CN115927344A - 一种检测呋喃西林的fam荧光标记核苷酸适配体、传感器、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测呋喃西林的FAM荧光标记核苷酸适配体、传感器、试剂盒及应用。本发明通过固定的磁珠‑SELEX筛选方法，得到呋喃西林的适配体；通过对获得的适配体一级结构、二级结构分析，挑选出候选序列；通过对候选适配体的截短优化，截短的适配体亲和力提高了2.5倍，通过分子对接和分子模拟分析得到了适配体的核心识别区域，获得了NFZ的最佳适配体。本发明还提供适配体与氧化石墨烯(GO)构建得到的荧光适配体传感器，及包含此传感器的呋喃西林检测试剂盒。本发明的荧光检测试剂盒用于检测呋喃西林，灵敏度高、操作简单、特异性强、速度快、价格低廉。在呋喃西林检测中具有良好的应用前景。

Description

一种检测呋喃西林的FAM荧光标记核苷酸适配体、传感器、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术中的抗生素残留检测领域，具体涉及一种检测呋喃西林的FAM荧光标记核苷酸适配体、传感器、试剂盒及应用。

背景技术

抗生素因其具有抗菌作用，可以减缓或杀死微生物的生长，所以通常广泛用于治疗细菌或真菌性感染。呋喃西林(NFZ)是一种广泛应用的硝基呋喃类抗生素药物，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞具有杀菌作用，常用于水产养殖、畜牧业、农业和饲料添加剂。由于NFZ可以抑制乙酰辅酶A并干扰微生物糖代谢，使得NFZ基本上不可生物降解，只能在生态环境中积累。长期摄入残留NFZ的水和食物会引起过敏反应、关节痛、肿瘤、癌症和其他副作用诱发的不良反应，因此，欧盟、美国、中国和许多国家已经禁止使用该药物。目前检测NFZ的方法大多为液相色谱-串联质谱、拉曼光谱、紫外光谱法、电化学等，这些检测方法都需要昂贵的仪器和专业的技术人员操作，不够简易且耗时耗力。为了有效地监测生态水环境中NFZ可能引起的问题，有必要开发一种方便快捷、高效检测NFZ残留的方法。

适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)得到的短核苷酸序列，也称为化学抗体，单链DNA或RNA可以通过折叠形成三维结构并高亲和力的特异性结合目标分子，适配体的筛选是化学过程而非生物过程，因此避免了抗体生产过程可能发生的细菌、病毒污染情况，且批间变异率低。与传统抗体或受体蛋白相比，适配体靶标多样性、价格低廉、易于合成和修饰、稳定性高、缺乏免疫原性和无毒性，适配体目前已成功用于检测特定目标，如抗生素、毒素、蛋白质。常用技术如毛细管电泳-SELEX(CE-SELEX)、细胞-SELEX、氧化石墨烯-SELEX(GO-SELEX)、磁珠-SELEX(MB-SELEX)。

氧化石墨烯(GO)由于其具有荧光猝灭效率高、比表面积大、水散性能好、导电性能好等独特性质，使它很适合运用在生物传感器开发中。GO常用于开发基于荧光共振能量转移(FRET)的生物传感器，荧光标记的适配体在没有目标分析物存在时，静电吸附和π-π堆积相互作用，会通过FRET猝灭荧光；反之，存在目标分析物时与GO表面竞争使适配体解离，使荧光恢复。有研究表明，通过截短序列的适配体应用于适配体传感器效果更佳也更可靠。

目前尚未有筛选得到的呋喃西林适配体，并将呋喃西林适配体用于GO适配体传感器的检测报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种检测呋喃西林的FAM荧光标记核苷酸适配体，可适用于各种水环境中对呋喃西林定性或定量检测。

本发明提供的一种检测呋喃西林的FAM荧光标记核苷酸适配体，所述适配体的序列包括核苷酸序列表记载的SEQ No.1：NFZ8、SEQ No.2：NFZ24、SEQ No.3：NFZ28、SEQ No.4：NFZ34、SEQ No.5：NFZ70,或所述适配体经过修饰或改造后得到的适配体衍生物。

进一步所述适配体衍生物包括：所述适配体的截短适配体SEQ No.6：NFZ8-1、SEQNo.7：NFZ24-1、SEQ No.8：NFZ28-1、SEQ No.9：NFZ34-1或SEQ No.10：NFZ70-1。

