TWI484037B - 乙基化胸腺嘧啶dna加成產物之偵測方法 - Google Patents

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Description

乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之偵測方法
本發明是有關於一種DNA加成產物之偵測方法，特別是有關於一種乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之偵測方法。
人類經常暴露於各種會改變DNA結構之化學物中，形成過多的DNA加成產物(DNA adducts)，並且當這些DNA加成產物未能有效地修復(repair)時，便會造成突變或是癌症的發生。在組織中之DNA加成產物量，反映了當受到化學傷害時，組織中的加成產物生成及修復能力之間的平衡。由於DNA加成產物參與在癌症發生(carcinogenesis)的起始期(initiation stage)，因此DNA加成產物已被用以作為評估暴露於致癌物(carcinogens)及癌症風險評估(cancer risk assessment)的生物標記(biomarkers)[1]。
烷化劑(alkylating agents)經常在環境中被發現。例如，香菸的煙中含有多環芳香烴化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)及菸草相關之亞硝胺(nitrosamines)，皆在細胞色素P450酵素(cytochrome P450 enzymes)代謝後，即成為潛在的烷化劑[2,3]。直接作用之非大量的烷化劑(non-bulky alkylating agents)通常也出現於香菸的煙中。而甲基化(methylated)及乙 基化(ethylated)之DNA加成產物也已於人類組織及尿液中被發現[4-13]。不同於甲基化DNA加成產物，已在一些研究中發現乙基化DNA加成產物的量在吸菸者中是高於非吸菸者[5,6,9-13]。DNA的乙基化可發生在磷酸骨架上[14,15]，也可發生在鹼基上，例如腺嘌呤(adenine)之N 3、鳥糞嘌呤(guanine)之O 6與N 7以及胸腺嘧啶(thymidine)之O 2、O 4、與N 3(第1圖)等位置都有乙基加成的文獻報導[8-13,16]。在乙基化DNA加成產物中，O 6-乙基化鳥糞嘌呤(O 6-ethylguanine)及O 4-乙基化胸腺嘧啶(O 4-ethylthymidine，O 4-edT)會造成編碼錯誤的病變(miscoding lesions)，並且於動物模式的研究中發現其與癌症形成相關[17,18]。此外，O 6-乙基化鳥糞嘌呤可被有效的修復，而O 2-乙基化胸腺嘧啶(O 2-ethyithymidine，O 2-edT)或O 4-edT則否[18-22]。O 2-edT及O 4-edT二者皆可於生物體內累積，成為持續性的DNA病變[18-20]。3-乙基化腺嘌呤(3-ethyladenine)及N 7-乙基化鳥糞嘌呤(N 7-ethylguanine)皆可發生自發性的去嘌呤作用(depurination)，並且已可於吸菸者的尿液中偵測到[9-11]。
吸菸者尿液中3-乙基化腺嘌呤的量較非吸菸者高[9,10]。相似地，吸菸者尿液及肝臟中N 7-乙基化鳥糞嘌呤的量也較非吸菸者高[11,12]。而在肺癌病人的肺臟DNA中之O 4-edT的量與PAH-DNA加成產物的量之間具有正相關性，這就表示這二個DNA加成產物皆係由香菸的煙作為主要之暴露來源而形成[5]。更進一步，有研究 指出相對於非吸菸者，吸菸者之血紅素(hemoglobin)N-端之N-乙基化纈胺酸(N-ethylvaline)的量有顯著上升的情形[23]。由以上之這些結果，可推論這些乙基化DNA加成產物可能是由於香菸的煙中的乙基化劑(ethylating agents)而產生。
評估乙基化DNA加成產物在癌症發生的過程中所扮演的角色，需要一個高靈敏度(sensitive)、專一性(specific)、定性(qualitative)以及定量(quantitative)的方法，以分析活體內(in vivo)之乙基化DNA加成產物。過去之研究係藉由氣相層析儀搭配電子衝擊游離化質譜儀(gas chromatography with electron impact ionization mass spectrometry，GC-EI/MS)分析尿液中之3-乙基化腺嘌呤[8-10]。然而，分析人類尿液及肝臟檢體中之N 7-乙基化鳥糞嘌呤，則是藉由液相層析儀搭配電噴灑離子化串聯式質譜法(liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry，LC-ESI/MS/MS)進行分析[11,12]。
