KR20050118738A - 핵산 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물학적 또는 환경 샘플에서 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 필요하다면 cDNA로 전환한 후 관심있는 핵산을 증폭하는 것으로, 증폭된 핵산은 실시간 PCR(RT PCR) 기술에 의한 추가 증폭에서 주형으로 사용된다. 증폭 과정의 조합은 통상의 증폭 기술과 비교하여 증폭의 감도와 특이성을 향상시킨다. 본 발명은 또한 이 방법에서 사용하는 프라이머와 진단 시험 키트에 관한 것이다.

Description

핵산 검출 방법{NUCLEIC ACID DETECTION}
본 발명은 생물학적 또는 환경 샘플로부터 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 검출 방법에서 사용하는 핵산, 프라이머, 및 프로브를 검출하는 진단 시험 키트에 관한 것이다.
심각한 급성 호흡기 증후군은(SARS)은 사람에게서 확인된 변칙적인 폐렴의 형태이다(Drosten et al.,"Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome "The New England Journal of Medicine, (2003) 348:1967-1976, published on 15 May 2003). 이것은 SARS 코로나바이러스 또는 어버니(Urbani) SARS-관련 코로나바이러스로 알려진, 신규한 코로나바이러스 균주에 의해 발생된다. 이 바이러스는 아크로솔(acrosol) 및 대인 접촉에 의해 유효하게 전염되는 것으로 증명되었다. 의심되거나 가능성 있는 SARS의 진단은 하기 WHO 진단 범주에 따라 이루어지며 문헌(Case Definitions for Surveillance of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS))(세계 보건 기구, 2003년 4월 30일 개정됨)에 구체화되어있다. 그러나, SARS 양성을 진단하려면 신규 코로나바이러스에 대한 항체의 존재를 증명하거나 환자 샘플에서 코로나바이러스 핵산의 존재를 증명하여 원인제(aetiological agent)를 식별해야 한다. 이 질병의 진행 과정은 되돌릴 수 없는 폐 손상을 일으켜 확인된 SARS 감염 환자의 사망률이 5 내지 10%인 것으로 기록되었다. 이러한 질병의 심각성을 제한하고 질병의 전염을 막기 위해, 즉각적인 조치를 개시할 수 있도록 가능한 빨리 감염 환자를 확인하는 것이 중요하다.
바이러스 감염을 확인하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 표준 혈청 검사 방법, 예컨대 아가 겔 면역확산법(AGID) 또는 효소 관련 면역흡수 분석법(ELISA)을 사용하여 환자 혈청 샘플에서 항체를 확인하는 것이다. 이러한 방법들은 항체가 정확하고 감도높은 검출을 가능하게하기에 충분한 농도로 생성되기까지 감염 후 7일 내지 21일 소요되기 때문에 제한된다.
또한 바이러스를 검출하기 위하여 시험관 내의 예민한 세포중의 바이러스를 배양하는 방법이 널리 확립되어 있다. 그러나 SARS 관련 코로나바이러스는 신규한 독자성이 있어서 최적의 성장 조건이 기술되지 못했다. 또한, 상기 분석 생성물은 손쉽게 감염되는 바이러스이기 때문에 바이러스의 성장은 매우 높은 생물학적 안정성을 요구한다. 따라서 고도로 훈련된 스태프, 장비, 및 설비가 필요하므로, 일상적인 진단에 사용하기에 이 기술은 적절치 않다는 한계가 있다. 또한, 바이러스의 성장이 너무나 느려서 충분한 시간이 지나야 검출이 가능하므로 즉각적인 조치를 개시할 수 없다.
바이러스 유전자 물질의 증폭과 검출에 기초한 분자 방법이 많은 병원균 바이러스에 대해 이전에 기술되었고 상기 SARS 코로나바이러스의 검출에 적용가능하다. 핵산 증폭 방법은 일반적으로 신속하고, 매우 특이적이며 민감하다.
다수의 상이한 핵산 증폭 과정은 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 후속하여 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis), 중첩(nested) PCR, 실시간-태크만R(Real-Time TaqmanR) PCR, 분자표지(molecular beacon) PCR, 핵산 서열에 기초한 증폭(NASBA), 핵산의 등온 키메라 프라이머 개시된 증폭(ICAN) 등을 포함하는 것으로 기술되었다.
전기영동 이전의 PCR(통상의 PCR로 공지됨)은 1985년도에 처음 설명된 표준 기술이다. 이후로 그것은 일상적인 실험 과정이 되었다. 그러나, 상당히 느리고 공이 많이 든다. 또한, 보다 최근에 개발된 통상의 PCR과 비교하여 감도가 낮다. 겔 전기영동 이전의 중첩 PCR은 통상의 PCR 감도를 증가시킨 기술이다. 중첩 PCR은 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머(외부 프라이머)의 특정한 쌍을 사용하여 특이적인 유전자 서열을 1회 증폭한다. 이러한 증폭 생성물은 2회 증폭에서 주형으로 사용되고, 2회 증폭에서 다른 쌍의 프라이머(내부 프라이머)가 1회 증폭 생성물내 부분에서 선택된다. 2회 증폭 생성물은 따라서 1회 증폭 생성물 보다 길이가 짧다. 이 방법은 추가의 증폭 단계로 인하여 매우 힘들다. 결과적으로 이 방법은 쉽게 오염된다.
NASBA는 컴프톤(Compton) J.의 문헌["Nucleic acid sequence-based amplification"(1991) Nature 350:91-92; Heim AI et al "Highly sensitive detection of gene expression of an intronless gene; amplification of mRNA, but not genomic DNA by nucleic acid sequence based amplification (NASBA)"(1998) Nucleic Acids Research 26(9):2250-2251; and Deiman B et al "Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification (NASBA)"(2002) Molecular Biotechnology]에서 상술된다.
실시간 PCR로 명명되는(본 명세서에서 RT-PCR로 언급됨) 고도로 자동화된 방법은 매우 특이적이고 사용자 친화적인 기술로 증명되었으나, 때때로 중첩 PCR 보다 낮은 감도를 보인다. RT-PCR은 하나의 말단에는 형광 흡수 부분 다른 하나의 말단에는 형광 방출 부분으로 표지된 부가적인 DNA 올리고뉴클레오티드 분자를 사용하는데, 이 분자는 상기 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머들 사이에서 표적 유전자 부분에 혼성화된다. 이렇게 표지된 분자는 형광유전자 프로브로 공지되어 있다. 증폭 과정이 계속되면서 촉진 DNA 폴리머라제 효소에 의해 형광유전자 프로브를 제거함에 따라 형광 신호은 증가한다. 실시간 PCR은 문헌[Desjardin LE et al "Comparison of the ABI 7700 system(TaqMan) and competitive PCR for quantification of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis." (1998)J Clin Microbiol. 36(7):1964-8 and Wang T et al "mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection"(1999) Anal Biochem. 269(1):198-201]에 상술된다.
문헌[Yang et al "Clinical detection of polymerase gene of SARS-associated coronavirus" Academic J First Med(2003) 23(5): 424-427, published on 8 May 2003]은 SARS 코로나바이러스-특이적 프라이머를 사용하는 역전사효소 PCR의 사용에 관한 것이다. 이전에 언급된 문헌[Drosten et al]은 SARS 코로나바이러스 검출을 위한 중첩 RT-PCR 또는 RT-PCR에 관한 것이다.
통상의 PCR, 중첩 PCR, 및 RT-PCR은 다양한 범주의 환자 샘플에서 충분히 정확하고 민감하게 SARS 코로나바이러스를 검출할 수 없다. PCR에 의한 음성 결과는 환자가 SARS를 갖지 않는다는 것을 반드시 의미하지 않는다. 왜냐하면 많은 인자, 예컨대 증폭 프로토콜에서 사용된 프라이머와 프로브의 무반응, SARS-CoV 감염 결여, 다른 감염제, 잘못된 음성 PCR 결과에 의해 관찰된 통증이 바이러스 핵산 검출에 영향을 미치거나, 바이러스 또는 바이러스의 유전물질이 존재하지 않을 때 또는 현재의 방법으로 검출 불가능할 때 상기 표본이 수집되었기 때문이다. 따라서, SARS-CoV 를 효과적으로 스크린하기에 충분히 민감한 방법을 고안하고, 고감도, 높은 특이성 및 속도를 갖는 증폭 기술로 SARS 코로나바이러스의 특정 부분의 핵산을 검출하여 SARS 진단을 향상시키는 것이 중요하다.
본 발명은 단지 SARS 코로나바이러스의 검출에 제한되지 않고 일반적인 핵산 검출에 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 SARS 코로나바이러스를 포함한 다수의 상이한 유형의 병원균 및 바이러스를 검출하는데 적용할 수 있다.
본 발명의 목적은 핵산, 예컨대 SARS 코로나바이러스를 검출하는 고감도의 방법을 제공하는 것을 목적으로 하여 초기 감염 단계의 사람을 식별할 수 있게 한다.
