KR101493236B1 - 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트 및 이를 이용한 정량방법 - Google Patents

안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트 및 이를 이용한 정량방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트 및 이를 이용한 정량방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트, 정량분석용 장치 및 이를 이용한 정량방법에 관한 것이다.

Description

안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트 및 이를 이용한 정량방법{Kit for the quantitative analysis of the stable isotope labelled peptide, and method for quantitative analysis of protein using stable isotope labeling strategy}
본 발명은 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트 및 이를 이용한 정량방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트, 정량분석용 장치 및 이를 이용한 정량방법에 관한 것이다.
최근 프로테오믹스(proteomics) 연구 분야에서는 첨단화된 분석방법, 특히, 텐덤 질량분석기(tandem mass spectrometry) 기반 다양한 다차원화된 크로마토그래피(multidimensional chromatography) 기술 개발로 인하여 생체 시료들(조직, 혈청, 세포 등)에 포함된 다양한 단백질 체(proteome)에 대한 생체 내에서의 기능 및 단백질 번역 후 변형 (Post Translational Modifications, PTMs)에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
특히, 세포내 특정 단백질의 기능 규명을 통해 질병과 연관된 다양한 바이오마커 발굴연구가 활발하게 진행되고 있다. 상기 프로테오믹스 기반 단백질 체 특성 연구는 일반적으로 세포나 생체시료에서 추출한 단백질 혼합물을 효소 과정(enzyme treatment)을 통해 펩타이드화한 후, 액체크로마토그래피-텐덤질량분석기(liquid chromatography-tandem mass spectrometer, LC-MS-MS) 또는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionizationtime of flight) 등 다양한 첨단 질량분석 기술을 통해 얻은 텐덤 질량 스펙트럼(MS/MS spectrum)을 단백질 데이터베이스 알고리즘(protein database algorithm)에 적용 및 통계학적 검증과정을 통해 최종적으로 단백질 추출물에 포함된 단백질들에 대한 정성 및 정량적 분석이 이루어진다.
상기 일련의 프로테오믹스 연구를 통해 도출된 단백질들에 대한 정상과 질환, 또는 정상세포와 암세포 간의 정량적 비교를 통해 단백질 치료제 및 질병 특이적 마커 발굴에 큰 활용도를 갖고 있으며, 더 나아가 질병에 대한 조기진단으로 국민 건강증진에 큰 기여도를 갖게 되어 그 중요성이 강조되고 있다.
특히, 최근 질량분석기와 조합된 안정동위원소(stable isotope) 표식 분석법은 단백질의 절대 정량과 구조규명을 위한 방법으로 널리 응용되고 있다. 대표적으로 18O-표지 전처리법은 단백질이 포함된 18O-water 용액에 환원제(reducing agent)를 처리하여 단백질의 변성을 유도한 후, 효소를 첨가 시키게 되면 12 시간 이상의 효소처리 과정을 통해 효소에 의해 발생되는 효소 특이적 펩타이드들의 C-terminus에 존재하는 두 개의 16O 이온들이 주위에 풍부하게 존재하는 18O에 의하여 치환하는 과정을 통해 펩타이드가 16O 이온으로 표지(labeling)가 이루어지게 된다.
그러나, 상기 일련의 효소 기반 18O-표지 전처리에서는 18O-표지를 위해 사용된 효소에 대한 완벽한 비활성 또는 제거가 이루어지지 않을 경우 펩타이드의 C-terminus에 치환된 두개의 18O 이온들이 잔존하는 효소 활성에 의해 본래의 상태(16O)로 돌아오는 역치환 현상(back-exchange)이 일어나는 문제점을 가지고 있으며, 이러한 결과는 프로테오믹스 정량적 분석결과에 대한 재현성에 크게 영향을 주게 된다.
