CN103387991A - 改进无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体筛选领域的通过改进无固定点靶物质的适配体筛选技术筛选得到青霉素类抗生素适配体及其应用。通过固定寡核苷酸文库，洗脱未固定的核酸，正向筛选时加入青霉素类抗生素的母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）与固定的核酸作用，洗脱下能与6-APA结合的核酸分子后，直接PCR扩增后用于下一轮筛选；负向筛选时加入其他抗生素，洗脱除去与青霉素类抗生素非特异性结合的核酸分子。经过多轮次的正、负筛选，得到10条与6-APA高特异性、强亲和力作用的核酸适配体，并选择其中二级结构较稳定的核酸适配体开发应用于检测6-APA的核酸适配体传感器。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体筛选领域，特别涉及利用链霉亲和素标记的琼脂糖颗粒固定寡核苷酸文库，并通过SELEX技术筛选出青霉素类抗生素适配体。
背景技术
适配体(aptamer，或核酸适配体)是一小段经过SELEX技术(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment，即指数富集配体的系统进化技术)体外筛选得到的寡核苷酸链。Aptamer一词来源于拉丁文的―aptus‖，意思为配对适应。它可以折叠成明确三维结构的、通过空间构型互补与靶分子高亲和性高特异性结合。1990年，Ellington和Szostak在《Nature》上首次报道了这种大容量随机单链寡核苷酸文库通过筛选、扩增的技术，筛选到能够特异性结合于染料小分子的RNA适配体；Tuerk和Gold在《Science》上报道了筛选出了T4DNA聚合酶；Robertson和Joyce则体外筛选出了Ⅰ型核酶，这三个课题组推动了SELEX技术的快速发展。SELEX技术的基本原理就是利用分子生物学技术，首先构建一个人工合成的单链随机寡核苷酸文库，这个文库中的每一条随机寡核苷酸，其随机区的每个核苷酸位置都存在4种可能性，如果随机区有n个核苷酸，那么随机序列的多样性就有n4种，再加上稀有碱基或人为修饰碱基，随机序列的多样性会更多。一般随机区域的长度为30个核苷酸左右，库容量便可达到1014～1015个单链寡核苷酸序列之间。文库的中间为随机序列，序列长度往往在20～40bp之间。随机序列两端是带有限制性内切酶位点的固定序列，此固定序列是多聚酶链反应及其他酶学反应相关引物的结合位点。在随机文库中，单链随机寡核苷酸不同分子有其独特一级序列，易形成多种三维空间立体结构，几乎能与自然界所有存在的种类分子作用。用它与靶物质混合,混合液中存在靶物质—核酸的复合物，洗掉未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子,以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的DNA或RNA分子被洗去，而与靶物质高有亲和力的DNA分子或RNA分子从中被分离出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，经数十轮后克隆测序后筛选得到适配体。
SELEX过程中的关键步骤是将未结合的核酸与能与靶物质结合的核酸分开。大多数研究者选择将靶物质固定，当单链寡核苷酸库与靶物质混合，能与靶物质结合的核酸分子随着靶物质一起留在固定介质上后，洗去不能结合的核酸。通过固定靶物质的方法，人们运用SELEX技术已成功筛选到包括有机染料、药物、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、氨基类似物、核苷酸和多肽等物质的适配体，青霉素类抗生素适配体的筛选少见报道。但运用该方法的前提是靶物质有固定点，而有些靶物质由于分子量过小等原因无法进行固定，因此开发一种无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体的筛选方法是十分有必要的。
