CN111500770B - 一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物及其试剂盒 - Google Patents

一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物及其试剂盒，为建立一种猫肠道相关病原体的mPCR检测方法，本发明提供一种用于检测猫肠道病原体的mPCR引物组合物，包括FCoV‑F、FCoV‑R、FeAstV‑F、FeAstV‑R、FeKoV‑F、FeKoV‑R；并根据该mPCR引物组合物建立一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR方法，检测过程使用Taq酶，使检测更加方便，减少了加样过程中的污染机会；检测时直接加入酶、ddH2O、预混引物、模板即可启动mPCR，优于其他mPCR检测方法，从而为猫肠道病原体提供了一种高效、灵敏、特异、低成本的检测工具。

Description

一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物及其 试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物及其试剂盒。
背景技术
猫是人类最常见的伴侣动物之一，在为人类提供感情支持方面扮演着重要的角色。至今，在世界范围内人类饲养的家猫约有8千万-4亿只，随着家猫数量的剧增，人类对猫咪的健康问题也越来越关注。
病毒性腹泻是猫常见的肠道疾病，是对猫健康的主要威胁之一。目前，在猫身上发现的与猫腹泻相关的病原体包括猫冠状病毒(feline coronaviruses，FCoVs)，猫星状病毒(Feline astrovirus，FeAstV)、猫嵴病毒(feline kobuvirus，FeKoV)和猫细小病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)等。猫冠状病毒(FCoVs)有两种已知的生物型，即猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)和猫肠道冠状病毒(FECV)，其中，FECV是一种普遍存在的世界性猫肠道冠状病毒，FECV感染通常不明显或表现为短暂性肠胃炎。猫星状病毒(FeAstV)最初是通过电子显微镜electron microscopy(EM)从一只患有腹泻的家猫的粪便中发现的，随后经过电子显微镜的调查证实，无论是否腹泻，FeAstV都普遍存在于猫的粪便中，而且实验室用一株FeAstV病毒感染无特定病原体(SPF)的小猫，诱导小猫肠炎和排泄病毒数天。猫嵴病毒(FeKoV)2013年在韩国腹泻猫的粪便中首次被发现，目前在我国南方也有关于猫嵴病毒的报道，并且经证实，FeKoV与猫的腹泻呈正相关。
在许多情况下，多种病原体有相似的临床症状并发生混合感染，因此检测猫肠道病原体对于预防、控制和治疗猫肠道疾病具有重要的意义。目前，虽然有许多检测猫肠道病原体的方法，但检测的病原体较单一，且耗时长。
多重PCR(multiplex Polymerase chain reaction，mPCR)，是由普通PCR延伸而来的一项PCR技术，在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个目的核酸片段的PCR反应。因其可在单一PCR体系中，同时扩增多个目的片段，多重PCR不仅保留了普通PCR特异性强、灵敏度高的优点，而且具有节约时间、节省人力物力等优点，在临床检测上具有很高的应用价值。
目前，尚未建立猫肠道相关病原体的mPCR检测方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物。
本发明的第二个目的是提供上述mPCR引物组合物在制备辅助诊断猫肠道病原体感染的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR检测试剂盒。
本发明的第四个目的是提供上述mPCR检测试剂盒在制备辅助诊断猫肠道病原体感染的产品中的应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种用于检测猫肠道病原体的mPCR引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括SEQ ID NO:1所示的FCoV-F、SEQ ID NO:2所示的FCoV-R、SEQ ID NO:3所示的FeAstV-F、SEQ ID NO:4所示的FeAstV-R、SEQ ID NO:5所示的FeKoV-F、SEQ ID NO:6所示的FeKoV-R；所述猫肠道病原体为猫冠状病毒、猫星状病毒和猫嵴病毒。