이에, 상기 효소 활성에 의한 역치환 현상을 줄이기 위하여 다양한 방법들이 시도되었다. 특히, 산 촉매를 이용한 단백질 분해방법은 포름산(formic acid)과 마이크로파(microwave irradiation)를 이용하여 아스파르트산의 N-terminus 또는 C-terminus가 가수분해 과정을 거치게 되며, 이때 생성된 펩타이드들은 일반적인 효소분해로 생성된 것과 유사하다는 특징을 가지고 있다. 상기 산-가수분해에 생성된 C-terminus에 존재하는 두 개의 16O는 18O-water와 특이적 반응에 의하여 18O는 생성된 펩타이드의 C-terminus에 도입된다. 약 산용액 하에 실온에서 10일 이상 두어야 변화가 일어나는 기존 18O-labeling 방법(Niles et al., 2009)에 비하면 많은 시간을 단축한 방법이지만 상대적으로 복잡한 과정이며, 마이크로웨이브 반응기(microwave reactor)를 사용하는 방법의 경우(Liu et al., 2010) 기계에 따른 많은 비용이 든다는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 전술한 문제점을 해결하기 위한 지속적인 연구를 진행하던 중, 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드가 기존 효소 처리과정에서 발생되는 정량분석의 낮은 재현성의 근본적으로 해결할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
Niles R et al., Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Anal. Chem. 81:2804-2809, (2009) Liu N et al., Microwave-assisted 18O-labeling of protein catalyzed by formic acid. 82:9122-9126, (2010)
본 발명의 목적은 기존 효소 처리과정에서 발생되는 낮은 재현성과 보다 정확한 정성-정량 분석결과를 제공하기 위한 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 기존 효소 처리과정에서 발생되는 낮은 재현성과 보다 정확한 정성-정량 분석결과를 제공하기 위한 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 기존 효소 처리과정에서 발생되는 낮은 재현성과 보다 정확한 정성-정량 분석결과를 제공하기 위한 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 장치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어 ‘중공사막’은 안정동위원소 표식 펩타이드만을 선택적으로 용리할 수 있는 실린더 형태의 막으로, 특정 분자량 차단(M. W. cutoff) 값을 가지며, 특정 분자량 차단 값 이하의 안정동위원소 표식된 펩타이드만을 선택적으로 용리하는 중공사막(micro hollow fiber enzymatic reactor, 이하 ‘mHFER'이라 한다.)을 말한다.
본 발명에 있어서 ‘안정동위원소’는 동위원소 가운데 방사성동위원소를 제외한 나머지 원소를 말하며, 16O, 17O, 18O, 및 2H로 구성될 수 있으며, 이러한 안정동위원소는 자연에 일정 비율로 존재하며 인체나 환경에 무해한 동위원소를 말한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
글리코실화된 단백질(glycosylated proteins)을 정제하는 중공사막(hollow fiber)을 포함하는 정제용 컬럼;
안정동위원소로 치환된 물;
완충용액; 및
효소; 를 포함하는 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 글리코실화된 단백질은 체내에 존재하는 단백질 중 많은 부분을 차지하고 있으며, 사람의 질병 또는 생물학적 기능과 밀접한 연관성을 가지고 있는 물질이다. 글리코실화된 단백질의 종류에 따라 질병을 판별할 수 있는 바이오마커가 될 수도 있으며, 잘못된 글리코실화 단백질로 선천성 질병의 원인을 파악할 수 있기 때문에 중요한 물질이라 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 키트는 원하는 단백질을 효소 가수분해 반응으로 펩타이드 단위로 절단하고, 동시에 중공사막을 통해 특정 분자량 이하의 18O 치환된 펩타이드만을 선택적으로 용리할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 중공사막은 10 kDa의 분자량 차단(M. W. cutoff) 값을 가지며, 1 내지 10 ㎕의 부피를 가지는 마이크로 중공사막(microbore hollow fiber)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 중공사막은 단백질을 분자량별로 분리하기 위한 것으로서, 이러한 목적을 위하여 사용되는 통상적인 중공사막이라면 어떠한 것을 사용하여도 무방하지만, 바람직하게는 투과한계 10 kDa, 내경 약 200 내지 600 ㎛, 외경 약 500 내지 1000 ㎛ 및 부피 1 내지 10 ㎛인 중공사막이 좋으며, 그 재질은 폴리스티렌설포네이트, 폴리비닐클로라이드, 폴리아크릴로나이트릴 또는 이들의 혼합물 등으로 이루어진 것이 좋다.
