ES2216592T3 - Metodo de diagnostico basado en la funcion de una proteina producida en un sistema acelular, a partir de una muestra de acidos nucleicos. - Google Patents
Metodo de diagnostico basado en la funcion de una proteina producida en un sistema acelular, a partir de una muestra de acidos nucleicos.Info
- Publication number
- ES2216592T3 ES2216592T3 ES99957373T ES99957373T ES2216592T3 ES 2216592 T3 ES2216592 T3 ES 2216592T3 ES 99957373 T ES99957373 T ES 99957373T ES 99957373 T ES99957373 T ES 99957373T ES 2216592 T3 ES2216592 T3 ES 2216592T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- function
- sample
- genes
- protein
- diagnostic method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Métodos de diagnóstico de la presencia de un organismo o del desarrollo de una enfermedad o de una infección o también de células, en una muestra biológica, caracterizados porque se detecta y/o se mide la función de una o de varias proteínas específicas de dicho organismo o el desarrollo de una enfermedad o de una infección o también de células, estando dichas proteínas producidas en un sistema acelular a partir de ácidos nucleicos de la muestra.
Description
Método de diagnóstico basado en la función de una
proteína producida en un sistema acelular, a partir de una muestra
de ácidos nucleicos.
La presente invención tiene por objeto un método
de detección y/o de cuantificación de una función conocida a partir
de una muestra de ácidos nucleicos. El método de la invención
encuentra, especialmente, su aplicación en el análisis in
vitro de una función conocida a partir de una muestra de ácidos
nucleicos. Este método encuentra también su aplicación en el ámbito
del diagnóstico, donde la función buscada se caracteriza por ejemplo
por la presencia de una actividad enzimática, de células cancerosas,
de organismos patógenos (bacterianos o virales), de una mutación
específica y de un gen extraño.
Hoy en día, la búsqueda de secuencias
polinucleotídicas que actúan como dianas representa un objetivo
principal en numerosos laboratorios de investigación implicados en
numerosos ámbitos de actividad, y principalmente en el ámbito médico
o agroalimentario o la industria química. En estos ámbitos, la
búsqueda de secuencias que actúan como dianas pretende por
ejemplo:
- -
- el diagnóstico de virus en el origen de enfermedades, tal como el SIDA (HIV) o la hepatitis B (HBV).
- -
- El diagnóstico específico de enfermedades de origen bacteriano, tal como la tuberculosis o la lepra.
- -
- El diagnóstico de mutaciones en el origen de enfermedades genéticas o de cánceres celulares.
- -
- El diagnóstico de una contaminación bacteriana en una cadena agroalimentaria, y
- -
- La búsqueda de los microorganismos implicados en la corrosión biológica de las canalizaciones o de los contenedores utilizados en procedimientos industriales.
La dificultad principal de los métodos de
diagnóstico utilizados en el estado de la técnica anterior reside en
la especificidad, la sensibilidad, la rapidez y la reproductibilidad
del ensayo de diagnóstico utilizado. Es indispensable poder dar un
resultado evidente. Conviene pues disponer de un método que se puede
realizar a partir de una muestra de partida cualquiera que sea su
naturaleza u origen. Es necesario por otro lado un método que
permite reducir los faltas positivas debidos a la composición de la
muestra o generados por el método empleado.
Ahora bien, tal como se indica anteriormente, los
métodos del estado de la técnica anterior se basan esencialmente
sobre la detección de fragmentos de ácidos nucleicos que permiten
eventualmente cuantificar un gen. Entre éstos, se puede citar:
- -
- Los ensayos que utilizan sondas genéticas, donde la cantidad de secuencia diana detectada depende del tamaño y de la homología de la sonda. Estos ensayos se aplican a la detección de distintos organismos, como bacterias, virus, micobacterias, hongos u otros parásitos. El problema de estos ensayos reside en su baja sensibilidad, y
- -
- Los ensayos de amplificación tipo PCR u otros que permiten detectar específicamente una información genética con una verdadera sensibilidad, que debe a pesar de todo ser matizada por problemas técnicos que conduce a faltas positivas.
Durante un diagnóstico de secuencias por
amplificación tipo PCR, no se está seguro sobre la naturaleza del
amplicon, y en el caso en que la proteína analizada se busca por
inmunodetección, los resultados pueden corresponder a una reacción
cruzada no específica. Además, en estos dos casos, no se conoce la
actividad de la proteína buscada.
Además, estos ensayos de detección no permiten
obtener información sobre la actividad funcional del producto del
gen, lo que puede:
- -
- generar faltas positivas durante la detección de secuencias homólogas en lugar de la secuencia diana,
- -
- generar errores de diagnóstico, tal como en el caso de la detección de un gen mutado codificador de una proteína no funcional,
- -
- alcanzar un nivel insuficiente de información, como, por ejemplo, la detección de un patógeno sin que por ello dar indicación sobre su virulencia o su sensibilidad a un tratamiento, lo que conduce a un defecto de caracterización, y
- -
- alcanzar un umbral máximo de sensibilidad muy baja.
También, se pueden citar los ensayos
inmunológicos o de incorporación de radioactividad durante la
síntesis de proteínas que permiten detectar y eventualmente
cuantificar directamente una proteína. En efecto, se utilizan
algunos anticuerpos en rutina para identificar específicamente un
antígeno en una muestra. Sin embargo, estos ensayos no dan
generalmente información sobre la actividad funcional de la
proteína.
