CN113444832A - 用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及方法 - Google Patents

用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及方法，所述用于2019新型冠状病毒检测的引物组包括用于等温扩增检测的外引物对、内引物对和环引物对，外引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，内引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，环引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。本发明提供的新型冠状病毒恒温显色扩增内外环引物组，以的恒温显色筛查检测方法，检测方法特异性强，灵敏度高，仅使用廉价、便捷的恒温水浴锅即可获得检测结果，是对新型冠状病毒检测S基因方法和试剂盒的有力补充。

Description

用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒 及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及检测方法。
背景技术
目前新型冠状病毒核酸检测试剂不仅短缺，而且存在着检出率不高，经常出现假阴性的问题；而且受PCR实验环境设施的严格要求，具有检测资质的实验室数量有限。这些都在影响新型冠状病毒肺炎病人的确诊，成为影响疫情防控的瓶颈问题。
2019年新型冠状病毒(2019-nCoV)是一种单链RNA冠状病毒，基因组序列由29903bp构成，该基因组拥有10个基因，可以有效编码10个蛋白。它可引起呼吸道感染，目前WHO已统一命名为“新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia，NCP)”。由于疫情发展迅速，及时对不同程度临床症状病人及疑似患者进行诊断需要快速有效的方法，新冠病毒RNA检测可为诊断提供直接证据，在目前最新版本(新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版))的诊疗方案中，新冠病毒核酸的检出仍是唯一确诊依据。从技术的角度看，在灵敏度和特异性的平衡上，相比较一些快速检测方法，目前平衡的最好的仍是实时荧光PCR(RT-PCR)检测技术。从过往的重大疫情来看，无论是西非埃博拉病毒、甲流还是中东呼吸综合征，RT-PCR仍是国家首推的检测手段。
基于病毒基因保守序列的RT-PCR检测方法，是呼吸道病毒检测的常用方法，本次疫情的新冠病毒检测也同样适用。该方法通过对病毒RNA进行提取、逆转录、PCR扩增病毒保守序列(RdRP基因(特异性靶点)、E蛋白基因、N蛋白基因以及一个鉴定保守基因S蛋白基因区位点；可以只检测RdRP基因或者选择RdRP基因和其他多个基因确认)，扩增体系中的荧光蛋白会结合扩增出的双链DNA序列从而发出荧光，根据检测到的荧光值判断是否有病毒存在并定量。
WHO推荐的6套检测靶点病毒保守序列有ORF1a基因、ORF1ab基因(特异性靶点RdRP)、S基因、E基因、M基因、N基因。目前，中国检测ORF1ab和N基因；德国检测RdRP、E基因、N基因；中国香港检测ORF1b-nsp14、N基因；日本检测筛查冠状病毒多基因、S基因；泰国检测N基因；美国检测N基因、PdRP。目前仅以ORF1ab和N基因作为检测靶标存在着一定的漏检风险。
现行的新型冠状病毒检测方法都存在一定的问题，影响新型冠状病毒肺炎病人的确诊，成为影响疫情防控的瓶颈问题。检测病毒抗体和血清学方法简单快速，但特异性差，灵敏度低，假阴性高，而且短期内很难获得病毒高质量特异性抗体，导致免疫学检测受到限制。病毒基因组测序检测时间长，对检测机构的技术能力和仪器条件要求比较高，导致病毒基因组测序技术不能大范围的推广应用，不能满足疫情实时检测的需要。PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低；基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵；实时荧光定量PCR技术灵敏度高，可靠性好，为全封闭反应，但是该技术需要价格昂贵的荧光定量PCR仪，无法在基层检测部门和防疫机构普及，并且要保证高特异性需要荧光标记探针，检测成本较高。总之，这些核酸检测技术都存在需要依赖昂贵仪器，检测成本较高，具有实验室限制性等一系列缺点；而且这些分子生物学检测对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，无法实现在基层的普及应用，无法满足疫情期间病毒快速检测的需要。