보다 상세하게는 트립신에 의해 분해된 펩타이드들이 10 kDa의 분자량 차단(M. W. cutoff) 값을 갖는 마이크로 중공사막(microbore hollow fiber) 내의 기공(pore)을 통과함으로써, 18O-치환에 사용된 효소와 10 kDa 분자량 이하의 18O 치환된 펩타이드가 자동적으로 용리되어짐으로써, 결과적으로 효소-펩타이드 반응에 의한 18O 분자의 역치환 반응을 효과적으로 제어할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 완충용액은 마이크로 중공사막에 포집된 단백질이 쉽게 변성(denaturation)이 일어날 수 있도록 해야 하며, 본 발명과 따른 단백질 변성 용매에 대한 조성은 제한되지 않으나 중탄산 암모늄(ammonium bicarbonate) 및 디티오트레이톨(Dithiothreitol, 이하 ‘DTT’라 한다.)의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소는 트립신, 키모트립신, 펩신, 프로티나제 K, 및 엔도프로테아제로 부터 선택된 어느 하나인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 안정동위원소는 16O, 17O, 18O, 및 2H로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 18O인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 안정동위원소는 단백질 효소가수분해 과정에서 효소에 의해 발생되는 펩타이드의 카르복시기 말단(carboxyl-terminus, C-terminus)에 존재하는 두 개의 16O 이온이 18O 이온으로 치환됨으로써 18O-표지(labeling)된 펩타이드들을 생성하게 되며, 상기 동위원소 치환과정을 통해 생성된 펩타이드들에 대한 질량분석 과정을 통해 정밀한 단백질의 정량분석이 가능하게 한다.
본 발명은
1) 단백질체 시료를 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 키트를 이용하여 단백질을 가수분해하는 단계; 및
2) 상기 가수분해된 단백질로부터 안정동위원소(stable isotope)로 치환된 펩타이드를 수득하여 정량분석하는 단계;
를 포함하는 안정동위원소 표식 펩타이드 정량방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 안정동위원소 표식 펩타이드 정량방법은
1-1) 단백질체 시료에 18O로 치환된 물과 완충액을 첨가하여 전처리하는 단계;
1-2) 상기 전처리된 단백질체 시료에 트립신, 키모트립신, 펩신, 프로티나제 K, 및 엔도프로테아제로 부터 선택된 어느 하나의 효소를 첨가하여 가수분해하는 단계;
2-1) 상기 가수분해된 단백질체 시료로부터 18O 치환된 펩타이드를 제조하는 단계;
2-2) 상기 제조된 18O 치환된 펩타이드를 중공사막(hollow fiber)을 이용하여 동일한 분자량으로 용리되어 정제하는 단계; 및
2-3) 상기 용리되어 정제된 18O 치환된 펩타이드를 정량분석하는 단계;를 포함 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 2-2)의 중공사막은 중공사막의 내부에는 첨가된 효소가 존재하고, 중공사막의 외부에는 10 kDa 분자량 이하의 18O 치환된 펩타이드만이 선택적으로 용리될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 정량분석은 LC/MS 질량 분석법, ESI-MS 질량 분석법, 및 LC-ESI-MS 질량분석법으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 수행되될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 정량방법은 단백질체 시료가 중공사막 내부에서 효소에 의한 분해되는 간단한 전처리 과정으로 재현성 있게 고효율의 10 kDa 분자량 이하의 18O 치환된 펩타이드만을 선택적으로 회수할 수 있고, 상기 회수된 펩타이드에 나노유속 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석법(nanoflow LC-ESI-MS-MS)을 이용하여 안정동위원소로 표식된 펩타이드를 정량적으로 분석할 수 있다.