또한 본 발명의 목적은 핵산을 검출하는 사용자-친화적인 진단 키트를 설계하는 것이다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 설명될 것이다:
도 1은 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 SARS 코로나바이러스의 전체 검출방법의 흐름도이고,
도 2는 SARS 코로나바이러스의 분리 및 본 발명의 바람직한 구체예에 의한 상보적인 DNA(cDNA)로의 전환 방법을 보여주며,
도 3은 SARS 코로나바이러스 cDNA 분자의 일부를 두 개의 DNA 분자, 프라이머 A 및 B에 의해 증폭하는 것을 보여주며, 증폭된 생성물이 두 개의 DNA 분자, 프라이머 C 및 D에 의한 추가 증폭에서 주형으로 사용되어 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 프로브 E에 의해 검출과 정량이 이루어지고,
도 4a와 4b는 서열번호 1 내지 27에 해당하는 핵산 서열을 보여주고,
도 5 내지 8은 향상된 실시간 증폭과 표준 실시간 증폭을 비교하여 보여준다. 각 샘플에 대해, △Rn(리포터(reporter) 염료 방출량과 소광(quenching) 염료 방출량의 비)은 순환 회수에 대해 도시된다. 형광 강도는 입력된 표적 DNA의 양과 직접 관련된다. 검출가능한 정도의 형광에 도달하는 데 순환 회수가 얼마 걸리지 않을수록 초기 복제 회수가 더욱 커진다.
도 5는 향상된 실시간 PCR을 사용하여 분석된 임상 샘플을 보여준다. SARS-CoV 양성 샘플은 SARS-CoV 음성 샘플과 분명히 구별되며 화살표로 나타내어진다.
도 6은 표준 실시간 PCR을 사용한 패널 A의 동일한 임상 샘플을 보여준다. SARS-CoV 양성 및 음성 샘플은 쉽게 식별되지 않는다.
도 7은 향상된 실시간 PCR을 사용한 SARS-CoV의 순차적인 10배 희석(2x102.5TCID50/㎖[최상의 흔적] 내지 2x10-10.5TCID50/㎖)을 보여준다. 보다 낮은 흔적은 역전사 음성 대조군과 태크만R 음성 대조군을 보여준다.
도 8은 표준 실시간 PCR을 사용한 SARS-CoV의 순차적인 10배 희석(2x102.5TCID50/㎖[최상의 흔적] 대 2x10-10.5TCID50/㎖)을 보여준다.
발명의 요약
일반적으로 본 발명은 다양한 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 코로나바이러스 핵산을 추출하고 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (A) SARS 코로나바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 회수하는 단계, (B) 상기 회수된 샘플로부터 리보핵산(RNA)을 추출하는 단계, (C) RNA/DNA 증폭 기술을 사용하여 특정 표적 서열을 증폭하는 단계, 및 (D) 상기 표적 증폭된 핵산 생성물을 DNA 증폭 기술과, 태크만(Taqman)R 프로브 또는 분자 표식(beacon)을 포함한, 형광생성(fluorogenic) 프로브와 같은 적절한 기록 시스템을 사용하여 검출하는 단계를 포함한다.
더욱이 본 발명은 SARS 코로나바이러스를 검출하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 표적 분자를 복제하는 핵산 복제제를 포함하며, 상기 표적 분자는 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열에 상보적인 하나 이상의 부분을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 상기 복제된 표적 분자를 증폭하고 증폭하는 동안 복제된 생성물을 검출하는 핵산 복제제 및 검출제를 포함한다. 이러한 제제들은 상기 복제된 생성물을 증폭할 수 있는 프라이머 세트와 상기 증폭된 생성물에 상보적인 형광생성 프로브를 포함한다.
본 발명의 제 1면에 따르면, 서열번호 1 내지 27 중 어느 하나로 구성된 단리된 DNA 서열이 제공된다.
본 발명의 제 2면에 따르면, 프라이머 또는 형광으로 표지된 프로브로서 DNA 증폭에서 사용하기 위한 서열번호 1 내지 27 중 어느 하나로 구성된 단리된 DNA 서열이 제공된다. 상기 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1 내지 27 중 어느 하나로 이루어질 수 있다.
본 발명의 제 3면에 따르면, 핵산 검출 방법이 제공되며, 상기 방법은 핵산 분리, DNA 증폭, 및 후속하여 실시간 PCR 단계를 포함한다. 바람직하게, DNA 증폭은 PCR, NASBA 또는 어느 다른 적절한 핵산 증폭 기술을 포함한다.
가장 바람직하게, 상기 방법은 ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계; ⅱ) 상기 핵산을 PCR, NASBA 또는 어느 하나의 다른 증폭 기술을 선택적으로 이용하여 증폭하는 단계; 및 ⅲ) 단계 ⅱ)에서 생성된 핵산을 실시간 PCR을 사용하여 증폭하고 검출하는 단계를 포함한다.
보다 바람직하게, 단계 ⅱ)는 PCR을 사용하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다. 단계 ⅱ)는 예비-증폭 단계로 공지된다. 이러한 증폭 단계는 DNA 증폭과 PCR에 의한 검출을 포함할 수 있다. 또한, NASBA가 사용될 수 있다. 단계 ⅱ)의 다른 적절한 핵산 증폭 기술은 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 에 후속하여 아가로스 겔 전기영동법, 중첩된(nested) PCR, 실시간 태그만R PCR, 분자 표지 PCR, 핵산의 등온 및 키메라 프라이머-개시된 증폭(ICAN)으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 핵산 증폭 기술의 이러한 신규한 조합에 의해 이루어진다. 예비-증폭 단계와 후속한 실시간 PCR의 조합은 유리하게 핵산을 검출하는 매우 감도 높은 방법을 제공한다. 이로 인하여 바이러스 또는 다른 병원균에 의한 초기 감염 단계의 사람을 쉽게 식별할 수 있게 한다.
본 발명의 추가적인 면은 핵산을 검출하는 방법에 사용하기 위한 서열번호 1 내지 27을 포함하는 단리된 DNA 서열과, 핵산의 검출 방법에 사용하기 위한 조성물의 제조 시 서열번호 1 내지 27을 포함하는 단리된 DNA 서열의 용도에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다: ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계; ⅱ) 상기 핵산을 PCR, NASBA 또는 어느 하나의 핵산 증폭 기술을 선택적으로 사용하여 증폭하는 단계; 및 ⅲ) 단계 ⅱ)에서 생성된 핵산을 실시간 PCR을 사용하여 증폭하고 검출하는 단계.
또한, 단계 ⅱ)는 예비-증폭 단계로 알려진다. 예비-증폭 단계는 PCR, 또는 NASBA에 의해 실행될 수 있다. 이러한 예비-증폭 단계에 사용되는 프라이머는 어떤 방법이 사용되었느냐에 따라 다를 것이다.
검출된 핵산은 바람직하게 SARS 코로나바이러스 RNA 또는 cDNA로부터 유도된다.
본 발명은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플에서 SARS 코로나바이러스를 검출하기 위한 진단 시험 키트에 관한 것으로, ⅰ) 상기 샘플로부터 SARS 코로나바이러스 RNA를 분리하는 분리제; ⅱ) SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 한 부분 이상에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 표적 분자를 복제하는 핵산 복제제; 및 ⅲ) 검출 분자를 포함하면서 표적 분자를 검출하는 핵산 검출제를 포함한다.
본 발명의 추가적인 면은 서열번호 1 내지 27에 해당하는 두개 이상의 단리된 DNA 서열을 포함하는 SARS 진단 시험 키트에 관한 것이다.
바람직하게, SARS 진단 시험 키트는 서열번호 1, 2, 3, 4, 또는 5; 및 6, 7, 8, 9 또는 10 중 어느 하나에 해당하는 예비-증폭 프라이머를 포함한다. 프라이머쌍 중 하나의 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 또는 5로부터 선택되고 다른 프라이머는 서열번호 6, 7, 8, 9, 또는 10으로부터 선택된다. 서열번호 1 내지 5는 PCR 정방향(forward) 프라이머에 해당하고 서열번호 6 내지 10은 PCR 역방향(reverse) 프라이머에 해당한다. 또한, 예비-증폭 프라이머는 서열번호 26 및 27에 해당한다. 서열번호 1, 2, 3, 4, 또는 5 및 6, 7, 8, 9, 또는 10은 예비-증폭 PCR에서 사용될 수 있고 서열번호 26 및 27은 예비-증폭 NASBA에서 사용될 수 있다.
또한, SARS 진단 시험 키트는 서열번호 11, 12, 13, 14, 또는 15 및 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 어느 하나에 해당하는 실시간 PCR 프라이머를 포함한다. RT-PCR 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머는 서열번호 11, 12, 13, 14, 또는 15으로부터 선택되고, 다른 프라이머는 서열번호 16, 17, 18, 19, 또는 20으로부터 선택된다. 더욱이, SARS 진단 시험 키트는 서열번호 21, 22, 23, 24, 또는 25 중 어느 하나에 해당하는 실시간 PCR 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 프라이머와 프로브는 실시간 PCR에서 사용된다. 서열번호 11 내지 15는 실시간 PCR 정방향 프라이머에 해당하고 서열번호 16 내지 20은 실시간 PCR 역방향 프라이머에 해당한다. 서열번호 20 내지 25는 실시간 PCR 프로브에 해당한다.