肠道病原体感染是猫类疾病最常见的原因。在许多情况下，多种病原体有相似的临床症状并发生混合感染。对这些病原体的快速诊断对于提供及时有效的治疗非常重要。为了提高诊断，本研究开发了一种新的mPCR方法，使用不同的引物混合，用于同时检测多种猫肠道病原体(FCoVs、FeAstV和FeKoV)，mPCR反应结果的敏感度表明，此种mPCR方法的检测极限为1.0×103copies；同时，本研究以患肠道疾病的猫为研究对象，采集10个肛门拭子(anal swabs)作为临床试验，可同时检测3种肠道病原体，并迅速评估共感染，本研究为猫肠道病原体的快速鉴别诊断和流行病学监测提供了有效、准确的工具。
具体的，所述FCoV-F和FCoV-R为检测猫冠状病毒的引物对。
具体的，所述FeAstV-F和FeAstV-R为检测猫星状病毒的引物对。
具体的，所述FeKoV-F和FeKoV-R为检测猫嵴病毒的引物对。
优选的，上述引物组合物还包括用于检测猫细小病毒的SEQ ID NO:7所示的FPV-F、SEQ ID NO:8所示的FPV-R。
本发明还提供了上述mPCR引物组合物(SEQ ID NO:1所示的FCoV-F、SEQ ID NO:2所示的FCoV-R、SEQ ID NO:3所示的FeAstV-F、SEQ ID NO:4所示的FeAstV-R、SEQ ID NO:5所示的FeKoV-F、SEQ ID NO:6所示的FeKoV-R组成的引物组合物，或者SEQ ID NO:1所示的FCoV-F、SEQ ID NO:2所示的FCoV-R、SEQ ID NO:3所示的FeAstV-F、SEQ ID NO:4所示的FeAstV-R、SEQ ID NO:5所示的FeKoV-F、SEQ ID NO:6所示的FeKoV-R、EQ ID NO:7所示的FPV-F、SEQ ID NO:8所示的FPV-R组成的引物组合物)在制备辅助诊断猫肠道病原体感染的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR检测试剂盒，包括上述的mPCR引物组合物(SEQ ID NO:1所示的FCoV-F、SEQ ID NO:2所示的FCoV-R、SEQ ID NO:3所示的FeAstV-F、SEQ ID NO:4所示的FeAstV-R、SEQ ID NO:5所示的FeKoV-F、SEQ ID NO:6所示的FeKoV-R组成的引物组合物，或者SEQ ID NO:1所示的FCoV-F、SEQ ID NO:2所示的FCoV-R、SEQ ID NO:3所示的FeAstV-F、SEQ ID NO:4所示的FeAstV-R、SEQ ID NO:5所示的FeKoV-F、SEQ ID NO:6所示的FeKoV-R、EQ ID NO:7所示的FPV-F、SEQ ID NO:8所示的FPV-R组成的引物组合物)。
为增加试剂盒的实用价值，上述mPCR检测试剂盒还包括其他辅助性试剂，优选的，还包括酶(Taq酶)。
在RNA病毒的检测中，在检测前，需将RNA反转录为cDNA，因此在一些具体实施方式中，上述mPCR检测试剂盒还包括逆转录酶以及用于逆转录的随机引物。
优选的，试剂盒中所述引物组合物的浓度为10mM。
优选的，所述mPCR检测试剂盒的mPCR反应体系为：10μL Mix(含Taq酶)，0.31μLFCoV-F，0.31μL FCoV-R，0.19μL FeAstV-F，0.19μL FeAstV-R，0.5μL FeKoV-F，0.5μLFeKoV-R，1μL DNA/cDNA模板(大于103DNA拷贝数)，7.0μL ddH2O，反应体系总体积为20μL。
或者，所述mPCR检测试剂盒的mPCR反应体系为：10μL Mix(含Taq酶)，0.26μLFCoV-F，0.26μL FCoV-R，0.16μL FeAstV-F，0.16μL FeAstV-R，0.42μL FeKoV-F，0.42μLFeKoV-R，0.16μL FPV-F，0.16μL FPV-R，1μL DNA/cDNA模板(大于103DNA拷贝数)，7.0μLddH2O，反应体系总体积为20μL。
优选的，所述mPCR检测试剂盒的mPCR反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，55.6℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸5min。
本发明还提供了上述mPCR检测试剂盒在制备辅助诊断猫肠道病原体感染的产品中的应用。
需要说明的是，本发明的mPCR检测试剂盒可以检测单个猫肠道病原体，也可以同时检测多个猫肠道病原体，此外还可以同时检测猫肠道病原体和猫呼吸道病原体，实现猫呼吸道和肠道病原体的快速鉴别诊断。