经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103114147A，公开日2013-05-22，公开了一种分析化学核酸适配体筛选技术领域的无固定点靶物质的适配体筛选方法，该技术通过构建随机寡核苷酸文库以及用于PCR扩增的上游引物和下游引物和固定寡核苷酸文库引物，并利用链霉亲和素标记的琼脂糖颗粒固定寡核苷酸文库，最终通过SELEX方法筛选得到可用于克隆测序的PCR产物，经测序后得到与无固定点靶物质特异亲和性结合的适配体。将该方法应用于重金属镉离子适配体的筛选，得到13条能与镉离子高特异性、强亲和力作用的适配体。本发明固定效果好、适用性强且成本低，可用于无固定点靶物质的适配体筛选。但该技术在洗脱与靶物质镉离子亲和力弱的核酸后，需要在固定了镉离子的ssDNA液中加入抑制剂，以去除重金属镉离子，防止镉离子对下一部PCR扩增的干扰作用。此过程可能会造成与镉离子亲和力高的ssDNA丢失或带入其他物质。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种改进无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体及其应用，通过固定寡核苷酸文库，洗脱未固定的核酸，正向筛选时加入青霉素类抗生素的母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）与固定的核酸作用，洗脱下能与6-APA结合的核酸分子后，直接PCR扩增后用于下一轮筛选；负向筛选时加入其他抗生素，洗脱除去与青霉素类抗生素非特异性结合的核酸分子。经过多轮次的正、负筛选，得到10条与6-APA高特异性、强亲和力作用的核酸适配体。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种青霉素类抗生素适配体，该青霉素类抗生素适配体长度为68bp，序列如Seq ID No.1所示，该适配体的二级结构为茎环结构，其分子结构如下：
这些具有特征性的茎环结构能通过氢键和静电作用、堆积、疏水相互作用等发生结构上的变化形成高度结构化与青霉素类抗生素结合的位点，这也就是青霉素类抗生素适配体与青霉素类抗生素结合的结构学基础。另外青霉素类抗生素适配体结构中的茎结构能够起到稳定支持的作用。
本方法涉及上述适配体的应用，具体为用于开发青霉素类适配体传感器，该传感器由青霉素类抗生素适配体、阳离子电解质和纳米金溶液组成；在520nm和650nm处的光吸收比值与6-APA浓度成正比。
所述传感器通过将6-APA溶液依次与青霉素类抗生素适配体溶液、纳米金溶液以及阳离子电解质混合制成。
所述的6-APA溶液的浓度范围为：0.2-2μM；
所述的青霉素类抗生素适配体溶液的浓度范围为：1-20nM，优选为6nM。
所述的纳米金溶液是指：将3.5mL 1.0wt%的次氯酸加入至10.5mL 1.0%的柠檬酸酸三钠溶液中，加热搅拌30分钟后，不加热搅拌至溶液颜色由灰色变为亮红色，置成纳米粒径为15nm的纳米金溶液，保存至4℃冰箱。
所述的阳离子电解质的浓度范围为：0.084-0.158nM，优选为0.1121nM。
所述的阳离子电解质为：聚二烯丙二甲基胺（PDDA）。
所述的青霉素类适配体传感器通过以下方式实现6-APA浓度检测：
第一步、制备已知浓度的6-APA检测体系：取9支包含青霉素类抗生素的核酸适配体与纳米金混合液的PE管，在25℃条件下孵育15分钟；然后分别加入10μL不同浓度6-APA标准液，使得整个检测体系中的6-APA含量维持在0.01–5μM之间，充分混匀后再将PE管置于25℃条件下孵育15min；
第二步、另取1支包含青霉素类抗生素适配体和缓冲溶液的PE管，加入10μL超纯水，制成空白对照体系溶液；
所述的空白对照体系溶液的组分为：将6nM青霉素类抗生素适配体在超纯水中孵育15分钟后，加入100μL纳米金，再加入浓度为0.1121nM的PDDA反应5分钟。
第三步、向10支PE管中分别加入100μL纳米金溶液，充分混匀后再将PE管置于25℃条件下孵育15min；然后向上述孵育完的10支PE管中分别加入0.1121nM的PDDA，充分混匀后再将PE置于25℃条件下孵育5min。
第四步、通过拟合酶标仪测得第三步步骤后各溶液的650nm和520nm处吸光值的比值之差，并制作得到光吸收差值标准曲线用于检测6-APA浓度。
所述的光吸收差值标准曲线是指：将不同浓度6-APA作为横坐标，以检测体系以及空白对照液用酶标仪测定得到的650nm和520nm处光吸收值的比值之差为纵坐标绘制标准曲线。得到公式y=7843.9x-3.0572，R2=0.996。
所述的6-APA浓度通过以下方式实现检测：取6nM青霉素类抗生素的核酸适配体，加入200μL纳米金溶液，孵育15分钟后，加入待测样品反应15分钟，再加入0.1121nM PDDA反应5分钟后，酶标仪检测溶液650nm和520nm处吸光值的比值之差。代入标准曲线计算公式，换算出待测样品中6-APA浓度。
本发明提供的筛选方法不需要大型仪器设备，固定效果好、操作方便、适用性强且成本低，可用于无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体筛选。