예비-증폭 PCR 및 RT-PCT에 사용된 프라이머는 필요하다면 교환하여 사용할 수 있다.
또한 진단 시험 키트는 (a) 서열번호 1, 2, 또는 3 및 6, 7, 또는 8; 및 b) 서열번호 11, 12, 또는 13의 프라이머 세트와; 서열번호 21, 22, 또는 23으로부터 선택된 프로브를 포함한다.
바람직한 구체예로서, 진단 시험 키트는 하기 A, B, C, 및 D의 프라이머 세트와; 프로브 E를 포함한다:
A) 서열번호 1, 2, 3, 4, 또는 5 중 어느 하나로부터 선택된 프라이머;
B) 서열번호 6, 7, 8, 9, 또는 10 중 어느 하나로부터 선택된 프라이머;
C) 서열번호 11, 12, 13, 14, 또는 15 중 어느 하나로부터 선택된 프라이머;
D) 서열번호 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 어느 하나로부터 선택된 프라이머; 및
E) 서열번호 20 내지 25 중 어느 하나로부터 선택된 프로브.
상기 진단 시험 키트는 예비-증폭 단계가 PCR과 연관될 때 사용될 수 있다. 추가로, 프라이머 세트 A 및 B; 또는 C 및 D는 종래의 PCR 및/또는 RT/PCR과 교환하여 사용할 수 있다.
다른 바람직한 구체예로서, 진단 시험 키트는 하기 프라이머 세트 A, C, D, 및 프로브 E를 포함한다:
A) 서열번호 26 또는 27로부터 선택된 프라이머;
C) 서열번호 11, 12, 13, 14, 또는 15로부터 선택된 프라이머;
D) 서열번호 16, 17, 18, 19, 또는 20으로부터 선택된 프라이머; 및
E) 서열번호 20 내지 25 중 어느 하나로부터 선택된 프로브.
이러한 진단 시험 키트는 증폭 전단계가 NASBA와 연관될 때 사용될 수 있다. 서열번호 26 및 27은 SARS NASBA T7 프라이머 및 SARS NASBA 전기화학적발광(ECL) 프라이머에 각각 해당한다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
핵산 증폭은 신속하게 많은 질병의 진단을 확인하기 위한 표준적인 실험용 방법이 되고 있으며, 환자 조직에서 감염 유기체의 존재를 직접 설명한다. 이러한 방법은 SARS 발발 동안 불가결하게 되었는데 왜냐하면 그방법들의 특이성 및 감도가 감염을 빠르게 확인할 수 있고 항바이러스 치료의 효능을 모니터링하게 하기 때문이다. SARS 진단 분석은 SARS-CoV에 대한 숙주 항체의 존재를 설명해 주는 것에 의존하며, ELISA 및 면역형광법을 사용하여 진행된다. 그러나, 이러한 시험는 검출가능한 수준에 항체가 도달하는 데 7 내지 21일이 요구되기 때문에 핵산 방법의 감도를 저하시키고 새롭게 감염된 환자를 검출할 수 없다.
본 발명은 생물학적 샘플 및 환경 샘플에서 SARS 코로나바이러스 RNA 또는 cDNA와 같은 핵산을 검출하는데 민감한 방법을 제공한다. 이러한 생물학적 샘플은 혈액, 타액, 혈청, 혈장, 비인두 면봉 채취물, 입인두 면봉 채취물, 소변, 대변, 다른 체액, 및 또한 환경 샘플은 물, 오수, 폐기물 등을 포함한다.
핵산 검출을 위한 본 발명의 방법은 실시간 PCR전의 예비-증폭 단계를 필요로 한다. 문헌(Lau et al "A real-time PCR for SARS-coronavirus incorporating target gene pre-amplification" Biochemical and Biophysical Research Communication (2003) 312: 1290-1296)의 내용이 참고로 기술된다. PCR 및 실시간 PCR(RT PCR)은 당업계에 공지된 기술이다. 형광 정량과 함께 실시간 폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR)은 DNA의 검출에 있어 신속하고 매우 민감하며 아주 특이적인 방법이고 SARS 코로나바이러스 핵산의 검출에 적용될 수 있다. 이 기술의 결과는 3시간 정도의 적은 시간으로 얻어질 수 있다. RT PCR은 형광 정량을 사용할 수 있으나 단지 형광 정량으로 제한되지 않는다. RT PCR은 예를 들면 바람직하게 하나의 말단은 형광 흡수 부분으로, 다른 말단은 형광 방출 부분으로 표지된 부가적인 DNA 올리고뉴클레오티드 분자(본 명세서에서는 프로브로 언급된다)의 사용을 포함한다. 부가적인 DNA 올리고뉴클레오티드는 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머들 사이에서 관심있는 핵산 부위와 혼성화를 이룬다. 여기에서, 신호 발생기는 형광 생성 분자, 분자 표지(beacon), 또는 적절한 검출기에서 검출 및 정량될 수 있는 광자를 방출하도록 자극될 수 있는 다른 분자가 될 수 있다.
중첩 PCR 방법은 초기 증폭 생성물이 후속하는 증폭과정에서 주형으로 사용되며, 많은 표적 유전자 검출의 신빙성 및 감도를 증가시키는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 예비-증폭 방법은 통상의 PCR 기술에서 일반적으로 감도가 뛰어나다는 것을 고려할 때 다양한 실시간 PCR 적용과정이 불필요하다. 그러나, 관심있는 표적 유전자가 드물고 및/또는 다른 오염물질의 이면에 존재하는 상황에서는, 본 발명에 따른 예비-증폭이 놀랍게도 검출의 한계를 높이는데 유리한 것으로 알려졌다.
본 발명의 방법, 즉 실시간 PCR 이전의 예비-증폭은 "향상된 실시간 PCR(Enhanced Real-time PCR)"로 본 명세서에서 언급될 것이다. 예비-증폭은 PCR, NASBA, 또는 다른 핵산 증폭 기술로 이루어질 수 있다. 이 ERT 기술의 하나의 이점은 검출 한계가 놀랍게도 통상의 태크만R 실시간 PCR 보다 100배 크고 통상의 PCR 보다 108배가 큰 TCID50(2x10-11.5)까지 되는 것으로 알려졌다. 추가 이점은 이 향상된 실시간 PCR 검출을 위한 턴어라운드(turnarround) 시간이 약 5.5시간 걸린다는 것이다. 전체 검출 방법의 시간을 단축하고 시험의 감도를 증가시키기 위해, 예비-증폭을 위한 NASBA 기술과 실시간 PCR을 조합하는 방법이 또한 사용될 수 있다. 예비-증폭 단계가 NASBA를 포함할 때, 턴어라운드 시간은 유익하게 약 4시간이 되는 것으로 알려졌다. 따라서, 이렇게 조합된 예비-증폭/RT-PCR 기술에 대한 검출 한계 및 시간에 관련된 이점은 예기치 않은 것이고 유익하다.
부가적으로 ERT는 분명한 방식으로 양성 및 음성 샘플 사이의 구별을 가능하게 한다. 이것은 오진 또는 오판을 허용하지 않는 임상 진단에서 특히 중요하다.
양성 및 음성 신호 사이의 차이는 동일한 샘플이 표준 실시간 PCR에 의해 분석될 때 SARS CoV 양성 및 음성 증폭 곡선이 서로 밀접하게 상치(overlap)하는 경향이 있어서(도 6) 매우 불분명하다. 그러므로, 실시간 PCR 결과를 판단하는데 있어서 보다 덜 숙련된 임상의는 ERT에 의해 얻어진 향상된 결과를 이용하여 양성 및 음성 신호을 쉽게 구별할 수 있다. 이것은 통상의 실시간 PCR에 대한 본 발명의 매우 중요한 이점이다.
향상된 실시간 PCR의 감도 증가는 간단한 임상 진단을 넘어서 많은 영역에 적용가능하게 한다. 매개물과 오수가 SARS 발발과 관련된다면, 환경 샘플에 핵산 검출 방법을 적용하는 것이 분명히 적절하다. SARS-CoV 핵산의 증명을 위해 대중 공간(리프트, 대기실 등)에서 표면을 조사하는 것은 세정/살균 과정의 효능를 모니터링하고 질병의 전염를 모니터링하는 기회를 제공할 것이다.
SARS의 징후와 증상은 예컨대 종종 열이 없는 나이지긋한 분들과 같이 위험성이 높은 환자들에게서 매우 다양하기 때문에, SARS-CoV 의 존재를 결정하는 민감한 방법이 임상 환경에서 바이러스의 전염을 제한하기에 매우 유용하다. 조기 검출은 비상 계획을 실행하여 국부적인 발발을 저지하고 SARS-CoV의 국제적인 전염을 방지하게 하여, 공공의 염려와 잠재적인 경제적 영향을 제한하게 된다.
본 발명의 바람직한 구체예는 도면을 참고하여 설명된다. 표 1은 도 1 내지 3에서 사용된 참조 번호를 포함한다.
