CN113640417A - 通过质谱测定法检测反式三碘甲状腺原氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的名称是通过质谱测定法检测反式三碘甲状腺原氨酸的方法。提供了使用质谱测定法测定样品中的反式T3的量的方法。该方法一般地包括电离样品中的反式T3并且检测和量化离子的量以测定样品中反式T3的量。

Description

通过质谱测定法检测反式三碘甲状腺原氨酸的方法
本申请是分案申请，原申请的申请日为2012年11月30日、申请号为2012800596979、发明名称为“通过质谱测定法检测反式三碘甲状腺原氨酸的方法”。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§120要求于2011年12月5日提交的美国申请系列号13/311,412的权益，该申请的全部内容通过引用并入本公开。
技术领域
本发明涉及反式三碘甲状腺原氨酸的检测。在具体的方面，本发明涉及通过质谱测定法检测反式三碘甲状腺原氨酸的方法。
背景技术
下面对本发明背景的描述仅简单地提供以帮助理解本发明并且不是承认描述或构成本发明的现有技术。
反式三碘甲状腺原氨酸((2S)-2-氨基-3-[4-(4-羟基-3,5-二碘苯氧基)-3-碘苯基]丙酸)(rT3)是三碘甲状腺原氨酸(T3)的无活性异构体。T3和rT3两者都通过如下脱碘酶的作用来源于甲状腺素(四碘甲状腺原氨酸，T4)：
Figure BDA0003208365230000021
T3和rT3两者都结合甲状腺激素受体。当T3结合时，受体被刺激，由此增加了代谢活性。不像T3，在结合时，rT3不刺激甲状腺激素受体。因此，rT3不刺激靶细胞的代谢活性，并且事实上，阻断T3激活受体位点。
过多的rT3可能导致T3结合的广泛停止，一种称为反式T3优势的状况。反式T3优势导致体温降低，其延缓了许多酶的作用，导致临床综合征，多酶功能障碍(Multiple EnzymeDysfunction)，其产生甲状腺功能减退中所见的效应。
进一步，将T4转变成T3以及将rT3转变成二碘甲状腺原氨酸(DIT)的5’单脱碘过程在大量的状况下被抑制，所述状况包括禁食、营养不良、控制不佳的糖尿病、创伤、手术和全身疾病。因此，在这些情况下，血清T3水平典型地降低，并且rT3水平常常增加。因此，T3与rT3的比率是临床化学中甲状腺激素和相关化合物的代谢和功能的重要诊断标记物。
已经开发了用于T4、T3和相关化合物(包括rT3)的测定，并且这些测定用来评价甲状腺状态或优化治疗剂量。测定形式包括放射免疫测定和质谱测定法。例如，Hantson等人报道了通过GC-MS量化衍生化的甲状腺激素(Hansen等人,J.Chromatogr.B(2004),807:185-192)；Zhang等人报道了通过SPE-ESI-MS/MS量化人血清中的T3和rT3(Zhang等人,J.Am.Soc.Mass Spectrom.(2005),16:1781-86)；Tai等人报道了通过SPE-HPLC-MS/MS量化血清中的T3(Tai等人,Anal.Chem.(2004),76:5092:96)；Couldwell等人报道了通过ESI-MS/MS进行的质谱测定分析，包括rT3在标准有机溶剂中的片段化谱(Couldwell等人,RapidComm.Mass Spectrom.(2005),19:2295-2304)；Wang和Stapleton报道通过SPE-LC-ESI-MS/MS量化加标牛血清样品中的rT3(Wang和Stapleton,Anal Bioanal Chem(2010),397:1831-39)。
发明内容
本发明提供通过质谱测定法——包括串联质谱测定法——检测样品中的反式T3(rT3)的量的方法。
在一个方面，提供了通过质谱测定法测定体液样品中的rT3的量的方法。此方面的方法包括：(a)电离来自体液样品的rT3以产生可通过质谱测定法检测到的一种或多种rT3离子；和(b)通过质谱测定法检测rT3离子(一种或多种)的量。一旦测量了一种或多种rT3离子的量，已测定的rT3离子(一种或多种)的量与体液样品中rT3的量相关联。在本发明的一些方法中，来自体液样品的rT3在电离前不经历固相提取。
在一些实施方式中，来自体液样品的rT3在被电离前经历液相色谱法。在一些实施方式中，液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。
在一些实施方式中，来自体液样品的rT3在被电离前通过蛋白沉淀富集。在一些实施方式中，在液相色谱法前进行蛋白沉淀。在一些实施方式中，通过使体液样品与足以使可能存在于体液样品中的蛋白的至少一部分沉淀的量的有机溶剂接触来进行蛋白沉淀。在一些相关实施方式中，有机溶剂包括甲醇。
在一些实施方式中，提供了通过质谱测定法测定体液样品中的反式T3(rT3)的量的方法，其包括处理体液样品以生成经处理的样品，所述经处理的样品包含来自体液样品的rT3。在相关方法中，所述处理包括：i)通过添加有机溶剂沉淀来自体液样品的蛋白，使得得到的上清液包含所述有机溶剂和来自所述体液样品的rT3；ii)通过使所述上清液经历反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱来纯化所述上清液中的rT3，其中所述纯化包括在引入所述上清液前将水性溶液引入至所述柱，优选地就在之前引入；和iii)从所述RP-HPLC柱洗脱rT3以生成包含rT3的经处理的样品。此经处理的样品然后可以如上所述进行分析；即，通过电离经处理的样品中的rT3以生成可通过质谱测定法检测到的一种或多种反式T3离子；通过质谱测定法测定一种或多种rT3离子的量；以及使用已测定的rT3离子的量来测定体液样品中的rT3的量。在一些实施方式中，有机溶剂包括甲醇。在一些相关实施方式中，步骤ii)中生成的上清液包含至少10％的甲醇。在一些方面，来自体液样品的rT3在电离前不经历固相提取。
在其中在引入含rT3样品前将水性填塞物引入至RP-HPLC柱中的实施方式中，样品体积与水性填塞物体积的比率可以在约10:1至约1:10的范围内；诸如在约5:1至约1:5的范围内；诸如约1:1。
在一些实施方式中，可通过质谱测定法测定到的一种或多种rT3离子选自质/荷比为649.9±0.5、605.2±0.5和127.1±0.5的离子。在一些实施方式中，所述离子选自质/荷比为649.9±0.5和605.2±0.5的离子。
在一些实施方式中，质谱测定法包括串联质谱测定法。在一些相关实施方式中，可通过质谱测定法测定到的一种或多种rT3离子包括质/荷比为649.9±0.5的前体离子，和选自质/荷比为605.2±0.5和127.1±0.5的离子的碎片离子。在一些实施方式中，碎片离子的质/荷比为605.2±0.5。