对于目前新型冠状病毒检测技术存在的问题主要在于：
一是目前新型冠状病毒检测技术各有优缺点。新型冠状病毒检测首选的病毒核酸检测方法，全基因组测序可准确鉴定病毒，但是目前的高通量测序平台测序时间较长，灵敏度相对较低。实时荧光PCR方法的优点是相较于其他抗原抗体法(如胶体金技术)更为灵敏，检测结果更为准确，但是检测需要专业的仪器和分子检测实验室以及专业的操作人员，操作不当或者实验室条件不足可能会因气溶胶污染造成假阳性，且整个流程需要几个小时，相较于胶体金法时间更长。
病毒分离鉴定：病毒培养是诊断流感病毒感染的传统方法之一，但是传统的分离鉴定方法需要连续培养多天，敏感性和特异性都会低于核酸检测方法，虽然在前期确定侵害性病原物起到关键作用，但较为耗时，且不便捷，安全防护要求较高，不能满足大量疑似患者筛查需求。
免疫胶体金层析技术：虽然免疫胶体金层析技术操作简单，出结果快(一般为20分钟)，但是此方法敏感性较差，加入样本后的原理靠的是层析，也就是往外分散，如果材料等质量有误差，会影响检测结果；也会因为病人感染时间较短或者采样部位导致病毒含量较低，导致出现假阴性。另外，该方法由于依赖抗原抗体，对于前期开发时选择包被的抗原/抗体最为关键，短时间内开发出的产品有待确认其特异性和灵敏性。
二是新型冠状病毒核酸检测试剂盒质量问题。试剂盒反转录效率低下；扩增的循环数不够；PCR长度/引物设计/引物的特异等都是影响试剂盒检测质量的重要影响因素。很多试剂盒在早期研发的时候，并未完成试剂的优化、质控、灵敏度、特异性测试等等，所以导致灵敏度不够，检测的结果不稳定。病人要经常要做上三四次核酸检测，甚至是四五次的实验，才知道是阳性还是阴性。即便如此，可能还有很多人检测出来是阴性，但已经出现白肺了，症状明显是新冠炎的症状，但是核酸检测结果还是阴性，或者有些人核酸检测阳转阴了，但其实是假阴性。
三是目前新冠病毒核酸检测针对的位点主要是新冠病毒基因组中2段保守基因靶标，即：开放读码框1ab(Open reading frame 1ab，ORF1ab)、核壳蛋白(Nucleocapsidprotein，N)基因，其中N基因特异性不强，易产生交叉反应，临床上双结果不易研判，导致临床上需要反复进行复核操作。尚没有S蛋白基因检测方法及试剂盒。2月19日，国家卫生健康委员会与国家中医药管理局发布了《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，为防治新冠肺炎提供了更加明确的指南，确诊病例需有病原学证据阳性结果(新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源)。
但目前在用的不同厂家荧光双位点定量PCR试剂盒普遍对于新冠病毒N蛋白基因的扩增敏感性高于ORF1ab检测，可能导致部分病毒含量较低的样本检测结果为单通道阳性；此外，由于N基因在新冠病毒的核酸序列中，其保守程度不及ORF1ab，故可能存在不同冠状病毒间有一定的交叉，导致N基因扩增阳性而ORF1ab阴性。对于临床上样本检测结果为单通道阳性的，需要谨慎对待，应采用同一检测方法的另一厂家试剂盒或采用目前实验室可进行的另一检测方法对样本进行复核，如第二次结果为阴性，则报告阴性，并根据相应文件要求需间隔1天以上再次对同一病人进行取样检测，两次阴性结果可初步排除感染，但仍需结合临床症状及CT检查结果考虑进一步的核酸检测策略；而第二次结果仍为单通道阳性的样本，将建议临床重新取该患者样本送检。同时，需要高度关注核酸提取效率影响病毒核酸检测结果，如出现单通道阳性结果也可以采用换提取方法重新提取核酸进行重新检测。
综上所述，目前，核酸检测试剂盒质量参差不齐，核酸检测稳定性可靠性尚存疑；核酸检出率低，许多病历需要重复2-3次检测；很多病人咽拭子阴性但肺细胞罐洗液里有病毒；目前等待核酸检测人数大大超过检测能力，仓促上阵得出的检测结果可靠性不高。目前针对新型冠状病毒核酸检测仅有ORF1ab及N基因检测指导方法，而尚没有S基因检测方法。最新报道，多家单位成功分离新型冠状病毒2019-nCoV毒株的全基因组序列测定和变异分析，与新型冠状病毒2019-nCoV参考基因组NC 045512.2相比，很多毒株基因组ORF 1a/b基因发生了重要的两个位点突变，提示现有的检测方法、检测靶标需要根据病毒变异情况进行进一步更新和优化。有必要开展新型冠状病毒S基因检测方法研究，研发适用于现场的快速筛查技术方法，适用于现场检测、便捷高效的技术手段。
