NO:8]과 함께 키메릭 42 염기 롤링 서클 복제 프라이머를 함유하는 동일한 부피의 버퍼와 혼합한다. 이 서열의 영역은 RT-PCR를 위해 실시예 1에서 사용된 캡쳐가능한 서열과 동일한 캡쳐가능한 서열이라는 것을 주의해야 한다. 다른 영역은 오픈 서클 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드[SEQ ID NO:7]와 상보적이다.
3. Φ29 DNA 중합효소(50μL 당 160ng)를 첨가하고 반응 혼합물을 30℃에서 30분 동안 배양한다
4. 상기 반응에 새롭게 합성된 가닥에 상보적인 다른 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드, 즉, 리버스 프라이머를 첨가한다. 이 프라이머의 농도는 0.2μM이고 서열은 5'-AAT ACG ACT CAC TAT AGG-3'[SEQ ID NO:9]이다. 반응은 30℃에서 추가로 30분 동안 계속되게 하고 둥글게 만들어진 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드에 최초 로 상보적인 서열에 역으로 상보적이고 SEQ ID NO:8의 영역에 상보적인 서열(블러킹 서열로 작용)을 포함하는 제 2 가닥이 합성된다.
5. 각 반응 튜브는 SEQ ID NO:8(상기)의 영역에 상보적인 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드[SEQ ID NO:4]와 실시예 1에서 사용된 시그널링 올리고뉴클레오티드와 동일한 시그널링 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 제 2 가닥의 합성이 단계 4에서 진행함에 따라, 블러킹 서열은 합성되고 이 서열은 SEQ ID NO:8의 영역을 격리하여, 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드 서열[SEQ ID NO:4] 및 시그널링 올리고뉴클레오티드 사이의 결합을 완결하는데 덜 사용하게 한다. 제 2 가닥 생성물의 양이 축적됨에 따라 결합 시그널링 올리고뉴클레오티드의 양은 증가할 것이다. 발생된 신호의 양은 시작 반응에 첨가된 플라스미드의 양에 비례한다.
6. RCA의 다른 예에서, 순서는 탐지 단계가 반응의 완결에서 수행되며 각 반응의 25μL 샘플은 마이크로웰 플레이트 속의 개별 탐지 웰에 운반되는 것을 제외하고 이전 실시예와 동일하다. 탐지 웰은 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 100 피코몰로 미리 코팅되고 바이오틴에 접합된 시그널링 올리고뉴클레오티드(100 피코몰)를 함유한다. 결합 시그널링 올리고뉴클레오티드의 농도는 스트렙타비딘 퍼록시다아제(Roche Cat. No. 1089153) 및 기질 TMB(실시예 2에 상기한 동일한 방법 사용)를 사용하여 탐지한다.
실시예 5
"종점" 탐지 II
이 실시예는 종점 탐지 단계의 다른 예를 나타낸다. 탐지 시약과 시그널링 시약은 실시예 1에 개시된 대로 웰 당 고정된 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 대략 .01 피코몰로 96 웰 플레이트에 존재한다. 캡쳐가능한 키메릭 RT-PCR 프라이머는 5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC GAI GTI AGI GAI ACI CAI GG-3'[SEQ ID NO:10]이다. 시그널링 올리고뉴클레오티드는 실시예 1과 같으나 FAM 표지화되며 캡쳐 올리고뉴클레오티드로 대략 동일한 몰 양으로 탐지 웰에 존재한다(비록 각 다른 분석물을 위해 적정될 것이다). PCR 프라이머는 아래 표에 나열된다(PCR-TAG 프라이머 및 PB2(2) 리버스 프라이머).
PCR 반응은 실시예 1과 같이 수행하였으나, 표적으로 200 피코그램의 cDNA으로 시작하고 최초 RT(역전사) 단계를 생략한다. 반응은 PCR 동안 캡쳐 올리고뉴클레오티드와 시그널링 올리고뉴클레오티드의 삽입 없이 수행된다. PCR 반응이 완결되자마자 반응 생성물은 아래와 같이 처리된다.
PCR 반응이 진행함에 따라, 키메릭 캡쳐가능한 PCR 프라이머(PCR-TAG 프라이머)는 이중 가닥 생성물 속에 포함되고 시그널링 올리고뉴클레오티드와 결합하기 위해 캡쳐 올리고뉴클레오티드와 덜 효과적으로 경쟁한다. PCR 생성물의 양이 반응의 종료시에 많이 존재하면 할수록, 시그널링 올리고뉴클레오티드의 결합을 위한 경쟁은 줄어든다.