本发明还提供了使用上述mPCR检测试剂盒检测猫肠道病原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取猫肠道病原体的核酸(若病原体为RNA病毒，则还需用到逆转录酶和逆转录引物进行反转录，使病毒RNA逆转录为cDNA)；
S2、以步骤S1的核酸(DNA/cDNA)为模板进行mPCR，mPCR的引物包括FCoV-F和FCoV-R、FeAstV-F和FeAstV-R、FeKoV-F和FeKoV-R；mPCR反应体系为：10μL Mix(含Taq酶)，0.31μLFCoV-F，0.31μL FCoV-R，0.19μL FeAstV-F，0.19μL FeAstV-R，0.5μL FeKoV-F，0.5μLFeKoV-R，1μL DNA/cDNA模板(大于103DNA拷贝数)，7.0μL ddH2O，反应体系总体积为20μL。mPCR扩增程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，55.6℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸5min；
S3、根据扩增条带的有无以及片段大小判断病原体的类型，其中，FCoVs的扩增目的片段的大小为726bp；FeAstV的扩增目的片段的大小为418bp；FeKoV的扩增目的片段的大小为198bp。
或者，本发明还提供使用上述mPCR检测试剂盒检测猫肠道病原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取猫肠道病原体的核酸(若病原体为RNA病毒，则还需用到逆转录酶和逆转录引物进行反转录，使病毒RNA逆转录为cDNA)；
S2、以步骤S1的核酸(DNA/cDNA)为模板进行mPCR，mPCR反应体系总体积为20μL，包括：10μL Mix(含Taq酶)，0.26μL FCoV-F，0.26μL FCoV-R，0.16μL FeAstV-F，0.16μLFeAstV-R，0.42μL FeKoV-F，0.42μL FeKoV-R，0.16μL FPV-F，0.16μL FPV-R，1μL DNA/cDNA模板(大于103DNA拷贝数)，7.0μL ddH2O；mPCR扩增程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，55.6℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸5min；
S3、根据扩增条带的有无以及片段大小判断病原体的类型，其中，FCoVs的扩增目的片段的大小为726bp；FeAstV的扩增目的片段的大小为418bp；FeKoV的扩增目的片段的大小为198bp；FPV的扩增目的片段的大小为337bp。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物，包括SEQ IDNO:1所示的FCoV-F、SEQ ID NO:2所示的FCoV-R、SEQ ID NO:3所示的FeAstV-F、SEQ ID NO:4所示的FeAstV-R、SEQ ID NO:5所示的FeKoV-F、SEQ ID NO:6所示的FeKoV-R；并根据该mPCR引物组合物建立一种用于同时检测多种猫肠道病原体(FCoVs，FeAstV，FeKoV)的mPCR方法，检测过程使用Taq酶，使检测更加方便，减少了加样过程中的污染机会；检测时直接加入酶、ddH2O、预混引物、模板即可启动mPCR，优于其他mPCR检测方法，从而为猫肠道病原体提供了一种高效、灵敏、特异、低成本的检测工具；含有上述引物组合物的mPCR检测试剂盒可以检测单个猫肠道病原体，也可以同时检测多个猫肠道病原体，此外还可以同时检测猫肠道病原体和猫呼吸道病原体，实现猫呼吸道和肠道病原体的快速鉴别诊断。
附图说明
图1为mPCR的梯度退火温度电泳图谱(M：100bp ladder plus；NS：阴性对照；1—12：梯度温度分别是50.0℃，50.5℃，51℃，52℃，53.2℃，54.4℃，55.6℃，56.8℃，58.0℃，59.0℃，59.5℃，60.0℃)；
图2为mPCR的特异性电泳图谱(M：100bp ladder plus；NS：阴性对照；1—4：MDCK,大肠杆菌，狂犬病毒，沙门氏菌；5—8：Pmd-FeKoV，Pmd-FeAstV，Pmd-FPV，Pmd-FCoVs)；
图3为Pmd-FCoVs质粒的敏感度极限电泳图谱(M：100bp ladder plus；NS：阴性对照)；
图4为Pmd-FeAstV质粒的敏感度极限电泳图谱(M：100bp ladder plus；NS：阴性对照)；