在一些实施方式中，体液样品包括血浆或血清,诸如取自人的血浆或血清。在一些相关实施方式中，本文所述的方法可以用来测定取自人的血浆或血清样品中存在的rT3的量。
在本文公开的方法的某些实施方式中，质谱测定法以负离子模式进行。可选地，质谱测定法以正离子模式进行。各种电离源，包括例如大气压化学电离(APCI)或电喷雾电离(ESI)，可以在本发明的实施方式中使用。在某些实施方式中，使用ESI以负离子模式测量rT3。
在一些实施方式中，在样品中提供可独立检测的rT3内标准，其量也在样品中测定。在这些实施方式中，存在于样品中内源性rT3和内标准两者的全部或一部分被电离以产生多种在质谱仪中可检测到的离子，并且通过质谱测定法检测由各自产生的一种或多种离子。
优选的rT3内标准是13C6-rT3。在优选的实施方式中，在质谱仪中可检测到的rT3内标准离子选自m/z为655.8±0.50、611.1±0.50和127.1±0.50的负离子。在利用串联质谱测定法的实施方式中，13C6-rT3离子可以包括m/z为655.8±0.50的前体离子和m/z为611.1±0.50的碎片离子。
在优选的实施方式中，通过与参照诸如13C6-rT3相比较，将rT3离子的存在或量与测试样品中rT3的存在或量相关联。
当在本文中使用时，除非另外指明，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。因此，例如，提及“一种(一个)蛋白”时包括多个蛋白分子。
当在本文中使用时，术语“纯化”并不是指从样品移除感兴趣分析物(一种或多种)以外的所有材料。而是，纯化是指这样的过程：相对于样品中可能干扰感兴趣分析物的检测的其他组分，富集一种或多种感兴趣分析物的量。通过各种手段纯化样品可以允许相对减少一种或多种干扰物质，例如，可能干扰或可能不干扰通过质谱测定法对所选的rT3母离子或子离子的检测的一种或多种物质。当使用相对减少时，此术语不要求待纯化材料中与感兴趣分析物一起存在的任何物质通过纯化被完全移除。
当在本文中使用时，术语“测试样品”是指可能含有rT3的任何样品。当在本文中使用时，术语“体液”意指可以从个体机体中分离的任何流体。例如，“体液”可以包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液等。
当在本文中使用时，术语“色谱法”是指其中当由液体或气体携带的化学混合物在固定液相或固相周围流动或流过固定液相或固相时由于化学实体的差异性分布导致分离成多种组分的过程。
当在本文中使用时，术语“液相色谱法”或“LC”意指当流体均一地渗滤通过细碎物质的柱，或通过毛细管通路时选择性地滞留流体溶液的一种或多种组分的过程。滞留是当此流体相对于固定相(一个或多个)移动时由混合物的组分在一个或多个固定相和体相流体(即，流动相)之间的分布引起的。“液相色谱法”的实例包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)和高湍流液相色谱法(HTLC)。
当在本文中使用时，术语“高效液相色谱法”或“HPLC”是指其中通过迫使流动相在压力下穿过载体基质——典型地致密装填柱上的固定相来增加分离程度的液相色谱法。当在本文中使用时，术语“超高效液相色谱法”或“UPLC”或“UHPLC”(有时称为“超高压液相色谱法”)是指在比传统HPLC技术更高的压力(约>5000psi)下并且任选地利用具有较小粒度(约<5μm)的柱装填材料进行的HPLC。
当在本文中使用时，术语“高湍流液相色谱法”或“HTLC”是指这样形式的色谱法，其利用待测定物质通过柱填料的湍流作为进行分离的基础。HTLC已经被应用于在通过质谱测定法分析之前制备含有两种未命名药物的样品。参见，例如Zimmer等人,J.Chromatogr.A854:23-35(1999)；也参见，美国专利号5,968,367,5,919,368,5,795,469和5,772,874，其进一步解释HTLC。本领域普通技术人员理解“湍流”。当流体缓慢并平稳地流动时，这种流动称为“层流”。例如，以低流速穿过HPLC柱移动的流体是层状的。在层流中，流体粒子的移动是有序的，其中粒子一般以直线移动。在更快的速度下，水的惯性克服了流体摩擦力并且形成湍流。不与不规则边界接触的流体“超越”(“outruns”)由于摩擦而减慢或被不平表面偏离的流体。当流体湍急流动时，它以漩涡和涡流(或旋流)流动，比流体层流时更“费力地移动(drag)”。许多参考文献可被利用用于当流体流动是层流或湍流时辅助测定(例如，Turbulent FlowAnalysis:Measurementand Prediction(湍流分析：测量和预测),P.S.Bernard&J.M.Wallace,John Wiley&Sons,Inc.,(2000)；An Introduction toTurbulent Flow(对湍流的介绍),Jean Mathieu&Julian Scott,Cambridge UniversityPress(2001))。
当在本文中使用时，术语“气相色谱法”或“GC”是指这样的色谱法，其中样品混合物被汽化并且被注射到移动穿过包含由液体或颗粒状固体组成的固定相的柱的载气(如氮气或氦气)流中，并且根据化合物对固定相的亲合力被分离成其组成化合物。
当在本文中使用时，术语“大颗粒柱”或“提取柱”是指含有平均粒径大于约35μm的色谱柱。如该上下文中所用，术语“约”意思是±10％。
当在本文中使用时，术语“分析柱”是指这样的色谱柱，其具有足够的色谱板以实现从柱中洗脱的样品中物质的分离足以允许测定分析物的存在或量。这种柱通常区别于“提取柱”，提取柱具有从未保留的物质中分离或提取保留的物质的通用目的以获得纯化的样品用于进一步分析。如该上下文中所用，术语“约”意思是±10％。在优选的实施方式中，分析柱含有直径在约1.5至约5μm范围内，诸如直径约2.6μm的颗粒。
当在本文中使用时，术语“在线(on-line)”或“线上(inline)”，例如用在“在线自动方式”或“在线提取”中，是指不需要操作者介入而进行的步骤。相反，术语“离线”(“off-line”)如本文所用是指需要操作者手动介入的过程。因此，如果样品经历沉淀，然后上清液手动地加样至自动取样器，沉淀和加样步骤对于后续步骤是离线的。在该方法的多个实施方式中，一个或多个步骤可以以在线自动方式进行。