恒温显色扩增是一种新型核酸扩增技术，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下进行特异、敏感和高效的核酸扩增。恒温扩增反应需要特别设计2条内引物和2条外引物，以及根据基因差异化程度而需要的2条环引物，增强特异性靶DNA在60℃～65℃恒温条件下(如水浴箱内)保温约60min，即可完成恒温核酸扩增反应。恒温扩增最终产物是由大量菜花样结构组成的茎环状DNA混合物，由于恒温扩增产生了巨大数量的DNA产物，故可通过反应管内副产物的浊度或显色来对产物进行检测。通过逆转录酶，恒温扩增可进行RNA高效扩增。恒温显色扩增具有不需要特殊仪器设备的特点，使用水浴锅、金属浴均可以适用，特别适用于现场或者基层单位，这些地方无法做到严格的实验分区或者严格的操作流程。恒温显色可以不用严格的实验分区，反应区和加样区可以合二为一。恒温显色技术的引物设计是关键核心技术，但对检测人员的实际操作要求并不高，操作简便、省时高效，且不需要特殊的试剂和仪器设备，该设备已国产化，价格很低，均能满足要求。因此，恒温显色扩增技术是解决目前核酸快速筛查检测基层应用难题的突破口，在生物安全快速检测领域具有广阔应用前景。但目前由于引物及探针的设计难度较大，一般较难达到理想的检测效果。
发明内容
为了解决上述现有技术问题，本发明提供一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组。本发明的另一个目的是提供一种2019新型冠状病毒检测恒温显色筛查试剂盒及其检测方法。本发明的检测方法不需要特殊的仪器即可获得检测结果，检测快速、成本低。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组，其包括用于等温扩增检测的外引物对、内引物对和环引物对，所述外引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
一种用于2019新型冠状病毒检测的恒温显色筛查试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的引物组、链置换Bst DNA聚合酶和逆转录酶。
如上所述的恒温显色筛查试剂盒，该试剂盒还包括钙黄绿素、dNTPs、KCl和MgCl2。
如上所述的恒温显色筛查试剂盒，该试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为S基因体外转录RNA序列的质粒作为阳性对照，所述S基因体外转录RNA的序列如SEQ ID NO.7所示，所述阴性对照为去核酸的灭菌水。
一种用于2019新型冠状病毒检测的恒温显色方法，该方法是非诊断目的的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)从样品中提取RNA；
(2)对步骤(1)提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述用于2019新型冠状病毒检测的引物组，置于63℃恒温反应；
(3)在所述恒温反应进行30min后取出反应，观察结果
(4)结果判定：待测样品中若呈现绿色，则判断为阳性，若呈现浅橘色，则判断为阴性。
如上所述的恒温显色方法，优选地，在步骤(2)中，所述等温扩增的反应体系，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有S-1:反应液：8×105U/L Rnasin，200mM dNTPs，10mM Tris-HCl(pH＝8.3)，20mM KCl，3.5mM MgCl2，0.8M betaine，1.6μM内引物对，0.2μM外引物对，0.8μM环引物对，1.6μM内引物对总共20.3μL，钙黄绿素1μL，Bst聚合酶1.5μL，AMV酶0.2μL，样品RNA模板2.0μL。
如上所述的恒温显色方法，优选地，同时设置无核酸酶水为阴性对照；采用含S基因体外转录RNA的序列的质粒作为阳性对照，所述S基因体外转录RNA的序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种新型冠状病毒S基因恒温显色扩增筛查检测内外环引物组，并建立相应的S基因恒温显色扩增筛查检测方法及筛查试剂盒，可以解决目前新型冠状病毒核酸检测仅局限于应用恒温扩增芯片法检测S基因，而没有使用廉价、便捷的恒温水浴锅即可完成筛查检测S基因的恒温显色筛查方法及试剂盒的问题。