Igualmente, existen en el estado de la técnica
anterior, ensayos que permiten efectuar directamente la detección de
una función a partir de una muestra sin pasar por los ácidos
nucleicos presentes en dicha muestra. Se trata entonces de trabajar
directamente sobre el conjunto de los factores presentes en la
muestra y susceptibles de actuar sobre el ensayo funcional. Sin
embargo, no será posible distinguir una misma función procedente de
dos factores diferentes. Se puede tratar, por ejemplo, de una
función asociada a dos virus diferentes que no será posible de
distinguir con el mismo ensayo funcional. Se puede citar, la
detección de la actividad funcional de transcriptasa inversa
propuesta en la solicitud de patente internacional PCT publicada
bajo el Nº W096/23076, donde no se puede determinar la actividad de
transcriptasa inversa procedente de HIV o de otro virus.
Finalmente, se pueden citar los ensayos de
detección de función y de variantes funcionales basados en etapas
realizadas in vivo como los antibiogramas, o en técnicas de
ensayos fenotípicos por ejemplo sobre el virus HIV. Si las cepas
manipuladas son peligrosas, requieren condiciones de seguridad
particulares y por lo tanto adaptaciones especiales de los
laboratorios. Además de su complejidad de empleo que las vuelve
difícilmente automatizable, estos ensayos son costosos y de empleo
largo y fastidioso. Así, en el caso de los virus, el aislamiento de
los virus dura de 4 a 10 semanas. Ensayos más recientes basados en
métodos de clonación de una cavidad enzimática toman también de 3 a
4 semanas. Además, estos ensayos no permiten siempre detectar las
variantes minoritarias.
Se describieron en el estado de la técnica
anterior los siguientes trabajos:
Resto et al. (1992, NAR20 (22),
5979-5983) se refiere a un método de mejora de la
expresión de proteínas en un medio acelular.
Henkel y Baeuerle (1993, Analytical Biochemistry
214 (1), 351-352), se refiere a un método de
comparación de mutantes por la expresión directa in vitro de
productos de PCR Hoeltke.
Hoeltke et al, (1985, Biotechniques 18 (5),
900-907), describe un método de marcado de proteínas
expresadas in vitro que constituye una alternativa al marcado
radioactivo.
La solicitud de patente internacional W09424303
se refiere a una mejora del método de síntesis in vitro de
proteínas.
La solicitud de patente internacional W0927949 se
refiere a un método de producción de proteínas in vitro sin
pasar por una etapa de clonación.
Database WPI, AN 1995-287962,
describe la secuencia de una proteinasa de HCV y su utilización en
un ensayo de actividad.
La solicitud de patente inglesa nº 2276621,
describe un vector utilizado en ensayos de producciones in
vivo de la proteasa de HIV utilizados para identificar
inhibidores de la enzima.
La solicitud de patente internacional W09608680,
describe un método in vitro para evaluar la eficacia de un
fármaco contra una forma mutante biológicamente activa o contra una
forma salvaje de la proteinasa HIV.
Jermutus et al, (1998, Current Opinion in
Biotechnology 9 534-548), describe los recientes
avances en la producción y la selección de proteínas producidas en
un medio acelular.
El objetivo de la presente invención es
precisamente ofrecer un método de detección y ventajosamente de
cuantificación de una función conocida eventualmente presente en una
muestra que no presenta los inconveniente anteriormente citados. El
método de la invención se aplica, bien entendido, para la detección
y/o la cuantificación simultánea o no simultánea de una o de varias
funciones conocidas presentes en la misma muestra o en muestras
diferentes agrupadas. Así, el empleo a continuación del término
"función" en singular cubrirá igualmente el término
"funciones" en plural y viceversa, excepto cuando se indique
explícitamente que se trata de la aplicación del método de la
invención sobre varias funciones. El método de la invención permite
por lo tanto no sólo detectar y ventajosamente cuantificar una o
varias funciones, sino también caracterizarlas desde el punto de
vista bioquímico a partir de una única muestra.
El objetivo de la presente invención es ahora
ofrecer un método de diagnóstico basado en la función de una o de
varias proteínas producidas en un sistema acelular a partir de los
ácidos nucleicos de una muestra.
Se entiende por función, la actividad de una o de
varias proteínas específicas de al menos un organismo o de al menos
un proceso, y que se detecta y/o se cuantifica según la presente
invención por el sesgo de un ensayo de la función de dicha o de
dichas proteína(s). En el marco de esta invención, el
fenotipo se considera como una función. El método de la invención
encuentra, por lo tanto, muy particularmente su aplicación en el
ámbito del diagnóstico in vitro y, especialmente, en materia
de análisis de una función. En efecto, se entiende también por
función, en el sentido de la presente invención, la manifestación de
una propiedad observable que corresponde a la expresión de uno o
varios genes. Esta manifestación se puede traducir por la expresión
de una característica morfológica, de un síndrome clínico, de una
resistencia a un compuesto tóxico, de la actividad de una proteína o
también de la producción de una sustancia tal como un metabolito, un
antibiótico, etc. En el marco de esta definición de la función, la
invención permite también el análisis in vitro de una función
que corresponde al resultado de la expresión de varios genes, siendo
todas las proteínas correspondientes necesarias para la expresión de
dicha función. En esta forma de realización de la invención, los
genes codificadores de esta o de estas funciones pueden estar
situados:
- -
- sobre el mismo fragmento de ADN, en el caso de un fenotipo expresado por un operón, y
- -
- en distintos sitios del ADN genómico, en el caso de algunas vías metabólicas.
