CN109844135B - 生物分子的处理方法以及分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种能够有效地抑制纳米孔阻塞的生物分子的处理方法以及分析方法。本发明是为了利用纳米孔进行分析而对生物分子进行处理的方法，该方法包含：准备含有用规定式来表示的铵阳离子；以及至少一部分的高阶结构被溶解的生物分子的试料溶液的工序。

Description

生物分子的处理方法以及分析方法
技术领域
本发明涉及一种生物分子的处理方法以及分析方法。
背景技术
作为一种生物分子的核酸的碱基排列的解析技术可应用于对遗传疾病的原因遗传基因的检测、对药剂的有效性·副作用的评价、对与癌症疾病相关的遗传基因变异的检测等，变得非常重要。核酸的碱基排列，例如能够利用使用了运用毛细血管的电泳的荧光检测装置(Thermo Fisher Scientific赛默飞世尔公司制，3500Genetic Analyzer)、对固定于平板上的核酸进行荧光检测的装置(Illumina未因生物科技公司制，HiSeq2500)等进行解析。但是，这些装置由于需要高价的荧光检测器、荧光试剂，因此该实验成本存在变高的趋势。
因此，作为能够更廉价地进行检测的解析技术，研究了如下方法：通过检测出核酸通过纳米孔时产生的光或电信号的变化从而对该碱基排列进行解析。首先，利用透射电子显微镜将数nm的孔(纳米孔)形成于1～60nm的薄膜。接着，在该薄膜的两侧设置充满电解质溶液的液槽，而且在各个液槽中设置电极。然后，当在这些电极间施加电压时，离子电流通过纳米孔而流动。该离子电流与纳米孔的截面积大约成比例。当DNA通过纳米孔时，DNA封闭纳米孔，由于使纳米孔的有效截面积减少，因此离子电流减少。将由于DNA的通过而变化的离子电流称为封闭电流。基于封闭电流的大小，能够判断单链DNA和双链DNA的差异、碱基的种类。在对碱基的种类进行判别时，电流值会根据碱基的种类而不同，因此从对各个碱基正确地进行判别的观点而言，优选噪声低并且较多电流流动的高电导率的测量用的试料溶液。
利用纳米孔的分析技术的对象不特别限定于DNA，例如还可列举RNA、肽、蛋白质等的生物分子。另外，由于DNA带负电，因此DNA从负极侧向正电极侧通过纳米孔。
作为1种生物试料的DNA包含的碱基，已知有嘌呤骨架即腺嘌呤和鸟嘌呤、嘧啶骨架即胞嘧啶和胸腺嘧啶(RNA是尿嘧啶)。已知腺嘌呤和胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤分别形成氢键，利用这些氢键等，形成DNA双螺旋结构，另外，产生作为单链DNA的高阶结构的自身杂交。DNA的双螺旋结构、单链DNA的高阶结构为了获取比纳米孔要大的立体结构，在DNA通过纳米孔时成为较大阻碍，有时会由于这些结构使得纳米孔阻塞。若纳米孔阻塞，则会阻碍阻塞后的DNA的通过。
针对与该阻塞相关的课题，在专利文献1中，记载有将激光作为热源照射于纳米孔来消除纳米孔阻塞的技术。
另外，关于纳米孔技术，在非专利文献1中报告有：利用包含四甲基铵盐的封闭电流测量用的试料溶液对蛋白质孔中的封闭电流进行测量的结果。在非专利文献1中记载有：在利用蛋白质孔的情况下，通过四甲基铵盐来提高脂质双层膜的稳定性的效果等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1美国专利申请公开第2013/0220811号说明书
非专利文献
非专利文献1Ying Wang等、[Tetramethylammonium-Filed Protein Nanoporefor Single-Molecule Analysis]、Anal.Chem.2015、87、9991－9997)
发明内容
发明所要解决的技术问题
如上所述，利用纳米孔分析核酸等的生物分子的技术中，有时生物分子会将纳米孔阻塞。针对该课题，在专利文献1中，提出了通过激光照射来消除阻塞的技术。但是，照射激光的设备的搭载与高价且具有复杂结构的分析装置相关。另外，有时会由于通过激光照射产生的热量使得生物分子的布朗运动变大。当生物分子的布朗运动变大时，由于通过纳米孔时的生物分子的运动变大，因此封闭电流值不稳定，从而难以正确地检测出生物分子。
另外，根据非专利文献1可知，报告了根据排列有时无法通过自身杂交对DNA进行电流测量。由于DNA具有各种各样的排列，因此优选即使对于具有易于形成高阶结构的排列的DNA也能够进行解析。另外，专利文献2(特开2008－104424号公报)报告了：在非专利文献1中所使用的四甲基铵阳离子在DNA的杂交反应中，对非特异的杂交进行抑制，而仅高效地形成特异的杂交。这示出了：即使使用四甲基铵阳离子，有时也会由于自身杂交而使得纳米孔阻塞，难以对电流进行测量。