图5为Pmd-FeKoV质粒的敏感度极限电泳图谱(M：100bp ladder plus；NS：阴性对照)；
图6为Pmd-FPV质粒的敏感度极限电泳图谱(M：100bp ladder plus；NS：阴性对照)；
图7为混合质粒(FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV)的敏感度极限电泳图谱(M：100bpladder plus；NS：阴性对照)；
图8为患肠道症状的家猫临床样本的电泳检测图谱(M：100bp ladder plus，NS：阴性对照；1-8为患肠道症状的家猫检测样本)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1mPCR引物的筛选以及mPCR检测方法的建立
(1)病毒和毒株
3种猫肠道病原体(FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV)，狂犬病病毒(RABV)，大肠杆菌(大肠杆菌，ATCC-29522)和沙门氏菌。
(2)主要试剂
2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(GenStar)，2×Taq Master(MixVazyme)，ddH2O，100bp Ladder Plus，PMD-18T Vector(TaKaRa)，病毒总核酸快速提取试剂盒(Magen)，Moloney murine leukemia virus(M-MLV)逆转录酶。
(3)猫肠道病原体(FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV)的mPCR引物的设计
先使用BioEdit软件比较各个病原体(FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV)的保守序列，然后采用primer 5.0软件根据各病原体的特定高度保守区域设计mPCR引物，引物的设计必须满足以下条件：引物设计为结合保守序列区域，退火温度相近，缺少二聚体或发夹结构，引物组合产生的扩增产物易于相互区分，并尽可能少地使用简并碱基以避免不匹配，特异性、敏感性和重复性试验结果均良好。所设计的mPCR引物见表1，由广州市天一汇远基因科技有限公司合成。
表1所设计的猫肠道mPCRS引物的序列
Figure BDA0002441369920000061
(4)猫肠道病原体(FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV)核酸的提取及逆转录-聚合酶链式反应
以患肠道疾病的家猫为研究对象，以肛门拭子的形式取样，然后从肛门拭子中提取FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV的核酸，由于FCoVs、FeAstV和FeKoV为RNA病毒，因此在检测前，需使用随机引物(TaKaRa，大连，中国)和Moloney murine leukemia virus(M-MLV)逆转录酶反转录为cDNA，并置于-20℃保存。
然后分别对各病原体的DNA(FPV)和病原体RNA(FCoVs、FeAstV和FeKoV)的cDNA进行单个形式的PCR扩增。PCR反应体系总体积为20μL，包括：Mix(含Taq酶)10μL，上下游引物(引物序列具体见表1，引物浓度为10mM)各1μL，病原体模版1μL，ddH2O为7μL。PCR反应的程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，57℃退火1min，72℃延伸1min30s，35个循环，72℃延伸5min。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)PMD-18T载体的克隆
取上述经琼脂糖凝胶电泳纯化并初步确认的目的基因，在SolutionI连接酶的作用下连接过夜(16℃)，使其连接到pMD18-T载体(Takara)上。然后将连接产物转化至大肠杆菌FDH-5α中，在具有Amp+抗性的普通固体琼脂培养基上37℃过夜培养，随机挑取单克隆菌，转入普通琼脂培养基中进行大量繁殖，并按照质粒提取试剂盒(天根试剂)说明书的操作方法抽提质粒，经菌液PCR和质粒酶切鉴定后，将同时检测呈阳性的质粒送广州市天一汇远基因科技有限公司进行测序，以判断连接的成功与否。
(5)猫肠道病原体(FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV)的mPCR