보다 상세하게는 안정동위원소 표식 펩타이드 정량방법은 도 2 및 도 3에 도식화된 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 장치를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 장치는
효소와 단백질이 유동하는 유동라인;
상기 유동라인 상에 설치되며, 상기 효소와 단백질 상의 글리코실화된 단백질(glycosylated proteins)을 정제하는 중공사막(hollow fiber);
상기 유동라인 상의 상기 중공사막 상류단에 설치되며, 상기 효소와 단백질을 공급받아 상기 중공사막으로 공급하는 인젝터(injector);
상기 유동라인 상의 상기 인젝터 상류단에 설치되며, 상기 인젝터로 안정동위원소(stable isotope)로 치환된 물과 완충용액을 공급하는 펌프(syringe pump); 및
상기 유동라인 상의 상기 중공사막 하류단에 설치되며, 상기 정제된 단백질을 포집하여 분석하는 정량 분석장치; 를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 유동라인은 유로 튜빙으로 mHFER의 주입/배출 튜빙을 제외한 모든 연결 튜빙은 50 mm 내경과 360 mm의 외경을 갖는 모세관(capillary)을 사용하였고, 상기 연결 튜빙은 기계적 특성에 따라 자유롭게 사용할 수 있다.
본 발명의 있어서, 상기 포집되어 용리된 펩타이드의 농축 및 염제거를 위한 수단은 트랩 컬럼(trap column)을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 중공사막은 10 kDa의 분자량 차단(M. W. cutoff) 값을 가지며, 1 내지 10 ㎕의 부피를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 중공사막은 다수개로 구비되며, 상기 유동라인 상의 상기 중공사막과 분석장치 사이에는 각각의 중공사막에서 공급되는 정제된 단백질을 취합하여 분석장치로 공급하는 커넥터(connector)가 더 구비될 수 있다.
보다 상세하게는 안정동위원소 표식 펩타이드 정량방법은 주사기 안에 단백질의 변성(denaturation) 및 환원(reduction)을 위해 18O로 치환된 물(H2 18O)로 만들어진 완충용액(50 mM 중탄산 암모늄, 10 mM DDT)을 넣고, 펌프(syringe pump)에 설치하게 되며, 단백질 및 효소의 공급을 위한 인젝터(injector)는 펌프(syringe pump)와 mHFER 사이에 연결되게 된다. 효소와 단백질은 인젝터(injector)를 통하여 mHFER 내부로 주입되도록 하며, 이 때 mHFER 내부에서의 효소처리 과정을 통해 용리되는 펩타이드들은 펌프(syringe pump)에 의한 유체흐름에 의해 용리되어지며, 용리된 펩타이드들은 최종적으로 nano LC-ESI-MS-MS로 분석하게 된다. 상기 본 발명은 60℃ 온도에서 진행되며 사용되는 마이크로 중공사막의 길이는 사용하는 효소와 시료의 양에 따라 조절이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 mHFER은 상기 인젝트로부터 단백질 및 효소를 공급받아 하류단으로 주입하기 위한 주입수단;
상기 주입수단과 연결되고, 주입수단의 반대편 말단이 폐쇄되어 있는 중공사막(hollow fiber);
상기 중공사막 외부에 연결되어 있으며, 중공사막 내부에서 효소에 의해 분해(digestion)되어 중공사막을 통과한 18O 치환된 펩타이드들을 포집하는 수단; 및
상기 18O 치환된 펩타이드들의 포집수단과 연결되어 있는 포집된 18O 치환된 펩타이드 용리를 위한 배출수단; 을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 mHFER은 특정 분자량 차단(M. W. cutoff) 값을 갖는 실린더 형태의 막으로서, 단백질 및 효소의 용리를 mHFER의 기공을 통한 선택적 용리가 이루질 수 있도록 mHFER의 한쪽 끝을 에폭시(epoxy)로 막고 건조한 후 사용하였다. 건조된 mHFER은 막히지 않은 쪽으로 fused silica capillary(200 mm-i.d., 350 mm-o.d.)를 mHFER 안으로 주입시킨 다음, 서로 교접하는 부분을 1/32-in. male nut 과 MicroTight ZDV adaptor를 사용하여 모세관과 중공사막을 고정화 시킨다. 고정된 mHFER은 용리된 펩타이드들의 포집 및 용리를 위해 1/16-in. PEEK tubing container와 1/16-in. male nut를 사용하여 연결, 고정시켜 준다.