在一個複雜的基質(matrix)中，要準確的定量微量的分析物(analyte)，通常需要一個適當的內部標準品。然而，由於與分析物結構相同之同位素體(isotopomer)在質譜儀中所預期之物理及化學性質與待分析物相同，故可作為一個理想的內部標準品。標定穩定同位素之內部標準品(stable isotope-labeled internal standard)也可作為載體(carrier)，用以攜帶微量的分析物經過檢體處理步驟。標定同位素之標準品也可用來標定分析物在層 析圖中的訊號位置，根據幾乎相同的滯留時間(retention times)，於複雜的層析圖中藉由同位素內標準品找出待分析物之波峰。
至今，尚未有質譜儀為主之方法，可用以分析乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物。而目前研究已於健康人之肝臟[4]、癌症病人之肺組織[5]、來自下呼吸道之細胞[6]、以及吸菸者之肺組織中偵測並定量可誘使突變之O 4-edT[13]。然而，並未利用於健康人之白血球細胞偵測O 4-edT。在這些研究中，O 4-edT的偵測是利用磷32同位素後標誌法(32P-postlabeling techniques)。不同於穩定同位素稀釋質譜法，在磷32同位素後標誌法中所使用之內部標準品[5,6,13]，不論是在結構上，或是在所使用之高效能液相層析法(high-performance liquid chromatography，HPLC)及薄膜層析法(thin layer chromatography，TLC)中的滯留時間皆與待分析物不同。
綜上所述，傳統之偵測DNA加成產物的方法具有需大量檢體、無法由層析圖上簡單找出分析物之分布位置及無法同時檢測多種加成產物而浪費人力、耗材及檢驗時間、及靈敏度不足等缺點，故本發明之發明人思索並設計一種乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之偵測方法，以期針對現有技術之缺失加以改善，進而增進產業上之實施利用。
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有鑑於上述習知技藝之問題，本發明之其中一目的就是在提供一種乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之偵測方法，以解決傳統偵測方法需要大量檢體、無法由層析圖上簡單找出待分析物之分布位置及無法同時檢測多種加成產物而浪費人力、耗材及檢驗時間、及靈敏度不足等缺點。
根據本發明之另一目的，提出一種乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之偵測方法，其步驟包含：提供白血球DNA；將至少一已標記同位素之內部標準品及複數個酵素加入白血球DNA中，使白血球DNA水解為複數個核苷(nucleoside)；利用固相萃取管萃取核苷；以及利用同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法(nanoflow LC-NSI/MS/MS)偵測並定量萃取後之核苷中之至少一乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物。
較佳地，至少一乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物可包括O 2-乙基化胸腺嘧啶(O 2-edT)、N 3-乙基化胸腺嘧啶(N 3-edT)、以及O 4-乙基化胸腺嘧啶(O 4-edT)。
較佳地，O 2-乙基化胸腺嘧啶、N 3-乙基化胸腺嘧啶及O 4-乙基化胸腺嘧啶之一偵測極限分別為5.0毫微微克、10毫微微克以及10毫微微克。
較佳地，O 2-乙基化胸腺嘧啶、N 3-乙基化胸腺嘧啶及O 4-乙基化胸腺嘧啶之一定量極限分別為50毫微微克、100毫微微克以及100毫微微克。
較佳地，至少一已標記同位素之內部標準品可包括[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT。
較佳地，酵素可包括去氧核糖核酸水解酶1(DNase 1)、磷酸二酯酶I(phosphodiesterase I)、以及鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)。
較佳地，白血球DNA可至少為50微克。
較佳地，同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法之噴灑電壓可為1.3至2.0千伏(kV)。
較佳地，同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法之來源溫度可為200至300℃。
較佳地，同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法更包含碰撞能，碰撞能係為5至40伏(V)。
較佳地，同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法之分析模式係為高選擇性反應監測模式(H-SRM)。
承上所述，依本發明之血液中乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之偵測方法，其可具有一或多個下述優點：
(1)本發明之偵測方法以低侵入式方法取得檢體，故檢體取得容易。