생물학적 샘플, 예컨대 입인두 면봉 채취물에서 SARS 코로나바이러스의 농도는 매우 낮아서 SARS 코로나바이러스 바이러스성 RNA의 존재는 생물학적 샘플에서 직접 검출될 수 없다. 검출 목적을 위해 충분한 양으로 바이러스성 RNA 분자의 수를 증가시키기 위한, 적절한 증폭 기술이 요구된다. 폴리머라제 사슬 반응(PCR)은 DNA의 증폭에 특별히 사용되는 융통성있는 기술인 것으로 알려져 있다. RNA를 DNA로 전환하는 것은 PCR 과정이 전개되어 SARS 코로나바이러스 같은, RNA 게놈이 병원균을 덮는다. 이 증폭된 DNA 분자는 적절한 기술로 검출될 수 있다.
SARS 코로나바이러스는 리보핵산(RNA, 10)의 단일가닥 형태의 유전 물질이다. 이 바이러스성 RNA는 재생을 위해 반드시 유전자를 함유하며 필수 유전자중 하나는 소위 폴리머라제이다. 이 유전자는 대략 길이가 2800 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드는 분자의 5' 말단으로부터 숫자가 매겨진다.
도 1은 검출 키트로 SARS 코로나바이러스를 검출하는 전체과정을 보여준다. 도 1에서와 같이, 표적 SARS 코로나바이러스 바이러스성 핵산 분자는 단일 가닥의 RNA 형태이고, 우선 생물학적 샘플에서 추출된다. 호환가능한 생물학적 샘플 유형은 혈액, 혈청/혈장, 말초 혈액 단핵구 세포/말초 혈액 림프구(PBMC/PBL), 타액, 소변, 대변, 인두 면봉 채취물, 피부 병변 면봉 채취물, 뇌척수액, 자궁 경관 도말, 고름 샘플, 푸드 매트릭스(food matrices), 및 뇌, 비장, 및 간을 포함한 신체의 다양한 부분에서의 조직을 포함한다. 열거되지 않은 다른 샘플도 또한 사용될 수 있다. 분리제는 본 발명의 검출 키트에서 핵산을 추출한다.
표적 SARS 코로나바이러스 바이러스성 RNA 분자(10)가 생물학적 샘플로부터 추출된 후, 샘플에서 RNA 분자의 양이 검출될 만큼 충분하지 않을 수 있다. 따라서, SARS 코로나바이러스 바이러스성 RNA 분자의 일부는 적절한 증폭 기술, 예컨대 폴리머라제 사슬 반응(PCR), NASBA, 또는 RT-PCR에 의해 표적 핵산 분자로 복제된다. 그리고 나서, 표적 핵산 분자는 적절한 방법으로 검출될 수 있다. RT-PCR 이전의 예비-증폭 단계는 놀랍게도 통상의 PCR 기술에 의해 제공된 것보다 큰 검출 정도, 향상된 감도와 보다 빠른 시간을 포함한 이점을 제공한다.
분리 및 증폭 과정이 하기에 상세하게 설명될 것이다.
핵산 분리:
SARS 코로나바이러스 바이러스성 RNA 분자(10)는 생물학적 샘플에 적절한 분리제를 적용하여 분리할 수 있다. 바람직하게, 분리제를 가하기 전에 용균제를 가할 수 있다. 용균제 예컨대, 용균 완충액은 단백질 및 지질을 녹이고 생물학적 샘플에서 단백질을 변성시킬 수 있어서 이 물질들을 보다 쉽게 샘플로부터 제거할 수 있다. 또한, 용균제는 장기 보관을 위해 RNA 분자를 안정화시키는 완충액으로 작용할 수 있다. 도 2에서와 같이, RNA 분자는 실온에서 48시간까지 용균 완충액에서 안정하고 -70℃에서 무기한으로 보관될 수 있다. 그렇게 하는 이점은 그러한 과정을 거치는 것이 적절치 않은 샘플링 장소에서 분석할 필요가 없다는 것이다.
적절한 용균 완충액은 예를들면 5M 구아니딘 티오시아네이트와 Tris/HCl을 포함한다. 이러한 용균 완충액은 당업계에 널리 공지되어 있다. 단백질과 지질을 녹이고 단백질을 변성시키고 RNA 분자를 안정화시킬 수 있는 상이한 조성의 용균제가 본 발명의 검출 키트에서 사용될 수 있다.
용균제를 생물학적 샘플에 가한 후, 다음 단계는 분리제를 사용하여 샘플로부터 핵산 분자를 분리하는 것이다. 도 2는 검출 키트에서의 전체적인 분리 과정을 설명하고 있다. 용균제를 생물학적 샘플에 가해진 후, 다른 원치 않는 성분과 함께 핵산은 용액의 형태로 존재한다. 이 용액을 핵산에 친화도가 높은 소형 크로마토그래피 컬럼(12)에 가한다. 비핵산 성분은 세척에 의해 컬럼으로부터 제거된다. 그 다음 핵산은 적절한 전개액을 이용하여 컬럼으로부터 특정하게 추출될 수 있다. 본 명세서에 설명된 핵산 정제과정은 당업계에 널리 공지되어 있다.
샘플에 함유된 핵산을 분리한 후, 필요하다면 증폭제를 핵산의 혼합물(14)에 가하여 SARS 코로나바이러스 바이러스성 RNA 분자를 역전사 효소를 사용하여 상보적인 DNA(cDNA)(16)로 전환시킨다. 이 과정은 당업계에 널리 공지되어 있다. cDNA로의 전환은 특정 상황에서만 요구된다. 따라서, RNA 또는 cDNA는 어떤 과정이 예비-증폭을 위해 사용되느냐에 따라 다음 단계를 위한 주형이 될 수 있다.
예비-증폭 단계:
SARS 코로나바이러스 게놈의 일부는 검출을 위해 예컨대 PCR 기술 또는 NASBA 또는 다른 적절한 핵산 증폭 기술에 의해 소위 예비-증폭 단계에서 복제된다. 증폭 동안 cDNA 및 단일가닥 RNA가 합성된다.
NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)은 핵산 증폭을 위한 연속적이고, 등온의 효소에 기초한 방법이다. 이 기술은 역전사효소, 리보뉴클레아제-H, RNA 폴리머라제, 및 두 개의 특이적으로 고안된 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머의 혼합물을 사용한다. NASBA는 직접 RNA에 작용할 수 있어 RNA를 cDNA로 전환할 필요가 없다. 서열번호 26과 27이 NASBA 예비-증폭 단계에서 프라이머로서 사용될 수 있다.
또한, 통상의 PCR 또는 다른 핵산 증폭 기술이 이 예비-증폭 단계에서 사용될 수 있다. 서열번호 1 내지 10은 예비-증폭 PCR 단계에서 프라이머로서 사용될 수 있다. 또한, 서열번호 11 내지 20은 이 예비-증폭 PCR 단계에서 프라이머로서 사용될 수 있다. PCR에서, SARS RNA는 우선 cDNA로 전환된 다음 예비-증폭 PCR을 위한 주형으로 사용된다.
PCR에 의한 예비-증폭 단계:
도 3에서와 같이, 증폭 과정은 프라이머 A(18)와 프라이머 B(20)를 95℃로 가열하여 단일가닥 형태가 되는, 표적 SARS 코로나바이러스 바이러스성 cDNA(16)로 어닐링(annealing)하여 개시된다. 프라이머 A와 프라이머 B는 그들이 표적 cDNA 분자와 결합할 수 있도록 고안된다. 정확한 결합 위치는 조사된 바이러스의 가닥에 따라 다르다. 결합 부위는 특정 주기 후에 변할 수 있다. 프라이머 A와 프라이머 B의 중요한 기술적 특징은 그들이 SARS 코로나바이러스 바이러스성 cDNA의 일부에 각각 결합할 수 있다는 점이다.
따라서, 프라이머 A와 프라이머 B는 SARS 코로나바이러스 바이러스성 cDNA의 한 부분 이상에 상보적인 DNA 서열을 암호화하는 결합 서열을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 프라이머 A가 SARS 코로나바이러스 바이러스성 cDNA에 결합하기에 적절한 부분은 결합 기능을 위해 최소 숫자의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 알려져 있는, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18319 내지 18338 사이 부분이다. 이러한 연구에서 사용된 유형의 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 수탁 번호(GenBank Accession Number) AY278491이다. 따라서, 프라이머 A의 결합 서열은 바람직하게 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18319 내지 18338 사이 부분에 상보적인 DNA 서열을 포함하고, 도 4a와 4b에서 서열번호 1로 정해진다. 서열번호 1은 5'-3' 방향으로 일반 형식으로 쓰여졌다. 결과적으로 바이러스성 유전자에 대한 결합 방향은 "뒤쪽"에서 "앞쪽"이 된다.
다른 방법으로, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18363 내지 18382(서열번호 2, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18404 내지 18386(서열번호 3, 도 4a와 4b)가 프라이머 A에서 결합을 위해 사용될 수 있다. 또한, 서열번호 4 또는 5가 프라이머 A에서 결합을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 프라이머 B가 SARS 코로나바이러스 바이러스성 cDNA에 결합하기에 적절한 부분은 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18157 내지 18179 사이 부분임이 알려졌고, 결합 기능을 위해 최소 숫자의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 알려졌다. 이러한 연구에 사용된 유형의 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 수탁 번호 AY278491이다. 그러므로, 프라이머 B의 결합 서열은 바람직하게 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18157 내지 18179 사이 부분에 상보적인 DNA 서열을 포함하고, 도 4a와 4b에서 서열번호 6으로 정해진다. 서열번호 6은 5'-3' 방향으로 일반 형식으로 쓰여졌다.