当在本文中使用时，术语“质谱测定法”或“MS”是指通过其质量鉴定化合物的分析技术。MS是指基于其质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般包括：(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比。化合物可通过任何合适的方式电离并检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。通常，感兴趣的一个或多个分子被电离，然后离子被引入质谱仪，其中由于磁场和电场的组合，离子在空间上沿着依赖于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径而行。参见，例如美国专利号6,204,500，发明名称为“Mass Spectrometry From Surfaces(从表面进行质谱测定法)”；6,107,623，发明名称为“Methods and Apparatus for Transerm Mass Spectrometry(用于串联质谱测定法的方法和设备)”；6,268,144，发明名称为“DNA Diagnostics Based On MassSpectrometry(基于质谱测定法的DNA诊断学)”；6,124,137，发明名称为“Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection OfAnalytes(用于解吸和检测分析物的表面增强不耐光附着和释放)”；Wright,等人,Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264-76(1999)；以及Merchant和Weinberger,Electrophoresis 21:1164-67(2000)。
当在本文中使用时，术语“以负离子模式运行”是指其中产生并检测负离子的那些质谱测定法。当在本文中使用时，术语“以正离子模式运行”是指其中产生并检测正离子的那些质谱测定法。
当在本文中使用时，术语“电离作用”或“电离”是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。
当在本文中使用时，术语“电子电离作用”或“EI”是指这样的方法，其中气态或蒸汽相中的感兴趣分析物与电子流相互作用。电子与分析物的冲击产生分析物离子，其然后可经历质谱测定法技术。
当在本文中使用时，术语“化学电离作用”或“CI”是指这样的方法，其中试剂气体(例如，氨)经历电子冲击，并且分析物离子通过试剂气体离子与分析物分子相互作用而形成。
当在本文中使用时，术语“快速原子轰击”或“FAB”是指这样的方法，其中高能原子束(通常为Xe或Ar)冲击非挥发性样品，使样品中包含的分子解吸并电离。测试样品被溶解在粘性液体基质诸如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺中。对于化合物或样品适合的基质的选择是经验过程。
当在本文中使用时，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指这样的方法，其中非挥发性样品被暴露于激光照射，其通过包括光致电离、质子化作用、去质子化作用和簇衰变在内的多种电离方式解吸并电离样品中的分析物。对于MALDI，样品与能量吸收基质混合，所述能量吸收基质促进分析物分子的解吸。
当在本文中使用时，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”是指另一种方法，其中非挥发性样品被暴露于激光照射，其通过包括光致电离、质子化作用、去质子化作用和簇衰变在内的多种电离方式解吸并电离样品中的分析物。对于SELDI，样品典型地结合至优先地保留一种或多种感兴趣分析物的表面。如在MALDI中一样，该过程也可使用能量吸收物质以促进电离。
当在本文中使用时，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指这样的方法，其中溶液沿短长度的毛细管穿过到达被施加高正电势或负电势的末端。到达管末端的溶液被蒸发(被雾化)成在溶剂蒸汽中微小液滴溶液的喷射或喷雾。这种雾滴流经蒸发室。随着液滴变小，电表面电荷密度增加直至相同电荷之间的自然排斥引起离子以及中性分子被释放的时间为止。
当在本文中使用时，术语“大气压化学电离”或“APCI”是指与ESI相似的质谱测定法；但是，APCI通过在大气压下发生在等离子体中的离子-分子反应产生离子。等离子体通过喷射毛细管与反电极之间的放电维持。然后，离子通常通过使用一系列差动泵送的撇油器阶段被提取至质量分析仪。干燥并预热的N2气的反流可用于提高溶剂的去除。APCI中的气相电离可以比ESI更有效地用于分析更小极性的种类。
当在本文中使用时，术语“大气压光致电离”或“APPI”是指这种形式的质谱测定法，其中分子M光致电离的机理是光子吸收和电子射出以形成分子的离子M+。由于光子能量典型地刚好在电离电势之上，所以分子离子不太易于解离。在许多情况下，可能的是在不需色谱测定法的条件下分析样品，从而节省大量时间和费用。在水蒸汽或质子溶剂存在的情况下，分子离子可吸取H以形成MH+。如果M具有高质子亲合力，这趋于发生。这不影响量化精确度，原因在于M+与MH+的和是恒定的。质子溶剂中的药物化合物通常观察到为MH+，而非极性化合物诸如萘或睾酮通常形成M+。Robb,D.B.,Covey,T.R.和Bruins,A.P.(2000):参见，例如，Robb等人,Atmospheric pressure photoionization:An ionization method forliquid chromatography-mass spectrometry(大气压光致电离：用于液相色谱法-质谱测定法的电离方法).Anal.Chem.72(15):3653-3659。
当在本文中使用时，术语“感应耦合等离子体”或“ICP”是指这样的方法，其中样品与部分电离的气体在足够高的温度下相互作用以使大部分元素原子化和离子化。
当在本文中使用时，术语“场致解吸”是指这样的方法，其中非挥发性测试样品被置于电离表面上，并且强电场被用于产生分析物离子。
当在本文中使用时，术语“解吸”是指将分析物从表面去除和/或分析物进入气相。
当在本文中使用时，术语“选择性离子监测”是用于质谱测量仪器的检测模式，其中仅相对窄的质量范围，典型地约1个质量单位内的离子被检测。
当在本文中使用时，“多反应模式”，有时称为“选择反应监测”，其是用于质谱测量仪器的检测模式，其中前体离子和一种或多种碎片离子被选择性地检测。
当在本文中使用时，术语“量化低限”、“定量低限”或“LLOQ”是指测量值在数量上变得有意义的点。利用在标准差(SD)小于总容许误差(TEa；对rT3任意地设定为LLOQ的30％)的三分之一时的浓度，在该LLOQ处分析物响应是可以识别的、离散的以及可重复的。
当在本文中使用时，术语“检测极限”或“LOD”是测量值大于与之相关的不确定性时的点。LOD是值超出与其测量值相关的不确定性时的点并且被定义为空白(blank)的均数加上空白标准差的四倍。