H7N7 인플루엔자 A cDNA의 탐지를 위한 특정 반응 조건은 다음과 같다:
DNA 주형(H7N7 인플루엔자 A cDNA) 200pg
PCR-Tag 프라이머"5'-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC GAI GTI AGI GAI ACI CAI GG-3'[SEQ ID NO:10] 0.5 내지 1 피코몰
PB2(2) 리버스 프라이머: 5'-AGT ATY CTC ATY CCW GAI CC-3' [SEQ ID NO:3] 4 피코몰
dNTPs 0.2mM
DNA 중합효소 1 유닛
MgCl2 2mM
PCR 버퍼 1 x
최종 부피에 대한 물 50μL
PCR 증폭(35 사이클) 후에, PCR 생성물을 1/2로 희석한다.
다음 혼합물을 제조한다:
Anti-tag:(5'-바이오틴-GAT TTG TAT TGA TTG AGA TTA AAG-3', [SEQ ID NO:4] 0.01 피코몰
Tag:(5'-FAM-CTT TAA TCT CAA TCA ATA CAA ATC-3', [SEQ ID NO:1]) 0.25 피코몰
Anti-tag와 tag의 전체 부피는 물로 보충 50μL
PCR 생성물 50μL
100μL의 반응 혼합물을 스트렙타비딘 플레이트 상의 각 웰로 운반하고 37℃에서 40분 동안 배양한다.
플레이트로부터 혼합물을 기울여 버리고 4회 PBS로 세척한다.
항체 희석제(150mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 2% V/V FBS(태아 소 혈청))에서 1:1,000으로 희석된 퍼옥시다아제 접합 안티-FAM 항체의 100μL(15m 유닛)를 스트렙타비딘 플레이트의 각 웰에 첨가하고 40분 동안 37℃에서 배양한다.
플레이트로부터 혼합물을 기울여 버리고 4회 PBS로 세척한다.
100μL의 BM 블루(로체) 기질을 스트렙타비딘 플레이트의 각 웰에 첨가하고 5분 동안 실온에서 배양한다.
100μL의 H2SO4을 스트렙타비딘 플레이트의 각 웰에 첨가하고 10분 동안 실온에서 배양한다.
450nm에서 흡수도를 측정한다.
도 7에 도시된 이 분석 결과는 평가법은 종점 탐지 단계를 사용하여 배경에 대해 노이즈 오버(noise over)하는 좋은 신호로 H7N7 인플루엔자 A cDNA를 선택적으로 탐지한다.
도 8은 상기 평가법에서 PCR-TAG 프라이머의 최적 양을 결정하는 적절 실험의 결과를 도시한다. 이런 결과는 PCR-TAG 프라이머의 최적 양은 50μL에서 대략 0.5 피코몰이라는 것을 나타낸다. 이 방법을 사용하여 증폭된 PCR 생성물은 아가로스 겔 전기영동 및 브롬화 이티듐 오염에 의해 결정된 대로 예상된 크기를 가졌다(도 9 참조).
본 발명에서 인용된 각 특허, 특허출원 및 공개공보는 전체로서 참조로 본 명세서에 포함된다.
임의의 참조문헌의 인용은 이런 참조문헌이 본 출원에 대한 "종래 기술"로 이용할 수 있다는 것을 인정하는 것으로 해석해서는 안 된다.
본 명세서를 통해서 본 발명의 목적은 본 발명을 임의의 하나 이상의 실시예 또는 특징들의 구체적인 집합에 한정하지 않으며 본 발명의 바람직한 실시예를 개시하는 것이다. 따라서 당업자는 개시의 면에서, 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 예시된 특정 실시예에서 이루어질 수 있다는 것을 알 것이다. 모든 이런 변형 및 변화는 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있음

Claims (27)

  1. 반응 용기에서 다음을 혼합하는 단계:
    (1) 표적 핵산 서열과 혼성화하지 않는 캡쳐 올리고뉴클레오티드(capture oligonucleotide)(예를 들어, 고정되거나 용액에서 자유로움)
    (2) 탐지가능한 신호를 제공하고 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 시그널링 올리고뉴클레오티드;
    (3) (a) 표적 핵산 서열의 서열에 혼성화하는 제 1 표적 서열; 및
    (b) (i) 캡쳐 올리고뉴클레오티드; 또는
    (ii) 시그널링 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 서열에 혼성화하는 캡쳐가능한 서열을 포함하는 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드
    (4) (a) 제 1 표적 서열이 혼성화하는 하부서열과 다른 표적 핵산 서열의 다른 서열; 또는
    (b) 표적 핵산 서열의 상보적 가닥의 하부서열 또는
    (c) 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 서열에 혼성화하는 제 2 표적 서열을 포함하는 적어도 하나의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드(cooperating olignucleotide); 및
    (5) 핵산을 포함하는 검사 샘플;
    표적 핵산 서열이 검사 샘플에 존재하는 경우 반응 생성물을 형성하기 위해 반응 용기의 내용물을 핵산 처리 반응에 첨가하는 단계(이렇게 형성된 반응 생성물 은 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 가닥뿐만 아니라 적어도 하나의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 2 가닥 또는 키메릭 올리고뉴클레오티드의 캡쳐가능한 서열의 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화를 막아서, 시그널링 올리고뉴클레오티드가 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성화하게 하는 이의 연장 생성물 포함한다); 및