本发明的原理是：体外化学合成一个单链寡核苷酸库，通过生物素与亲和素之间的作用将单链寡核苷酸固定在介质上，洗脱未固定的核苷酸，正向筛选时，加入6-APA与固定的核苷酸孵育，孵育过程中有核苷酸与6-APA发生亲和性作用，该作用足以克服生物素与亲和素之间的作用力，当分离6-APA与固定介质时，结合部分的核苷酸就随着靶物质脱离固定介质，再分离与6-APA结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮的正向筛选。通过重复的正向筛选与扩增，一些与6-APA不结合或与6-APA有低亲和力、中亲和力的核酸分子被去除。负向筛选时，在加入6-APA之前，先加入其他抗生素与固定的核酸作用，若有核酸分子随该物质从固定介质上脱离，则其为6-APA的非特异性结合核酸，也会被除去。如此经过多轮次的正、负向筛选，最终将与6-APA有高特异性、强亲和力的核苷酸分子从随机库中分离出来，该核酸分子即为6-APA的适配体。
附图说明
图1为本发明流程图。
图2为青霉素类抗生素适配体二级结构图
图3青霉素类抗生素适配体6-APA含量与吸光值关系图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例包括以下步骤：
1)构建总长度为68bp的随机寡核苷酸文库，寡核苷酸文库的序列为:5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’，其中两端为19bp的固定序列，中间30个碱基为随机序列。
2)设计三条引物，其中：P1(5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3’)和P2(5’-CGCAACGCTCGCTCATACT-3’)分别用作PCR扩增寡核苷酸的上游引物和下游引物，上游引物(5’-Biotin-CGCAACGCTCGCT CATACT-3’)用于将寡核苷酸文库固定在链霉亲和素标记的琼脂糖颗粒上。
3)取一定量的随机寡核苷酸文库，与琼脂糖颗粒固定序列按一定的比例(1:2～3)均匀混合，混合液进行退火处理，退火条件为：94℃变性60s，59℃退火60min，25℃延伸5min，降温速度为0.1℃/s。退火过程中寡核苷酸3’端的19个碱基将与P3形成配对。将退火后的混合液加入到装有表面接枝亲和素的琼脂糖的柱子中，通过生物素-亲和素作用将随机寡核苷酸库固定在琼脂糖颗粒上。用缓冲液充分洗涤，离心除去未固定的寡核苷酸和琼脂糖颗粒固定序列。
4)向上述柱子中加入200μM6-APA溶液进行正向筛选，孵育一定时间后离心，收集离心液。
5)将上述收集的离心液用作非对称PCR扩增的模板，经一定的PCR程序扩增后，收集PCR产物并纯化，用作下一轮筛选的文库。
6)按步骤3)和步骤4)做下一轮筛选，每进行一轮筛选，将步骤4)中加入的6-APA浓度降低。
7)当6-APA浓度降低至0.002μM时，按步骤3)、步骤4)、步骤5)进行负向筛选。步骤4)中加入6-APA之前，先加入其他的抗生素，孵育一定时间后离心，弃掉离心液，再向柱子中加入200μM6-APA，孵育一定时间后离心，收集离心液，用作PCR扩增寡核苷酸的模板，经一定的PCR程序扩增后，收集PCR产物并纯化，用作下一轮负向筛选的文库。
8)进行四轮负向筛选之后，将所得回收纯化的PCR产物交由专业DNA测序公司进行克隆测序。
9)克隆测序得到10条6-APA核酸适配体序列。
实施例2
如图2所示，为实施例1制备得到的适配体的具体说明。
本实施例通过克隆测序，分析制备得到的适配体的碱基组成如Seq ID No.1所示，具体为：
5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTGGCACGGGCGGGAGATAAGTTTGCTGGACCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’
本实施例利用Mfold软件进行模拟青霉素类适配体的二级结构。并通过计算，青霉素类抗生素适配体的自由能是-14.92，而A、T、C、G四种碱基分布相对均匀。T+G数量在整个碱基中比例占到了43.6%。
实施例3
如图2所示，为实施例1制备得到适配体的具体应用，即青霉素类适配体传感器，其结构及组成和制备方法为
优化体系中适配体浓度：分别加入浓度范围为1-20nM青霉素类抗生素适配体于纳米金溶液中，最后加入0.1365μM PDDA，用酶标仪测定得到的650nm和520nm处光吸收值的比值之差绘制曲线，峰值对应的青霉素类抗生素适配体浓度为6nM。
优化体系中PDDA浓度:将6nM青霉素类抗生素适配体分别与0.2、2μM6-APA溶液中孵育15分钟后，加入100μL纳米金，最后加入浓度范围为0.084-0.158nM的PDDA反应5分钟后，用酶标仪测定得到的650nm和520nm处光吸收值的比值之差绘制曲线，峰值对应的PDDA浓度为0.1121nM。