由此，本发明的目的在于提供一种能够有效地抑制纳米孔阻塞的生物分子的处理方法以及分析方法。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明的方式如下所述。
(1)一种为了利用纳米孔进行分析而对生物分子进行处理的方法，包含：准备含有用下述式(1)来表示的铵阳离子、以及至少一部分的高阶结构被溶解的生物分子的试料溶液的工序：
[化1]
Figure BDA0002027690140000041
[式(1)中，R1～R4分别独立地为氢原子或有机基团，但是，R1～R4全部为氢原子的情况除外]。
(2)在(1)中所记载的方法中，所述阳离子是季铵阳离子。
(3)在(1)或(2)中所记载的方法中，所述阳离子是烷基季铵阳离子。
(4)在(1)～(3)中的任一项所记载的方法中，准备所述试料溶液的工序至少包含：将所述阳离子和所述生物分子进行混合来制备溶液的工序；以及对该溶液实施加热处理，使所述生物分子的至少一部分的高阶结构溶解的工序。
(5)在(4)中所记载的方法中，在所述溶解工序之后，包含对所述溶液实施冷却处理的工序。
(6)在(1)～(3)中的任一项所记载的方法中，准备所述试料溶液的工序至少包含将所述阳离子、所述生物分子、以及将所述试料溶液调整成使该生物分子的高阶结构溶解的pH的pH调整剂进行混合的工序。
(7)在(1)～(3)中的任一项所记载的方法中，准备所述试料溶液的工序至少包含将所述阳离子、所述生物分子、以及使该生物分子的高阶结构溶解的变性剂进行混合的工序。
(8)在(1)～(7)中的任一项所记载的方法中，所述试料溶液还包含具有比为了使所述阳离子存在于所述试料溶液中而使用的盐要高的电导率的电解质。
(9)在(8)所记载的方法中，所述阳离子是季铵阳离子,所述电解质是季铵阳离子。
(10)在(1)～(9)中的任一项所记载的方法中，所述生物分子是核酸。
(11)一种利用包括具有纳米孔的基板的装置来对生物分子进行分析的方法，包含：
通过(1)～(10)中的任一项所述的方法对生物分子进行处理，准备试料溶液的工序；以及
对所述试料溶液中的生物分子通过纳米孔时的光或电信号进行检测的工序。
(12)一种利用包括具有纳米孔的基板以及试料导入区域的装置来对生物分子进行分析的方法，包含：
对含有用上述式(1)来表示的铵阳离子和所述生物分子的溶液进行制备的工序；
将所述溶液配置于所述试料导入区域内的工序；
对所述试料导入区域内的所述试料溶液实施加热处理，使所述生物试料的至少一部分的高阶结构溶解的工序；以及
在所述溶解工序之后，对所述生物分子通过纳米孔时的光或电信号进行检测的工序。
(13)在(11)或(12)所记载的方法中，还包含在所述纳米孔阻塞时，进行加热处理来消除该阻塞的工序。
(14)在(11)～(13)中的任一项所记载的方法中，所述基板是固体基板。
发明效果
本发明的目的在于提供一种能够有效地抑制纳米孔阻塞的生物分子的处理方法以及分析方法。
附图说明
图1是用于说明包括具有纳米孔的基板的纳米孔式分析装置的腔体部的结构的示意性剖视图。
图2是用于说明包括具有纳米孔的基板和温度控制单元的纳米孔式分析装置的腔体部的结构的示意性剖视图。
具体实施方式
本说明书中，用语“生物分子”是指核酸(例如DNA、RNA)、肽、多肽、蛋白质、糖链等的生物体内存在的生物高分子。核酸包含单链、双链或三链的DNA、RNA、以及它们的任意的化学改性。
本说明书中，用语“分析”意味着对生物分子的特征进行决定、检测或鉴定，例如意味着决定生物分子的构成要素的排列。另外，本说明书中，生物分子的测序是指决定生物分子(例如DNA或RNA)的构成要素(碱基)的排列。
本说明书中，用语“纳米孔”是指纳米级别尺寸(即、0.5nm以上且小于1μm的直径)的孔。纳米孔设置为贯通基板，并与试料导入区域和试料流出区域连通。
以下，针对本发明的实施方式进行说明。
本发明的一个实施方式是为了利用纳米孔进行分析而对生物分子进行处理的方法，是包含准备含有用上述式(1)来表示的铵阳离子、以及至少一部分的高阶结构被溶解的生物分子的试料溶液的工序的方法。
利用纳米孔进行的分析具体而言是指，使用具有纳米孔的基板(以下也称纳米孔基板)，且通过对生物分子通过该纳米孔时的光或电信号进行检测来对生物分子进行分析，是指例如，通过包括纳米孔基板的核酸测序仪来对核酸的碱基排列进行分析。