    검사 샘플에 표적 핵산 서열의 존재 또는 양을 나타내는 시그널링 올리고뉴클레오티드로부터 탐지가능한 신호를 탐지하는 단계를 포함하는 검사 샘플에서 표적 핵산 서열을 분석하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산 처리 반응은 중합-의존성 핵산 처리 반응인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    a) 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 키메릭 올리고뉴클레오티드의 표적 서열의 표적 핵산 서열에 대한 혼성화하는 단계(상기 표적 핵산 서열은 표적 핵산 서열의 비혼성화 부분을 한정하기 위해 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오티드를 넘어 3' 내지 5' 방향으로 연장된다);
    b) 제 1 연장 생성물을 포함하는 제 1 듀플렉스(duplex)를 형성하기 위해 주형으로서 표적 핵산 서열의 비혼성 부분을 사용하는 중합제 및 뉴클레오티드 전구체의 존재하에서 제 1 혼성의 키메릭 올리고뉴클레오티드의 연장 단계;
    c) 제 1 연장 생성물로부터 표적 핵산 서열을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계;
    d) 제 2 하이브리드를 형성하기 위해 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 제 1 연장 생성물과 혼성화하는 단계(상기 제 1 연장 생성물은 제 1 연장 생성물의 비혼성 부분을 한정하기 위해 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 3'말단 뉴클레오티드를 넘어 3' 내지 5' 방향으로 연장된다); 및
    e) 제 1 연장 생성물에 상보적인 제 1 연장 생성물과 제 2 연장 생성물을 포함하는 반응 생성물을 형성하기 위해서, 주형으로 제 1 연장 생성물을 사용하는 중합제와 뉴클레오티드 전구체의 존재하에서 제 2 하이브리드의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 연장하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    단계 a) 내지 e)는 1회 이상 반복되는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 중합제는 프라이머 의존성 DNA 중합효소인 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    단계 b)의 상기 중합제는 프라이머 의존성 역전사효소인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 중합-의존성 핵산 처리 반응은
    i) 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 순환가능한 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이다);
    ii) 표적 핵산 서열의 제 2 하부서열에 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 2 하부서열은 제 2 하이브리드를 형성하기 위해 제 1 하부서열에 인접하게 위치한다),
    iii) 표적 핵산 서열의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스 및 순환하는 형태로 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 1 및 제 2 표적 서열을 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드 및 결찰제(ligation agent)의 존재하에서 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 1 및 제 2 표적 서열을 결찰하는 단계,
    iv) 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계,
    (v) 제 3 하이브리드를 형성하기 위해 결찰 생성물로 키메릭 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계,
    (vi) 제 1 연장 생성물을 형성하기 위해, 주형으로서 결찰 생성물을 사용하여 중합제 및 뉴클레오티드 전구체의 존재하에서 제 3 하이브리드의 키메릭 올리고 뉴클레오티드를 연장하는 단계,
    (vii) 제 4 하이브리드를 형성하기 위해 제 1 연장 생성물에 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계, 및
    (viii) 제 1 연장 생성물 및 제 1 연장 생성물에 상보적인 제 2 연장 생성물을 포함하는 반응 생성물을 형성하기 위해서, 주형으로서 제 1 연장 생성물을 사용하여 중합제(예를 들어, φ29 DNA 중합효소를 포함하나 이에 한정되지 않는 프라이머 의존성 DNA 중합효소) 및 뉴클레오티드 전구체의 존재하에서 제 4 하이브리드의 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 연장하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산 처리 반응은 리가아제-의존성 핵산 처리 반응인 방법.