本发明开展新型冠状病毒S基因恒温显色扩增筛查检测方法，创新性设计新型冠状病毒S基因恒温显色扩增内外环引物组，建立成熟稳定、测试成本低的恒温显色扩增筛查检测新方法。针对世界公布的新型冠状病毒2019-nCoV毒株全基因组序列测定和变异分析结果，针对S基因，自主设计恒温显色扩增特异性引物，体外转录RNA进行验证实验，建立特性、灵敏的新型冠状病毒S基因恒温显色扩增筛查检测新方法。25-35min即可完成对新型冠状病毒S基因的快速筛查检测，性能指标优于国内外同类方法水平。所研发建立的方法可以在线实现样品的预处理及测试的全过程，使核酸现场快速筛查检验设想成为可能。
本发明研发的新型冠状病毒S基因恒温显色扩增内外环引物组，以及研发的恒温显色筛查检测方法及筛查试剂盒，检测方法特异性强，灵敏度高，使用廉价、便捷的恒温水浴锅检测S基因的恒温显色筛查方法即可获得检测结果，是对新型冠状病毒检测S基因方法和试剂盒的有力补充。新型冠状病毒S基因恒温显色筛查检测试剂盒具有技术成熟稳定、测试成本低，更适合于基层推广的优势，可以使用廉价的恒温水浴锅即可完成筛查检测，更适合于社区化验室、企业化验室、县区卫生所等基层实验室的快速筛查检测，成果具有很好的市场竞争力，有良好的产业化前景。
附图说明
图1为本发明的靶基因与Bat SARS-like coronavirus差异位点；
图2为本发明的靶基因与SARS coronavirus差异位点；
图3为引物对筛选结果；
图4灵敏度测试扩增结果；
图5为本发明检测方法操作流程示意图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。本发明实施例中所用的AMV反转录酶BioLabs M0277，Bst聚合酶BioLabs M0537L恒温荧光扩增反应液购自广州双螺旋公司；恒温水浴锅购自春秋电子仪器有限公司；等温仪购自天津天根生物公司的。也可以采用其它公司试剂及仪器。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1S基因恒温显色扩增引物组筛选及特异性验证
1.1引物组的设计
在新型冠状病毒基因组中，有三个基因是该病毒的“护卫”“冲锋兵”以及“运输兵”。第一个S基因，编码刺突糖蛋白，这是用于包病毒的外壳的蛋白；第二个M基因，编码膜糖蛋白，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成；另外E基因，是很短的编码75个氨基酸的小包膜糖蛋白，可以与包膜结合的蛋白。这三个蛋白就形成了病毒蛋白的脂肪膜，把这个病毒“老大”(30K的单链RNA)给包起来。其实单链的RNA是十分不稳定，且容易变异，而且由于人体有大量的RNA酶会迅速消灭RNA。
经过仔细研究比对，本发明选择了新型冠状病毒基因组中特异性最强的S基因作为检测靶标，位于病毒的Spike蛋白区，与其他冠状病毒/细菌/人体基因组无交叉。S基因序列的特异性比对如下。
种内保守性比对：自新型冠状病毒国家科技资源服务系统(http://nmdc.cn/#/nCoV)下载已上传的26组2019-nCoV序列，经比对分析对在2019-nCoV种内序列同源性为99.97％以上，仅在末梢存在个别碱基出入。
种外同源性比对：初步比对结果显示，其与两株蝙蝠类SARS冠状病毒同源性为87％(bat-COVZC45、bat-SL-COVZXC21)，与SARS病毒同源性约80％。排除SARS病毒及蝙蝠类SARS冠状病毒后，其与其他蝙蝠冠状病毒同源性也在80％，极大可能是来源于蝙蝠的变异株。排除其他蝙蝠冠状病毒后，发现其与MERS冠状病毒同源性约30％，保守性约67％。
根据新型冠状病毒国家科技资源服务系统(http://nmdc.cn/#/nCoV)下载已上传的26组2019-nCoV序列，选取S基因的保守区，采用Primer Premier 5.0软件自行设计3组恒温显色扩增引物对，分别标记为第一组、第二组、第三组。每组引物包括2条内引物、2条外引物及2条环引物，并使用Primer blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行评估。
1.2特异性扩增基因片段的序列比对
1.2.1种内保守性比对
自新型冠状病毒国家科技资源服务系统(http://nmdc.cn/#/nCoV)下载已上传的26组2019-nCoV序列，经比对分析对在2019-nCoV种内序列同源性为99.97％以上，仅在末梢存在个别碱基出入。
1.2.2种外同源性比对
初步比对结果显示，其与两株蝙蝠类SARS冠状病毒同源性为87％(bat-COVZC45、bat-SL-COVZXC21)，与SARS病毒同源性约80％。
排除SARS病毒及蝙蝠类SARS冠状病毒后，其与其他蝙蝠冠状病毒同源性也在80％，极大可能是来源于蝙蝠的变异株。