本实施方式中，试料溶液至少包含：用上式(1)来表示的铵阳离子(以下也称阳离子(A))、以及至少一部分的高阶结构被溶解的生物分子。
阳离子(A)通过静电作用能够接近于生物分子，因此能够防止高阶结构被溶解的生物分子再次形成高阶结构。
阳离子(A)也可单独使用1种，也可将多种组合来使用。阳离子(A)例如能够使用包含阳离子(A)的盐包含试料溶液中。作为含有阳离子(A)的盐可以列举出例如氯化物、氢氧化物，但并不局限于此。
在式(1)中，有机基团的碳原子数优选1～4，更优选1～3，进一步优选1～2。另外，有机基团优选烃基。烃基的碳原子数优选1～4，更优选1～3，进一步优选1～2。烃基也可具有取代基。作为烃基优选烷基、链烯基或炔基，更优选烷基。
铵阳离子(A)优选季铵阳离子。即，在式(1)中，R1～R4优选分别独立的有机基团。
另外，铵阳离子(A)更优选烷基季铵阳离子。即，在式(1)中，R1～R4优选分别独立的烷基。烷基也可是直链状，也可是分支链状，或者也可是环状。烷基优选直链状或分支链状，更优选直链状。烷基的碳原子数优选1～4，更优选1～3，进一步优选1～2。
作为烷基季铵阳离子，可列举例如四甲基铵阳离子(以下也称TMA+)，四乙基铵阳离子(以下也称TEA+)，四丙基铵阳离子(以下也称TPA+)等。作为烷基季铵阳离子的盐，如上所述可列举氯化物、氢氧化物，具体而言，可列举例如氯化四甲铵、氯化四乙铵、氯化四丙铵、氢氧化四甲铵、氢氧化四乙铵、氢氧化四丙铵等。
阳离子(A)的试料溶液中的浓度未作特别的限制，例如是0.1～4.0M,优选0.5～3.0M。
试料溶液的pH优选在7.5以上，更优选在8.0以上，进一步优选在8.6以上。通过使pH在7.5以上，从而能够更有效地抑制纳米孔的阻塞。试料溶液的pH优选在11.0以下，更优选在10.0以下。通过使pH在11.0以下，从而能够降低对纳米孔基板的破坏。
试料溶液除了阳离子(A)以外也还可包含其它的离子。例如试料溶液能够包含电解质。电解质优选具有比为了使试料溶液中含有阳离子(A)所使用的包含阳离子(A)的盐要高的电导率。作为具有这样的高电导率的电解质(也可称为高电导率电解质)，可列举例如氯化铵、氯化钾、氯化钠、或氯化铯等。另外，除此以外也可列举伯胺盐、仲胺盐、胍化合物的盐。特别是，阳离子(A)为季铵阳离子(例如烷基季铵阳离子)时，从导电性以及降低噪声的观点而言，高电导率的电解质优选包含铵离子的盐,更优选氯化铵、氢氧化铵。另外，电解质的浓度优选0.1～3.0M，更优选0.5～2.5M，进一步优选1.0～2.0M。烷基季铵盐的电导率相比于通常所使用的氯化钾等的电解质的电导率要低。为此，通过封闭电流来对生物分子(例如核酸)进行分析(例如碱基排列分析)时，从精度的观点而言，除了在试料溶液中添加包含阳离子(A)的盐以外，进一步添加电导率更高的电解质。另外，若高电导率电解质变多，则会提高试料溶液的电传导性，另外，噪声有下降的趋势，但是若阳离子(A)以外的其它的阳离子过多地存在于试料溶液中，则存在抑制阳离子(A)的阻塞抑制效果的可能性。因此，包含阳离子(A)的盐以及高电导率电解质的比(摩尔比)优选4:1～1:4，更优选2:1～1:2。
本说明书中，化合物的电导率[mS/cm]能够例如使用包含1M目标化合物的水溶液(25℃)进行测定。
试料溶液还能够含有水等的溶剂、pH调整剂、变性剂、或其它添加剂。作为pH调整剂，可以列举出例如缓冲剂。作为缓冲剂，可对应于生物分子的特性适当地选择，可以列举出例如三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCI)、碳酸-重碳酸缓冲液、硼酸钠缓冲液或磷酸缓冲液等。这些中，三羟甲基氨基甲烷、或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐容易将试料溶液的pH控制在7.5以上的范围，因此优选。
本说明书中，[高阶结构被溶解]是指对高阶结构进行分解的意思，例如对单链核酸的自身杂交结构或双链核酸或者三链核酸的杂交结构进行分解，或者对蛋白质的高阶结构进行分解的意思。
至少一部分的高阶结构被溶解的生物分子通过例如加热处理、由pH调整剂进行pH的调整、或者使用变性剂来获得。