또한 중공사막의 반대편은 PEEK tubing container와 fused silica capillary( 200 mm-i.d., 350 mm-o.d.)를 사용하여 연결된다. 특이 사항으로 중공사막 배출구에 연결된 배관(tubing)은 중공사막과 연결되지 않은 형태로 구성되며, 결과적으로 중공사막을 통해 용리 후 정제된 펩타이드들은 PEEK container에 연결된 모세관 배관(capillary tubing)에 의하여 수득되어 진다.
본 발명의 일 실시예에 따른 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 장치는 단일개 또는 다수개의 mHFER를 구비할 수 있으며, 상기 각각의 mHFER를 통하여 하나 또는 다수개의 다른 독립된 효소를 처리할 수 있다. 보다 상세하게는 정상 및 환자시료에 대하여, 두 개의 주사기에 각각의 인젝터(injector)와 mHFER을 연결한 후 단일개 또는 다수개의 mHFER으로부터 공급되는 정제된 펩타이드를 y-커넥터( y-connector)를 이용하여 한 병에 취합하여 분석할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 장치가 다수개의 mHFER를 구비함으로 인해, 일반 물(H2 16O)을 사용한 결과와 18O로 치환된 물(H2 18O)을 사용하여 얻은 결과를 동시에 볼 수 있다는 장점이 있다. 따라서 한 번의 실험으로 두 가지 조건에서 얻을 수 있는 비교데이터를 확보할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 정량 분석장치는 LC/MS 질량 분석법, ESI-MS 질량 분석법, 및 LC-ESI-MS 질량분석법으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 나노유속 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석법(nanoflow LC-ESI-MS-MS)을 이용하여 펩타이드를 분리하고, 질량 스펙트럼을 단백질 데이터베이스와 비교하여 단백질 시료를 분석할 수 있다.
본 발명에 따른 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트, 정량분석용 장치 및 이를 이용한 정량방법은 조작이 간단하고 용이하며, 세척(washing) 과정 후, 재사용이 가능하다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트, 정량분석용 장치 및 이를 이용한 정량방법은 저렴한 가격으로 단시간 내에 많은 단백질을 분석할 수 있으며, 기존 단백질 정량분석에 있어 여러 단점들을 보안하였기 때문에 경제적일 뿐 아니라 효율적인 실험을 수행할 수 있어, 암이나 염증반응 등의 질병 유무를 판단할 수 있는 단백질들에 대한 재현성 있는 정량적 평가를 위해 사용될 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 중공사막(micro-hollow fiber enzymatic reactor, mHFER)의 전제적인 구성도를 보여주는 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 단일개의 중공사막(mHFER)을 구비한 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 장치를 보여주는 것이며,
도 3은 본 발명에 따른 다수개의 중공사막을 구비한 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 장치를 보여주는 것이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예로, 물(H2 16O)을 이용하는 기존 트립신 분해방법으로 수득된 펩타이드들의 LC-ESI-MS 크로마토그램을 나타낸 것이며,
도 5는 본 발명의 일 실시예로, 물(H2 16O) 대신 18O로 치환된 물(H2 18O)을 이용한 기존 트립신 분해방법으로 수득된 펩타이드들의 LC-ESI-MS 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예로, 18O로 치환된 물(H2 18O)을 이용한 기존 트립신 분해방법을 2회 반복 후, 본 발명에 따른 중공사막(mHFER)으로 정제한 펩타이드들의 LC-ESI-MS 크로마토그램을 나타낸 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예] 기존 트립신 분해방법과 mHFER를 이용한 분석 방법 비교
기존 트립신 분해(tryptic digestion)방법에 있어서, 전처리 방법은 물(H2 16O)에 50 mM 중탄산 암모늄(ammonium bicarbonate)와 10 mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol, 이하 ‘DTT’라 한다.)을 포함한 완충용액(90 ㎕)에 상기와 동일한 물(H2 16O)에 녹인 시토크롬 C(1 ㎍/㎕) 10 ㎕를 넣고, 37℃에서 2시간 반응을 시켰다. 그 후에 소화효소인 트립신(0.1 ㎍/㎕) 2 ㎕을 넣고 37℃에서 18시간 동안 반응시켰으며, 반응물(5 ㎕)은 nano LC-ESI-MS-MS에 주입하고, 트랩 컬럼(trap column)을 통과하면서 염을 제거한 후 분석하였다.