(2)本發明之偵測方法可同時偵測多種乙基化胸 腺嘧啶DNA加成產物，減少檢驗時間、減少操作人力的消耗並減少耗材的浪費。
(3)本發明之偵測方法為高靈敏度，僅需少量檢體即能完成測定。
為利 鈞審瞭解本發明之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效，茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下，而其中所使用之圖式，其主旨僅為示意及輔助說明書之用，故不應就所附之圖式解讀、侷限本發明於實際實施上的權利範圍，合先敘明。
本發明之乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之偵測方法，係為一種高靈敏度之定量方法，可利用白血球DNA作為檢體，藉由穩定同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法(stable isotope dilution nanoflow liquid chromatography-nanospray ionization tandem mass spectrometry，nanoflow LC-NSI/MS/MS)，於高選擇性反應監測模式下(highly selected reaction monitoring mode，H-SRM mode)，偵測並定量一種以上之乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物，其中乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物包含O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT。以實施例對本發明說明如下。
請參閱第1圖，其係為本發明之偵測方法所偵測之乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之結構圖。如圖所示，本 發明之偵測方法所偵測之乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物為在胸腺嘧啶之O 2、N 3、以及O 4的位置上加上一個乙基。
請參閱第2圖，其係為本發明之一實施例之步驟流程圖，S11：提供白血球DNA；S12：將至少一已標記同位素之內部標準品及複數個酵素加入白血球DNA中，使白血球DNA水解為複數個核苷(nucleoside)；S13：利用固相萃取管萃取核苷；以及S14：利用同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法(nanoflow LC-NSI/MS/MS)偵測並定量萃取後之核苷中之至少一乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物。
實驗方法： 高效能液相層析法之實驗條件(HPLC-UVConditions)
HPLC-UV系統由具有光電二極體矩陣偵測器(photodiode array detector，L-7450A)、D-7000介面(D-7000 interface，Hitachi,Tokyo,Japan)、樣品注入器(Rheodyne injector)、以及逆相C18管柱(reversed phase C18 column，Gemini C18(2)，4.6mm×250mm，5μm，100Å，Phenomenex,Torrance,CA)的Hitachi L-7000泵系統(pump system)所組成。自0至30分鐘，以線性濃度梯度0至100%之甲醇水溶液(aqueous methanol)，以1.0mL/min之流速進行沖出(elute)。其中，在利用 100%之去離子水清洗與平衡之前，將甲醇之濃度維持於100%10分鐘。
核磁共振光譜法(NMR Spectrometer)
藉由核磁共振光譜儀(Varian-Unity INOVA-500MHz NMR spectrometer)紀錄1H及13C之核磁共振光譜(NMR spectra)。化學移動係以四甲基矽烷(tetramethylsilane)作為內部標準品，以百萬分之一(ppm)呈現。
合成O 2 -edT、N 3 -edT及O 4 -edT標準品
將N-乙基-N-亞硝基尿素(N-ethyl-N-nitrosourea，150mg，1.28mmol)溶於1.0mL之氫氧化鉀水溶液(KOH，40%)及1.5mL之二乙醚(diethyl ether)中，於0℃劇烈攪拌20分鐘，以產生重氮乙烷(diazoethane)。溶液之上層加入溶於0.7mL甲醇(methanol)中之2’-去氧胸腺嘧啶(2’-deoxythymidine，1.0mg，4.13nmol)，並且於室溫下攪拌1小時。將此混合物利用HPLC-UV進行分析，並且自15至16.5分鐘收集O 2-edT、自17至18.5分鐘收集N 3-edT、以及自19至20.5分鐘收集O 4-edT，並將所收集之部分進行乾燥。