排除其他蝙蝠冠状病毒后，发现其与MERS冠状病毒同源性约30％，保守性约67％。
1.2.3差异位点分析
新型冠状病毒属于RNA病毒，存在很不稳定，容易变异的特点。不一致碱基分布在全基因组，约十几个碱基就有1～2个碱基不一致，与bat-COVZC45的连续不一致区域主要有3205～3354，21580～21850(S蛋白基因)等位点，经分析发现S蛋白基因差异最大，故选择S蛋白基因建立本筛查检测方法。差异位点分析比对结果如图1，图2。
1.3引物组的特异性扩增测试
1.3.1阳性对照品的制备
根据新型冠状病毒国家科技资源服务系统(http://nmdc.cn/#/nCoV)公布的2019-nCoV核酸序列，人工合成制备S基因质粒体外转录RNA阳性对照(序列如SEQ ID NO.7所示)样本，分装并于-20℃保存备用。
1.3.2特异性扩增试验
提取与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其它病原体核酸或阳性对照质粒，主要包括冠状病毒229E型质粒、冠状病毒OC43型质粒、冠状病毒HKU1型质粒、冠状病毒NL63型质粒、MERS冠状病毒质粒、甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA、副流感病毒质粒、腺病毒质粒、呼吸道合胞病毒质粒、鼻病毒质粒、肺炎支原体质粒、肺炎衣原体质粒、肺炎链球菌质粒、肺炎克雷伯菌核酸、军团菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸等做特异性扩增试验。验证本发明所设计的3套新型冠状病毒S基因恒温显色内外环引物组的扩增特异性，以便筛选出最佳的一套引物组。
1.3.3引物组的特异性扩增测试结果
使用10pg/μL(10^6copies/μL)新型冠状病毒S基因体外转录RNA阳性对照进行引物筛选，分析所设计3套引物组的显色扩增反应结果及特异性。
通过对3套引物进行筛选，其中第3套引物组颜色显色时间较早、且较稳定，结果如图3所示图中表示阳性质控，NC为阴性对照，特异性结果仅S基因质粒体外转录RNA阳性对照检测出为阳性，其余为阴性，因此，确定第3套新型冠状病毒S基因恒温显色扩增内外环引物组。
第三套内外环引物组碱基序列如下(方向为5'to 3')
(1)外引物对：
SEQ ID NO.1：5′-TTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGT-3′
SEQ ID NO.2：5′-AGTAGGGACTGGGTCTTCGAAT-3′
(2)内引物对：
SEQ ID NO.3：5′-TGTAAAACTGAGGATCTGAAAACTTTGTTTTAACCAGAACTCAATTACCCCCTG-3′
SEQ ID NO.4：5′-AATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTTTTTATTATGTTAGACTTCTCAGTGGAA-3′
(3)环引物对：
SEQ ID NO.5：5′-GGGTAATAAACACCACGTGTGAAA-3′
SEQ ID NO.6：5′-CCATTTAATGATGGTGTTTATTT-3′。
实施例2S基因恒温显色扩增检测体系的优化
2.1恒温显色扩增反应体系的建立
采用105U/L Bst酶、4×106U/L AMV酶、8×105U/L RNasin、200mM dNTPs、10mMTris-HCl(pH＝8.3)、20mM KCl、3.5mM MgCl2配制恒温显色扩增预混反应液，采用实施例1中确认的新型冠状病毒S基因检测最特异的第3套引物组(内引物对、外引物对和环引物对)，配制成新型冠状病毒S基因恒温显色扩增检测反应体系，混匀后置于恒温仪中进行恒温显色扩增。
反应条件为：
恒温水浴锅：63℃条件下反应30min。
或等温扩增仪：63℃条件下反应30min。
2.2恒温显色扩增检测体系的建立及优化结果
使用10pg/μL(106copies/μL)S基因体外转录RNA作为检测样本，使用第3套引物组进行恒温显色扩增检测体系的建立及优化测试。确定在反应时间30分钟以内，阳性样品应显示为绿色，阴性样品应显示为橙黄色的检测体系，最终确定的反应体系如表1所示。
表1恒温显色扩增检测体系
Figure BDA0002716002720000121