制备已知浓度的6-APA检测体系：取9支包含青霉素类抗生素的核酸适配体与纳米金混合液的PE管，在25℃条件下孵育15分钟；然后分别加入10μL不同浓度6-APA标准液，使得整个检测体系中的6-APA含量维持在0.01–5μM之间，充分混匀后再将PE管置于25℃条件下孵育15min；
另取1支包含青霉素类抗生素适配体和缓冲溶液的PE管，加入10μL超纯水，按步骤1)处理后作为空白对照体系溶液；
向10支PE管中分别加入100μL纳米金溶液，充分混匀后再将PE管置于25℃条件下孵育15min；
再向上述孵育完的10支PE管中分别加入0.1121nM的PDDA，充分混匀后再将PE置于25℃条件下孵育5min。
所述的光吸收差值标准曲线是指：以不同浓度6-APA作为横坐标，以检测体系以及空白对照液用酶标仪测定得到的650nm和520nm处光吸收值的比值之差为纵坐标绘制标准曲线。得到公式y=7843.9x-3.0572，R2=0.996。
根据通过3倍噪声比与方程斜率的比值（3σ/s）计算出体系的检出下限为21.5nM。
Claims (8)
1.一种青霉素类抗生素适配体，其特征在于，该青霉素类抗生素适配体长度为68bp，序列如Seq ID No.1所示，该适配体的二级结构为茎环结构，其分子结构如下：
2.根据权利要求1所述的适配体的应用，其特征在于，用于开发青霉素类适配体传感器，该传感器由青霉素类抗生素适配体、阳离子电解质和纳米金溶液组成；在520nm和650nm处的光吸收比值与6-APA浓度成正比。
3.根据权利要求2所述的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述传感器通过将6-APA溶液依次与青霉素类抗生素适配体溶液、纳米金溶液以及阳离子电解质混合制成；
所述的6-APA溶液的浓度范围为：0.2-2μM；
所述的青霉素类抗生素适配体溶液的浓度范围为：1-20nM；
所述的纳米金溶液是指：将3.5mL1.0wt%的次氯酸加入至10.5mL1.0%的柠檬酸三钠溶液中，加热搅拌30分钟后，不加热搅拌至溶液颜色由灰色变为亮红色，置成纳米粒径为15nm的纳米金溶液，保存至4℃冰箱；
所述的阳离子电解质的浓度范围为：0.084-0.158nM；
所述的阳离子电解质是指：聚二烯丙二甲基胺。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的青霉素类抗生素适配体溶液的浓度为6nM；所述的阳离子电解质的浓度为0.1121nM。
5.根据权利要求3所述的青霉素类适配体传感器的检测方法，其特征在于，所述方法通过以下方式实现6-APA浓度检测：
第一步、制备已知浓度的6-APA检测体系：取9支包含青霉素类抗生素的核酸适配体与纳米金混合液的PE管，在25℃条件下孵育15分钟；然后分别加入10μL不同浓度6-APA标准液，使得整个检测体系中的6-APA含量维持在0.01–5μM之间，充分混匀后再将PE管置于25℃条件下孵育15min；
第二步、另取1支包含青霉素类抗生素适配体和缓冲溶液的PE管，加入10μL超纯水，制成空白对照体系溶液；
第三步、向10支PE管中分别加入100μL纳米金溶液，充分混匀后再将PE管置于25℃条件下孵育15min；然后向上述孵育完的10支PE管中分别加入0.1121nM的PDDA，充分混匀后再将PE置于25℃条件下孵育5min。
第四步、通过拟合酶标仪测得第三步步骤后各溶液的650nm和520nm处吸光值的比值之差，并制作得到光吸收差值标准曲线用于检测6-APA浓度。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的空白对照体系溶液的组分为：将6nM青霉素类抗生素适配体在超纯水中孵育15分钟后，加入100μL纳米金，再加入浓度为0.1121nM的PDDA反应5分钟。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的光吸收差值标准曲线是指：将不同浓度6-APA作为横坐标，以检测体系以及空白对照液用酶标仪测定得到的650nm和520nm处光吸收值的比值之差为纵坐标绘制标准曲线，得到公式y=7843.9x-3.0572，R2=0.996。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的6-APA浓度通过以下方式实现检测：取6nM青霉素类抗生素的核酸适配体，加入200μL纳米金溶液，孵育15分钟后，加入待测样品反应15分钟，再加入0.1121nM PDDA反应5分钟后，酶标仪检测溶液650nm和520nm处吸光值的比值之差。代入标准曲线计算公式，换算出待测样品中6-APA浓度。
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