合成[ 13 C 10 , 15 N 2 ]O 2 -edT、[ 13 C 10 , 15 N 2 ]N 3 -edT及 [ 13 C 10 , 15 N 2 ]O 4 -edT標準品
此步驟與上述之合成O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT之方法相同。[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT之ESI-MS光譜圖顯示了m/z 283([M+H]+)。[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT之碰撞誘導游離質量光譜圖(Collision-induced dissociation mass spectra)於10eV時顯示m/z 162([M+H-dR]+)，於25eV則顯示m/z 134([M+H-dR-C2H4]+)。
自血液中萃取DNA(Extraction of DNA from Blood)
利用10%(v/v)之抗血凝固枸櫞酸鹽葡萄糖(citrate-dextrose solution，ACD)作為抗凝劑，抽取人類血液並儲存於4℃。取1.1毫升之血液/抗凝劑混合物，利用血液DNA萃取套組(Blood Genimic Midi kit,Viogen,Sunnyvale,CA)，根據操作手冊所述之步驟萃取血液之DNA。利用分光光度計(NanoDrop 1000 photometer；J&H Technology Co.,Ltd.，Wilmington，DE)將萃取之血液DNA定量。而血液DNA的純度則利用A260/A280吸光度比值進行檢查，比值需介於1.8至2.0才可進行後續實驗。
碘乙烷處理之小牛胸腺DNA(Iodoethane-Treated Calf Thymus DNA)
在含有去離子水(583μL)及小牛胸腺DNA(1.0mg)的溶液中，加入含有碘乙烷(20μL，0.25mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(N,N-dimethylformamide，DMF，50μL)，並將此混合物於58℃劇烈攪拌12小時後，且將pH值調整為pH 7.0。接著將此溶液依序利用二氯甲烷(dichloromethane，10mL)及己烷(hexane，10mL)進行萃取，以移除溶液中之碘乙烷。
酵素水解DNA(Enzyme hydrolysis of DNA)
將上述之DNA溶液各加入100pg之[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT作為內部標準品，並進行酵素水解。將DNA(50μg)、內部標準品、10.2單位之去氧核糖核酸水解酶1(DNase 1)、10mM檸檬酸鈉(sodium citrate，pH 6.5)、以及10mM氯化鎂(MgCl2)混合，並於37℃中靜置1小時。加入預先混合於三羥甲基氨基甲烷緩衝液(Tris buffer；pH 8.0)的0.0016單位之磷酸二脂酶I(phosphodiesterase I)及0.03單位之鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)，並於37℃中靜置18小時。
加成產物濃縮(Adduct Enrichment)
本發明之一實施例中，將水解產物藉由0.22微米的尼龍注射器濾膜(Nylon syringe filter)過濾，接著於固相萃取管柱(solid-phase extraction column(SPE)；Bond Elut Bonded phase C18-OH,nonend-capped,500mg,3mL,Varian；Harbor City，CA)經過各15mL之甲醇及水進行清洗與平衡後，利用此固相萃取管柱純化複數個以核苷形式存在的DNA加成產物。接著，將固相萃取管柱依序以12毫升的水及3毫升的含甲醇之水溶液(15%)清洗後，加入3毫升的甲醇水溶液(40%)以收集水解產物。將水解產物乾燥並重新溶於10微升之醋酸(acetic acid，0.1%，pH 3.2)後，利用0.22微米的尼龍注射器濾膜(Nylon syringe filter)再次過濾。最後，取2微升之處理後檢體進行下列所述之同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法分析。
奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法(Nanoflow LC-NSI/MS/MS Analysis)