优选的一个实施方式中，准备试料溶液的工序至少包含：将阳离子(A)和生物分子进行混合来制备溶液的工序；以及对该溶液实施加热处理，且使所述生物分子的至少一部分的高阶结构溶解的工序。即，该实施方式中，首先制备包含阳离子(A)和生物分子的溶液。之后，通过对该溶液实施加热处理来准备试料溶液。在该实施方式中，至少一部分的高阶结构被溶解的生物分子能够通过加热处理获得。在本实施方式中，生物分子优选核酸。加热处理温度优选60～100℃，更优选90～100℃。另外，在加热处理之后，也可进行冷却处理，冷却处理中优选对加热处理后的溶液急速冷却。通过进行冷却处理，从而能够更有效地抑制高阶结构的再形成。急速冷却处理是例如使温度在1秒内降低1℃以上(优选5℃以上，进一步优选10℃以上，特别优选20℃以上)的处理。冷却后的温度优选0～10℃，更优选0～4℃。
另外，优选的一个实施方式中，准备试料溶液的工序至少包含将阳离子(A)、生物分子、以及将试料溶液调整成使该生物分子的高阶结构溶解的pH的pH调整剂来进行混合的工序。即，在该实施方式中，通过制备至少包含阳离子(A)、生物分子、以及将试料溶液调整成使该生物分子的高阶结构溶解的pH的pH调整剂的溶液来准备试料溶液。在该实施方式中，至少一部分的高阶结构被溶解的生物分子能够通过pH调整剂的作用来获得。作为pH调整剂，能够使用例如缓冲剂。在本实施方式中，pH值从使高阶结构(例如核酸的高阶结构)溶解的观点而言，优选在9.0以上，更优选在10.0以上。另外，pH从纳米孔基板的稳定性的观点而言，优选在11.0以下。
另外，优选的一个实施方式中，准备试料溶液的工序至少包含对阳离子(A)、生物分子、以及使该生物分子的高阶结构溶解的变性剂进行混合的工序。即，在该实施方式中，通过制备至少包含阳离子(A)、生物分子、以及使该生物分子的高阶结构溶解的变性剂的溶液来准备试料溶液。使至少一部分的高阶结构溶解的生物分子通过基于变性剂的变性作用而获得。作为变性剂，不作特别限定，例如生物分子为核酸时，能够使用甲酰胺、甲醛、尿素、DMSO等，生物分子为蛋白质时，能够使用尿素、胍等。变性剂的浓度不作特别限定，优选根据生物分子来进行适当地选择。
另外，本发明的实施方式是使用包括具有纳米孔的基板的装置(以下也称纳米孔式分析装置)对生物分子进行分析的方法，包含：通过本实施方式所涉及的处理方法对生物分子进行处理，且准备试料溶液的工序；以及对该试料溶液中的生物分子通过纳米孔时的光或电信号进行检测的工序。
试料溶液能够在导入到纳米孔测序仪等的纳米孔式分析装置内之前进行准备。另外，在将包含阳离子(A)和生物分子的溶液导入到纳米孔式分析装置内之后，也可进行加热处理等的溶解工序，且准备试料溶液(即，包含阳离子(A)以及至少一部分的高阶结构被溶解的生物分子)。即，在使包含阳离子(A)和生物分子的溶液配置在纳米孔装置的试料导入区域内之后，通过纳米孔式分析装置包括的温度控制单元进行加热处理，从而能够准备试料溶液。
即，本发明的优选实施方式是利用包括具有纳米孔的基板以及试料导入区域的装置对生物分子进行分析的方法，包含：制备含有阳离子(A)和所述生物分子的溶液的工序；将所述溶液配置在所述试料导入区域内的工序；对所述试料导入区域内的所述溶液实施加热处理，且使所述生物分子的至少一部分的高阶结构溶解的工序；以及在所述溶解工序后，对所述生物分子通过纳米孔时的光或电信号进行检测的工序。
图1中示出用于说明本发明所涉及的分析方法中可使用的纳米孔式分析装置的腔体部的结构示例的示意性剖视图。在图1中，腔体部101具有试料导入区域104、试料流出区域105、以及在试料导入区域104及试料流出区域105之间配置的具有纳米孔102的基板(纳米孔基板)103。试料导入区域104和试料流出区域105通过纳米孔102在空间上连通，作为试料113的生物分子能够通过纳米孔102从试料导入区域104向试料流出区域105移动。试料导入区域104中经由第一流入路106填充有第一液体110。另外，试料流出区域105中经由第二流入路107填充有第二液体111。另外，第一液体110以及第二液体111也可分别经由第一流出路108以及第二流出路109从试料导入区域104以及试料流出区域105流出。在分析中，第一液体110以及第二液体111也可从流入路向流出路流动，也可不流动。第一流入路106和第二流入路107也可夹着基板设置于相对的位置。另外，同样地，第一流出路108和第二流出路109也可夹着基板设置于相对的位置。