当在本文中使用时，体液样品中rT3的“量”通常指反映体液体积中可检测到的rT3质量的绝对值。但是，量还可理解为与另一rT3量比较的相对量。例如，体液中rT3的量可以是大于对照或正常存在的rT3正常水平的量。
当在本文中使用时，术语“约”在提及不包括离子质量测量的定量测量时，是指所示值加上或减去10％。质谱测量仪可在测定给定分析物的质量时轻微变化。术语“约”在离子质量或离子质/荷比的上下文中是指+/-0.5原子质量单位。
上述的发明内容是非限制性的，并且本发明的其他特征和优势将从以下的具体实施方式和权利要求书中显而易见。
附图说明
图1A和B示出HPLC泵配置的示意图，所述配置就在引入样品之前引入水性填塞物。水性溶剂以黑色显示，而具有高有机溶剂含量的样品以灰色显示。图1A示出加样阶段(即，进样环路的加样)。图1B示出了按次序将流体填塞物引入至HPLC中。
图2A和B示出由HPLC-MS/MS收集的基于甲醇的样品中T3和rT3的示例性色谱图。就在引入100μL样品之前向HPLC引入(图2A)和不引入(图2B)水性填塞物的情况下收集色谱图。细节在实施例3中讨论。
图3示出由HPLC-MS/MS收集的基于丙酮的样品中T3和rT3的示例性色谱图。在引入100μL样品之前不立即向HPLC引入水性填塞物的情况下收集色谱图。细节在实施例3中讨论。
图4A和B分别示出rT3和13C6-rT3(内标准)的示例性色谱图。细节在实施例5中讨论。
图5示出通过分析具有25pg/mL-2000pg/mL的rT3的校准样品生成的典型校准曲线。细节在实施例6中描述。
图6示出了在定量低限(LLOQ)、检测极限(LOD)和空白检测限(LOB)实验中生成的一系列数据。细节在实施例9中描述。
图7示出rT3检测至至少约200ng/dL的线性。细节在实施例10中描述。
图8A和B分别示出在EDTA血浆和血清中rT3定量的比较和差值作图。细节在实施例11中描述。
图9A和B分别示出在肝素血浆和血清中rT3定量的比较和差值作图。细节在实施例11中描述。
图10A和B分别示出在SST血浆和血清中rT3定量的比较和差值作图。细节在实施例11中描述。
具体实施方式
本发明的方法被描述用于测量样品中rT3的量。更具体地，描述了质谱测定法用于检测和量化样品中的rT3。所述方法可以利用液相色谱法(LC)，最优选HPLC或UPLC，来进行所选分析物的纯化，并且将该纯化与质谱测定法(MS)的独特方法结合，由此提供高通量测定系统用于检测并量化测试样品中的rT3。优选的实施方式特别适应用于大的临床实验室用于自动rT3测定。提供的方法在不需要在液相色谱法前通过固相提取进行样品纯化的条件下实现。
用于本发明的方法中的合适样品包括任何可能包含感兴趣分析物的样品。在一些优选的实施方式中，样品是生物学样品；即，从任何生物来源诸如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物诸如狗、猫、马等获得。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选地是男性人类或女性人类。特别优选的样品包括体液诸如血液、血浆、血清、唾液、脑脊髓液或组织样品。这样的样品可获自例如患者；即有生命的人，男性或女性，其将自己置于临床环境中以诊断、预测或治疗疾病或病症。样品优选地获自患者，例如血液血清或血浆。
本发明考虑用于rT3定量测定的试剂盒。本发明的用于rT3定量测定的试剂盒可以包括包含内标准的试剂盒，其量足以用于至少一次测定。典型地，该试剂盒还将包含以有形形式记录的说明书(例如，包含在纸或电子介质上)用于使用包装的在用于测定rT3的量的测量测定中使用的试剂。
用于本发明的实施方式中的校准和QC混合样品(pool)可以使用“经提取的(stripped)”血浆或血清(提取掉rT3)制备：例如，提取掉分析物、去纤维蛋白的和脱脂的血浆/血清。应当检查人或非人血浆或经提取的血清的所有来源以确保它们不含有可测量到的量的内源性rT3。
质谱测定法的样品制备
在质谱测定法前可使用多种方法以相对于样品中的其它组分(例如蛋白)富集rT3，所述方法包括例如液相色谱法、过滤、离心、薄层色谱(TLC)、包括毛细管电泳在内的电泳、包括免疫亲和分离在内的亲和分离、包括乙酸乙酯提取和甲醇提取在内的提取法以及离液剂的使用或上述或类似方法的任意组合。
蛋白沉淀是一种优选的制备样品特别是生物学样品诸如血清或血浆的方法。蛋白沉淀可以用来去除存在于样品中的蛋白的至少一部分，将rT3留在上清液中。可以将沉淀的样品离心以将液体上清液与沉淀的蛋白分开；可选地所述样品可以例如通过玻璃纤维滤器过滤以去除沉淀的蛋白。得到的上清液或滤液然后可以直接应用于质谱分析；或可选地应用于液相色谱和随后的质谱分析。
各种沉淀剂在本领域中是已知的，诸如丙酮，醇类诸如甲醇，或各种酸化剂。在某些实施方式中，蛋白沉淀诸如例如甲醇蛋白沉淀的使用可以消除在质谱测定法、或HPLC或UPLC和质谱测定法之前对固相提取(SPE)诸如高湍流液相色谱(HTLC)或其他在线提取的需要。
因此，在一些实施方式中，所述方法涉及：(1)进行感兴趣样品的蛋白沉淀；和(2)在没有使用SPE的情况下将上清液直接加样到LC-质谱仪上。
在其它实施方式中，HTLC，单独地或与一种或多种纯化方法组合，可被用于在质谱测定法之前纯化rT3。在这样的实施方式中，样品可使用捕获分析物的HTLC萃取柱体进行提取，然后在电离之前在第二HTLC柱或分析性HPLC或UPLC柱上洗脱并色谱分离。因为包含在这些色谱程序中的步骤可以以自动方式连接，所以对分析物纯化期间操作者参与的需求可最小化。该特征可节省时间和费用并排除操作者错误的可能性。
根据一些实施方式，所述方法包括从血清或血浆样品进行蛋白沉淀。在这些实施方式中，可以以足以将蛋白从样品中沉淀的量向样品添加导致蛋白从血清或血浆中沉淀出来的试剂，诸如甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮或硫酸锌溶液，以及内标准。例如，可以以在约1:1至约10:1；诸如约2:1至约5:1；诸如约3:1的范围内的比率将甲醇添加至血清样品。在蛋白沉淀后，可以将混合物离心，使rT3保留在上清液中。然后可以收集上清液并将其在进一步纯化或不进一步纯化的情况下进行质谱分析。
可以在质谱测定法之前使用的一种另外的此类样品纯化手段是液相色谱法(LC)。液相色谱法，包括高效液相色谱法(HPLC)，依赖于相对缓慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充，其中样品穿过柱的层流是将感兴趣分析物从样品中分离的基础。本领域技术人员会理解这种柱中的分离是扩散过程并且可以选择适合rT3使用的HPLC仪器和柱。色谱柱典型地包括便于分离化学结构部分(即，分馏)的介质(即，填料)。介质可包括微小颗粒。颗粒包括结合表面，其与各种化学结构部分相互作用以促进化学结构部分的分离。一个合适的结合表面是疏水性结合表面诸如烷基结合表面。烷基结合表面可包括C-4、C-8、C-12或C-18结合的烷基基团，优选地C-18结合的基团。色谱柱包括直接或间接接收样品的入口(诸如来自耦连的SPE柱)和排出包括分馏样品的流出物的出口。