本發明之一實施例中，將一個2μL之注射環(injection loop)連接至一個液相層析系統之6埠切換閥(6-port switching valve)，其中，液相層析系統由奈升液相層析系統(UltiMate 3000 Nano LC system；Dionex，Amsterdam，Netherlands)及內部充填之逆相管柱(reversed phase column；75μm×11cm，5μm；MAGIC C18AQ，200Å，5μm；Michrom BioResource，Auburn，CA)所組成。泵輸出(pump out；30μL/min)於注射埠前被分割為流速300nL/min。移動相A係為0.1%之醋酸(pH 3.2)，而移動相B係為含有0.1%醋酸的乙精 (acetonitrile)。沖出以0至30分鐘內，由10%之移動相B至100%之移動相B的線性梯度開始，並接著維持10分鐘於100%之移動相B。流出液(effluent)係藉由具有奈噴灑離子化介面(nanospray ionization interface)之三段式四極柱質譜儀(triple quadrupole mass spectrometer；TSQ Quantum Ultra EMR mass spectrometer；Thermo Electron Corp.，San Jose，CA)，於奈電噴灑離子化串聯式質譜儀之正離子模式(positive-ion mode)下進行分析。噴灑可藉由內建之電荷耦合裝置相機(CCD camera)監控著。噴灑之電壓可為1.3至2.0千伏(kV)，較佳為1.5至1.8千伏；且來源溫度可為200至300℃，較佳為230至270℃。氬氣於質譜儀實驗中被用作碰撞氣體(collision gas)，碰撞氣體之壓力為1.5mTorr，且碰撞能為5至40V，較佳為10至30V。於本實施例中，噴灑之電壓為1.5千伏、來源溫度為270℃以及碰撞能為10V，此實驗條件僅為舉例，並不以此為限。
藉由穩定同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑串聯式質譜法分析加成產物濃縮後之檢體，利用高選擇性反應監測(highly selective reaction monitoring；H-SRM)模式進行分析，其中Q1與Q3的質量寬(mass width)分別為m/z 0.2及m/z 0.7，以及延遲時間(dwell time)為0.1秒。由第一四極柱(Q1)篩選出游離之母離子(parent ion)[M+H]+，並於碰撞室(collision cell；Q2)中經碰撞解離而產生子離子(product ion)，子離子於第三四極柱(Q3)中，進一步進行篩選出特定之子離子分 析。二種高選擇性反應監測方法被應用於此：方法1利用10V之碰撞能分別在Q1中於m/z 271.1處監測O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT，以及在Q3中於m/z 155.1處監測子離子(daughter ions)[M+H-116]+([M+H-dR]+)。而[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT則利用10V之碰撞能，分別在Q1之m/z 283.1處及Q3之m/z 162.1處監測。方法2利用25V之碰撞能分別在Q1中於m/z 271.1處監測O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT，以及在Q3中於m/z 127.1處監測子離子[M+H-144]+([M+H-dR-C2H4]+)。而[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT則利用25V之碰撞能，分別在Q1之m/z 283.1處及Q3之m/z 134.1處監測。
校正曲線(Calibration Curves)
分別製備含有各100pg之[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT，以及不同量之O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、10以及50pg)的溶液。將各個檢體分別通過上述之固相萃取管柱。接著將含有上述加成產物的部分進行乾燥，並回溶於0.1%之醋酸(pH 3.2)中，最後取2μL處理後之檢體，利用上述之奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法進行分析。
研究對象
本發明之乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之偵測方法所用之研究對象係為健康成人，來自國立中正大學之教職員，其中包含20個男性吸菸者及20個非吸菸者(14個男性及6位女性)。吸菸者之平均年紀為21.9±5.2(mean±SD)歲，而非吸菸者為25.3±6.5歲。
統計分析
利用GraphPad InStat版本3.00(GraphPad Software，San Diego，CA)進行統計分析。使用無母數曼-惠特尼試驗(nonparametric Mann-Whitney test)對20個吸菸者與20個非吸菸者之間之人類白血球DNA檢體中O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT的差異進行分析，並且同時分析吸菸者中各個乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物與吸菸指數(smoking index，number of cigarette per day×years smoked)之間的關係。40個檢體中之任意二個加成產物含量之間的相關係數係利用直線回歸(linear correlation)進行計算。