本发明中采用的恒温扩增技术原理：基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对内引物(2条)、1对外引物(2条)及1对环引物(2条)，3对特异性引物组依靠链置换Bst DNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。通过逆转录酶(AMV酶)，恒温扩增则进行RNA高效扩增。反应30min～1h后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断扩增情况。此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3个阶段。
恒温扩增产物显色技术原理：在钙黄绿素中加入Mn2+，Mn2+使钙黄绿素的绿色荧光淬灭。当等温扩增反应发生后，产生的副产物焦磷酸离子与Mn2+结合并释放钙黄绿素，淬灭状态解除。最终呈现的结果为在365nm蓝光激发下，阳性反应发出强绿色荧光，阴性反应发出较弱绿色荧光。在自然光下，阳性反应呈浅绿色，阴性反应呈浅橘色。
实施例3S基因恒温显色扩增筛查检测方法灵敏度验证
分别将S蛋白基因体外转录RNA质粒阳性对照样本以10倍差进行稀释，梯度浓度分别为1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10copies/μL，经实施例2中优化好的恒温显色扩增反应体系进行检测，结果显示，以第3套引物组进行恒温显色方法检测灵敏度试验，以RNA为模板10倍梯度稀释进行检测，结果如图4所示，在30分钟以内，1×103copies两个平行均稳定检出，检出限为1×103copies。
实施例4新型冠状病毒S蛋白基因恒温显色筛查检测试剂盒及使用方法
本发明制备的新型冠状病毒S蛋白基因恒温显色筛查检测试剂盒包括如下试剂，如表2所示。
表2试剂盒产品内容
Figure BDA0002716002720000131
试剂盒中内引物是指序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的序列均为1.6μM；外引物是指序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列均为0.2μM；环引物是指序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的序列均为0.8μM。
试剂盒的使用方法，即对于样品的检测，适用样本类型有：咽拭子、鼻咽拭子、肛拭子、血浆等样本；标本应当避免反复冻融。
检测的操作流程示意图如图5所示，具体操作步骤如下：
样本RNA提取(也可以按照其他提取试剂盒操作进行)
(一)、样品RNA提取步骤
1、取样品如咽拭子、鼻咽拭子、肛拭子、血浆等临床样本的保存液至1.5mL离心管中，每管加入200μL 1号液，加3μL Carrier RNA(1μg/μL)，涡旋混匀15s。室温放置3-5min。
2、向上述离心管中加入20μL磁珠(注：磁珠优化前要摇晃均匀)，再加入150μL 2号液，轻轻颠倒混匀后，放入磁力架上。待磁珠集中到管底后，将上清液吸出并弃掉(注：不要将磁珠吸出，吸取上清液时，离心管应一直放在磁力架上)。
3、向离心管中加入200μL 3号液，充分颠倒混匀后，放回磁力架上，待磁珠集中到管底后，将上清液吸出并弃掉。
4、重复步骤3。
5、将离心管盖打开，55℃放置4分钟后取出。
6、加入20μL 4号液，用加样枪混匀，放回磁力架。上清液即为提取RNA。
(二)、恒温显色扩增检测步骤
(1)取出试剂盒，将试剂完全解冻，各组分离心30s，B-I及R-I为液体，取出后应放置于冰盒上。
(2)试剂配制
若有N个待检样本，则参照下表，按照N+3个数量计算各组分用量(N个待检样本+1个阴性对照+1个阳性对照+1份备用)，总共的使用量：
S-1 21.8×(N+3)μL
B-11.5×(N+3)μL
R-10.2×(N+3)μL
反应液总体积23×(N+3)μL
将反应液置于0.6mL或者1.5mL离心管中，涡旋混匀，离心30s，分装23μL于0.2mLPCR管中。
(3)添加待检样本模板
向步骤(2)中已含有反应液的0.2mL PCR管中分别加入2μL模板(待测样品的RNA或DNA)，离心30s，应立即进行扩增反应。
(4)扩增反应
等温仪或水浴条件：63℃条件下反应30min。
(5)检测结果判定
空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明检测体系有效：在反应时间30分钟以内，阳性对照应显示为绿色，阴性对照应显示为橙黄色
样本检测结果判定：样品检测结果的判定应与阳性对照和阴性对照比较，如果样品的反应液显示为绿色则表示该样品的检测结果为阳性，如果样品的反应液显示为橙黄色则表示该样品的检测结果为阴性。在黑色背景下观察结果更有利于实验结果的观察。