在一个实施方式中，样品可以在入口处被施加到柱，用溶剂或溶剂混合物进行洗脱，并且在出口处排出。可选择不同的溶剂模式用于洗脱感兴趣分析物(一种或多种)。例如，液相色谱可采用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式进行。在色谱期间，物质的分离受到变量诸如洗脱液(也称为“流动相”)、洗脱模式、梯度条件、温度等的选择的影响。
在某些实施方式中，分析物可在感兴趣分析物被柱填料可逆地保留而一种或多种其它物质没有被保留的条件下，通过将样品施加到柱中进行纯化。在这些实施方式中，可应用第一流动相条件，其中感兴趣分析物被柱保留，并且一旦未保留的物质被洗涤穿过，随后可应用第二流动相条件以从柱中移出保留的物质。可选地，分析物可在相比于一种或多种其它物质以不同的速度洗脱感兴趣分析物的流动相条件下通过将样品施加到柱中进行纯化。这种程序可相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种感兴趣分析物的量。
在一些实施方式中，HPLC或UPLC利用疏水柱色谱系统进行。在某些实施方式中，使用C18分析柱(例如，来自Phenomenex的具有TMS封端分析柱的Kinetex C18(2.6μm粒度,50×4.6mm)，或等价物)。在某些实施方式中，使用HPLC级0.1％甲酸水溶液和100％甲醇作为流动相进行HTLC和/或HPLC和/或UPLC。
反相HPLC通常使用非极性固定相和中等极性水性流动相进行。在这些条件下，被注入用于分析的包含大含量的有机或醇溶剂的样品经过柱的固定相而没有显著的相互作用，导致不佳的柱性能(即，较少的分析物保留和不佳的峰形)。典型地采用两种策略中的一种去抵消这种影响。第一，包含大含量有机物或醇的样品(诸如通过醇蛋白沉淀产生的那些)可以在高含水量的溶剂中干燥和重构。第二，可以使用非常小体积的包含大含量有机物或醇的样品，例外是由于流动相与样品体积的相对体积，这种小绝对体积的有机物或醇的作用将大大被克服。两种方式对临床实验室测定均具有显著的不利之处。干燥和重构样品对于可以否则是自动程序的方式增加大量的时间和成本，而使用非常小体积的样品可以通过限制引入至柱的分析物量来消除测定灵敏性。
本发明提供了克服上述困难的方法。已经发现就在引入具有大含量有机物或醇的样品之前将水性或大部分水性溶剂的“填塞物”引入至反相HPLC柱避免了与这种样品相关的问题。本发明方法可以应用于具有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％(v/v)有机物或醇或其混合物的样品。在一些实施方式中，样品溶剂是甲醇。对于典型市售的反相HPLC柱，可以就在引入约10μL至1000μL样品之前立即引入约10μL至1000μL的水性填塞物体积。优选地，填塞物体积与样品体积的比率将在约5:1至约1:5的范围内；诸如在约2:1至约1:2的范围内；诸如约1:1。每种溶液的合适的绝对和相对体积将随变量而变化，所述变量诸如样品的有机溶剂含量、样品中分析物的浓度、柱填料、和柱体积。然而，测定每种溶液的合适的绝对和相对体积在本领域技术人员的能力范围内。
技术人员将认识到存在大量的方式来实现使用管道和泵的多种配置在HPLC柱上按次序引入多种溶液。在一些实施方式中，在引入包含高含量的有机或醇溶剂的样品之前，使用预定体积的样品环路来实现按次序引入水性填塞物，诸如基本上没有有机溶剂组分的填塞物(即，具有纯水性溶剂组分的填塞物)。术语“基本上没有有机溶剂组分”，当在本文中使用时，是指含有少于约20％(v/v)、或可选地少于约15％、10％、5％、1％、0.5％或0.1％(v/v)有机溶剂的水性溶液(水性填塞物)。在这些实施方式中，样品环路初始地用水性流体填充至容量。然后将一定体积的含有机物或醇的样品引入至样品环路中使得所述环路仅部分地被含有机物或醇的样品占据，同时至少一些水性流体保留在环路中。然后，使用一系列阀门和泵、或其他管道部件，将水性填塞物，接着将含有机物或醇的样品从样品环路引入至HPLC柱上。图1A和1B示出处于工作中的这种系统的示意性图示。
一旦分析物已经从第一色谱柱洗脱，其可以在一个或多个附加的柱上进行进一步的色谱分离。通过仔细选择阀门和连接器管道，两个或多个色谱柱可按需要连接以使物质从一个穿至下一个而不需任何手动步骤。在优选的实施方式中，阀门和管道的选择通过预编程的计算机进行控制以进行必要步骤。最优选地，色谱系统也以这种在线方式连接至检测器系统，例如，MS系统。因此，操作者可将样品盘置于自动取样器中，并在计算机控制下进行剩余的操作，实现全部所选样品的纯化和分析。
通过质谱测定法的检测和定量
在多种实施方式中，样品中存在的rT3可通过本领域技术人员已知的任何方法进行电离。质谱测定法采用质谱仪进行，所述质谱仪包括离子源，用于电离分馏的样品并产生带电分子用于进一步分析。例如样品的电离可通过电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、快速原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场致电离、场致解吸、热喷雾/等离子体喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、感应耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进行。本领域技术人员应理解电离方法的选择可根据要测量的分析物、样品类型、检测器类型、正-负模式的选择等进行确定。
在优选的实施方式中，rT3通过加热的电喷雾电离(ESI)以负模式进行电离。
通常在质谱测定技术中，在样品已经电离后，由此产生的带正电或带负电的离子可进行分析以测定质荷比。用于测定质荷比的合适分析器包括四极分析器、离子阱分析器、磁电扇形分析器和飞行时间分析器。离子可采用几种检测模式进行检测。例如，所选离子可以进行检测，即采用选择性离子监测模式(SIM)，或者可选地，离子可采用扫描模式例如多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)进行检测。优选地，质荷比采用四极分析器进行测定。例如，在“四极”或“四极离子阱”仪器中，处于振荡射频场中的离子经历与电极之间施加的DC电势、RF信号的振幅和质/荷比成比例的力。可以选择电压和振幅，以致于只有具有特定质/荷比的离子行进四极的长度，而所有其它离子是偏离的。因此，四极仪器可对注入到仪器中的离子起到“质量过滤器”和“质量检测器”的作用。