在本实施方式中，基板103包含基底(基材)103a、以及形成于基底103a上的薄膜103b。另外,基板103也可包含形成于薄膜103b上的绝缘层103c。纳米孔形成于薄膜103b。通过将适合于形成纳米孔的材料以及厚度的薄膜形成于基底103a上，从而能够将纳米孔简单且高效地设置于基板。基板优选为固定基板。构成薄膜的材料可以列举出例如石墨烯、硅、硅化合物(例如二氧化硅、氮化硅、氮氧化硅)、金属氧化物、金属硅酸盐等的固体膜。在优选的一个实施方式中，薄膜由含有硅或硅化合物的材料所形成。另外，薄膜(以及根据情况是基板整体)也可实质上是透明的。在此[实质上透明]意味着能够使外部光透过约50％以上，优选80％以上。另外，薄膜可是单层也可是多层。薄膜的厚度是0.1nm～200nm，优选0.1nm～50nm，更优选0.1nm～20nm。通过该技术领域中公知的技术，薄膜能够例如利用低压化学气相沉积法(LPCVD)形成。
本发明中，至少第一液体110是上述的试料溶液。即，第一液体110是包含作为试料113的生物分子以及阳离子(A)的试料溶液，生物分子的高阶结构是溶解的。另外，第二液体111也可包含生物分子以及阳离子(A)。另外，本实施方式中，第一液体110除了包含生物分子以及阳离子(A)以外，还可以包含溶剂(优选水)、电解质(例如氯化铵、KCL(氯化钾)或NaCL(氯化钠))。因该电解质引起的离子能够起到作为电荷负载的作用。
腔体部101在试料导入区域104和试料流出区域105设置有第一电极114以及第二电极115，该第一电极114以及第二电极115配置成以使得夹着纳米孔102相对。在本实施方式中，腔体部还包括对于第一电极114以及第二电极115的电压施加单元。通过施加电压，具有电荷的试料113从试料导入区域104通过纳米孔102向试料流出区域105移动。
纳米孔式分析装置除了具有上述腔体部以外也可具有用于对生物分子通过纳米孔时的光或电信号进行检测的检测部。检测部也可具有：放大器(放大器)，该放大器放大电信号；模数转换器，该模数转换器将放大器的模拟输出转换成数字输出；以及存储装置等，该存储装置用于存储测量数据。
对生物分子通过纳米孔时的光或电信号进行检测的方法无特别限制，例如能够采用公知的检测方法。作为检测方法，具体而言，可以列举出例如封闭电流方式、隧道电流法、电容方式。作为示例，针对利用了封闭电流的检测方法以下简单地进行说明。生物分子(例如核酸)通过纳米孔时，由于生物分子阻塞纳米孔内，因此纳米孔中的离子流动减少，其结果是发生电流的减少(封闭电流)。通过测量该封闭电流的大小和该封闭电流的持续时间，从而能够对通过纳米孔的各个核酸分子的长度、碱基排列进行解析。另外，例如关于隧道电流方式，能够利用隧道电流检测出通过配置于纳米孔附近的电极间的生物分子。
另外，作为检测光变化的方法，也可以列举出利用拉曼光的检测方法。例如，通过对进入至纳米孔的生物分子照射外部光(激励光)来激励生物高分子以产生散射光，从而能够基于该拉曼散射光的频谱来决定生物分子的特征。在该情况下，测量部也可具有用于照射外部光的光源、以及检测拉曼散射光的检测器(分光检测器等)。另外，也可在纳米孔附近配置导电性薄膜以产生接近电场，来增强光。除了通过封闭电流方式、隧道电流方式或电容方式来检测以外，也可通过进行利用拉曼光的检测从而提高分析精度。
基板103具有至少一个纳米孔。基板103能够由电绝缘体材料、例如无机材料以及有机材料(包含高分子材料)来形成。作为构成基板的电绝缘体材料的示例，可以列举出硅(硅)、硅化合物、玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为硅化合物可以列举出氮化硅、氧化硅、碳化硅、或氮氧化硅等。特别是构成基板支撑部的基底(基材)能够由这些任意的材料制作而成，例如优选由包含硅或硅化合物的材料(硅材料)形成。另外，作为构成形成纳米孔的部分即薄膜的材料，如上所述那样，可以列举出例如石墨烯、硅、硅化合物(例如氧化硅、氮化硅、氮氧化硅)、金属氧化物、金属硅酸盐等。即使在这些材料中，也优选含有硅或硅化合物的材料。即，在本实施方式中，优选纳米孔设置于由含有硅或硅化合物的材料形成的构件中。
优选将绝缘层103c设置于薄膜103b上。绝缘层的厚度优选5nm～50nm。作为绝缘层的材料能够使用任意的绝缘体材料，优选为例如包含硅或硅化合物(例如氧化硅、氮化硅、氮氧化硅)的材料。
基板可由本技术领域中公知方法来制作。或者，基板也可作为市售商品来获得。基板能够使用例如光刻法、电子束光刻法、蚀刻法、激光烧蚀法、注塑成形法、铸造法、分子束外延法、化学气相沉积(CVD)法、介质击穿法、以及电子束或聚焦离子束法等的技术来制作。
