CN113444834A - 2019新型冠状病毒lamp检测的引物组、双重恒温显色试剂盒及检测方法 - Google Patents

2019新型冠状病毒lamp检测的引物组、双重恒温显色试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN113444834A CN202011073715.1A CN202011073715A CN113444834A CN 113444834 A CN113444834 A CN 113444834A CN 202011073715 A CN202011073715 A CN 202011073715A CN 113444834 A CN113444834 A CN 113444834A
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郑文杰
季超
薛淑霞
孙金生
张芹
刘文彬
闫春财
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Tianjin University
Tianjin Normal University
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Abstract

本发明提供了2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组、双重恒温显色试剂盒及检测方法，双重恒温显色试剂盒包括有外引物对1、外引物对2、内引物对1、内引物对2、环引物对1和环引物对2。本发明提供的2019新型冠状病毒双重恒温显色筛查检测试剂盒具有技术成熟稳定、测试成本低，更适合于基层推广的优势，更适合于社区化验室、企业化验室、县区卫生所等基层实验室的快速筛查检测，成果具有很好的市场竞争力，有良好的产业化前景。

Description

2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组、双重恒温显色试剂盒 及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组、双重恒温显色试剂盒及检测方法。
背景技术
现有2019冠状病毒检测试剂存在一些缺陷，如PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低；基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵；实时荧光定量PCR技术灵敏度高，可靠性好，为全封闭反应，但是该技术需要价格昂贵的荧光定量PCR仪，无法在基层检测部门和防疫机构普及，并且要保证高特异性需要荧光标记探针，检测成本较高。总之，这些核酸检测技术都存在需要依赖昂贵仪器，检测成本较高，具有实验室限制性等一系列缺点；而且这些分子生物学检测对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，无法实现在基层的普及应用，无法满足疫情期间病毒快速检测的需要。恒温显色扩增操作简单，方便还不需要专业技能较高的工作人员即可操作，但是由于其引物设计难度较大，容易出现假阴性或假阳性，导致恒温显色扩增的试剂短缺。
目前，核酸检测试剂盒质量参差不齐，核酸检测稳定性可靠性尚存疑；核酸检出率低，许多病历需要重复2-3次检测；很多病人咽拭子阴性但肺细胞罐洗液里有病毒；目前等待核酸检测人数大大超过检测能力，仓促上阵得出的检测结果可靠性不高。最新报道，多家单位成功分离新型冠状病毒2019-nCoV毒株的全基因组序列测定和变异分析，与新型冠状病毒2019-nCoV参考基因组NC 045512.2相比，很多毒株基因组ORF 1ab基因发生了重要的两个位点突变，提示现有的检测方法、检测靶标需要根据病毒变异情况进行进一步更新和优化。有必要继续开展新型冠状病毒N基因检测方法研究，并提高检测的特异性和灵敏度，研发适用于现场的快速筛查技术方法，适用于现场检测、便捷高效的技术手段。
发明内容
为了解决上述现有技术问题，本发明提供2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组。本发明的另一个目的是提供一种2019新型冠状病毒LAMP检测的双重恒温显色筛查试剂盒及其检测方法。本发明的检测方法不需要特殊的仪器即可获得检测结果，检测快速、成本低。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一组用于2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组，其包括外引物对1、内引物对1和环引物对1，所述外引物对1的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对1的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对1的序列如SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示。
一组用于2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组，其包括外引物对2、内引物对2和环引物对2，所述外引物对2的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，所述内引物对2的序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，所述环引物对2的序列如SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12所示。