以上述连接成功的4种肠道病原体质粒的混合物为模板，优化mPCR的退火温度。本研究应用的引物浓度为10mM，mPCR反应体系总体积为20μL，包括：Mix(含Taq酶)10μL，0.26μL FCoV-F，0.26μL FCoV-R，0.16μL FeAstV-F，0.16μL FeAstV-R，0.42μL FeKoV-F，0.42μLFeKoV-R，0.16μL FPV-F，0.16μL FPV-R，1010copies的质粒混合模版(Pmd-FcoVs、Pmd-FeAstV、Pmd-FeKoV和Pmd-FPV)1μL，ddH2O为7.0μL。用梯度退火温度从50℃到60℃对各混合病原体模板进行梯度mPCR优化反应(50.0℃，50.5℃，51℃，52℃，53.2℃，54.4℃，55.6℃，56.8℃，58.0℃，59.0℃，59.5℃，60.0℃)。mPCR反应的程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，50℃-60℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸5min。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。另外，以FeKoV-F1和FeKoV-R1、FeKoV-F2和FeKoV-R2为对照引物。
通过扩增得出，引物对FeKoV-F1和FeKoV-R1、引物对FeKoV-F2和FeKoV-R2均未能扩增出条带，而其他引物对均能扩增出相应的条带。由此得到本发明的最佳mPCR引物：
FCoV-F：GATGGAGTMTTCTGGGTTGC；
FCoV-R：TTCCTCAGGCTTCTTATCAG；
FeAstV-F：GAAATGGACTGGACACGTTATGA；
FeAstV-R：GGCTTGACCCACATGCCGAA；
FeKoV-F：CCTCTTTYCTTCGGGACTTTTA；
FeKoV-R：ACCACATCACTGAYTGTTCGTA；
FPV-F：AAGACGTGCAAGCGAGTCC；
FPV-R：GAGCGAAGATAAGCAGCGTAA。
同时，通过调整退火温度探索mPCR的最佳反应条件，如图1的扩增结果可以看出，4种猫肠道病原体(FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV)mPCR的最佳退火温度为55.6℃。可见，本发明的mPCR的最佳扩增程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，55.6℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸5min。
实施例2猫肠道病原体mPCR检测方法的特异性
为评估猫肠道病原体mPCR检测方法的特异性，按照实验例1的方法以4种猫肠道病原体(FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV)的特异性引物进行mPCR特异性分析。以MDCK，狂犬病毒(RABV)，大肠杆菌和沙门氏菌的RNA/DNA作为反应的模板，验证猫肠道病原体mPCR可能存在的交叉反应，并以猫肠道病原体的单个质粒作为阳性对照，用空载的PMD-18T作为阴性对照。
如图2所示，RABV、大肠杆菌、肠沙门氏菌和MDCK细胞没有扩增的条带，而4种猫肠道病原体(FCoVs、FeAstV、FeKoV和FPV)均显示扩增出特定的条带。可见，本发明的mPCR特异性好。
实施例3猫肠道病原体mPCR检测方法的敏感性
用紫外分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，USA)测定质粒的浓度(concentration，g/μL)，拷贝数(Copies)计算公式如下：
Figure BDA0002441369920000081
将混合质粒(Pmd-FcoVs、Pmd-FeAstV、Pmd-FeKoV和Pmd-FPV)从1×1010Copies稀释到1×101Copies，单个质粒也从1×1010稀释到1×101Copies，然后按照实验例1的方法进行mPCR分析，用稀释度来确定mPCR检测方法的敏感度极限。
根据检测结果可知，对于单个肠道病原体质粒而言，Pmd-FCoVs、Pmd-FeAstV、Pmd-FeKoV和Pmd-FPV的mPCR最低检测极限均为103份病原体DNA拷贝数(图3、图4、图5、图6)，而混合质粒(Pmd-FcoVs、Pmd-FeAstV、Pmd-FeKoV和Pmd-FPV)mPCR的最低同时检出极限为103copies(图7)。
实施例4猫肠道病原体mPCR检测试剂盒的建立
所述试剂盒包括实施例1中经过引物筛选后得到的mPCR引物组合物，具体包括FCoV-F和FCoV-R、FeAstV-F和FeAstV-R、FeKoV-F和FeKoV-R；或者FCoV-F和FCoV-R、FeAstV-F和FeAstV-R、FeKoV-F和FeKoV-R、FPV-F和FPV-R。