技术人员可通过利用“串联质谱测定法”或“MS/MS”提高MS技术的分辨率。在该技术中，由感兴趣分子产生的前体离子(也称为母离子)可在MS仪器中进行过滤，并且前体离子随后被碎片化以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)，其然后在第二MS程序中进行分析。通过仔细选择前体离子，仅由某些分析物产生的离子通过至碎裂室，其中与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。因为前体和碎片离子两者都在给定系列的电离/碎片化条件下以可再生方式产生的，所以MS/MS技术可提供极其强大的分析工具。例如，过滤/碎片化组合可被用于消除干扰物质，并且可特别用于复杂样品诸如生物学样品。
质谱仪典型地给用户提供离子扫描；即，在给定范围(例如100至1000amu)内具有特定质荷比的各种离子的相对丰度。分析物测定的结果，即质谱，可通过本领域已知的许多方法与原始样品中分析物的量相关联。例如，假定对取样和分析参数进行仔细控制，可将给定离子的相对丰度与将相对丰度转化成原始分子的绝对量的表进行比较。可选地，标准品可与样品一起运行，并且基于从那些标准品中产生的离子构建标准曲线。利用这种标准曲线，给定离子的相对丰度可被转化成原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，内标准被用于产生计算rT3的数量的标准曲线。产生和利用这种标准曲线的方法在本领域中是熟知的，并且普通技术人员能选择合适的内标准。例如，同位素标记的rT3可用作内标准；在某些优选的实施方式中，所述标准是13C6-rT3。将离子的量与原始分子的量关联的许多其它方法对本领域普通技术人员是熟知的。
所述方法的一个或多个步骤可采用自动仪器进行。在某些实施方式中，一个或多个纯化步骤在线进行。
在某些实施方式中，诸如MS/MS，其中前体离子被分离以进一步碎片化，碰撞活化解离通常被用于产生碎片离子以进一步检测。在CAD中，前体离子通过与惰性气体碰撞获得能量，并且随后通过被称为“单分子分解”的过程产生碎片。足够的能量必须蓄积在前体离子中以致于离子内的某些键可由于增加的振动能而断开。
在特别优选的实施方式中，rT3如下采用MS/MS进行检测和/或量化。样品经历蛋白沉淀，接着经历液相色谱，优选地HPLC或UPLC；来自液相色谱柱的液体溶剂流进入MS/MS分析仪的ESI喷雾器界面；并且溶剂/分析物混合物在界面的加热管中被转化为蒸汽。包含在雾化溶剂中的分析物(例如，rT3)作为被蒸发的雾化液滴中存在的溶剂被电离。离子，例如前体离子，穿过仪器的孔并且进入第一个四极。四极1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，允许根据它们的质荷比(m/z)选择离子(即，分别在Q1和Q3中选择“前体”和“碎片”离子)。四极2(Q2)为碰撞室，其中离子被碎片化。质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有rT3的质荷比的分子。具有正确质/荷比的前体离子被允许穿入到碰撞室(Q2)中，而具有任何其它质荷比的不期望离子与四极的侧面碰撞并且被除去。
进入Q2的前体离子与中性碰撞气体分子和碎片碰撞。该过程被称为碰撞活化解离(CAD)。所产生的碎片离子穿入到四极3(Q3)中，其中rT3的碎片离子被选择而其它离子被除去。在一些实施方式中，rT3前体离子通过与惰性碰撞气体诸如氩气或氮气——优选氮气——碰撞而被碎片化。
所述方法可包括以正离子模式或负离子模式进行的MS/MS；优选负离子模式。采用本领域熟知的标准方法，普通技术人员能鉴定可用于在四极3(Q3)中选择的rT3的特定前体离子中的一种或多种碎片离子。
随着离子与检测器碰撞，它们产生转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图。所产生的质量色谱图类似于在传统HPLC方法中产生的色谱图。测量对应于特定离子的峰下面积或这些峰的振幅，并且面积或振幅被与感兴趣分析物的量相关联。在某些实施方式中，对碎片离子(一种或多种)和/或前体离子的曲线下面积或峰的振幅进行测量以测定rT3的量。如上所述，给定离子的相对丰度可基于内标准分子诸如13C6-rT3的一种或多种离子的峰采用校准标准曲线转化成原始分析物例如rT3的绝对量。
下列实施例起到阐明本发明的作用。这些实施例绝对没有意图限制所述方法的范围。
实施例
实施例1:样品(血清)和试剂准备
通过将血液收集在标准红帽血清
Figure BDA0003208365230000181
管中并允许其在室温下凝结30分钟来准备血清样品。然后离心样品并立即将血清与细胞分离。可选地，将血液收集在双重凝胶屏障管中，允许其在室温下凝结。然后将样品离心，并在24小时内将血清与细胞分离。
还准备在EDTA血浆
Figure BDA0003208365230000182
管和肝素钠
Figure BDA0003208365230000183
管中收集的血浆样品，用于分析。
制备三种rT3储备溶液。通过将rT3溶解在40mL浓NaOH中并用甲醇稀释至100mL来准备甲醇/碱性溶液中的1mg/mL初始rT3储备溶液。通过用甲醇进一步稀释一部分初始储备溶液来准备1,000,000pg/mL rT3的中间储备溶液。最后，通过用经双重-炭处理的血清进一步稀释一部分中间储备溶液来准备10,000pg/mL rT3的工作储备溶液。
类似于上述的rT3溶液制备13C6-rT3内标准溶液，不同之处在于通过用甲醇而不是经处理的血清稀释来将最终的工作13C6-rT3内标准制备成500pg/mL的终浓度。
实施例2:通过蛋白沉淀富集血清中的rT3
首先将100μL标本加入至96孔板的孔中。然后将300μL甲醇溶液中的500pg/mL13C6-rT3(内标准)加入至每个孔中，检查每个孔的沉淀物形成。肉眼确认沉淀后，将孔板在约1500rpm下混合约1分钟，使其静置，再次混合，冷藏约30分钟，并最后混合一次。在最后的混合后，将所述板在最小3000x g下离心至少30分钟。
实施例3:具有和不具有前端(leading)水性填塞物的甲醇溶液中的rT3的HPLC- MS/MS的比较
如实施例2中所示通过甲醇沉淀和通过相似的程序利用丙酮沉淀制备含rT3的样品。得到的样品含有相对高百分比的甲醇或丙酮作为溶剂。