一组用于2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组，其包括外引物对1、外引物对2、内引物对1、内引物对2、环引物对1和环引物对2，所述外引物对1的序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示，所述外引物对2的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，所述内引物对1的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述内引物对2的序列如SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10所示，所述环引物对1的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述环引物对2的序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。
如上所述的引物组在制备检测2019新型冠状病毒LAMP检测试剂盒中的应用。
一种2019新型冠状病毒LAMP检测的双重恒温显色筛查试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的引物组。
如上所述的双重恒温显色筛查试剂盒，该试剂盒还包括链置换Bst DNA聚合酶和逆转录酶。
如上所述的双重恒温显色筛查试剂盒，该试剂盒还包括钙黄绿素、dNTPs、KCl、MgCl2、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为N基因体外转录RNA序列的质粒作为阳性对照，所述阴性对照为去核酸的灭菌水。
一种2019新型冠状病毒LAMP检测的方法，该方法是非诊断目的的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)从样品中提取RNA；
(2)对步骤(1)提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述用于2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组，置于63℃恒温反应；
(3)在所述恒温反应进行30min后取出反应，观察结果；
(4)结果判定：待测样品中若呈现绿色，则判断为阳性，若呈现浅橘色，则判断为阴性。
如上所述的恒温显色方法，优选地，在步骤(2)中，所述等温扩增的反应体系，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有N-1:反应液：8×105U/L Rnasin，200mM dNTPs，10mM Tris-HCl(pH＝8.3)，20mM KCl，3.5mM MgCl2，0.8M betaine，各引物终浓度为3.2μM的内引物对1和内引物对2，各引物终浓度为0.4μM外引物对1和外引物对1，各引物终浓度为1.6μM的环引物对1和环引物对2，总共21.3μL，钙黄绿素1μL，Bst聚合酶1.5μL，AMV酶0.2μL，样品RNA模板2.0μL。
如上所述的恒温显色方法，优选地，同时设置无核酸酶水为阴性对照；采用含N基因体外转录RNA的序列的质粒作为阳性对照进行检测。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种用于2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组，包含有2组LAMP检测引物，即可分别用于2019新型冠状病毒的检测，又可组合使用，组合使用检测更加灵敏，准确。本发明通过密切分析国际上公布的新型冠状病毒全基因组序列，开展新型冠状病毒N基因种内保守性比对、种外同源性比对以及差异位点分析，设计并筛选确定了4条内引物、4条外引物及4条环引物为核心技术，增强了恒温显色扩增筛查检测方法和试剂盒的特异性和灵敏度保证。成果与国内外同类技术相比，具有明显的成本、效益优势。所研发的新型冠状病毒N基因双重恒温显色筛查检测试剂盒，性能指标与RT-PCR具有同等水平，检测时间可在35分钟-45分钟完成，操作简便、快捷。本发明提供的新型冠状病毒N基因双重恒温显色扩增内外环引物组，以及研发的恒温显色筛查检测方法及筛查试剂盒，解决仅有恒温扩增芯片法和实时荧光定量RT-PCR方法检测N基因，而没有使用便捷的恒温显色检测N基因的恒温显色筛查方法及试剂盒的问题，是对新型冠状病毒检测N基因方法和试剂盒的有力补充。新型冠状病毒N基因双重恒温显色筛查检测试剂盒具有技术成熟稳定、测试成本低，更适合于基层推广的优势，更适合于社区化验室、企业化验室、县区卫生所等基层实验室的快速筛查检测，成果具有很好的市场竞争力，有良好的产业化前景。
附图说明
图1为与Bat SARS-like coronavirus差异位点；
图2为与SARS coronavirus差异位点；
图3为引物的筛选结果；
图4灵敏度测试扩增结果。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。本发明实施例中所用的AMV反转录酶BioLabs M0277，Bst聚合酶BioLabs M0537L恒温荧光扩增反应液购自广州双螺旋公司；恒温水浴锅购自春秋电子仪器有限公司；等温仪购自天津天根生物公司的。也可以采用其它公司试剂及仪器。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 N基因双重恒温显色扩增引物组筛选
1.1特异性扩增基因片段的序列比对
1.1.1种内保守性比对