El fenotipo analizado según el procedimiento de
la invención puede, por lo tanto, no ser solamente el asociado a una
proteína, sino el asociado a un conjunto de proteínas. Se trata por
ejemplo, tal como se indica anteriormente, de un fenotipo que
corresponde a la síntesis de un metabolito (metabolito energético,
antibiótico, etc...), a la degradación de un compuesto (de tipo
nutrimento o xenobiótico) o a la unión de una proteína compleja
constituida de varias subunidades idénticas o diferentes.
La función puede corresponder por ejemplo a una
actividad enzimática o a una afinidad. En el marco de la puesta de
manifiesto de una actividad enzimática, cualquier tipo de sustrato
específico se puede considerar por el experto en la técnica para
poner de manifiesto la presencia de la función buscada. El experto
en la técnica podrá por ejemplo referirse a obras como Methods in
Enzymology o Annual Review Of Biochemistry, en las cuales se
describieron un gran número de métodos de dosificación de enzimas y
de preparación de sustratos. En el caso de la puesta de manifiesto
de una afinidad por ejemplo de un antígeno para un anticuerpo, de
una proteína para el ADN, de un receptor para ligando etc... la
puesta de manifiesto de una función se puede realizar por ejemplo
por ensayos tal como la fijación de ligandos marcados por un isótopo
o por una enzima o por un fluoroforo, por una detección inmunológica
que utiliza anticuerpos marcados por un metal o por una enzima o por
un fluoroforo.
Se entiende por organismo, todo tipo de organismo
o microorganismo, como virus, bacterias, algas, hongos, o cualquier
producto que incluye ácidos nucleicos sintéticos o naturales que
permite la expresión de las funciones buscadas mediante el
procedimiento de la invención.
Se entiende por proceso, el desarrollo de una
enfermedad, de una infección o de células por ejemplo cancerosas o
de contaminantes. Estos procesos pueden tener lugar sobre un huésped
o en un procedimiento industrial.
Se entiende por extracto de traducción un
extracto que incluye todos los factores necesarios en la etapa de
traducción a partir de los mensajeros neosintetizados tal como, por
ejemplo, los ribosomas, los tRNA, los factores de alargamiento, los
factores de iniciación, etc...
Se entiende por función conocida, la función que
se analiza, según el procedimiento de la invención y que se puede
detectar y/o medir por un ensayo funcional.
El material biológico a partir del cual se
obtiene la muestra sobre la cual se realiza el método de la
invención puede ser cualquier muestra susceptible de contener ácidos
nucleicos de tipo humano, animal, vegetal, microbiano, viral o
muestras procedente del suelo, del agua, de la biopsia, de distintas
células, un proceso o un organismo. Estas muestras pueden también
corresponder a productos de cualquier método de amplificación del
ADN genómico, del ADN sintético, del ARN o cualquier producto de
ácidos nucleicos que proceden de tratamientos generalmente
utilizados por el experto en la técnica. Se puede tratar, bien
entendido, de una muestra biológica bruta tal como la sangre,
tejidos, orina o cualquier otro líquido corporal como el líquido
cerebro-espinal, sinovial, pleural, pericárdico o
previamente tratado para preparar los ácidos nucleicos que le
contienen.
Por lo tanto, la presente invención tiene por
objeto un método de diagnóstico de la presencia de un organismo o
del desarrollo de una enfermedad o de una infección o también de
células, en una muestra biológica, caracterizado porque se detecta
y/o se mide la función de una o de varias proteínas específicas de
dicho organismo o el desarrollo de una enfermedad o de una infección
o también células, siendo dichas proteínas producidas en un sistema
acelular a partir de los ácidos nucleicos de la muestra.
Más particularmente, el método anteriormente
descrito incluye las etapas siguientes:
- a)
- la preparación, a partir de los ácidos nucleicos de la muestra, de moléculas de ácidos nucleicos que incluyen el o los genes codificadores de una o de varias proteínas específicas de dicho organismo o el desarrollo de una enfermedad o de una infección o también de células, y los elementos de control necesarios para la transcripción y la traducción de dicho o de dichos genes;
- b)
- la transcripción y la traducción en un sistema acelular de molécula(s) de ácido nucleico preparada(as) en la etapa (a); y
- c)
- el diagnóstico de la presencia de un organismo o del desarrollo de una enfermedad o de una infección o también de células por detección y/o medida de la función o de la o de las proteínas producidas en la etapa (b).
La exposición de las distintas formas de empleo
de la invención se ajusta a las reivindicaciones.
Así, es necesario entender por método de
detección y/o de cuantificación, un método de diagnóstico.