다른 방법으로, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18125 내지 18144(서열번호 7, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18103 내지 18122(서열번호 8, 도 4a와 4b)가 프라이머 B에서 결합을 위해 사용될 수 있다. 또한, 서열번호 9 또는 10이 프라이머 B에서 결합을 위해 사용될 수 있다.
프라이머 A 및 B가 SARS 코로아바이러스 바이러스성 cDNA에 결합한 후, 프라이머 A 및 B는 프라이머 A 및 B의 3' 말단에 적절한 뉴클레오티드가 존재하면 적절한 폴리머라제, 예컨대 Taq DNA 폴리머라제의 활성으로 신장된다. 따라서, 신장된 프라이머 A(22) 및 B(24)가 생성되며, (a) SARS 코로나바이러스 바이러스성 RNA의 일부에 상보적인 DNA 서열을 포함한다.
SARS 코로나바이러스 cDNA에 적절한 증폭 프로그램을 적용하여 과량의 이중가닥 DNA 생성물(26)로 전환시킬 수 있다. 적절한 증폭 프로그램은 다음과 같다:
NASBA에 의한 예비-증폭
또한, 예비-증폭은 핵사의 증폭에서 연속적이고, 등온이며, 효소에 기초한 방법인 NASBA으로 이루어질 수 있다. 이 기술은 역전사효소, 리보뉴클레아제-H, RNA 폴리머라제, 및 두 개의 특이적으로 고안된 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머의 혼합물을 사용한다. 증폭과정 동안, cDNA와 단일가닥 RNA가 합성된다. 따라서, 태크만 실시간 PCR이 NASBA 생성물에서 cDNA의 존재를 이용하여 실행될 수 있다. RNA는 NASBA를 위한 주형으로 활동할 수 있어서 이러한 상황에서는 SARS RNA를 cDNA로 전환하는 것이 불필요하다.
NASBA를 실행하기에 적절한 프라이머는 SARS NASBA T7 프라이머와 SARS NASBA ECL 프라이머에 각각 해당하는 서열번호 26 및 27을 포함한다. 이러한 NASBA 프라이머는 예비-증폭 단계에서 PCR 프라이머 서열번호 1 내지 10 대신 사용될 수 있다.
실시간 PCR
검출 과정의 감도를 높이기 위해, 예비-증폭 단계, 즉 PCR 반응 또는 NASBA의 생성물이 추가 증폭 과정, 즉 RT-PCR과정에서 사용된다. 프라이머 서열번호 1 내지 10이 필요하다면 대신 사용될 수 있더라도 서열번호 11 내지 20은 RT-PCR을 실행하기 위한 프라이머로 사용될 수 있다. 서열번호 21 내지 25는 RT-PCR에서 프로브로서 사용된다.
검출 목적을 얻기 위하여, 예비-증폭 단계, 예컨대 PCR 또는 NASBA의 증폭된 이중가닥 DNA 생성물(26)을 RT-PCR, 바람직하게 태크만R 정량 실시간 PCR을 이용하는 추가적인 증폭에서 주형으로 사용한다. 추가적인 증폭에서 주형으로 사용하기 전에 복제된 DNA를 적절한 액체에서 우선 희석해야 후속한 증폭 과정의 효율을 최대화할 수 있다. 복제된 분자의 적절한 희석액은 뉴클레아제가 없는 물 또는 완충액을 포함한다. RT-PCR 과정의 적절한 증폭 프로그램은 다음과 같다:
증폭 정도는 적절한 장치, 예컨대 ABI 프리즘 7700 유전자 검출 시스템(Applied Biosystems)에서 자동적으로 모니터링될 수 있다.
RT-PCR에 의한 증폭은 두 개의 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머(프라이머 C(28) 및 프라이머 D(30))와 형광유전 프로브(E, 32)를 필요로 한다.
본 발명의 목적을 위해, SARS 코로나바이러스 바이러스성 cDNA 증폭 생성물에 대해 프라이머 C의 결합이 적절한 부분은 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18264 내지 18245 사이 부분으로, 결합 기능을 위해 최소 숫자의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 알려졌다. 이러한 연구에서 사용된 유형의 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 수탁 번호 AY278491이다. 따라서, 프라이머 C의 결합 서열은 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18264 내지 18245 사이 부분에 상보적인 DNA 서열을 바람직하게 포함하고, 도 4a와 4b에서 서열번호 11로 정해진다. 서열번호 11은 5'-3'방향으로 일반 형식으로 쓰여졌다. 결과적으로 바이러스 유전자에 대한 결합 방향은 "뒤쪽"에서 "앞쪽"이 된다.
또한, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18295 내지 18314(서열번호 12, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18322 내지 18304(서열번호 13, 도 4a와 4b)가 프라이머 C에서 결합을 위해 사용될 수 있다, 또한 서열번호 14 또는 15가 프라이머 C에서 결합을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 SARS 코로나바이러스 바이러스성 cDNA 증폭 생성물에 대한 프라이머 D의 결합에 적절한 부분은 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18193 내지 18211 사이 부분이고, 결합 기능을 위해 최소 숫자의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 알려졌다. 이러한 연구에서 사용된 유형의 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 수탁 번호 AY278491이다. 따라서, 프라이머 D의 결합 서열은 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18193 내지 18211 사이 부분에 상보적인 DNA 서열을 바람직하게 포함하고, 도 4a와 4b에서 서열번호 16으로 정해진다. 서열번호 16은 5'-3'방향으로 일반 형식으로 쓰여졌다.
또한, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18219 내지 18336(서열번호 17, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18205 내지 18220(서열번호 18, 도 4a와 4b)가 프라이머 D에서 결합을 위해 사용될 수 있다, 또한 서열번호 19 또는 20이 프라이머 D에서 결합을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, SARS 코로나바이러스 바이러스성 cDNA 증폭 생성물에 대한 프로브 E의 결합에 적절한 부분은 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18217 내지 18234 사이 부분이고, 결합 기능을 위해 최소 숫자의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 알려졌다. 이러한 연구에서 사용된 유형의 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 수탁 번호 AY278491이다. 따라서, 프로브 E의 결합 서열은 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18217 내지 18234 사이 부분에 상보적인 DNA 서열을 바람직하게 포함하고, 도 4a와 4b에서 서열번호 21로 정해진다.
또한, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18241 내지 18260(서열번호 22, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18228 내지 18246(서열번호 23, 도 4a와 4b)이 프로브 E에서 결합을 위해 사용될 수 있다. 또한 서열번호 24 또는 25가 프로브 E에서 결합을 위해 사용될 수 있다.
프라이머 C 및 D는 적절한 효소, 예컨대 Taq DNA 폴리머라제 및 첨가된 뉴클레오티드의 활성에 의해 3' 발단으로부터 신장하여 이중가닥 생성물(34)을 형성한다. 증폭 과정 동안, DNA 폴리머라제 효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 프로브 E가 제거된다. 이 결과 증폭 정도 및 증폭된 생성물의 농도와 관련되는 형광 신호이 증가된다. 따라서 RT-PCR 증폭 과정의 생성물은 하기 DNA 서열을 각각 포함하는 다량의 표적 DNA 분자이다:
(a) SARS 코로나바이러스의 일부에 상보적인 DNA 서열.
태크만R 실시간 프로브의 서열은 말단이 프라이머 C 및 D로 정의되는, 증폭된 DNA 생성물의 어느 부분에 상보적일 수 있다. 그러나, 프로브 서열은 프라이머 C 및 D의 서열과 상치할 수 없는데, 왜냐하면 증폭 반응이 일어나는 것을 방해하기 때문이다.
향상된 실시간 PCR
이렇게 조합된 예비-증폭과 실시간 PCR 기술은 본 명세서에서 "향상된 실시간 PCR"(ERT)로 언급된다. 도 3은 PCR과 RT-PCR의 조합에 의한 SARS 코로나바이러스 바이러스성 RNA 증폭의 개략도이다.
이러한 신규 분석의 특징은 예비-증폭 단계, 예컨대 통상의 PCR 또는 NASBA의 1회의 증폭 생성물을 RT-PCR의 2회에서 주형으로 사용한다는 것이다. 이렇게 조합된 기술은 SARS-CoV 검출 감도를 증가시킨다. 선택적으로, 동일한 프라이머가 통상의 PCR 및 RT-PCR 단계에 의해 초기 예비-증폭에서 사용된다. 이러한 부가적인 예비-증폭 단계는 임상 샘플에서 SARS-CoV의 검출 감도를 향상시킨다.
표 2는 열거된 프라이머 서열이 CUHK AG03 AY345988 유전자은행 서열에 기초하여 어떻게 SARS 서열에 해당하는지를 보여준다.
서열번호 4, 9, 14, 19, 24는 SARS 뉴클레오캡시드 단백질(NP) 유전자로부터 유도되고, 서열번호 5, 10, 15, 20, 및 25는 SARS 폴리머라제(Pol) 유전자로부터 유도된다.