안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 중공사막(micro hollow fiber enzymatic reactor, 이하 ‘mHFER'이라 한다)를 이용한 전처리 방법은 10 kDa의 분자량 차단(M. W. cutoff) 값을 가지는 중공사막의 한쪽 끝은 에폭시를 사용하여 막고, 다른 한쪽은 모세관과 이어지도록 피팅(fitting)을 연결한 후, PEEK 재질로 된 관으로 감싸주어 용출되는 용액을 모을 수 있는 장치를 설치한다. 도 1을 참고한다.
본 발명의 mHFER를 이용한 실험에서는 상기 기존 트립신 분해방법과 동일하나 18O로 치환된 물(H2 18O)에 50 mM 중탄산 암모늄과 10 mM DDT를 혼합하여 완충용액을 제조하고, 상기 제조된 완충용액(90 ㎕)에 상기 18O로 치환된 물(H2 18O)에 녹인 시토크롬 C(1 ㎍/㎕) 10 ㎕를 넣고, 37℃에서 2시간 반응을 시켰다. 인젝트(Injector)를 이용하여 상기 반응물과 소화효소인 트립신(0.1 ㎍/㎕) 2㎕을 넣고, 37℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, 가수분해된 펩타이드를 수득하는 방법으로 실험을 진행하였다. 즉 본 발명에 따른 안정동위원소 표식 펩타이드 정량방법에 있어서 제(1) 단계만을 진행하였다.
또한, mHFER 이용에 대한 효과를 확인하기 위하여, 본 발명에 따른 안정동위원소 표식 펩타이드 정량방법에 있어서, 상기 제(1) 단계 반응과정을 한 번 더 반복한 후, mHFER를 이용하여 가수분해된 펩타이드들을 정제하는 제(2) 단계를 더 포함하여 실험을 진행하였다.
이때 도 2의 본 발명의 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 장치를 이용하여 설명하자면, 주사기 안의 용매는 18O로 치환된 물(H2 18O)에 50 mM 중탄산 암모늄과 10 mM DDT를 혼합한 완충용액을 사용하였으며, 자동주사주입기(syringe pump)를 이용하여 5 ㎕/min의 속도로 흘려주었다.
30분 동안 받은 용출액은 nano LC-ESI-MS-MS에 주입하고, 트랩 컬럼을 이용하여 염을 제거한 후 아세토니트릴의 비율을 높여주며 분석하였다.
분석은 하기 정량 분석장치 및 분석방법을 이용하였다.
LTQ Velos ion trap 질량분석기(Thermo Finnigan, San Jose, CA)와 모델 1250 capillary LC 시스템(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)을 이용한 nano LC-ESI-MS는 분석을 위해 capillary pulled tip column[17 cm×75 μm-i.d., 5 μm-100Å Magic C18AQ, Michrom Bioresources Inc. (Auburn, CA)], 트랩 컬럼(3 cm×200 μm-i.d., 5 μm-200Å Magic C18AQ)을 사용하였다. 컬럼 패킹(column packing)은 참고문헌을 참조하였다(Kang DJ, Ji ES, Moon MH, Yoo JS (2010) Lectin-based enrichment method for glycoproteomics using hollow fiber flow field-flow fractionation: Application to Streptococcus pyogenes. J. Proteome Res. 9:2855-2862.). 이동상 A는 0.1% 포름산을 함유하는 물/아세토니트릴(98/2, v/v), 이동상 B는 아세토니트릴/0.1% 포름산을 함유하는 물(95/5, v/v)을 사용하였다.