  9. 제 3 항에 있어서,
    1. 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 혼성화하는 단계(키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이다);
    2. 표적 핵산 서열의 제 2 하부서열에 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 2 하부서열은 제 2 하이브리드를 형성하기 위해 제 1 하부서열에 인접하게 위치된다);
    3. 표적 핵산의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스 및 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 모두 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드 및 결찰제의 존재하에서 키메릭 올리고뉴클레오티드를 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드로 결찰하는 단계;
    4. 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계; 및
    5. 반응 생성물을 형성하기 위해 결찰 생성물의 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 1 코퍼레이팅 서열 부분에 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제 3 항에 있어서,
    a. 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적이고 캡쳐가능한 서열의 5' 뉴클레오티드는 비-결찰성이다);
    b. 제 2 하이브리드를 형성하기 위해, 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 인접한 제 2 하부서열에 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열을 혼성화하는 단계(캡쳐가능한 서열의 5' 뉴클레오티드는 비-결찰성이다);
    c. 표적 핵산의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스 및 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드를 모두 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드 및 결찰제의 존재하에서 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드를 제 2 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드로 결찰하는 단계;
    d. 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계; 및
    e. 반응 생성물을 형성하기 위해 결찰 생성물의 제 1 및 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드에 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제 3 항에 있어서,
    i. 제 1 하이브리드를 형성하기 위해 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 1 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 올리고뉴클레오티드 및 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드에 상보적인 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 캡쳐가능한 서열을 포함한다);
    ii. 제 2 하이브리드를 형성하기 위해, 표적 핵산 서열의 제 1 하부서열에 인접한 제 2 하부서열에 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제 2 표적 서열을 혼성화하는 단계(제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드는 시그널링 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 캡쳐가능한 서열을 포함한다);
    iii. 표적 핵산의 제 1 및 제 2 하부서열을 포함하는 제 1 듀플렉스 및 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드 및 제 2 키메릭 올리고뉴클레오티드를 모두 포함하는 결찰 생성물을 형성하기 위해 제 1 하부서열의 5' 뉴클레오티드 및 결찰제의 존재하에서 제 1 키메릭 올리고뉴클레오티드를 제 1 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드로 결찰하는 단계; 및
    iv. 표적 핵산으로부터 결찰 생성물을 유리하기 위해 제 1 듀플렉스를 변형하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 1 내지 5 또는 a 내지 e 또는 i 내지 iv는 1회 이상 반복되는 방법.
  13. (1) 표적 핵산 서열에 혼성화하지 않는 캡쳐 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 고정되거나 용액에서 자유로움);
    (2) 탐지가능한 신호를 제공하고 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 혼성하는 시그널링 올리고뉴클레오티드;
    (3) 다음을 포함하는 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드:
    (a) 표적 핵산 서열의 하부서열에 혼성화하는 제 1 표적 서열; 및
    (b) 다음으로부터 선택되는 서열에 혼성화하는 캡쳐가능한 서열:
    (i) 캡쳐 올리고뉴클레오티드; 또는
    (ii) 시그널링 올리고뉴클레오티드
    (4) 다음으로부터 선택된 서열에 혼성화하는 제 2 표적 서열을 포함하는 적 어도 하나의 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드:
    (a) 제 1 표적 서열이 혼성화하는 하부서열과 다른 표적 핵산 서열의 서열; 또는
    (b) 표적 핵산 서열의 상보적 가닥의 하부서열, 또는
    (c) 적어도 하나의 키메릭 올리고뉴클레오티드
    를 포함하는 키트.
  14. 제 13 항에 있어서,
    (5) 하나 이상의 중합제 및/또는 결찰제를 더 포함하는 키트.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    임의의 하나 이상의 성분 (1) 내지 (5)는 동결건조 형태인 키트.
  16. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    임의의 하나 이상의 성분 (1) 내지 (5)는 혼합물의 형태인 키트.
  17. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    임의의 하나 이상의 성분 (1) 내지 (5)는 개별 용기 속에 있는 키트.
  18. 제 13 항에 있어서,
    상기 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 고체 표면상에 고정되는 키트.
  19. 제 13 항에 있어서,
    상기 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 미세입자 또는 비드의 표면상에 고정되는 키트.
  20. 제 13 항에 있어서,
    상기 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 나노와이어의 표면상에 고정되는 키트.
  21. 제 13 항에 있어서,
    상기 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 반응 용기의 표면상에 고정되는 키트
  22. 제 13 항에 있어서,
    복수의 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 올리고뉴클레오티드 어레이의 형태로 고정되는 키트.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 어레이는 고체상 어레이인 키트.
  24. 제 22 항에 있어서,
    상기 어레이는 액체상 어레이인 키트.
  25. 제 13 항에 있어서,
    임의의 하나 이상의 성분 (1) 내지 (5)은 반응 용기에 제공되는 키트.
  26. 제 25 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실시하기 위해 미리 최적화된 상기 성분들이 존재하는 키트.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 방법을 실시하기 위해서, 마지막 사용자가 반응 용기에 핵산 샘플, 핵산 처리 효소, 키메릭 올리고뉴클레오티 및 코퍼레이팅 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나를 첨가하는 키트.
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