또한, 본 발명은 생물학적 또는 환경 샘플에서 SARS 코로나바이러스를 검출하는 키트 제조에서의 제 1 및 제 2 정제 및 단리된 DNA 분자의 용도에 관한 것으로, SARS 코로나바이러스의 RNA 분자는 분리제에 의해 생물학적 또는 환경 샘플로부터 분리되고, 표적 분자는 제 1 및 제 2 정제 및 단리된 DNA 분자를 포함하는 핵산 복제제에 의해 복제되며, 표적 분자는 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 한 부분 이상에 상보적인 핵산 서열번호 및 검출 분자에 결합하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 표적 분자는 핵산 검출제에 의해 검출되며, 상기 핵산 검출제는 검출 분자를 포함한다.
바람직하게, 상기 표적 분자는 RNA 또는 다른 핵산일 수 있지만 cDNA 분자이다. 상기 제 1 정제 및 단리된 DNA 분자는 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 한 부분 이상에 결합하는 DNA 서열을 포함하여 제 1 정제 및 단리된 DNA 분자는 효소와 DNA 뉴클레오티드의 존재에서 신장하여 DNA 서열을 발생시키며, 이 DNA 서열은 상기 제 1 정제 및 단리된 DNA 분자가 SARS 코로나바이러스의 cDNA 서열의 한 부분 이상에 결합할 때 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 한 부분 이상에 상보적인 DNA 서열을 포함한다.
보다 바람직하게, 제 1 DNA 서열은 서열번호 6, 7, 8, 9, 또는 10 중 하나의 DNA 서열과 함께 서열번호 1, 2, 3, 4, 또는 5 중 하나의 DNA 서열을 암호화할 수 있다. 또한, 제 1 DNA 서열은 서열번호 26 및 27의 DNA 서열을 암호화할 수 있다.
또한, 상기 핵산 복제제는 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 한 부분 이상에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 제 2 정제 및 단리된 DNA 분자를 포함하여 상기 제 2 정제 및 단리된 DNA 분자가 효소와 DNA 뉴클레오티드의 존재시 신장하여 DNA 서열을 발생시키며, 이 DNA 서열은 상기 제 2 정제 및 단리된 DNA 분자가 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 한 부분 이상에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자에 결합할 때 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 한 부분 이상을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 DNA 서열은 서열번호 16, 17, 18, 19, 또는 20의 DNA 서열 중 어느 하나와 함께 서열번호 11, 12, 13, 14, 또는 15의 DNA 서열 중 어느 하나를 암호화한다. 상기 복제된 DNA 생성물은 우선 추가 증폭 전에 희석된다.
검출 분자는 표적 분자에 결합하기 위해 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 한 부분 이상을 암호화하는 DNA 서열과 신호 발생기를 포함한다.
상기 신호 발생기는 다음 중 하나를 포함한다: 형광유전 분자, 분자 표지(beacon), 적절한 검출기에서 검출되어 정량가능한 광자를 방출하도록 자극될 수 있는 다른 분자. 바람직하게, 검출 분자의 DNA 서열은 서열번호 20 내지 25의 DNA 서열 중 어느 하나를 암호화한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 설명된다. 하기 실시예에 대해 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
하기 실시예에 사용된 성분과 일반적인 프로토콜은 다음과 같이 전개된다:
샘플
핵산을 분리하기 위해 사용된 샘플은 SARS 환자에게서 얻어졌으며 중국, 북경의 병원에서 제공되었다.
박스 A(핵산 분리)
치아젠 RN이지R 미니 키트(Qiagen RNeasyR Mini Kit) 핵산 분리 키트
박스 B(핵산 증폭)
마스터믹스(MASTERMIX)(0.5㎖)(유로젠텍(Eurogentec)에서 구입)
dUTP와 dNTPs 함유물(0.2mM dATP, dCTP, dGTP 및 0.4mM dUTP), 핫스타트(HotStart) Tag DNA 폴리머라제, MgCl2, 유라실-N-글리코실라제(UNG), 및 비활성 기준(Passive Reference).
SARS 프라이머(20㎕)
SARS 관련 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자 부분에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 20, 26, 및 27을 포함한다.
SARS 프로브(10㎕)
SARS 관련 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자 부분에 상보적이고 형광 방출 표지와 형광 소광 분자로 표지되는 DNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 21 내지 25을 포함한다. 0.2mM의 SARS 프라이머와 0.24mM 태크만 SARS 프로브를 전체 마스터믹스에 첨가한다.
SARS 양성 대조군(10㎕)
SARS 관련 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 일부를 포함하는 고도로 정제되고 감염되지 않은 플라스미드
제제(reagents)의 제조를 위한 프로토콜
박스 A(핵산 분리)
필요에 따라 충분한 수의 RN이지(RNeasy) 소형 컬럼(샘플당 하나)을 제조했다. RLT 완충액(샘플당 0.4㎖), RW1 완충액(샘플당 0.7㎖), 및 RPE 완충액(샘플당 0.5㎖)(모두 RN이지 키트에서 제공된다)을 제조하고 실온으로 천천히 가온했다. 70% 에탄올(샘플당 0.4㎖)과 뉴클레아제가 없는 물(샘플당 50㎕)을 필요에 따라 제조하여 실온으로 천천히 가온했다.
박스 B(핵산 증폭)
마스터믹스, SARS 프라이머, SARS 프로브, 정제된 핵산 주형(샘플) 및 뉴클레아제가 없는 물을 필요에 따라 제조하고 실온으로 천천히 가온했다.
핵산 추출 프로토콜( Qiagen RNeasy R Mini Kit)
1. 0.4㎖ 샘플과 0.4㎖ RLT 완충액을 혼합했다.
2. 0.4㎖ 70% 에탄올을 튜브에 첨가했다.
3. 0.6㎖의 혼합 용액을 RN이지 컬럼에 첨가했다. 상기 튜브를 부드럽게 잠그고 15초 동안 약 10,000x g으로 원심분리시켰다. 끝내고 나온 액체흐름은 2㎖ 회수 튜브에 분리했다. 단계 3을 반복했다.
4. 0.7㎖ RW1 완충액을 RN이지 컬럼에 첨가했다. 튜브를 부드럽게 잠그고 15초 동안 약 10,000x g으로 원심분리시켰다. 끝내고 나온 액체흐름을 분리했다.
5. 0.5㎖ RPE 완충액을 RN이지 컬럼에 첨가하고 15초 동안 약 10,000x g으로 원심분리시켰다. 끝내고 나온 액체흐름을 분리했다. 단계 5를 반복했다.
6. 상기 컬럼을 추가 2분 동안 약 10,000x g으로 원심분리시켰다.
7. 상기 RN이지 컬럼을 새로운 1.5㎖회수 튜브에 옮겼다. 50㎕ RN아제(RNase)가 없는 물을 실리카겔 멤브레인 위에 직접 피펫으로 떨어뜨리고 3분 동안 RT에서 배양했다.
8. RNA는 1분 동안 약 10,000x g으로 원심분리에 의해 추출했다.
9. 핵산 RNA가 얻어졌다.
서열번호 프로토콜
증폭 반응의 생성물을 서열화하여 앰플리콘(amplicon)이 의도하는 표적 서열에 해당하는지를 확인했다. 서열화 반응은 상업상 이용가능한 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 이루어졌다. DNA 서열은 373A 서열분석기 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 서열화 반응을 풀어서 얻어진다. 생명공학 정보를 위한 내셔널 센터(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)로부터 이용가능한 BLAST 서열번호 비교 도구를 사용하여 DNA 서열을 분석했다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
실시예 1
예비-증폭을 위해 PCR을 사용하는 향상된 실시간 PCR
PCR 예비-증폭
전체 부피 25㎕에, 하기 성분들을 혼합한다: 뉴클레아제가 없는 물, 0.2mM dNTPs, 1U 플라티늄 Taq DNA 폴리머라제(Invitrogen), 5mM MgCl2, 1xPCR 완충액, 프라이머(10μM), 및 cDNA 주형(약 100ng). PCR 증폭은 하기 온도 프로파일로 마스터사이클러(MasterCycler)(Eppendorf)에서 실행했다:
실시간 PCR
제 1회 PCR 예비-증폭에 이어서, 생성물의 일부를 RT-PCR을 이용한 추가 증폭에서 주형으로 사용했다.
PCR 성분을 표 3에 설명된 비율로 혼합했다.
RT-PCR 장치(ABI 7700)는 표 4의 증폭 프로파일로 프로그래밍했다.
RT-PCR 이전의 PCR 예비-증폭을 사용한 SARS 코로나바이러스 검출 결과가 표 5 및 6에 보여진다. 상기 결과는 퍼킨 엘머 ABI 310 유전자 분석기(Perkin Elmer ABI 310 Genetic Analyzer)를 사용하여 DNA로 확증되었고 일반적인 프로토콜은 위와 같다.
SARS 환자로부터 얻어진 핵산 샘플에서의 상이한 증폭 방법들의 비교
표 5와 6에 보여진 결과들은 다양한 환자 샘플로부터 단리된 핵산의 증폭을 시도함으로써 얻어졌다. 샘플들은 SARS 환자로부터 얻어졌고 중국 베이징 병원으로부터 제공되었다. 각 샘플은 세가지의 다른 방법으로 시험되었다:
ⅰ) 아가로스 겔 전기영동을 이용한 통상의 PCR
ⅱ) 실시간 태크만R PCR, 및
ⅲ) 새롭게 기술된 방법인, 예비-증폭 단계를 이용한 향상된 RT-PCR.