新型冠状病毒是一种带有包膜，基因组全长约为30Kb的单股正链RNA病毒。四种结构蛋白对病毒体组装起到重要作用。S基因，编码刺突糖蛋白，这是用于包病毒的外壳的蛋白。M基因，编码膜糖蛋白，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成。E基因，是很短的编码75个氨基酸的小包膜糖蛋白，可以与包膜结合的蛋白。N基因，编码核壳蛋白，参与病毒体装配的结构蛋白，在病毒转录和装配效率中起关键作用。
自新型冠状病毒国家科技资源服务系统(http://nmdc.cn/#/nCoV)下载已上传的26组2019-nCoV序列，经比对分析对在2019-nCoV种内序列同源性为99.92％以上，仅在末梢存在个别碱基出入。
1.1.2种外同源性比对
初步比对结果显示，其与两株蝙蝠类SARS冠状病毒同源性为91％(bat-COVZC45、bat-SL-COVZXC21)，与SARS病毒同源性约88％。排除其他蝙蝠冠状病毒后，发现其与MERS冠状病毒同源性约53％，保守性约63％。
1.1.3差异位点分析
新型冠状病毒属于RNA病毒，存在很不稳定，容易变异的特点。不一致碱基分布在全基因组，约十几个碱基就有1～2个碱基不一致，与bat-COVZC45和SARS MA15的差异位点分析比对结果如图1、图2所示。
1.2引物组的设计
根据上述比对后的结果，选取N基因的保守区作为检测靶标，采用Primer Premier5.0软件自行设计4组恒温显色扩增引物对，分别标记为N1#Primer、N2#Primer、N3#Primer、N4#Primer。每组引物包括2条内引物、2条外引物及2条环引物，并使用Primer blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行评估。使用新型冠状病毒N基因体外转录RNA阳性对照进行引物筛选，分析所设计4套引物组的显色扩增反应结果及特异性。
1.3引物组的特异性扩增测试
1.3.1阳性对照品的制备
根据新型冠状病毒国家科技资源服务系统(http://nmdc.cn/#/nCoV)公布的2019-nCoV核酸序列，人工合成制备N基因质粒体外转录RNA阳性对照样本，分装并于-20℃保存备用。
1.3.2特异性扩增试验
提取与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其它病原体核酸或阳性对照质粒，主要包括冠状病毒229E型质粒、冠状病毒OC43型质粒、冠状病毒HKU1型质粒、冠状病毒NL63型质粒、MERS冠状病毒质粒、甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA、副流感病毒质粒、腺病毒质粒、呼吸道合胞病毒质粒、鼻病毒质粒、肺炎支原体质粒、肺炎衣原体质粒、肺炎链球菌质粒、肺炎克雷伯菌核酸、军团菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸等做特异性扩增试验。
1.3.3引物组的特异性扩增测试结果
新型冠状病毒N基因体外转录RNA阳性对照进行引物筛选，分析所设计4套引物组的显色扩增反应结果及特异性。通过对4套引物进行筛选，其中N1#Primer和N2#Primer的引物组显色时间较早、且较稳定(如图3所示)，而N3#Primer和N4#Primer引物未检出信号。将初步选择的N1#Primer+N2#Primer引物组进行合管试验，建立双重恒温显色检测方法；最终确定N1#Pri mer+N2#Primer的引物组合管作为新型冠状病毒N基因双重恒温显色扩增内外环引物组进行后续实验。2019新型冠状病毒N基因双重恒温显色扩增内外环引物组，包括如下引物：
(1)外引物对1：
SEQ ID NO.1：5′-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3′
SEQ ID NO.2：5′-CCACCACGAATTCGTCTGG-3′
(2)内引物对1：
SEQ ID NO.3：5′-CGTTGTTTTGATCGCGCCCCTTTCATTACGTTTGGTGGACCCT-3′
SEQ ID NO.4：5′-AATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTTTAGCTCTTCGGTAGTAGCCA-3′
(3)环引物对1：
SEQ ID NO.5：5′-TGGTTACTGCCAGTTGAATC-3′
SEQ ID NO.6：5′-TAACACCAATAGCAGTCCAGATG-3′。
(1)外引物对2：
SEQ ID NO.7：5′-CACCCGCAATCCTGCTAAC-3′
SEQ ID NO.8：5′-TTTGCTCTCAAGCTGGTTCA-3′
(2)内引物对2：
SEQ ID NO.9：5′-CCTCTGCTCCCTTCTGCGTAGATTTAATGCTGCAATCGTGCTACA-3′
SEQ ID NO.10：5′-AACTCCAGGCAGCAGTAGGGTTTGTCAAGCAGCAGCAAAGC-3′
(3)环引物对2：
SEQ ID NO.11：5′-GCCTTTTGGCAATGTTGTTCCTT-3′
SEQ ID NO.12：5′-CTCCTGCTAGAATGGCTGGC-3′。
实施例2S基因恒温显色扩增检测体系的优化
2.1恒温显色扩增反应体系的建立
采用105U/L Bst酶、4×106U/L AMV酶、8×105U/L RNasin、200mM dNTPs、10mMTris-HCl(pH＝8.3)、20mM KCl、3.5mM MgCl2配制恒温显色扩增预混反应液，采用实施例1中确认的新型冠状病毒N基因检测引物，配制成新型冠状病毒N基因双重恒温显色扩增检测反应体系，混匀后置于恒温仪中进行恒温显色扩增。
反应条件为：
恒温水浴锅：63℃条件下反应30min。
或等温扩增仪：63℃条件下反应30min。
2.2恒温显色扩增检测体系的建立及优化结果