进一步，所述检测呋喃西林的FAM荧光标记适配体序列为核苷酸序列表记载的NFZ8-1。

所述核苷酸适配体由单链DNA组成，且5’末端标记FAM荧光基团。

本发明所述检测呋喃西林的FAM荧光标记适配体制备方法，所述方法包括如下步骤：

1)通过固定的磁珠-SELEX筛选方法，得到呋喃西林的适配体；

2)通过对获得的适配体一级结构、二级结构预测，挑选亲和力高的序列；

3)通过对候选适配体序列的截短，得到了适配体的核心识别区域，进行亲和力测定获得亲和力最高的最佳适配体。

本发明还提供检测呋喃西林的基于氧化石墨烯GO的荧光适配体传感器，所述传感器组成包括：

(1)FAM荧光标记核苷酸序列表记载的SEQ No.6：NFZ8-1，得到的FAM-NFZ8-1；

(2)氧化石墨烯GO；

(3)1×结合缓冲液(20mM Tris、100mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl₂、2mM MgCl₂、pH7.5)。

本发明还提供一种用于检测呋喃西林的试剂盒，所述试剂盒包括上述基于氧化石墨烯GO的荧光适配体传感器。

上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)依据国标要求处理水样品；

2)将处理好的样品和FAM-NFZ8-1混合摇匀30分钟；

3)加入GO，继续摇晃10分钟；

4)离心之后吸取上清液并测荧光值。

本发明还提供上述检测呋喃西林的试剂盒在水环境测试样品中定量检测呋喃西林的应用。

本发明提供的呋喃西林荧光检测试剂盒，包括基于GO的荧光适配体传感器；其中荧光适配体传感器包括GO和FAM标记的适配体；所述的FAM标记的适配体的序列为核苷酸序列表记载的NFZ8、NFZ24、NFZ28、NFZ34、NFZ70、NFZ8-1、NFZ24-1、NFZ28-1、NFZ34-1、NFZ70-1其中之一。上述适配体经过修饰和改造以后得到的截短适配体也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明基于适配体构建的适配体传感器用于检测呋喃西林，灵敏度高、操作简单、选择性强、速度快、价格低廉。在呋喃西林检测中具有良好的应用前景。

2.本发明通过对磁珠-SELEX筛选得到的适配体序列进行分析并优化，得到了适配体的核心识别区域，通过体外克隆测序合成了对呋喃西林有高亲和力和特异性的适配体。

3.本发明基于呋喃西林的适配体和GO构建了荧光适配体传感器。当检测体系中有呋喃西林时，适配体特异性的结合呋喃西林，不会通过π-π堆积被GO吸附。并且呋喃西林的浓度不同，其检测到的荧光值也不一样。而当检测体系中没有呋喃西林时，荧光标记的适配体就会通过π-π堆积被GO吸附。基于这个原理，实现了呋喃西林的定量检测。

4.本发明针对传统的检测方法不能够检测大规模的样品、操作繁琐，以及免疫分析方法中的抗体制备需要长时间的动物实验，建立了基于GO的荧光传感器快速检测方法，可用于水环境中呋喃西林残留的快速和灵敏的定量检测，并且克服了上述方法的缺陷。为水环境中抗生素的检测提供了新的检测方法。

5.本发明基于GO对呋喃西林适配体进行了筛选及序列优化，构建了基于GO的荧光适配体传感器，在实际样本水产品养殖水中成功检出呋喃西林，线性关系好，在呋喃西林的检测开发产品方面奠定了基础。

附图说明

图1：本发明基于GO的荧光适配体传感器原理示意图；

图2：适配体亲和力的测定；

图3：荧光适配体传感器特异性分析；

图4：绘制的标准曲线。

具体实施方式

实施例1呋喃西林适配体检测体系的建立

1.筛选呋喃西林适配体的磁珠-SELEX过程

1)文库和引物的处理：

200μL的500nM适配体文库(5’-FAM-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3’，N为随机序列)、100μL的10μM正向引物(5’-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3’)和100μL的1μM反向引物(5’-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3’)和100μL的10μM生物素-反向引物(Biotin-5’-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3’)置于95℃金属浴中10分钟，随后置于冰上30分钟，之后取出避光放置于室温下10分钟，以使文库中大量的ssDNA折叠形成独特的结构，并储存在-20℃直至使用。

2)偶联磁珠和纯化磁珠的制备：

①偶联磁珠：100μL的10mg/mL羧基磁珠用ddH₂O洗一次后DMF清洗四次，并使用磁力架收集。磁珠与50μL的5μM HATU和22μL的3μM DIPEA在25℃下反应2小时，然后将30μL的1mg/mL呋喃西林添加到混合物中，25℃下持续振荡过夜。随后，使用结合缓冲液(100mMNaCl、2mM MgCl₂、20mM Tris-HCl、1mM CaCl₂、5mM KCl，pH 7.6)将磁珠清洗3次。所得磁珠在4℃下保存以备使用。此外，1-氨基乙内酰脲(AHD)、3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)和氨基脲(SEM)也分别使用与上述相同的程序分别偶联到磁珠上。