同时，还包括酶(Taq酶)。
在涉及RNA病毒的检测中，还包括逆转录酶以及用于逆转录的随机引物。
所述试剂盒的mPCR反应体系为：反应体系总体积为20μL，包括：10μL Mix(含Taq酶)，0.31μL FCoV-F，0.31μL FCoV-R，0.19μL FeAstV-F，0.19μL FeAstV-R，0.5μL FeKoV-F，0.5μL FeKoV-R，1μL DNA/cDNA模板(大于103DNA拷贝数)，7.0μL ddH2O；或者10μL Mix(含Taq酶)，0.26μL FCoV-F，0.26μL FCoV-R，0.16μL FeAstV-F，0.16μL FeAstV-R，0.42μLFeKoV-F，0.42μL FeKoV-R，0.16μL FPV-F，0.16μL FPV-R，1μL DNA/cDNA模板(大于103DNA拷贝数)，7.0μL ddH2O。
所述试剂盒的mPCR反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，55.6℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸5min。
使用上述试剂盒检测猫肠道病原体的方法，具体包括以下步骤：
S1、提取猫肠道病原体的核酸(若病原体为RNA病毒，则还需用到逆转录酶和逆转录引物进行反转录，使病毒RNA逆转录为cDNA)；
S2、以步骤S1的核酸(DNA/cDNA)为模板进行mPCR，mPCR的引物包括FCoV-F和FCoV-R、FeAstV-F和FeAstV-R、FeKoV-F和FeKoV-R；mPCR反应体系为：10μL Mix(含Taq酶)，0.31μLFCoV-F，0.31μL FCoV-R，0.19μL FeAstV-F，0.19μL FeAstV-R，0.5μL FeKoV-F，0.5μLFeKoV-R，1μL DNA/cDNA模板(大于103DNA拷贝数)，7.0μL ddH2O，反应体系总体积为20μL。mPCR扩增程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，55.6℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸5min；
S3、根据扩增条带的有无以及片段大小判断病原体的类型，其中，FCoVs的扩增目的片段的大小为726bp；FeAstV的扩增目的片段的大小为418bp；FeKoV的扩增目的片段的大小为198bp。
或者，使用上述试剂盒检测猫肠道病原体的方法包括以下步骤：
S1、提取猫肠道病原体的核酸(若病原体为RNA病毒，则还需用到逆转录酶和逆转录引物进行反转录，使病毒RNA逆转录为cDNA)；
S2、以步骤S1的核酸(DNA/cDNA)为模板进行mPCR，mPCR反应体系总体积为20μL，包括：10μL Mix(含Taq酶)，0.26μL FCoV-F，0.26μL FCoV-R，0.16μL FeAstV-F，0.16μLFeAstV-R，0.42μL FeKoV-F，0.42μL FeKoV-R，0.16μL FPV-F，0.16μL FPV-R，1μL DNA/cDNA模板(大于103DNA拷贝数)，7.0μL ddH2O；mPCR扩增程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，55.6℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸5min；
S3、根据扩增条带的有无以及片段大小判断病原体的类型，其中，FCoVs的扩增目的片段的大小为726bp；FeAstV的扩增目的片段的大小为418bp；FeKoV的扩增目的片段的大小为198bp；FPV的扩增目的片段的大小为337bp。
实施例5使用mPCR检测试剂盒对猫肠道疾病临床样本(患肠道症状的家猫)进行检测
2019年10月-12月期间，在中国广州和中国澳门地区采集10份患有肠道症状的家猫的肛门拭子。所有拭子均置于1mL冰冷的Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)中，其中含青霉素和链霉素各10000U/mL，4℃，12000rpm离心10min，去除杂质。然后提取RNA/DNA，所有样品在-80℃保存。每个拭子样本提取体积200μL。模板是每个样本的1μL DND/cDNA，最后采用实施例4中的方法进行mPCR实验。