就在引入样品之前向HPLC分析柱(Phenomenex Kinetex C18，利用TMS封端，100×4.6mm,2.6μm粒度柱)引入和不引入约100μL水性填塞物的条件下，分析100μL基于甲醇溶剂的样品。对两种条件收集的质量色谱图见图2A-B。为了比较，在不引入水性填塞物的条件下，还分析了100μL基于丙酮溶剂的样品。基于丙酮的样品的示例性质量色谱图见图3。
如图2A-B和图3中所见，在引入水性填塞物后，对于通过HPLC纯化的样品，T3和rT3两者的离子信号强度大大增强。
实施例4:富集rT3液相色谱法
由实施例2中离心得到的上清液进行高效液相色谱法以在质谱分析前进一步富集rT3。利用使用Aria OS V 1.5或更新的软件以层流模式运转的Cohesive TechnologiesAria TLX-1HTLC系统进行样品注入。
HTLC系统自动地将100μL上面制备的上清液注入至分析柱(Phenomenex KinetexC18，具有TMS封端，100×4.6mm,2.6μm粒度柱)中。向分析柱施加二元HPLC梯度，以将rT3与样品中含有的其他分析物分开。流动相A为0.1％甲酸水溶液，且流动相B为100％甲醇。HPLC梯度以70％流动相A和30％流动相B的混合物开始，并且在300秒内逐步升高至5％流动相A和95％流动相B。然后将此比率保持另外60秒，然后恢复到原始混合物持续60秒。在这些条件下，rT3(和13C6-rT3)在大约235秒时从HPLC柱被洗脱。然后将洗脱的分析物进行MS/MS用于定量。
实施例5:通过MS/MS检测和定量rT3
使用ABSciex 5500MS/MS系统(ABSciex)进行MS/MS。在本文所述的实施例中使用所有均来自ABSciex的下述软件程序：Analyst 1.4或更新版本。离开分析性HPLC柱的液体溶剂/分析物流到MS/MS分析仪的ESI界面。在从界面的管道离开后，溶剂/分析物混合物被转变成蒸汽。雾化溶剂中的分析物被ESI以负离子模式电离。示例性的质谱仪参数显示在表1中。
表1.质谱仪操作参数
Figure BDA0003208365230000201
离子传送到第一四极(Q1)，其选择对于rT3质荷比为649.9±0.50和对于13C6-rT3质荷比为655.8±0.50的离子。进入四极2(Q2)的离子与氮气碰撞以产生离子碎片，后者传送至四极3(Q3)进行进一步选择。同时，利用内标准13C6-rT3进行使用同位素稀释质谱测定法的相同过程。在负极性上在验证期间用于检测和定量的质量跃迁显示在表2中。对rT3和13C6-rT3分别观察到649.9±0.50→127.1±0.50和655.8±0.50→127.1±0.50的另外质量跃迁。
表2.rT3的质量跃迁(负极性)
Figure BDA0003208365230000211
通过监测表2中显示的跃迁生成的rT3和13C6-rT3(内标准)的示例性色谱图分别见图4A和B。
实施例6:通过MS测定用于rT3的示例性校准曲线
制备经处理的血清中的rT3的浓度为25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL和2000pg/mL的7种校准标准品，并如上所概述的那样进行分析以生成示例性校准曲线。一种这样的校准曲线展示在图5中。显示的校准曲线通过线性回归分析，得到下面的系数：y＝0.0117x+-0.00213,和r＝0.9988。
实施例7:对干扰物质的测试
测试含甘油三酯(多至约2000mg/dL)、胆红素(多至约50mg/dL),和/或血红蛋白(多至约500mg/dL)的样品中的可能的干扰物质。从这些物质中没有检测到干扰物质。
实施例8:rT3测定精确度和准确度
通过在经处理血清中以10ng/dL、25ng/dL和100ng/dL掺入rT3制备三种质量控制(QC)混合样品。
在5个测定中的每一个中分析来自三个QC混合样品中的每一个的5个等分试样以测定样品在测定内的准确度和变异系数(CV(％))。这些实验的数据和结果见表3。
表3.rT3测定精确度和准确度
Figure BDA0003208365230000221
Figure BDA0003208365230000231
Figure BDA0003208365230000241
如表3中所示，在每个QC级别的准确度和变异系数(CV(％))对于作为临床测定使用是可接受的。
实施例9:分析灵敏度:空白检测限(LOB)、检测极限(LOD)和定量低限(LLOQ)
LLOQ是指测量值在数量上变得有意义时的浓度。利用在标准差(SD)小于总容许误差(Tea；对rT3任意地设定为LLOQ的30％)的三分之一时的浓度，在该LLOQ处分析物响应是可以识别的、离散的以及可重复的。LOD是测量值大于与之相关的不确定性时的浓度。LOD是值超出与其测量值相关的不确定性时的点并且被定义为空白的均数加上空白标准差的四倍。对于零校准标准品，LOB被设定为平均测量值之上的两个标准差。
通过测定处于接近于期望LLOQ的浓度的样品并测定可重复性(在5个批次中测定的各自在0、2、4和8ng/dL rT3的5个重复实验)，然后确定标准差(SD)，来测定LLOQ、LOD和LOB。将结果对rT3作图(显示在图6中)。从曲线确定LOB、LOD和LLOQ分别为0.309ng/dL、0.392ng/dL和2.050ng/dL。来自这些实验的数据在表4中给出。
表4.rT3空白检测限(LOB)、检测极限(LOD)和定量低限(LLOQ)研究
Figure BDA0003208365230000251
实施例10:线性和测定参考区间
为了建立rT3检测的线性，由不同比例的空白经处理血清和掺入200ng/dL的经处理血清制备5种样品。分析范围为0％至100％的加标血清的每种样品的两个重复品并将结果作图。显示所得曲线的线性的图显示在图7中。
通过分析来自115名成人(包括年龄在18至86岁之间的61名女性和54名男性)的样品来进行参考区间研究。纳入标准为：表观健康的、非卧床的、社区居住的、未服药成人。剔除标准为正常TSH、FT4、FT3、抗-TPO和抗-TG，没有慢性疾病史、服药或近期医学问题。分析得到的数据以形成正常的参考区间。结果在表5中给出。
表5.参考区间
rT3(ng/dL)
参考区间下限 7.000
参考区间上限 26.000
参考区间中位数 15.000
供体数目 115
RI之上数目 5
RI之下数目 3
RI外的百分比 7％
实施例11:样品类型研究
将来自30名患者的样品采集在各种
Figure BDA0003208365230000261
管中以得到血清、EDTA血浆、肝素血浆和来自具有凝胶屏障的血清分离管(即，SST样品管)的血清。分析得到的样品并比较结果。所有样品类型被确定为对于临床分析是可接受的。EDTA血浆、肝素血浆和SST血清样品相对于血清的比较作图分别显示在图8A、9A和10A中；差值作图分别显示在图8B、9B和10B中。