Cuando el procedimiento de la invención es un
método de detección, se prepara en la etapa (a) al menos una
molécula de ácido nucleico que comprende el o los genes
codificadores de la o de las proteínas que corresponden a dicha
función. Preferentemente, cuando el método de la invención es un
método de cuantificación, se prepara en la etapa (a), una cantidad
de moléculas de ácidos nucleicos proporcional a la cantidad de dicho
o de dichos genes eventualmente presente(s) en los ácidos
nucleicos de la muestra. En consecuencia, los procedimientos
empleados en la etapa (a) tal como se describe a continuación, se
emplean de tal manera a garantizar esta proporcionalidad.
Con el fin de facilitar la exposición de la
invención, se designa en la etapa (a) del método de la invención,
con el término de gen, cualquier secuencia de ácidos nucleicos que
permite la expresión de la o de las proteína(s) que
corresponde a la función detectada. Por lo tanto, se puede tratar de
secuencia de ADN o de ARN.
La detección y/o la medida de la función que
corresponde a la o a las proteínas producidas en la etapa (b) se
realiza por cualquier ensayo funcional de dicha o de dichas
proteínas determinado por el experto en la técnica. Si los ácidos
nucleicos están presente en la muestra, la función se detecta o se
valora de manera directa o indirecta por uno o varios ensayos
funcionales de la o de las proteínas producidas en la etapa (b). La
detección y/o la medida de la función que corresponde a la o a las
proteínas producidas en las etapas (b) puede emplear una de las
etapas (a) y/o (b) y/o (c), una o varias moléculas transportadoras
que permiten revelar la presencia de la o de las funciones
analizadas características de un proceso o un organismo.
La molécula transportadora, si está presente,
puede ser cualquier sustancia capaz de revelar directamente o
indirectamente la función conocida buscada codificada por la o las
proteínas expresadas en la etapa (b), como una molécula de ácido
nucleico, una proteína, un péptido, tal como un anticuerpo o una
mezcla de anticuerpo(s) específico(s) de una proteína
y capaz(ces) de revelar su actividad, o un sustrato o una
cascada de sustratos, en que uno es el de la enzima que corresponde
a la función buscada o cualquier molécula química o sintética u
orgánica.
Así, en la etapa (c), la puesta en contacto de la
molécula transportadora con las proteínas eventualmente expresadas
en la etapa (b) se puede realizar por adición de la molécula
transportadora en la mezcla de la reacción que resulta de la etapa
(b). Pero la molécula transportadora puede también estar presente en
la mezcla de la reacción desde cualquiera de las etapas (a) o (b),
bien sea bajo su forma final de molécula transportadora, o bien,
según una forma particular de realización de la invención, bajo la
forma de una molécula de ácido nucleico (ADN o A8N) que corresponde
al gen codificador de dicha molécula transportadora, y entonces se
designa a continuación un gen transportador. En este método de
realización particular, la molécula transportadora se producirá
entonces en la etapa (b) conjuntamente con la o las proteínas que
corresponderán a la función buscada.
En esta forma particular de empleo del método de
la invención, se coloca el gen transportador bajo las mismas
secuencias de control de regulación de la transcripción y la
traducción que el o los genes codificadores de la o de las proteínas
que corresponden a la función analizada de manera para ser
coexpresada con éstas y así permitir a la molécula transportadora
estar presente en la etapa (c). El gen transportador con sus
secuencias de regulación de la transcripción y de la traducción está
presente bajo cualquier forma de ácido nucleico tal como un vector
de expresión in vitro.
A título de ejemplo, el gen transportador puede
ser el gen de la proteína GFP (Green Fluorescent Protein) o el de la
beta-lactamasa (TEM-1).
En el caso de la GFP, la etapa (c) comprende la
detección y la cuantificación de la emisión de fluorescencia. Así,
el método de la invención permite por ejemplo realizar un ensayo tal
como la GFP que solo es fluorescente si la secuencia diana es
ausente de la muestra de ácido nucleico estudiado. Conviene señalar
que el gen transportador de la GFP presenta la ventaja de producir
una proteína, cuya actividad es instantáneamente medible, lo que
permite un ahorro de tiempo suplementario.
En el caso de la beta-lactamasa,
la etapa (c) comprende la medida de la actividad de esta enzima,
incubando una fracción de la reacción de traducción en un tampón que
contiene nitrocefina. La nitrocefina es una
beta-lactamina cromogénica que tiene la propiedad de
cambiar de color de amarillo a rojo cuando se hidroliza con una
beta-lactamasa activa. Un ensayo rojo indica por
ejemplo que la secuencia diana está presente en la muestra de ácido
nucleico analizado.
Cualquier otro gen transportador se puede
considerar en el marco del método de la invención, como, por
ejemplo, los de la beta-galactosidasa, la
luciferasa, la peroxidasa o una microperoxidasa etc... Hay que
señalar que un gen transportador que corresponde a una proteína que
tiene una actividad enzimática presenta una gran sensibilidad debida
al coeficiente enzimático multiplicador.
Por lo tanto, el método de la invención ofrece
una gran elección de modo de realización a partir de genes y
moléculas transportadoras elegidos en función de la naturaleza y la
actividad de la o de las proteínas que corresponden a la función
buscada.