纳米孔的尺寸能够根据分析对象的生物高分子的种类来选择适当的尺寸。纳米孔也可具有均匀的直径，也可根据部位具有不同的直径。纳米孔也可与具有1μm以上的直径的孔连结。纳米孔的直径优选在100nm以下，优选为0.5nm～100nm，优选为0.5nm～50nm，优选为0.5nm～10nm。
作为分析对象的生物分子的一个示例，可以列举出ssDNA(单链DNA)。ssDNA的最大直径约为1.5nm，用于分析ssDNA的纳米孔直径的合适范围为1.5nm～10nm，优选为1.5nm～2.5nm。dsDNA(双链DNA)的直径约为2.6nm，用于分析dsDNA的纳米孔直径的合适范围为3nm～10nm，优选为3nm～5nm。将其它生物分子、例如蛋白质、多肽、糖链等作为分析对象的情况也同样地，可考虑到生物分子的尺寸来选择纳米孔的直径。
纳米孔的深度(长度)能够通过设置纳米孔的构件的厚度(例如薄膜103b的厚度)来进行调整。纳米孔的深度优选为构成分析对象的生物分子的单体单位。例如在选择核酸作为生物分子的情况下，纳米孔的深度优选为1个碱基以下的大小，例如约0.3nm以下。纳米孔的形状基本是圆形的，但也可以是椭圆形、多边形。
在基板上至少能够设置一个纳米孔，在设置多个纳米孔的情况下，也可规则地进行排列。纳米孔能够通过本技术领域公知的方法，例如通过照射透射电子显微镜(TEM)的电子射束，或者使用纳米光刻技术或离子束光刻技术等来形成。也可通过绝缘破坏在基板上形成纳米孔。
如上所述，腔体部101除了具有试料导入区域104、试料流出区域105以及基板103以外，还可具有用于使试料113通过纳米孔102的第一电极114以及第二电极115。优选的示例中，腔体部101具有设置于试料导入区域104的第一电极114、设置于试料流出区域105的第二电极115、向第一电极以及第二电极施加电压的电压施加单元。也可在设置于试料导入区域104的第一电极114与设置于试料流出区域105的第二电极115之间设置有电流计117。通过第一电极114和第二电极115之间的电流能够对试料通过纳米孔的速度进行调整。对本领域技术人员而言能够对该电流的值进行适当选择，但在试料是DNA的情况下优选为100mV～300mV。
作为电极的材料，能够使用金属，可以列举出例如铂、钯、铑或钌等的铂族、金、银、铜、铝、镍、石墨(可以是单层或多层中的任意一个)，例如石墨烯、钨、或钽等。
另外，图2示出包括具有纳米孔的基板和温度控制单元201的纳米孔式分析装置的腔体部的结构示例。可设置温度控制单元201，其能够对存在于试料导入区域104内的第一液体110或存在于试料流出区域105的第二液体111进行加热或冷却。纳米孔式分析装置通过具有对试料导入区域104或试料流出区域105的温度进行控制的温度控制单元201，从而能够在装置内对生物分子进行溶解处理。另外，在测量中产生阻塞时，通过温度控制单元201来进行加热处理(以及根据需要进行冷却处理)，从而也能够消除阻塞。
[实施例]
以下，针对本发明的实施例进行说明。
(试料的制备)
作为试料，通过以下的方法制备具有数k～数十k碱基长度的DNA。首先，合成了连续地具有50个碱基的腺嘌呤，接着连续地具有25个碱基的胸腺嘧啶，接着连续地具有25个碱基的胞嘧啶的排列A 50 T 25 C 25(单链DNA)。将该合成的单链DNA用单链DNA连接酶(CircLigase(商标)ssDNA Ligase，ARBROWN公司制)进行环状化后，用phi29DNAPolymerase(New England BioLabs公司制)进行放大，从而制备长链(数k～数十k碱基的长度)的DNA。放大的DNA具有连续的腺嘌呤和胸腺嘧啶的排列，因此通过自身杂交比较容易制作高阶结构。因此，可以优选用于本发明的评价。另外，在本实施例中，所有的试料溶液作为试料以含有浓度为1.73ng/μl的上述单链DNA的方式来进行准备。
实施例1
对具有下述组成1的水溶液实施加热处理以及冷却处理，从而准备试料溶液1。加热处理以及冷却处理在95℃维持15分钟后，急冷至4℃(降温速度：10℃/秒)且在4℃维持5分钟。
·组成1:4.0M四甲基铵盐,0.1MTris