使用1ng/μL N基因体外转录RNA作为检测样本，。确定在反应时间30分钟以内，阳性样品应显示为绿色，阴性样品应显示为橙黄色的检测体系，最终确定的反应体系如表1所示。
表1恒温显色扩增检测体系
Figure BDA0002716013300000081
上述内引物对1和2是指内引物的四条引物各浓度为3.2μM，外引物对1和2是指外引物的四条引物各浓度为0.4μM，环引物对1和2是指环引物的四条引物各浓度为1.6μM。
实施例3N基因双重恒温显色扩增筛查检测方法灵敏度验证
分别将N蛋白基因体外转录RNA质粒阳性对照样本以10倍差进行稀释，梯度浓度分别为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，经实施例2中的恒温显色扩增反应体系进行检测，结果显示，在45分钟以内，10fg两个平行均稳定检出，1fg两个平行只有一个检出，检出限为10fg。
实施例4新型冠状病毒N基因双重恒温显色筛查检测试剂盒及使用方法
本发明制备的新型冠状病毒S蛋白基因恒温显色筛查检测试剂盒包括实施例1中的引物组所示的序列。
根据需要可配置成一个检测试剂的用量，方便检测使用，具体如表1所示。根据多少次检测试剂，再按照需要的次数包装。还可包括阳性对照和阴性对照。阳性对照为N基因体外转录RNA，阴性对照为RNase free dH2O。试剂盒的使用方法，即对于样品的检测，适用样本类型有：咽拭子、鼻咽拭子、肛拭子、血浆等样本；标本应当避免反复冻融。
所需要的器材保温设备：恒温水浴锅或等温检测仪；移液器(量程0.1-200uL)；样品架、浮子(仅用于水浴锅)；乳胶或一次性手套若干。
检测的具体操作步骤如下：
样本RNA提取(也可以按照其他提取试剂盒操作进行)
(一)、样品RNA提取步骤
1、取样品如咽拭子、鼻咽拭子、肛拭子、血浆等临床样本的保存液至1.5mL离心管中，每管加入200μL 1号液，加3μL Carrier RNA(1μg/μL)，涡旋混匀15s，室温放置3-5min。
2、向上述离心管中加入20μL磁珠(注：磁珠优化前要摇晃均匀)，再加入150μL 2号液，轻轻颠倒混匀后，放入磁力架上。待磁珠集中到管底后，将上清液吸出并弃掉(注：不要将磁珠吸出，吸取上清液时，离心管应一直放在磁力架上)。
3、向离心管中加入200μL 3号液，充分颠倒混匀后，放回磁力架上，待磁珠集中到管底后，将上清液吸出并弃掉。
4、重复步骤3。
5、将离心管盖打开，55℃放置4分钟后取出。
6、加入20μL 4号液，用加样枪混匀，放回磁力架。上清液即为提取RNA。
(二)、双重恒温显色扩增检测步骤
(1)取出试剂盒，将试剂完全解冻，各组分离心30s，B-I及R-I为液体，取出后应放置于冰盒上。
(2)试剂配制
若有N个待检样本，则参照下面按照N+3个数量计算各组分用量(N个待检样本+1个阴性对照+1个阳性对照+1份备用)，总共的使用量：
N-1 21.3×(N+3)μL
B-1 1.5×(N+3)μL
R-1 0.2×(N+3)μL
反应液总体积23×(N+3)μL
将反应液置于0.6mL或者1.5mL离心管中，涡旋混匀，离心30s，分装23μL于0.2mLPCR管中。
(3)添加待检样本模板
向步骤(2)中已含有反应液的0.2mL PCR管中分别加入2μL模板(待测样品的RNA或DNA)，离心30s，应立即进行扩增反应。
(4)扩增反应
等温仪或水浴条件：63℃条件下反应30min。
(5)检测结果判定
空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明检测体系有效：在反应时间30分钟以内，阳性对照应显示为绿色，阴性对照应显示为橙黄色
样本检测结果判定：样品检测结果的判定应与阳性对照和阴性对照比较，如果样品的反应液显示为绿色则表示该样品的检测结果为阳性，如果样品的反应液显示为橙黄色则表示该样品的检测结果为阴性。在黑色背景下观察结果更有利于实验结果的观察。
序列表
<110> 天津师范大学
<120> 2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组、双重恒温显色试剂盒及检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccccaaaatc agcgaaatgc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaccacgaa ttcgtctgg 19
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgttgttttg atcgcgcccc tttcattacg tttggtggac cct 43
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattccctcg aggacaaggc gttttagctc ttcggtagta gcca 44
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggttactgc cagttgaatc 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taacaccaat agcagtccag atg 23
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacccgcaat cctgctaac 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttgctctca agctggttca 20
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctctgctcc cttctgcgta gatttaatgc tgcaatcgtg ctaca 45