La medida de la actividad de una o de varias
proteínas en la etapa (c) se puede leer directamente en un lector de
fluorimetría si la medida de la función emplea un fluoroforo tal
como por ejemplo la GFP, o de colorimetría si la medida de la
función emplea un cromoforo como por ejemplo la nitrocefina. Pero se
puede igualmente considerar medidas por absorbancia, por
viscosimetría, por espectrofotometría de masa o cualquier otro
método vinculado a la medida de la función en la etapa (c). Es
completamente posible realizar una lectura, en continuo de la
función, si el ensayo funcional se presta a ello.
Como se indica anteriormente, la función
analizada puede corresponder a una única proteína o a varias
proteínas, tal como, por ejemplo, en el caso de un fenotipo
expresado por un operón, en consecuencia, el método de la invención
acepta varias formas de realización.
Cuando la función detectada y/o cuantificada
corresponde a una sola proteína, el método de la invención comprende
las etapas (a) a (c) siguientes:
- a)
- la preparación, a partir de la muestra de ácido nucleico, de molécula de ácidos nucleicos que comprenden el gen que codificador de la proteína que corresponde a dicha función en 5' de dicho gen, un promotor de ARN polimerasa y un sitio de fijación de los ribosomas, y eventualmente un terminador de ARN polimerasa en 3' de dicho gen, y
- b)
- la transcripción y la traducción in vitro de la molécula de ácido nucleico preparada en la etapa (a), eventualmente en presencia de una o de varias moléculas transportadoras que permiten revelar y/o medir la actividad, la presencia o la ausencia de la proteína que corresponde a dicha función,
- c)
- la puesta en contacto de las proteínas eventualmente producidas en la etapa (b) con una o varias moléculas transportadoras, si ésta(s) no está(n) presente(s) en la etapa (b), que permite revelar y/o medir la actividad y la presencia de la proteína que corresponde a dicha función.
Pero el método de la invención se puede también
aplicar a la detección y/o a la cuantificación de una función que
corresponde a un conjunto de proteínas. Los genes codificadores de
estas proteínas se pueden situar sobre el mismo fragmento de ADN
como en el caso de un operón, o en distintos sitios del ADN genómico
como en el caso de algunas vías metabólicas.
Cuando la función conocida analizada corresponde
a varias proteínas, la etapa (a) del método de la invención admite
las dos formas de empleo siguientes:
- I)
- bien sea, dichos genes se agrupan en forma de un operón, y entonces la etapa (a) consiste en preparar a partir de la muestra de ácidos nucleicos, una molécula de ácido nucleico que comprende los genes (el operón) codificadores de las proteínas que corresponden a dicha función, si están presentes en los ácidos nucleicos de la muestra, en 5' del conjunto de dichos genes (del operón) un promotor de ARN polimerasa, eventualmente en 3' del conjunto de dichos genes (del operón) un terminador de ARN polimerasa, y para cada uno de dichos genes su sitio de fijación de los ribosomas natural.
- II)
- o bien, dichos genes se separan y entonces la etapa (a) consiste en preparar, a partir de la muestra de ácido nucleico, una o varias moléculas de ácido nucleico que comprende los genes codificadores de las proteínas que corresponden a dicha función, si están presentes en los ácidos nucleicos de la muestra, en 5' de cada uno de dichos genes un promotor de ARN polimerasa y un sitio de fijación de los ribosomas, y eventualmente en 3' de cada uno de dichos genes un terminador de ARN polimerasa.
En la primera forma de empleo (I) citada
anteriormente, un empleo preferido se refiere al sitio de fijación
de los ribosomas de cada uno de los genes, que es su sitio de
fijación de los ribosomas natural, y se prefiere entonces utilizar
en la etapa (b) un extracto de traducción preparado a partir del
organismo de que procede la muestra de ácidos nucleicos o de un
organismo filogenéticamente próximo.
En la segunda forma de empleo (II) citada
anteriormente, el sitio de fijación de los ribosomas puede ser el
sitio natural de cada uno de los genes u otro sitio de fijación de
los ribosomas más adaptado a la etapa (b) de traducción.
Una variante de la primera (I) y segunda forma
(II) de empleo citadas anteriormente, consiste en realizar en
paralelo o simultáneamente, el método de la invención descrito
anteriormente cuando la función analizada corresponde a una sola
proteína, estando cada etapa (a) realizada con cada uno de los
genes. Una alternativa a la realización en paralelo o simultánea de
los métodos de la invención, consiste en realizar por separado para
cada uno de los genes las etapas (a) y (b), luego, para la detección
y/o la medida final de la función que implica cada una de las
proteínas, para reunir los productos de las etapas (b) para realizar
la etapa (c).
Del mismo modo, cuando la función analizada
corresponde a proteínas cuyos genes están físicamente separados
sobre el genoma, el método de la invención consiste en realizar en
paralelo o simultáneamente, el método descrito anteriormente cuando
la función analizada corresponde a una sola proteína, estando cada
etapa (a) realizada con cada uno de los genes. Una alternativa a la
realización en paralelo o simultánea de los métodos de la invención,
consiste en realizar por separado para cada uno de los genes, las
etapas (a) y (b), luego, para la detección y/o la medida final de la
función que implica cada una de las proteínas, para reunir los
productos de las etapas (b) para realizar la etapa (c).