용출액을 2% 이동상 B에서 10분 동안 흘려줌으로써 분석할 시료를 트랩 컬럼에 모은 뒤 그래디언트 모드(Gradient mode)로 분리분석하였다. Ion spray voltage는 3.0 kV, collision energy는 30 kV, 모세관 온도(capillary temperature)는 300℃, 유속은 200 nL/min을 유지하였다. MS-MS scan은 각각 두드러지는 프레커스 이온(precursor ion)으로 분석하였고, 포지티브 모드(positive mode)를 사용하였다. MS-MS spectra는 Proteome Discoverer software[(Ver 1.2.0.208) Thermo-Finnigan]를 사용하여 분석하였다.
도 4에서도 확인할 수 있듯이, 기존 트립신 분해방법과 mHFER를 이용한 분석 방법을 비교한 결과, 도 4의 기존 전처리 방법의 경우 18O로 치환된 펩타이드가 형성되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
반면 도 5 및 도 6의 경우 18O 치환된 펩타이드가 다량 형성되는 것을 확인할 수 있었고 특히, 도 6의 경우 즉 mHFER를 이용하여 가수분해된 펩타이드를 정제를 통하여 펩타이드의 C말단에 위치한 2개의 16O가 18O로 표지된 펩타이드만 수득되는 것을 확인할 수 있었다. 되는 경우가 더 많은 것을 확인할 수 있다.
[ 실시예 2] 경과시간에 따른 18 O-표지 전처리방법의 안정성 시험
도 2의 본 발명의 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 장치를 이용하여, 경과시간에 따른 18O-표지 전처리 방법의 안정성을 시험하였다.
18O로 치환된 물(H2 18O)에 50 mM 중탄산 암모늄과 10 mM DDT를 혼합하여 완충용액을 주사기에 담아 자동주사주입기(syringe pump)를 통하여 중공사막을 통과하도록 흘려준다. H2 18O에 녹인 트립신(2 ㎍)과 시토크롬 C(10 ㎍)는 인젝터(injector)를 통하여 공급하였다. 30분 동안 용출된 용액을 받은 후 nanoLC-ESI-MS로 분석하였다. 분석 후 남은 용액은 4℃에서 1주일 간 냉장보관을 한 뒤 nano LC-ESI-MS를 이용하여 재분석하였다.
Figure 112012079671917-pat00001
상기 표 1의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 18O로 치환된 펩타이드와 치환되지 않은 펩타이드와의 비율에는 큰 변화가 없는 것을 관찰할 수 있다. 또한 괄호 안에 기재된 수치는 펩타이드의 C말단에 위치한 2개의 O에 모두 18O로 치환된 것과 하나의 O에만 18O로 치환된 펩타이드에 대한 비율을 나타낸 것으로, 이들의 비율에 있어서도 큰 차이를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과들은 기존의 효소 기반 18O-표지 전처리법의 문제 즉, 프로테오믹스 정량적 분석결과에 대한 재현성에 영향을 주게 되는 효소(18O-표지를 위해 사용된 효소)에 인한 역치환 현상(back-exchange)을 근본적으로 제어할 수 있고, 이는 결국 재현성 있는 정량적 분석으로 질병에 대한 조기진단에 크게 기여할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.