配置于具有图1所示的结构的纳米孔式分析装置的试料导入区域104，测定通过纳米孔102时产生的封闭电流纳米孔直径是1.1～1.8nm。另外，使用膜片钳放大器(Axopatch200B amplifiers,Molecular Devices美谷分子仪器公司制)来检测出封闭电流。封闭电流是在采样率为50kHz，施加电压为+300mV的条件下检测出的。从所获得的检测数据，针对“阻塞”、“事件次数”、“长时间封闭次数”、“频率”进行了评价。这里，“事件次数”表示由于封闭电流的减小而被视为单链DNA通过纳米孔的次数。“长时间封闭次数”表示电流值减小的状态保持5秒以上的次数。“频率”是由式：“长时间封闭次数”/“事件次数”×100(％)来计算出的。在电流值减小的状态保持5秒以上的情况下，通过将电压反转为-300mV从而消除了由于DNA所致的纳米孔的封闭状态。在即使反转电压也无法消除纳米孔封闭状态的情况下，将“阻塞”评价为“存在”。
实施例2
对具有下述组成2的水溶液实施实施例1中记载的加热处理以及冷却处理，从而准备试料溶液2。并且，除了将试料溶液2代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
·组成2:4.0M氯化四乙铵,0.1MTris
(比较例1)
对具有下述组成3的水溶液实施实施例1中记载的加热处理以及冷却处理，从而准备试料溶液3。并且，除了将试料溶液3代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
·组成3:1M氯化钾,0.1MTris
(比较例2)
对具有下述组成4的水溶液实施实施例1中记载的加热处理以及冷却处理，从而准备试料溶液4。并且，除了将试料溶液4代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
·组成4:4.0M氯化铵,0.1MTris
(比较例3)
除了未实施加热处理以及冷却处理以外，与实施例1相同地准备试料溶液5。另外，除了将试料溶液5代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
(比较例4)
除了未实施加热处理以及冷却处理以外，与实施例2相同地准备试料溶液6。另外，除了将试料溶液6代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
(比较例5)
除了未实施加热处理以及冷却处理以外，与实施例3相同地准备试料溶液7。另外，除了将试料溶液7代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
(比较例6)
除了未实施加热处理以及冷却处理以外，与实施例4相同地准备试料溶液8。另外，除了将试料溶液8代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
实施例1～2以及比较例1～6的评价结果如表1所示。
[表1]
Figure BDA0002027690140000181
Figure BDA0002027690140000191
在比较例1～6中，也观测到几个DNA的通过事件，但产生了纳米孔的阻塞。另一方面，在实施例1～2中，未产生纳米孔的阻塞。从以上的实验结果，确认到通过使用包含阳离子(A)且实施溶解处理来准备的试料溶液，即使在对容易引起自身杂交的单链DNA进行分析的情况下，也能够抑制纳米孔的阻塞来进行分析。通过使单链DNA的高阶结构溶解，从而阳离子(A)(在本实施例中TMA+、TEA+)接近于高阶结构溶解的部分，形成物理位阻，且通过对由氢键形成的复杂的高阶结构的形成进行阻碍，从而可推测到能够获得对纳米孔的阻塞进行抑制的效果。另外，该推测并不限定本发明。
在实施例1以及2中，作为使高阶结构溶解的手段，实施了加热处理以及冷却处理(急冷)，但本发明并不限定于此。
如上述的实施方式所说明的，作为具有比四烷基氯化铵(具体而言，氯化四甲铵或氯化四乙铵)要高的电导率的物质，能够使用氯化钾或氯化铵等。即使在将这些与四烷基氯化铵一起使用的情况下，也能够进行无阻塞的测量，更进一步地为了调查作为封闭电流测量能否获得高电导率，进行了如下实验。在下述实验中，即使电导率变高，由于若噪声增加也是不希望的，因此对噪声等级也进行了评价。
实施例3
对具有下述组成5的水溶液实施实施例1中记载的加热处理以及冷却处理，从而准备试料溶液9。并且，除了将试料溶液9代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
·组成5:1.7M氯化钾，1.5M氯化四乙铵,0.1MTris
实施例4
对具有下述组成6的水溶液实施实施例1中记载的加热处理以及冷却处理，从而准备试料溶液10。并且，除了将试料溶液10代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