\newpage
La invención se refiere también a un método de
cuantificación de una función conocida, a partir de los ácidos
nucleicos presentes en dicha muestra, caracterizado porque
comprende:
de a) a c) la medida de dicha función según las
etapas (a) a (c) citadas anteriormente, luego
- d)
- la comparación de la medida de la función eventualmente presente en la muestra efectuada en la etapa (c) con un valor patrón o un conjunto de valores patrones de dicha función medido sobre una o varias muestras patrones según un procedimiento de medida idéntico o equivalente al de la etapa (c).
Una muestra patrón para la realización de la
etapa (d) citada anteriormente puede ser cualquier muestra que
contiene:
- -
- una cantidad, ventajosamente conocida, de gen o de genes codificador(es) de las proteínas que corresponden a la función analizada por el método de la invención, y que entonces será sometido a un tratamiento de transcripción y traducción como en la etapa (b), luego la función de la o de las proteínas obtenidas se medirá según un procedimiento de medida idéntico o equivalente al de la etapa (c),
- -
- una cantidad, ventajosamente conocida de la o de las proteínas que corresponden a dicha función, la cual se medirá según un procedimiento de medida idéntico o equivalente al de la etapa (c), y
- -
- una cantidad, ventajosamente conocida, de uno o varios organismos o procesos que poseen el o los genes codificadores de la o de las proteínas que corresponden a dicha función, la cual se medirá según un procedimiento de medida idéntico o equivalente al de la etapa (c).
La muestra patrón puede proceder de un medio
idéntico o diferente del sobre el cual se realizan las etapas (a) a
(d) del método de la invención. Se puede tratar del mismo medio pero
tomado en un diferente momento.
En una forma particular de realización del método
de detección de la invención, la muestra puede contener en sí misma
el patrón.
Se puede evaluar, especialmente, con respecto a
un umbral máximo predeterminado o con respecto a una curva estándar
que permite la comparación de las medidas de la función de la etapa
(c) con las de muestras patrones.
En el marco de los diferentes empleos de la
presente invención, la preparación de la muestra en la etapa (a) del
método de la invención consiste en colocar una o varias secuencias
de ácido nucleico codificadoras de la o de las proteínas que
corresponden a la función analizada que se desea detectar o
cuantificar bajo el control de elementos necesarios para la
transcripción y para la traducción in vitro.
Así, en la etapa (a), las secuencias de control
del o de los genes codificadores de las proteínas que corresponden a
la función detectada y/o cuantificada según el procedimiento de la
invención son para la transcripción:
- -
- un promotor de ARN en 5' de la hebra codificadora del o de dichos genes,
- -
- eventualmente un terminador de ARN polimerasa en 3', y para la traducción,
- -
- un sitio de fijación de los ribosomas que puede ser o no el o los sitio(s) de fijación natural(es) del o de los genes.
El promotor (en 5') y el terminador (en 3') si
está presente, de un ARN polimerasa, son por ejemplo los del ARN
polimerasa de los fagos T7, SP6, Q\beta o \lambda.
Una forma de empleo ventajosa de la etapa (a) del
método de la invención consiste en preparar la o las moléculas de
ácido nucleico mediante una reacción de amplificación del o de los
genes codificadores de las proteínas que corresponden al fenotipo
analizado, a partir de la muestra de ácidos nucleicos. Se puede
tratar de una amplificación por PCR o por técnicas derivadas de la
PCR del tipo RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR, o
técnicas diferentes de la PCR del tipo NASBA, SDA o rolling circle
entre otras. Ventajosamente esta preparación emplea una pareja de
oligonucleotidos o una pareja de cebadores específicos de la o de
las moléculas de ácido nucleico que comprenden el o los genes
codificadores de la o de las proteínas que corresponden a la función
analizada. Esta preparación por amplificación se realiza con la
ayuda de uno o varios pares de cebadores, cada uno constituido para
el ejemplo de la PCR (figura 1) y de la NASBA:
- -
- para el cebador sentido, de la secuencia que se hibrida aguas arriba, de una o de varias moléculas de ácido nucleico que comprende el o los genes codificadores de la o de las proteínas que corresponden a la función analizada, y de un promotor de ARN polimerasa y eventualmente un sitio de fijación de los ribosomas, y
- -
- para el cebador antisentido, de la secuencia que se hibrida aguas abajo, de una o de varias moléculas de ácido nucleico que comprende el o los genes codificadores de la o de las proteínas que corresponden a la función analizada.
La etapa (a) se puede realizar mediante cualquier
otra técnica conveniente. En efecto, la preparación de la molécula
de ácido nucleico de la etapa (a) se puede realizar mediante
cualquier otro método conocido por el experto en la técnica tal
como, por ejemplo, un corte de restricción que permite recuperar el
o los genes de interés seguido de una ligación orientada con los
elementos de control necesarios para la transcripción y la
traducción in vitro indicadas anteriormente.
Cuando la invención se refiere a la detección o a
la cuantificación de al menos dos funciones en la misma muestra,
cualquiera que sea la técnica de preparación de la o de las
moléculas de ácido nucleico en la etapa (a), ésta se puede emplear
con cebadores discriminantes o no discriminantes.
Así, cuando la etapa (a) se utilizan cebadores no
discriminantes, entonces en la etapa (c) se detecta y/o se miden
dichas funciones por ensayos funcionales que permiten diferenciar
dichas funciones.