如图8的检测结果所示，采用本发明的mPCR检测试剂盒对猫肠道疾病临床样本进行检测时，可以同时4种肠道病原体，并迅速评估共感染，表明所建立的mPCR方法是一种简单、有效的检测方法。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物及其试剂盒
<141> 2020-04-07
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gatggagtmt tctgggttgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
ttcctcaggc ttcttatcag 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
gaaatggact ggacacgtta tga 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ggcttgaccc acatgccgaa 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
cctctttyct tcgggacttt ta 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
accacatcac tgaytgttcg ta 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
aagacgtgca agcgagtcc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
gagcgaagat aagcagcgta a 21

Claims (9)

1.一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括SEQ ID NO:1所示的FCoV-F、SEQ ID NO:2所示的FCoV-R、SEQ ID NO:3所示的FeAstV-F、SEQ ID NO:4所示的FeAstV-R、SEQ ID NO:5所示的FeKoV-F、SEQ ID NO:6所示的FeKoV-R；所述猫肠道病原体为猫冠状病毒、猫星状病毒和猫嵴病毒。
2.根据权利要求1所述的用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR引物组合物，其特征在于，还包括用于检测猫细小病毒的SEQ ID NO:7所示的FPV-F、SEQ ID NO:8所示的FPV-R。
3.权利要求1或2所述的mPCR引物组合物在制备辅助诊断猫肠道病原体感染的产品中的应用。
4.一种用于同时检测多种猫肠道病原体的mPCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的mPCR引物组合物。
5.根据权利要求4所述的mPCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物组合物的浓度为10mM。
6.根据权利要求5所述的mPCR检测试剂盒，其特征在于，还包括逆转录酶以及用于逆转录的随机引物。
7.根据权利要求6所述的mPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的mPCR反应体系为：10μL Mix，0.31μL FCoV-F，0.31μL FCoV-R，0.19μL FeAstV-F，0.19μL FeAstV-R，0.5μLFeKoV-F，0.5μL FeKoV-R，1μL DNA/cDNA模板，7.0μL ddH2O，反应体系总体积为20μL；或者，所述试剂盒的mPCR反应体系为：10μL Mix，0.26μL FCoV-F，0.26μL FCoV-R，0.16μLFeAstV-F，0.16μL FeAstV-R，0.42μL FeKoV-F，0.42μL FeKoV-R，0.16μL FPV-F，0.16μLFPV-R，1μL DNA/cDNA模板，7.0μL ddH2O，反应体系总体积为20μL。
8.根据权利要求6所述的mPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的mPCR反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性20s，55.6℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸5min。
9.权利要求5-8任一项所述的mPCR检测试剂盒在制备辅助诊断猫肠道病原体感染的产品中的应用。
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