Claims (15)

  1. 글리코실화된 단백질(glycosylated proteins)을 정제하는 중공사막(hollow fiber)을 포함하는 정제용 컬럼;
    안정동위원소로 치환된 물;
    완충용액; 및
    효소;
    를 포함하되,
    상기 중공사막은 10 kDa의 분자량 차단(M. W. cutoff) 값을 가지는 것을 특징으로 하는 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 키트.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 완충용액은 중탄산 암모늄(ammonium bicarbonate) 및 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT)의 혼합물인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 효소는 트립신, 키모트립신, 펩신, 프로티나제 K, 및 엔도프로테아제로 부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 안정동위원소는 16O, 17O, 18O, 및 2H로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 안정동위원소는 18O인 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 1) 제 1항에 따른 안정동위원소 표식 펩타이드 정량 분석용 키트를 이용하여 단백질체 시료의 단백질을 가수분해하는 단계; 및
    2) 상기 가수분해된 단백질로부터 안정동위원소(stable isotope)로 치환된 펩타이드를 수득하여 정량분석하는 단계;
    를 포함하는 안정동위원소 표식 펩타이드 정량방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 안정동위원소 표식 펩타이드 정량방법은
    1-1) 단백질체 시료에 18O로 치환된 물과 완충액을 첨가하여 전처리하는 단계;
    1-2) 상기 전처리된 단백질체 시료에 트립신, 키모트립신, 펩신, 프로티나제 K, 및 엔도프로테아제로 부터 선택된 어느 하나의 효소를 첨가하여 가수분해하는 단계;
    2-1) 상기 가수분해된 단백질체 시료로부터 18O 치환된 펩타이드를 제조하는 단계;
    2-2) 상기 제조된 18O 치환된 펩타이드를 중공사막을 이용하여 동일한 분자량으로 용리되어 정제하는 단계; 및
    2-3) 상기 용리되어 정제된 18O 치환된 펩타이드를 정량분석하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 2-2)의 중공사막은 중공사막의 내부에는 첨가된 효소가 존재하고, 중공사막의 외부에는 10 kDa 분자량 이하의 18O 치환된 펩타이드만이 선택적으로 용리되는 것을 특징으로 하는 정량방법.
  10. 제 7항 또는 제 8항에 있어서,
    상기 정량분석은 LC/MS 질량 분석법, ESI-MS 질량 분석법, 및 LC-ESI-MS 질량분석법으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 정량방법.
  11. 효소와 단백질이 유동하는 유동라인;
    상기 유동라인 상에 설치되며, 상기 효소와 단백질 상의 글리코실화된 단백질(glycosylated proteins)을 정제하는 중공사막;
    상기 유동라인 상의 상기 중공사막 상류단에 설치되며, 상기 효소와 단백질을 공급받아 상기 중공사막으로 공급하는 인젝터(injector);
    상기 유동라인 상의 상기 인젝터 상류단에 설치되며, 상기 인젝터로 안정동위원소(stable isotope)로 치환된 물과 완충용액을 공급하는 펌프(syringe pump); 및
    상기 유동라인 상의 상기 중공사막 하류단에 설치되며, 상기 정제된 단백질을 포집하여 분석하는 정량 분석장치;
    를 포함하는, 중공사막을 이용한 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 장치.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 중공사막은 다수개로 구비되며,
    상기 유동라인 상의 상기 중공사막과 분석장치 사이에는 각각의 중공사막에서 공급되는 정제된 단백질을 취합하여 분석장치로 공급하는 커넥터(connector)가 더 구비되는 것을 특징으로 하는 장치.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 장치는
    상기 인젝터(injector)로부터 단백질 및 효소를 공급받아 하류단으로 주입하기 위한 주입수단;
    상기 주입수단과 연결되고, 주입수단의 반대편 말단이 폐쇄되어 있는 중공사막(hollow fiber);
    상기 중공사막 외부에 연결되어 있으며, 중공사막 내부에서 효소에 의해 분해(digestion)되어 중공사막을 통과한 18O 치환된 펩타이드들을 포집하는 수단; 및
    상기 18O 치환된 펩타이드들의 포집수단과 연결되어 있는 포집된 18O 치환된 펩타이드 용리를 위한 배출수단;
    을 포함하되,
    상기 중공사막은 상기 주입수단과 연결되고, 상기 주입수단의 반대편 말단이 폐쇄되어 있는 것인 장치.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 중공사막은 10 kDa의 분자량 차단(M. W. cutoff) 값을 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 정량 분석장치는 LC/MS 질량 분석법, ESI-MS 질량 분석법, 및 LC-ESI-MS 질량분석법으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 분석하는 장치인 것을 특징으로 하는 장치.
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