O, cuando en la etapa (a) se utilizan cebadores
discriminantes, mientras que en la etapa (c) se detectan y/o se
miden dichas funciones por ensayos funcionales que permiten o no
distinguir dichas funciones.
En el caso de utilización de parejas de cebadores
en la etapa (a) de la preparación de moléculas de ácidos nucleicos,
se pueden realizar distintas formas de empleo del método de la
invención. Es posible combinar en un tubo solo o no dos reacciones
de detección y/o cuantificación objeto del método de la invención.
La etapa (a) se realiza entonces con los cebadores necesarios para
la amplificación específica de los genes dianas. En este caso, se
pueden utilizar dos ensayos funcionales diferentes para detectar y/o
cuantificar cada una de las funciones. También es posible utilizar
el mismo ensayo funcional para las funciones, y un resultado
positivo indica entonces únicamente la presencia de una o de otra de
las proteínas dianas. Por lo tanto, es posible utilizar tantos
ensayos funcionales como proteínas dianas, permitiendo cada
transportador diferente revelar cada una de las proteínas
dianas.
Es posible utilizar cebadores discriminantes o no
discriminantes de la etapa (a) y/o ensayos funcionales diferentes o
no en la etapa (c) del método de la invención (ejemplo I).
Los cebadores discriminantes permiten aislar
específicamente una secuencia de ácido nucleico codificadora de una
proteína que corresponde a una función representativa de un proceso
o de un organismo, mientras que los cebadores no discriminantes no
permiten inevitablemente aislar específicamente un gen codificador
de dicha función.
En el caso de la utilización de cebadores no
discriminando en la etapa (a) del método de la invención, la
especificidad del proceso o del organismo se podrá determinar por un
ensayo funcional o por una combinación de ensayos funcionales
realizados en la etapa (c) del método de la invención. Los cebadores
no discriminantes pueden ser universales o no universales,
degenerados o no degenerados. Se entiende por cebadores degenerados,
los cebadores que se hibridan parcialmente al diana nucleotídico
codificador de la proteína que corresponde a la función buscada.
Igualmente, se entiende por cebadores no discriminantes los
conjuntos de parejas de cebadores discriminantes para preparare en
la etapa (a) la o las moléculas de ácido nucleico que comprende el o
los genes codificadores de las proteínas que corresponden a la
función buscada presente en uno o varios procesos o uno o varios
organismos.
Es posible realizar el método de la invención
combinando cebadores discriminantes o no discriminantes en la etapa
(a) con ensayos funcionales específicos o no específicos en la etapa
(c) para realizar la detección y la cuantificación de un proceso o
de un organismo. En efecto, es la interpretación de estos distintos
ensayos que permite determinar la especificidad de la detección.
El método de la invención permite analizar las
distintas funciones que corresponden a la expresión de varios
mutantes de un mismo gen que se pueden contener en una misma muestra
de ácidos nucleicos de partida. Como ejemplo de esta aplicación del
método de la invención, se pueden citar los distintos mutantes del
gen de la proteasa del VIH contenidos en una muestra de un paciente
infectado por este virus. El empleo del método de la invención
consiste entonces en realizar cada etapa (a) con cada uno de los
mutantes de dicho gen de manera a expresar cada uno de éstos por
separado. La separación de los mutantes contenidos en la muestra se
puede realizar por clonación, dilución extrema o por cualquier otro
método conocido por el experto en la técnica. Por lo tanto, esta
aplicación del método de la invención consiste en analizar las
distintas formas de una función conocida contenida en una única
muestra de ácidos nucleicos. Se entiende por distintas formas de una
función conocida, la manifestación de propiedades comparables, ya
que todas las variantes de la proteasa del VIH tienen una actividad
proteásica, pero distinguibles unas de otras, puesto que cada
variante proteica de la proteasa del VIH puede presentar una
resistencia específica a una antiproteasa.
Por lo tanto, la invención se refiere también a
la aplicación del método para la detección y/o la cuantificación
in vitro de las distintas formas de una función conocida en
una muestra de ácidos nucleicos susceptibles de contener el o los
genes codificadores de la o de las proteínas que corresponden a
estas distintas funciones. En efecto, tal como se indica
anteriormente sobre la proteasa del VIH, la muestra de un paciente
infectado por este virus puede contener varias variantes del virus
que expresa cada una, una proteasa diferente. Por lo tanto, es
interesante efectuar no solamente un diagnóstico de la presencia del
virus por medio de la búsqueda de la función de la proteasa del
virus conforme al método de la invención, sino también realizar un
análisis de la representación de los diferentes variantes de esta
proteasa.
Sobre la base de este ejemplo sobre el VIH, la
invención permite el análisis in vitro de las distintas
formas de una función conocida que corresponde a la expresión de
varias variantes de un gen que se puede contener en una misma
muestra de ácidos nucleicos de partida. Este objetivo se alcanza
según la invención, ampliando eventualmente las diferentes
variantes, por ejemplo, por cultivo celular o por amplificación
molecular, luego aislando cada gen, por ejemplo por clonación o por
dilución extrema, y expresando cada uno de estos genes de acuerdo
con las etapas (a) y (b) del método de la invención, y finalmente
revelando de la o de las funciones buscadas.