②纯化磁珠：为获得纯化磁珠，将PBS(pH 7.4)中的1mL的1mg/mL链霉亲和素磁珠与100μL的10μM生物素-反向引物在25℃下反应20分钟，并用PBS洗涤4次(pH 7.4)。收集的磁珠在4℃下储存在PBS(pH 7.4)中直至使用。

3)磁珠-SELEX筛选呋喃西林适配体：

取100μL的羧基磁珠，移除上清液并加入200μL的500nM适配体文库，之后在25℃孵育1小时。收集磁分离得到的上清液，并将其用作正向选择的新文库。之后取100μL呋喃西林偶联磁珠，移除上清液后加入100μL的新文库，25℃孵育2小时。呋喃西林偶联磁珠用结合缓冲液洗涤4次，所得上清液全部移除。随后，加入100μL0.05M的NaOH洗脱，并在25℃下涡旋10分钟后磁分离收集上清液，使用100μL0.05M的HCl将pH值调节至7.4。再用2×结合缓冲液(175mM NaCl、4mM MgCl₂、40mM Tris-HCl、2mM CaCl₂、10mM KCl，pH 7.6)平衡适配体所处的缓冲液体系。洗脱过程重复3次，洗脱的ssDNA文库进行PCR扩增。

4)PCR程序扩增：

将5μL的ssDNA文库、2μL的25μM正向引物、2μL的0.5μM反向引物、25μL的2×taqPCR MasterMixⅡ和16μL的ddH₂O混合，95℃变性30s，55℃退火30秒，并在72℃下延长6秒。该扩增过程重复15轮。使用与上述第3)步相同的程序纯化扩增产物并用作下一轮的适配体文库。

5)第七轮使用AHD、AOZ、SEM进行反向筛选，之后使用NFZ-磁珠继续正向筛选。紫外-可见光谱UV-VIS光谱用于在每轮筛选结束时测定适配体的核酸浓度。

6)回收率的测定：

(每轮结束纯化回收到的ssDNA浓度/每轮开始投入的ssDNA浓度)*100％。

2.克隆和测序

经过十三轮筛选，得到的产物经过PCR扩增，挑选克隆子测序。

3.适配体序列分析和优化

通过DANMAN、RNAstructure、ViennaRNA Web Services和UNAFold Web Server预测获得的适配体的二级结构；挑选出符合要求的候选序列，序列见表1。之后通过对适配体进行序列的截短，获得了候选序列新的截短适配体，序列见表2。

表1

表2

4.亲和力测定

为了评估候选适配体的亲和力，将100μL的NFZ-羧基功能化磁珠(10mg/mL)与200μL不同浓度的FAM标记适配体(即0、25、50、100、200和400nM)混合，混合物在25℃下反应2小时。随后，在80℃下向反应混合物中加入200μL洗脱缓冲液(40mM Tris-HCl、3.5M尿素、10mMEDTA、0.02％Tween 20、pH 8.0)孵育10分钟以洗脱附着的ssDNA。最后，收集来自反应混合物的上清液，并使用酶标仪的荧光计在λex＝492nm和λem＝518nm处测量其荧光强度。代表结合亲和力的K_d值使用Origin 2021软件分析并根据非线性回归方程Y＝B_max×X÷(K_d+X)计算，其中X代表适配体浓度，Y代表相对荧光强度，B_max代表最多的结合位点。如表3(图2)所示，NFZ8、NFZ8-1、NFZ24-1、NFZ28-1、NFZ34-1、NFZ70-1的亲和力分别为193.94、76.11、235.23、142.21、482.21和237.30nM。

表3

将上述适配体进行修饰和改造而得到的截短适配体等也属于本发明保护范围。

5.适配体与呋喃西林的特异性分析

为了评估适配体对呋喃西林的特异性，配制200μL反应液混合物，其中荧光标记适配体浓度为100nM,呋喃西林或其结构类似物：呋喃妥因(NFT)、呋喃唑酮(FZD)、呋喃它酮(FTD)、3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)、1-氨基-2-乙内酰脲(AHD)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、卡那霉素(KAN)、土霉素(OTC)。荧光强度的相对比率与亲和力测定方法相同的程序来测定。用荧光强度相对比来评价适配体的特异性，公式为荧光强度相对比＝(测得其他抗生素荧光强度/测得呋喃西林荧光强度)×100％。如图3所示，其他抗生素和呋喃西林结构类似物的相对荧光强度小于25％。这些结果表明NFZ8-1对呋喃西林具有较高的特异性。