結果與討論： 標準品之合成及特性
標準品O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT係由2’去氧胸腺嘧啶與重氮乙烷反應後生成。其中，重氮乙烷可合成自 於鹼性環境下反應之N-乙基-N-亞硝基尿素。請參見第3A至3D圖，其係為本發明之一實施例中利用HPLC分析乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之層析圖。如圖所示，所測定之三種乙基化位向異構物(regioisomers)具有明顯不同之UV光譜(第3B至3D圖)及滯留時間(第3A圖)。
方法之發展
請參見第2圖，其係為本發明之一實施例之步驟流程圖。如圖所示，本發明之整個實驗方法包括：(1)加入內部標準品[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT至DNA；(2)酵素水解；(3)藉由逆相固相萃取管柱濃縮DNA加成產物，以及(4)於高選擇性反應監測(highly selective reaction monitoring；H-SRM)模式下，利用奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法進行分析。
方法之效能及驗證
本發明中之高靈敏度的奈升液相層析系統連結至三段式四極柱質譜儀，並於高選擇性反應監測模式下進行監測，其中第一四極柱及第三四極柱皆於靜態模式(static mode)下分別監測具有特定m/z值之母離子及子離子。由於本發明所述之奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法具有高靈敏度，因此在定量DNA檢 體中極微量之加成產物時，可減少所需之DNA檢體量。奈升液相層析系統與奈電噴灑離子化串聯式質譜儀之組合，是最靈敏的設置。為了增加本發明之偵測方法之專一性，故使用具較窄監測視野(0.2Da)之高選擇性反應監測模式監測母離子。如此一來，較少之離子可被允許通過第一四極柱，因而降低了背景值，這樣的方法特別適用於分析複雜之混合物。本發明所述之偵測方法之準確度(accuracy)、精密度(precision)及再現性(reproducibility)，皆藉由於實驗開始時在檢體中加入待測物之同位素體作為內部標準品而被監控。本發明中利用二種高選擇性反應監測模式之轉換進行監測。也就是說，在第三四極柱監測母離子[M+H]+(m/z 271.1)轉換為子離子[M+H-116]+([M+H-dR]+)(m/z 155.1，方法1)；以及轉換為子離子[M+H-144]+([M+H-dR-C2H4]+)(m/z 127.1，方法2)。由於利用方法1所得到之加成產物的信號強度為利用方法2所得到之信號強度的3倍，所以在本發明中利用方法1對所述之乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物進行定量。
由管柱注射(on-column)之O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT的偵測極限分別為5.0fg(18.5amol)、10fg(37amol)、以及10fg(37amol)。藉由混合各100pg之[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT，並加入不等量之O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT加成產物標準品，接著經過固相萃取濃縮的步驟及藉由奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法 分析，而得到校正曲線。於一實施例中，本發明之偵測方法之定量極限定義為具有線性之校正曲線中可測得之最低量待測物，而O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT之偵測極限分別為50、100以及100fg。也就是說，在每109個(50μg)正常之核苷酸中，可分別偵測到1.2、2.3以及2.3個O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT。這也就表示，當每mL血液可萃取25至35μg DNA時，需要1.5至2mL之血液以進行實驗。由於奈升液相層析系統最大注入體積為2μL，故加入10μL之溶劑回溶經濃縮之檢體。由於只有五分之一經濃縮之檢體的回溶溶液注入奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜儀中進行分析，所以本發明之偵測方法之定量極限至少為管柱注射之偵測極限之5倍。