통상의 PCR은 PCR 예비-증폭과 동일한 프로토콜을 사용하여 실행되었다. 실시간 태크만R PCR은 ERT 방법과 동일한 프로토콜을 사용하여 실행되었다.
감도 연구 결과
코로나바이러스를 추출하여 cDNA로 전사시켰다. cDNA를 순차로 희석하고 표 6에 설명된 세가지 방법으로 시험했다.
실시예 2
예비-증폭을 위해 PCR을 사용한 향상된 실시간 PCR
SARS로 의심되거나 가능한 것으로 진단된 120명의 환자로부터 임상 샘플을 회수하고 실시예 1의 프로토콜을 사용하여 통상의 PCR 이전에 본 발명에 따른 아가로스 겔 전기영동, 통상의 태크만R 실시간 PCR 및 향상된 태크만R 실시간 PCR 분석에 의해 분석했다.
ERT를 사용하여, SARS-CoV 폴리머라제 유전자의 약 190bp 부분을 cDNA로부터 통상의 PCR을 사용하여 증폭했다. 이 앰플리콘을 서열화하여 SARS-CoV의 예측된 부위에 해당하는지를 확인했다. 상기 PCR 생성물을 RT-PCR을 사용하여 향상된 실시간 PCR 프로토콜을 위한 주형으로 사용하였다. 이 프로토콜을 이용하여, 28/120(23.3%) 환자 샘플이 SARS-CoV 양성으로 확인되었으나 이와 비교하여 표준 실시간 방법을 사용한 경우 21/120(18.3%), 다양한 통상의 PCR 방법을 사용한 경우 단지 평균 10.6%만이 확인되었다. 적절한 음성, 양성, 및 PCR 억제 대조군을 증폭 과정의 각 단계에서 사용하였다.
임상 샘플에 대한 표준 및 향상된 실시간 PCR 데이터의 선택을 (도 5 내지 8) 보여준다. SARS-CoV 양성 샘플과 SARS-CoV 음성 샘플 사이의 구별이 명확하다(도5, 화살표로 표시). 양성과 음성 신호 사이의 구별은 동일한 샘플을 표준 실시간 PCR로 분석했을 때 더욱 불분명하고, 이때 SARS-CoV 양성 및 음성 증폭 곡선이 서로 밀접하게 상치하는 경향이 있다(도 5). ERT에 의해 얻어진 향상된 결과와 양성 및 음성 신호을 쉽게 구별하기 위해 실시간 PCR 결과를 해석하는 것이 보다 용이하다. 향상된 실시간 PCR 방법은 통상의 실시간 PCR 방법과 비교하여 SARS-CoV 양성 샘플에 대한 순환 시간(Ct)값을 낮춘다. 35.0과 같거나 작은 Ct값은SARS-CoV 핵산을 함유한 샘플과 그렇지 못한 샘플간의 차이를 구별하기에 적절한 값이다.
분석 감도
각 증폭 방법의 검출 한계는 홍콩의 환자에서 얻어진 SARS-CoV(2x102.5TCID50/㎖) 배양 샘플로부터 추출된 전체 핵산을 순차로 희석하여 측정되었다. 통상 PCR, 표준 실시간 PCR, 및 향상된 실시간 PCR 방법의 검출 한계는 각각 2x10-5.5TCID50/㎖, 2x10-10.5TCID50/㎖(도 1D),및 2x10-12.5TCID50/㎖(도 1C)이다. 따라서, 향상된 실시간 PCR 방법은 표준 실시간 PCR 보다 적어도 102배 이상 민감하고 SARS-CoV의 분자검출을 위해 현재 사용되는 통상의 PCR 기술보다 107배 민감하다. 바이러스 배양물에 의한 SARS-CoV의 검출은 가장 민감하지 않은 방법인데, 향상된 실시간 PCR에 의해 검출된 3/28(10.7%) 경우만이 바이러스 배양물에 의한 SARS-CoV에 대해 양성이었다.
향상된 실시간 PCR 방법은 임의의 다른 방법으로 확증되지 않은 SARS-CoV 양성 샘플을 검출하기 위한 여러 경우에 제공되었다. 그러므로, 진단의 정확도를 높이는 신규한 검출법은 임상의에게 진단 도구 장비를 매우 가치있게 한다. 통상의 PCR 및 실시간 PCR 만으로는 SARS-CoV 양성인 경우를 거의 확인하지 못했다. 결과는 3/28 경우에 바이러스 배양물에 의해 확증되었다. 향상된 실시간 PCR 방법의 검출 한계는 표준 실시간 PCR 분석보다 102배 이상 민감하고 통상의 PCR 기술보다 107배 민감하다. 분석법의 감도가 증가됨으로써 앞으로의 SARS 발발 동안 질병 전염의 억제를 도울 수 있다.
실시예 3
예비-증폭을 위해 NASBA를 사용한 향상된 실시간 PCR
(ⅰ)NASBA 반응
NASBA 제제를 위한 혼합물(최종 농도):
SARS 프라이머쌍 0.2mM(서열번호 26 및 27)
Tris-Cl, pH 8.5 40mM
MgCl2 12mM
KCl 70mM
DTT 5mM
DMSO 10%
dNTPs 각 1mM
NTPs 각 2mM
NASBA 효소를 위한 혼합물(최종 농도):
BSA 0.1㎎/㎖
T7 RNA 폴리머라제 30유닛(Units)
역전사효소 8유닛
RNase H 0.1유닛
반응 혼합물을 65℃에서 5분 동안의 배양 후 41℃에서 5분 동안 냉각시켰다. 다음 5㎕ 효소 혼합물(1 효소구에 대해 전체 55㎕)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 잠시 혼합한 후, 41℃로 냉각하고 5분 동안 배양하였다. 상기 반응 혼합물을 잠시 회전시킨 다음 41℃에서 1.5시간 동안 배양시켰다.
(ⅱ) 태크만 실시간 PCR
제 1회 NASBA 예비-증폭에 따른 NASBA 생성물을 다음의 RT-PCR을 사용하는 추가 증폭에서 주형으로 사용했다:
온도순환(Thermocycle) 프로파일;
50℃에서 2분
95℃에서 10분
95℃에서 15초; 40순환
58℃에서 1분
NASBA 향상된 실시간 PCR의 결과:
표 7, 8, 및 9에 보여진 바와 같이 코로나바이러스 NASBA 생성물은 태크만 실시간 PCR에 의해 성공적으로 증폭되고 검출되었다.
NASBA-태크만 PCR을 위한 반응 조건을 최적화하였다. NASBA-태크만과 통상의 NASBA의 감도는 대략 TCID50 2x10-5.5로 유사하다. 표 7(NASBA ECL 결과)에서 시험는 TCID50 2x10-8 아래로 검출될 수 있으며 NASBA 태크만 PCR(ERT)와 동일함을 보여준다. 그러나, NASBA ECL의 판독값은 다른 양성 신호(일반적으로 다수의 수치에 대해)과 매우 다른 7407이다. 따라서, 실제 상황에서, 이러한 결과는 양성으로 용이하게 판정될 수 없다. 그러나 NASBA 실시간 PCR(ERT)에서, Ct는 다른 양성 신호과 유사한 7.16이다. 따라서, 우리의 NASBA 실시간 PCR(ERT)은 통상의 NASBA 방법에 대해 여전히 이점이 있다.
상기 실시예에서 보여진 바와 같이, 검출 키트는 다양한 시험 부위에서 편리하게 사용될 수 있다. 또한, 검출 키트는 현재의 방법들 보다 사용하기에 용이하고, 보다 짧은 시간 내에 검출 결과를 제공할 수 있으며, 상기 검출 결과는 원한다면 3시간 내에 이용될 수 있다. 이것은 DNA 기초 검출 시스템이기 때문에, 특이성 및 감도가 향상되고 실시예에서 기술된 검출 키트는 SARS 코로나바이러스에 대해 특이적이고, 바이러스가 검출을 위한 표적 분자로 복제되므로 샘플중 SARS 코로나바이러스의 농도는 더 이상 중요치 않다.