实施例2基于氧化石墨烯GO的荧光传感器检测呋喃西林

1.氧化石墨烯生物传感器开发

基于非固定化氧化石墨烯的适配体传感器示意图如图1所示。针对ssDNA/GO比例优化(1:60、1:80、1:100、1:120,1:140,1:160),孵育时间优化(0,5,10,15,20min)。在25℃下孵育200μL的FAM标记的适体200nM和1μL不同浓度的NFZ(0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320ng/mL)震荡孵育2小时。然后加入16μL ssDNA/GO(1:160)最佳GO值，避光孵育10min，13000rpm离心5min，收集上清液，用酶标仪测量上清液的荧光强度。

2.标准曲线的建立

氧化石墨烯的荧光传感器标准曲线如图4所示，使用已知浓度范围为0.3125至320ng/mL的NFZ标准构建。检测限(LOD)由LOD＝3SD/斜率计算，其中SD是空白样品荧光强度的标准偏差，斜率是线性回归响应曲线的斜率。

实施例3实际样本中呋喃西林的测定

使用养殖水生鱼类的水样品对适配体传感器进行了验证，10mL水产养殖水在4℃下，以13000rpm的速度离心10分钟，然后用0.22μm滤膜过滤。适配体传感器的准确度和精密度分别用回收率和变异系数表示。养殖水样品中加入已知浓度的呋喃西林(50、100、150μg/mL)。平均回收率通过以下等式计算：(测量浓度/加标浓度)×100％。变异系数是通过分析上述添加了三个不同水平的呋喃西林的样品来确定的。变异系数的计算公式：变异系数CV＝(标准偏差/平均值)×100％。每个浓度水平测试五次，计算了适配体传感器在加标样品中呋喃西林检测方面的相关性。

如表4所示，样品的回收率在96.7％到113.6％之间，变异系数在3.8％到11.2％之间。结果表明所提出的适体传感器用于检测呋喃西林的可靠性。

实施例4本发明提供的用于检测呋喃西林的试剂盒：

试剂盒的组成包括：

(1)100nM FAM荧光标记核苷酸序列表记载的FAM-NFZ8-1；

(2)2mg/mL GO；

(3)结合缓冲溶液(100mM NaCl,2mM MgCl2,20mM Tris-HCl,1mM CaCl₂,5mM KCl,and 0.02％Tween 20,pH 7.5)；

按照如下步骤进行检测：

1)依据要求处理水环境样品；

2)将处理好的样品溶解于结合缓冲液中，稀释10倍。加入100nM FAM-NFZ8-1混合摇匀30分钟；

3)加入16μL 2mg/mL的GO，继续摇晃10分钟；

4)离心吸取上清液并测荧光值。

具体检查过程与实施例2相同。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种检测呋喃西林的FAM荧光标记核苷酸适配体，其特征在于：所述适配体的序列包括核苷酸序列表记载的SEQ No.1：NFZ8、SEQ No.2：NFZ24、SEQ No.3：NFZ28、SEQ No.4：NFZ34、SEQ No.5：NFZ70,或所述适配体经过修饰或改造后得到的适配体衍生物。

2.根据权利要求1检测呋喃西林的FAM荧光标记适配体，其特征在于：所述适配体衍生物包括：所述适配体的截短适配体SEQ No.6：NFZ8-1、SEQ No.7：NFZ24-1、SEQ No.8：NFZ28-1、SEQ No.9：NFZ34-1或SEQ No.10：NFZ70-1。

3.根据权利要求1检测呋喃西林的FAM荧光标记适配体，其特征在于：所述核苷酸适配体由单链DNA组成，且5’末端标记FAM荧光基团。

4.根据权利要求2所述检测呋喃西林的FAM荧光标记适配体制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)通过固定的磁珠-SELEX筛选方法，得到呋喃西林的核酸适配体；

2)通过对获得的适配体一级结构、二级结构预测，挑选出亲和力高的候选序列；

3)通过对候选适配体序列的截短，得到了适配体的核心识别区域，进行亲和力测定获得亲和力最高的最佳适配体。

5.基于氧化石墨烯GO的荧光适配体传感器，其特征在于，所述传感器组成包括：

(1)FAM荧光标记核苷酸序列表记载的SEQ No.6：NFZ8-1，得到的FAM-NFZ8-1；

(2)氧化石墨烯GO；

(3)结合缓冲溶液。

6.一种用于检测呋喃西林的试剂盒，其特征在于：包括权利要求4所述基于氧化石墨烯GO的荧光适配体传感器。

7.权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)依据要求处理各实际样品；

2)将处理好的样品和FAM-NFZ8-1混合摇匀30分钟；

3)加入氧化石墨烯GO，继续摇晃10分钟；

4)离心后吸取上清液并测荧光值。

8.权利要求6所述检测呋喃西林的试剂盒在水产品养殖水测试样品中定量检测呋喃西林的应用。

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