本文提到或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件或电子可用信息的内容以其全部内容通过引用并入本文至这样的程度，如同每一单独出版物被具体且单独地显示通过引用并入。申请人保留将任何和所有的来自任何这些文章、专利、专利申请或其它物理和电子文件的材料和信息在物理上并入本申请的权利。
本文例证性描述的方法可在本文没有具体公开的任何要素或多个要素、一个或多个限制不存在的情况下合适地实施。因此，例如术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应当广义且非限制性地理解。此外，本文所用的术语和表述已经作为描述性术语而不是限制性术语使用，并且没有意图使用这种将所示和所述特征的任何等价形式或其部分排除的术语和表述。应当认识到在所请求保护的发明范围内各种改变是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方式和任选特征具体地公开，但是本领域技术人员可诉诸于本文公开的其中实施的本发明的改变和变化，并且这种改变和变化被认为在本发明的范围内。
本发明在本文中已经作了广泛且概括性的描述。落入上位公开内容中的每一个较窄类别和亚类分组也构成所述方法的部分。这包括本发明的概括性描述，条件是或者否定性限制是从类属中去除了任何主题内容，无论排除的材料是否在本文中具体描述。
其它实施方式在权利要求之内。此外，在所述方法的特征或方面按照马库什组进行描述的情况下，本领域技术人员应认识到本发明也因此按照马库什组的任何单个成员或成员的亚组进行描述。

Claims (24)

1.一种通过串联质谱测定法测定样品中的反式三碘甲状腺原氨酸(rT3)的量的方法，所述方法包括：
a.添加内标准至所述样品；
b.使所述样品经历蛋白沉淀；
c.电离rT3和所述内标准以生成至少一种rT3离子和至少一种内标准离子；
d.通过串联质谱测定法测定所述至少一种rT3离子的量和所述至少一种内标准离子的量；其中所述样品中的rT3的量由所述至少一种rT3离子的量和所述至少一种内标准离子的量测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括使所述样品经历液相色谱法。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)、反相液相色谱法(RPLC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)或高湍流液相色谱法(HTLC)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白沉淀包括有机溶剂沉淀。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白沉淀包括甲醇沉淀。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述电离是通过电喷雾电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述电离处于正离子模式。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子使用多反应监测(MRM)进行检测。
9.根据权利要求1所述的方法，其中可通过质谱测定法检测到的所述一种或多种rT3离子包括选自质/荷比为649.9±0.5、605.2±0.5和127.1±0.5的离子的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的方法，其中可通过质谱测定法检测到的所述一种或多种rT3离子包括选自质/荷比为649.9±0.5和605.2±0.5的离子的一种或多种。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述内标准是同位素标记的。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述内标准是13C-标记的rT3。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括血浆或血清。
14.一种通过串联质谱测定法测定样品中的反式三碘甲状腺原氨酸(rT3)的量的方法，所述方法包括：
a.添加13C-标记的rT3至所述样品；
b.使所述样品经历蛋白沉淀；
c.电离rT3和所述13C-标记的rT3以生成至少一种rT3离子和至少一种13C-标记的rT3离子；
d.通过串联质谱测定法测定所述至少一种rT3离子的量和所述至少一种13C-标记的rT3离子的量；其中所述样品中的rT3的量由所述至少一种rT3离子的量和所述至少一种13C-标记的rT3离子的量测定。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法还包括使所述样品经历液相色谱法。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)、反相液相色谱法(RPLC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)或高湍流液相色谱法(HTLC)。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述蛋白沉淀包括有机溶剂沉淀。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述蛋白沉淀包括甲醇沉淀。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述电离是通过电喷雾电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述电离处于正离子模式。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述离子使用多反应监测(MRM)进行检测。
22.根据权利要求14所述的方法，其中可通过质谱测定法检测到的所述一种或多种rT3离子包括选自质/荷比为649.9±0.5、605.2±0.5和127.1±0.5的离子的一种或多种。
23.根据权利要求14所述的方法，其中可通过质谱测定法检测到的所述一种或多种rT3离子包括选自质/荷比为649.9±0.5和605.2±0.5的离子的一种或多种。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述样品包括血浆或血清。
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