본 발명의 바람직한 구체예가 이전의 그래프로 설명되었지만, 본 발명의 변형 및 대체가 당업자에게는 자명하며, 이러한 변형 및 대체는 본 발명의 범주 내에 있으며 하기 청구항에서 기술된다. 또한, 본 발명의 구체예는 실시예 또는 도면으로만 제한적으로 설명되는 것은 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> HONG KONG DNA CHIPS LIMITED YU, Chueng Hoi LAU, Lok Ting <120> Nucleic Acid Detection <130> FP5260 <150> GB 0310181.3 <151> 2003-05-02 <160> 27 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 1 accagtcggt acagctacta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 2 gcattaactc tggtgaattc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 3 ctggtcacct ggtggaggt 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 4 gcgctaacaa agaaggcatc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 5 ggattatgtg ttgacatacc ag 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 6 attaccaagt caatggttag ggt 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 7 tagactcatc tctatgatgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 8 taccaaagga catgacctac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 9 ccttgttgtt gttggccttt 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 10 ccagtcggta cagctactaa gt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 11 ctctagttgc atgacagccc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 12 aacacctgta gaaaatccta 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 13 actaagttaa cacctgtag 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 14 gcggcagtca agcctcttc 19 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 15 cccgcgaaga agctatcg 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 16 cccgcgaaga agctattcg 19 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 17 cgtgcgtgga ttggcttt 18 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 18 ctattcgtca cgttcg 16 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 19 tgctgccagg agttgaattt c 21 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 20 cgtgcgtgga ttggcttt 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 21 ttcgtgcgtg gattggct 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 22 tagagggctg tcatgcaact 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 23 attggctttg atgtagagg 19 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 24 cgctcctcat cacgtagtcg ctgtaattc 29 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 25 ctattcgtca cgttcg 16 <210> 26 <211> 56 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 26 aattctaata cgactcacta tagggagaag gagctggaga ggtaggttag taccca 56 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 27 gatgcaaggt cgcatatgag taccgtagac tcatctctat ga 42

Claims (41)

  1. 서열번호 1 내지 27 중 어느 하나를 포함하는 단리된 DNA 서열.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 1 내지 27 중 어느 하나로 구성된 단리된 DNA 서열.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    DNA 증폭에 사용하기 위한 단리된 DNA 서열.
  4. 제 3 항에 있어서,
    프라이머 또는 프로브로 사용되고 프로브는 형광으로 표지될 수 있는 단리된 DNA 서열.
  5. 핵산 분리단계, 후속적으로 핵산 증폭단계, 및 후속적으로 실시간 PCR 단계를 포함하는 핵산 검출 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    핵산 증폭단계가 PCR, NASBA 또는 임의의 다른 핵산 증폭 기술을 포함하는 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    실시간 PCR 단계가 형광으로 표지된 프로브를 사용하는 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출되는 핵산이 DNA 또는 cDNA인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    핵산이 SARS 코로나바이러스 cDNA인 방법.
  10. 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계;
    ⅱ) 상기 핵산을 PCR, NASBA 또는 임의의 다른 핵산 증폭 기술을 선택적으로 이용하여 증폭하는 단계; 및
    ⅲ) 단계 ⅱ)에서 생성된 핵산을 실시간 PCR을 사용하여 증폭하고 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    단계 ⅰ) 후 얻어진 핵산이 RNA이면, 상기 RNA를 역전사효소를 사용하여 cDNA로 전환하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 5 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    프라이머 및/또는 프로브를 단계 ⅰ) 및 단계 ⅱ)에서 사용하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    프라이머 및/또는 프로브가 SARS 코로나바이러스 cDNA의 한 부분 이상에 결합하여 SARS 코로나바이러스 cDNA를 검출하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    사용된 프라이머 및 프로브가 서열번호 1 내지 27을 포함하는 단리된 DNA 서열에 해당하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    단계 ⅲ)에서 사용된 프라이머가 프로브와 상치(overlap)하지 않는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    단계 ⅱ)에서 사용된 프라이머 세트가 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5; 및 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10 중 어느 하나에 해당하는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서,
    단계 ⅱ)에서 사용된 프라이머 세트가 서열번호 26 및 27 중 어느 하나에 해당하는 방법.
  18. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    단계 ⅲ)에서 사용된 프라이머 세트가 서열번호 11, 12, 13, 14 또는 15; 및 서열번호 16, 17, 18, 19 또는 20 중 어느 하나에 해당하는 방법.
  19. 제 16 항 내지 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 ⅲ)에서 사용된 프로브가 서열번호 21, 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나에 해당하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서,
    핵산 검출 방법에 사용하기 위한 단리된 DNA 서열.
  21. 제 20 항에 있어서,
    핵산이 SARS 코로나바이러스 RNA 또는 cDNA인 단리된 DNA 서열.
  22. ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계;
    ⅱ) 상기 핵산을 PCR, NASBA 또는 임의의 다른 핵산 증폭 기술을 선택적으로 사용하여 증폭하는 단계; 및
    ⅲ) 단계 ⅱ)에서 생성된 핵산을 실시간 PCR을 사용하여 증폭하고 검출하는 단계
    를 포함하는 핵산 검출 방법에 사용하기 위한 조성물의 제조에서의, 제 1 항의 단리된 DNA 서열의 용도.
  23. 제 22 항에 있어서,
    핵산이 DNA 또는 cDNA인 용도.
  24. 제 23 항에 있어서,
    핵산이 SARS 코로나바이러스 cDNA인 용도.
  25. 바이러스는 SARS 코로나바이러스이고 프라이머는 서열번호 1 내지 27로 구성된 바이러스 감염을 검출하는 진단 시험 키트의 제조에서의, SARS 코로나바이러스에 특이적인 프라이머의 용도.
  26. 서열번호 1 내지 27에 해당하는 두 개 이상의 단리된 DNA 서열을 포함하는 SARS 진단 시험 키트.
  27. 제 26 항에 있어서,
    서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5; 및 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10 중 어느 하나에 해당하는 프라이머를 포함하는 SARS 진단 시험 키트.
  28. 제 26 항에 있어서,
    서열번호 26 및 27 중 어느 하나에 해당하는 프라이머를 포함하는 SARS 진단 시험 키트.
  29. 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 11, 12, 13, 14 또는 15; 및 서열번호 16, 17, 18, 19 또는 20 중 어느 하나에 해당하는 프라이머를 포함하는 SARS 진단 시험 키트.
  30. 제 29 항에 있어서,
    서열번호 21, 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나에 해당하는 프로브를 포함하는 SARS 진단 시험 키트.
  31. ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 SARS 코로나바이러스 RNA를 분리하는 분리제;
    ⅱ) SARS 코로나바이러스의 한 부분 이상의 RNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 표적 분자를 복제하는 핵산 복제제; 및
    ⅲ) 검출 분자를 포함하는, 표적 분자를 검출하는 핵산 검출제
    를 포함하는, 생물학적 또는 환경 샘플 중 SARS 코로나바이러스를 검출하기 위한 진단 시험 키트.
  32. 제 31 항에 있어서,
    표적 분자가 cDNA분자인, SARS 코로나바이러스 검출 키트.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서,
    핵산 복제제가 SARS 코로나바이러스의 한 부분 이상의 RNA 서열에 결합하는 DNA 서열을 포함하는 제 1 정제 및 단리된 DNA 분자를 포함하여, 상기 제 1 정제 및 단리된 DNA 분자가 효소 및 DNA 뉴클레오티드의 존재하에 신장되어 제 1 정제 및 단리된 DNA 분자가 SARS 코로나바이러스의 한 부분 이상의 cDNA 서열과 결합될 때 SARS 코로나바이러스의 한 부분 이상의 cDNA 서열에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 발생시키는, SARS 코로나바이러스 검출 키트.
  34. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 DNA 서열이 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 양자택일적으로 서열번호 26 및 27의 DNA 서열 중 어느 하나와 함께 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 DNA 서열 중 어느 하나를 암호화하는, SARS 코로나바이러스 검출 키트.
  35. 제 31 항 내지 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 복제제가 제 1회 증폭에 의해 생성된 SARS 코로나바이러스의 한 부분 이상의 DNA 서열과 결합하는 DNA 서열을 포함하는 제 2 정제 및 단리된 DNA 분자를 포함하여, 상기 제 2 정제 및 단리된 DNA 분자가 효소 및 DNA 뉴클레오티드의 존재하에 신장되어 제 2 정제 및 단리된 DNA 분자가 SARS 코로나바이러스의 한 부분 이상의 cDNA 서열과 결합될 때 제 1회 증폭과정 동안 생성된 SARS 코로나바이러스의 한 부분 이상의 cDNA 서열과 상보적인 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 발생시키는, SARS 코로나바이러스 검출 키트.
  36. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,
    제 2 DNA 서열이 서열번호 16, 17, 18, 19 또는 20의 DNA 서열 중 어느 하나와 함께 서열번호 11, 12, 13, 14 또는 15의 DNA 서열 중 어느 하나를 암호화하는, SARS 코로나바이러스 검출 키트.
  37. 제 31 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복제된 DNA 생성물이 추가적인 증폭 이전에 우선 희석되는, SARS 코로나바이러스 검출 키트.
  38. 제 31 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출 분자가 표적 분자에 결합하는 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열에 상보적인 하나 이상의 부분을 암호화하는 DNA 서열; 및 신호 발생기를 포함하는, SARS 코로나바이러스 검출 키트.
  39. 제 38 항에 있어서,
    제 1 DNA 분자의 DNA 서열이 제 2 DNA 분자와 상치하지 않는 키트.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서,
    신호 발생기가 형광생성 분자, 분자 표식(beacon), 또는 적절한 검출기에서 검출 및 정량될 수 있는 광자를 방출하도록 자극될 수 있는 다른 분자중 하나를 포함하는 키트.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출 분자가 서열번호 21 내지 25 중 어느 하나의 DNA 서열을 암호화하는, SARS 코로나바이러스 검출 키트.
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