需要注意的是：该试剂的反应体系、扩增管以及阳性对照品在-20℃条件下保存。在试剂使用过程中，每一步用吸管滴加或吸取液体后必须更换新的吸管，不同样品之间滴入或吸出液体也必须更换新的吸管，以防止交叉污染。
操作过程中要佩戴一次性或乳胶手套，若检测的样品量大，要提高更换手套的频率，以防止交叉污染。尽量在空气流通的地方向扩增管中加入样品和阳标，防止检测结果出现假阳性。每一次检测都要设置阳性对照和阴性对照以保证被测样品检测结果的可靠性。
实施例5特异性及实际样本的检测
采用实施例4的试剂盒及检测方法，对冠状病毒229E型质粒、冠状病毒OC43型质粒、冠状病毒HKU1型质粒、冠状病毒NL63型质粒、MERS冠状病毒质粒、甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA、副流感病毒质粒、腺病毒质粒、呼吸道合胞病毒质粒、鼻病毒质粒、肺炎支原体质粒、肺炎衣原体质粒、肺炎链球菌质粒、肺炎克雷伯菌核酸、军团菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸等做特异性扩增试验。对5例新冠病毒肺炎确诊阳性的样本、100份正常人血清采用实施例4的试剂盒及检测方法进行检测。检测结果显示绿色的为阳性，橙黄色为阴性；对对冠状病毒229E型质粒、冠状病毒OC43型质粒、冠状病毒HKU1型质粒、冠状病毒NL63型质粒、MERS冠状病毒质粒、甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA、副流感病毒质粒、腺病毒质粒、呼吸道合胞病毒质粒、鼻病毒质粒、肺炎支原体质粒、肺炎衣原体质粒、肺炎链球菌质粒、肺炎克雷伯菌核酸、军团菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸的检测结果显示为阴性，对新冠病毒肺炎确诊阳性的样本检测为阳性，100份正常人血清的检测均为阴性，说明本发明建立的试剂盒及方法即采用的引物的特性强，与其他病原不发生交叉反应。
序列表
<110> 天津师范大学
<120> 用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttattgccac tagtctctag tcagtgt 27
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtagggact gggtcttcga at 22
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaactg aggatctgaa aactttgttt taaccagaac tcaattaccc cctg 54
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatggtacta agaggtttga taaccctttt tattatgtta gacttctcag tggaa 55
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggtaataaa caccacgtgt gaaa 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccatttaatg atggtgttta ttt 23
<210> 7
<211> 1001
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taattagaga aaacaacaga gttgttattt ctagtgatgt tcttgttaac aactaaacga 60
acaatgtttg tttttcttgt tttattgcca ctagtctcta gtcagtgtgt taatcttaca 120
accagaactc aattaccccc tgcatacact aattctttca cacgtggtgt ttattaccct 180
gacaaagttt tcagatcctc agttttacat tcaactcagg acttgttctt acctttcttt 240
tccaatgtta cttggttcca tgctatacat gtctctggga ccaatggtac taagaggttt 300
gataaccctg tcctaccatt taatgatggt gtttattttg cttccactga gaagtctaac 360