請參照第4A及4B圖，其係為本發明之一實施例中定量乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之校正曲線圖。如圖所示，本發明之校正曲線具有良好之線性，在所測量之3種DNA加成產物中，自定量極限至50pg之偵測範圍裡，相關係數(correlation coefficient，R 2 )為1.0000(第4A圖)。在定量極限至1.0pg之範圍內，O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT之相關係數分別為0.9989、0.9985、以及0.9978(第4B圖)。此外，當檢體中只含有同位素時，偵測不到DNA加成產物，故校正曲線通過原點。
請參照第5A至5C圖，其係為本發明之一實施例中定量乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物準確度之示意圖。如圖所示，藉由分別加入已知量之O 2-edT(3.0、6.0、以 及15pg，第5A圖)、N 3-edT(35、70、以及175pg，第5B圖)及O 4-edT(3.0、6.0、以及15pg，第5C圖)至經碘乙烷處理之小牛胸腺DNA(10μg)與未處理之小牛胸腺DNA(40μg)並進行分析，以驗證本發明之偵測方法之準確度。如圖所示，以線性迴歸分析(linear regression)得到O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT之y截距分別為2.15、28.84、以及3.42pg，且具有高相關係數。這樣的量相當接近於未添加標準品之50μg經碘乙烷處理之小牛胸腺DNA中所分別測得之O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT濃度2.22、29.9、以及3.27pg，也就是說，每108個正常核苷酸中，偵測到5.2、70.5、以及7.7個DNA加成產物。
藉由三重複分析經碘乙烷處理之小牛胸腺DNA(5倍稀釋，總量50μg)中之O 2-edT、N 3-edT及O 4-edT，且以最佳化之實驗步驟連續分析3天，以評估本發明之偵測方法之精密度。如表1所示，不管是在同一天中(intraday)或是不同天(interday)之重複分析，其相對標準差都落於10%以內，這就表示本發明之偵測方法之再現性高。
分析人類白血球DNA
將分離自人類血液之白血球中的DNA加成產物進行定量，是一種低侵入性之生物標記，可反應身體中DNA傷害(DNA damage)的程度。由於血液中之DNA加成產物含量較身體中其他組織來得低，因此需要一個高靈敏度及專一性的檢測方法，作為評估組織中DNA傷害程度之替代品(surrogate)。
請參照第6A及6B圖，其係為本發明之一實施例中之高選擇性反應監測模式下O 2-edT、N 3-edT、O 4-edT及其標記同位素之內部標準品之層析圖。如圖所示，這三種DNA加成產物皆可在高選擇性反應監測模式下利用方法1(第6A圖)及方法2(第6B圖)清楚偵測。雖然方法1因具有高靈敏度而可被用於DNA加成產物之定量，但可利用方法2進一步作為方法1所偵測到之DNA加成產物定性分析的證據。由50μg之白血球DNA開始，僅取出等同於10μg之DNA水解物注射至管柱，並藉由奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法進行分析。利用此方法分析而得O 2-edT、N 3-edT、以及O 4-edT的量，分別為每108個正常核苷酸中含有14.8、13.0以及30.3個。
在40個所分析之人類白血球檢體中，20個非吸菸者只有5個人可偵測到含有一種以上之乙基化胸腺嘧啶加成產物。如表2所示，其總結利用本發明之偵測方法偵測40個人類白血球檢體中O 2-edT、N 3-edT以及O 4-edT的結果。由於吸菸者與非吸菸者中之DNA加成產物含量並非呈常態分佈，故使用無母數曼-惠特尼試驗進行統計。雖然檢體數量有限，但吸菸者之白血球DNA中O 2-edT、N 3-edT以及O 4-edT的含量仍遠高於非吸菸者，p值(p values)分別為0.0004、0.0009以及0.0004。在20個吸菸者中，O 2-edT、N 3-edT以及O 4-edT的平均含量分別為每108個正常核苷酸中含有44.8±52.0、41.1±43.8以及48.3±53.9個，然而在20個非吸菸者中的平均含量分別為0.19±0.87、4.1±13.3以及1.0±2.9個。在所有檢體中，各個加成產物之相對標準差皆小於10%，這就表示本發明之偵測方法具有優異之再現性及精密度。
在之前的研究中，已藉由磷32同位素後標誌法於健康人之肝臟中偵測可致癌之O 4-edT，但其低於磷32同位素後標誌法之偵測極限[5]。然而，在人類檢體中，O 2-edT及N 3-edT卻未曾被定量過。本發明之偵測方法可對所述之三種乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物進行定量，並可在同一白血球DNA檢體中比較三種乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之含量。本發明之一實施例中所偵測之三種乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物，在40個檢體中，彼此具有顯著之統計上差異(p<0.0001)。利用線性迴歸計算，O 2-edT與O 4-edT之間、O 2-edT與N 3-edT之間以及N 3-edT與O 4-edT之間的相關係數分別為0.9896、0.9840以及0.9901。此外，吸菸者中O 2-edT的含量與其 吸菸指數呈顯著相關(γ=0.4789，p=0.0327)。其中，吸菸指數定義為一天吸的香菸數量乘以吸菸的時間(年)。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