·组成6:2.0M氯化铵，1.5M氯化四乙铵,0.1MTris
实施例5
对具有下述组成7的水溶液实施实施例1中记载的加热处理以及冷却处理，从而准备试料溶液11。并且，除了将试料溶液11代替试料溶液1进行使用以外，与实施例1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
·组成7:2.0M氯化铵，1.5M氯化四乙铵,0.1MTris
实施例3～5以及作为参考的比较例1的评价结果如表2所示。另外，“噪声”示出将由测量所获得的数据以2kHz施加了滤波之后的标准偏差的值。
[表2]
Figure BDA0002027690140000201
Figure BDA0002027690140000211
从实施例3～5可知，除了包含阳离子(A)的盐以外通过进一步添加具有比该盐要高的电导率的电解质(在实施例中氯化钾或氯化铵)，从而能够维持阻塞抑制效果的同时，降低噪声。
标号说明
101 腔体部
102 纳米孔
103 基板
103a 底座(基材)
103b 薄膜
103c 绝缘层
104 试料导入区域
105 试料流出区域
106 第一流入路
107 第二流入路
108 第一流出路
109 第二流出路
110 第一液体
111 第二液体
113 试料(生物分子)
114 第一电极
115 第二电极
117 带电流计电源
201 温度控制单元

Claims (10)

1.一种为了利用纳米孔进行分析而对生物分子进行处理的方法，其特征在于，包含：
准备含有用下述式(1)来表示的铵阳离子、以及至少一部分的高阶结构被溶解的生物分子的试料溶液的工序，
准备所述试料溶液的工序至少包含：
将所述阳离子和所述生物分子进行混合来制备溶液的工序；以及
对含有所述阳离子以及所述生物分子的所述溶液实施加热处理，随后以10℃/秒的速度将所述溶液冷却到4℃并将所述溶液的温度在4℃维持5分钟，以使所述生物分子的至少一部分的高阶结构溶解的工序，
Figure FDA0003820259380000011
所述式(1)中，R1～R4分别独立地为氢原子或有机基团，但是，R1～R4全部为氢原子的情况除外。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述阳离子是季铵阳离子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述阳离子是烷基季铵阳离子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述试料溶液还包含具有比为了使所述阳离子存在于所述试料溶液中而使用的盐要高的电导率的电解质。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述阳离子是季铵阳离子。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述生物分子是核酸。
7.一种使用包括具有纳米孔的基板的装置来对生物分子进行分析的方法，该方法应用于非疾病诊断用途，其特征在于，包含：
通过权利要求1所述的方法对生物分子进行处理，准备试料溶液的工序；以及
对所述试料溶液中的生物分子通过纳米孔时的光或电信号进行检测的工序。
8.一种使用包括具有纳米孔的基板以及试料导入区域的装置来对生物分子进行分析的方法，该方法应用于非疾病诊断用途，其特征在于，包含：
对含有用下述式(1)来表示的铵阳离子和所述生物分子的溶液进行制备的工序；
将所述溶液配置于所述试料导入区域内的工序；
对所述试料导入区域内的所述溶液实施加热处理，随后以10℃/秒的速度将所述溶液冷却到4℃并将所述溶液的温度在4℃维持5分钟，以使所述生物试料的至少一部分的高阶结构溶解的工序；以及
对所述生物分子通过纳米孔时的光或电信号进行检测的工序，
Figure FDA0003820259380000031
所述式(1)中，R1～R4分别独立地为氢原子或有机基团，但是，R1～R4全部为氢原子的情况除外。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，
还包含在所述纳米孔阻塞时，进行加热处理来消除该阻塞的工序。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，
所述基板是固体基板。
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