ataataagag gctggatttt tggtactact ttagattcga agacccagtc cctacttatt 420
gttaataacg ctactaatgt tgttattaaa gtctgtgaat ttcaattttg taatgatcca 480
tttttgggtg tttattacca caaaaacaac aaaagttgga tggaaagtga gttcagagtt 540
tattctagtg cgaataattg cacttttgaa tatgtctctc agccttttct tatggacctt 600
gaaggaaaac agggtaattt caaaaatctt agggaatttg tgtttaagaa tattgatggt 660
tattttaaaa tatattctaa gcacacgcct attaatttag tgcgtgatct ccctcagggt 720
ttttcggctt tagaaccatt ggtagatttg ccaataggta ttaacatcac taggtttcaa 780
actttacttg ctttacatag aagttatttg actcctggtg attcttcttc aggttggaca 840
gctggtgctg cagcttatta tgtgggttat cttcaaccta ggacttttct attaaaatat 900
aatgaaaatg gaaccattac agatgctgta gactgtgcac ttgaccctct ctcagaaaca 960
aagtgtacgt tgaaatcctt cactgtagaa aaaggaatct a 1001

Claims (7)

1.一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组，其特征在于，其包括用于等温扩增检测的外引物对、内引物对和环引物对，所述外引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对的序列如SEQID No.5和SEQ ID No.6所示。
2.一种用于2019新型冠状病毒检测的恒温显色筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求1所述的引物组、链置换Bst DNA聚合酶和逆转录酶。
3.根据权利要求2所述的恒温显色筛查试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括钙黄绿素、dNTPs、KCl和MgCl2。
4.根据权利要求2所述的恒温显色筛查试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含S基因体外转录RNA的序列的质粒作为阳性对照，所述S基因体外转录RNA的序列如SEQ ID NO.7所示，所述阴性对照为去核酸的灭菌水。
5.一种用于2019新型冠状病毒检测的恒温显色方法，其特征在于，该方法是非诊断目的的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)从样品中提取RNA；
(2)对步骤(1)提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述用于2019新型冠状病毒检测的引物组，置于63℃恒温反应；
(3)在所述恒温反应进行30min后取出反应，观察结果
(4)结果判定：待测样品中若呈现绿色，则判断为阳性，若呈现浅橘色，则判断为阴性。
6.根据权利要求5所述的恒温显色方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述等温扩增的反应体系，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有S-1:反应液：8×105U/LRnasin，200mM dNTPs，10mM Tris-HCl(pH＝8.3)，20mM KCl，3.5mM MgCl2，0.8M betaine，1.6μM内引物对，0.2μM外引物对，0.8μM环引物对，1.6μM内引物对总共20.3μL，钙黄绿素1μL，Bst聚合酶1.5μL，AMV酶0.2μL，样品RNA模板2.0μL。
7.根据权利要求5所述的恒温显色方法，其特征在于，同时设置无核酸酶水为阴性对照；采用含S基因体外转录RNA的序列质粒作为阳性对照，所述S基因体外转录RNA的序列如SEQ ID NO.7所示。
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