S11-S14‧‧‧步驟
第1圖 係為本發明之偵測方法所偵測之乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之結構圖。
第2圖 係為本發明之一實施例之步驟流程圖。
第3A至3D圖 係為本發明之一實施例中利用HPLC分析乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之層析圖。
第4A及4B圖 係為本發明之一實施例中定量乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之校正曲線圖。
第5A至5C圖 係為本發明之一實施例中定量乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物準確度之示意圖。
第6A及6B圖 係為本發明之一實施例中之高選擇性反應監測模式下O 2-edT、N 3-edT、O 4-edT及其標記同位素之內部標準品之層析圖。
S11-S14‧‧‧步驟

Claims (8)

  1. 一種乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物之偵測方法，其包含：提供一白血球DNA；將至少一已標記同位素之內部標準品及複數個酵素加入該白血球DNA中，使該白血球DNA水解為複數個核苷(nucleoside)；利用一固相萃取管萃取該些核苷；以及利用一同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法(nanoflow LC-NSI/MS/MS)在一第一四極柱中於質荷比(m/z)271.1處及在一第三四極柱中於質荷比(m/z)155.1或127.1處，偵測並定量萃取後之該些核苷中之至少一乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物；其中該至少一乙基化胸腺嘧啶DNA加成產物係包括O 2-乙基化胸腺嘧啶(O 2-edT)、N 3-乙基化胸腺嘧啶(N 3-edT)以及O 4-乙基化胸腺嘧啶(O 4-edT)；其中O 2-乙基化胸腺嘧啶、N 3-乙基化胸腺嘧啶及O 4-乙基化胸腺嘧啶之一偵測極限分別為5.0毫微微克、10毫微微克以及10毫微微克。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之偵測方法，其中O 2-乙基化胸腺嘧啶、N 3-乙基化胸腺嘧啶及O 4-乙 基化胸腺嘧啶之一定量極限分別為50毫微微克、100毫微微克以及100毫微微克。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之偵測方法，其中該至少一已標記同位素之內部標準品係包括[13C10,15N2]O 2-edT、[13C10,15N2]N 3-edT及[13C10,15N2]O 4-edT。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之偵測方法，其中該些酵素係包括去氧核糖核酸水解酶1(DNase 1)、磷酸二酯酶I(phosphodiesterase I)以及鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之偵測方法，其中該同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法之一噴灑電壓係為1.3至2.0千伏(kV)。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之偵測方法，其中該同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法之一來源溫度係為200至300℃。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之偵測方法，其中該同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法更包含一碰撞能，該碰撞能係為5至40伏(V)。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之偵測方法，其中該同位素稀釋奈升流速液相層析奈電噴灑離子化串聯式質譜法之一分析模式係為高選擇性反應監 測模式(H-SRM)。
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