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aactccaggc agcagtaggg tttgtcaagc agcagcaaag c 41
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccttttggc aatgttgttc ctt 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcctgctag aatggctggc 20

Claims (10)

1.一组用于2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组，其特征在于，其包括外引物对1、内引物对1和环引物对1，所述外引物对1的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对1的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对1的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
2.一组用于2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组，其特征在于，其包括外引物对2、内引物对2和环引物对2，所述外引物对2的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，所述内引物对2的序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，所述环引物对2的序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。
3.一组用于2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组，其特征在于，其包括外引物对1、外引物对2、内引物对1、内引物对2、环引物对1和环引物对2，所述外引物对1的序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示，所述外引物对2的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，所述内引物对1的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述内引物对2的序列如SEQ IDNo.9和SEQ ID No.10所示，所述环引物对1的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述环引物对2的序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物组在制备检测2019新型冠状病毒LAMP检测试剂盒中的应用。
5.一种2019新型冠状病毒LAMP检测的双重恒温显色筛查试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求3所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的双重恒温显色筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括链置换Bst DNA聚合酶和逆转录酶。
7.根据权利要求5所述的双重恒温显色筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括钙黄绿素、dNTPs、KCl、MgCl2、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为N基因体外转录RNA序列的质粒作为阳性对照，所述阴性对照为去核酸的灭菌水。
8.一种2019新型冠状病毒LAMP检测的方法，其特征在于，该方法是非诊断目的的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)从样品中提取RNA；
(2)对步骤(1)提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用权利要求1-3中任一项所述用于2019新型冠状病毒LAMP检测的引物组，置于63℃恒温反应；
(3)在所述恒温反应进行30min后取出反应，观察结果；
(4)结果判定：待测样品中若呈现绿色，则判断为阳性，若呈现浅橘色，则判断为阴性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述等温扩增的反应体系，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有N-1:反应液：8×105U/L Rnasin，200mM dNTPs，10mM Tris-HCl，pH＝8.3，20mM KCl，3.5mM MgCl2，0.8M betaine，各引物终浓度为3.2μM的内引物对1和内引物对2，各引物终浓度为0.4μM外引物对1和外引物对1，各引物终浓度为1.6μM的环引物对1和环引物对2，总共21.3μL，钙黄绿素1μL，Bst聚合酶1.5μL，AMV酶0.2μL，样品RNA模板2.0μL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，同时设置无核酸酶水为阴性对照；采用含N基因体外转录RNA的序列的质粒作为阳性对照进行检测。
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