Las reacciones de transcripción y de traducción
(etapa b) pueden ser simultáneas, lo que significa quo la fase de
traducción se realiza simultáneamente con la transcripción, o se
descompone en dos etapas distintas de transcripción y de
traducción.
El desacoplamiento de las etapas de transcripción
y de traducción permite optimizar los rendimientos de cada etapa, y
producir así cantidades más importantes de proteínas, lo que
encuentra toda su utilidad en el caso de la detección de enzimas de
baja actividad específica.
Este desacoplamiento permite también normalizar
la formación de los productos en la etapa (b) y poder comparar
posteriormente las distintas funciones expresadas.
Igualmente, el desacoplamiento entre la
transcripción y la traducción permite evitar los problemas de
degradación de la matriz ADN por las nucleasas si ésta ha sido
preparada por PCR. En efecto, los componentes de la reacción de
transcripción están menos contaminados por nucleasas, al contrario
de los extractos de traducción.
El desacoplamiento permite, por otro lado, el
empleo de extractos de traducción diferentes según el origen del ADN
tamizado. En efecto, la fase de traducción del transcrito se realiza
ventajosamente con un extracto de traducción del mismo origen o de
un origen próximo al de la muestra biológica sobre la cual se
practica el procedimiento de la invención. Así, se optimiza la
adecuación entre el origen de las señales de traducción de los
transcritos y el extracto celular para una eficacia de traducción
óptima. Se puede citar a título de ejemplo la utilización de un
extracto de traducción preparado a partir de células eucariotas para
la traducción de una secuencia diana eucariota o de un extracto de
traducción preparado a partir de micobacterias no patógenas para la
traducción de genes de micobacterias patógenas tal como la inteína
de RecA de Mycobacterium tuberculosis. En un otro caso
hipotético, el extracto de traducción se prepara a partir de
organismos extremofilos para la traducción de un gen de un mismo
organismo o de un otro organismo extremofilo del mismo tipo
(termófilos, halófilos, acidófilos, etc...). Estos extractos
respectivos son susceptibles de mejorar la eficacia del
procedimiento. Estos extractos se eligen por su capacidad de
traducir los transcritos.
El procedimiento de la invención es destacable
porque emplea una adecuación entre la puntuación de expresión de los
transcritos y los extractos de traducción utilizados. Estos
extractos también se caracterizan porque bien sea no contienen la
propiedad buscada, o bien la contienen pero que no es detectable en
las condiciones de ensayos realizados para detectar la función
buscada. Se trata por ejemplo de la utilización de un extracto de
traducción que contiene una actividad
beta-galactosidasa mesófila que permite traducir un
ARNm de una beta-galactosidasa termófila y de la
detección de la actividad de este último a alta temperatura, lo que
elimina la actividad beta-galactosidasa
mesófila.
En función del origen genético de las moléculas
de ácido nucleico preparadas en la etapa (a), por ejemplo ADN de
microorganismos Gram positivos, o Gram negativos, de eucariotas, de
virus etc..., y de la función ensayada, se pueden utilizar, por lo
tanto, distintos extractos de traducción.
Un empleo particular del procedimiento de la
invención consiste en utilizar en la etapa (b) un extracto de
traducción que sea de hecho una mezcla de varios extractos de
traducción. Se puede tratar por ejemplo de extracto de traducción de
E. coli que sobrexpresa una proteína chaperon A mezclada con
un extracto de traducción de E. coli que sobrexpresa una
proteína chaperon B. Todo tipo de mezcla es posible en el momento
que corresponde a las características descritas anteriormente. De la
misma manera, es posible utilizar un extracto de traducción en el
cual se añaden uno o varios tRNAs específicos de uno o de varios
codones. Los extractos de traducción así obtenidos permiten entonces
traducir mRNA que incluyen estos codones específicos, como, por
ejemplo, la traducción de un mRNA que contiene un codón ámbar
añadiendo de nuevo en el extracto de traducción uno o varios tRNAs
supresores.
El tratamiento de la etapa (b) con un extracto de
traducción se puede también realizar con un extracto estándar de
traducción cualquiera que sea el origen de la muestra tal como, por
ejemplo, un extracto de E. coli y/o cualquier otro extracto
celular suplementado o no suplementado por moléculas interesantes
como, por ejemplo, las indicadas anteriormente (tRNA, chaperon,
etc...).
Igualmente, es posible añadir al extracto de
traducción de la etapa (b) una o varias sustancias que favorecen un
repliegue o una maduración más eficaz de las proteínas expresadas,
como por ejemplo chaperones, detergentes, sulfobetainas, extractos
membranales, etc....
En el caso en que la secuencia diana es de tipo
eucariota, la reacción de transcripción de la etapa (b) se puede
completar por una reacción de "splicing" y maduración in
vitro de los ARNm añadiendo un extracto nuclear a la mezcla de
la reacción.
En el caso particular en que el gen transportador
coexpresado con la o con las proteínas codificadores de la o de las
funciones, la reacción de transcripción y de traducción de la etapa
(b) se estandariza de manera a evitar resultados que corresponden a
faltas positivas o faltas negativas:
- -
- por una parte, para que la proteína diana codificadora de la función tenga tiempo de actuar a nivel de la medida de la función en la etapa (c) tal como, por ejemplo, de actuar sobre el transportador para inhibirlo por ejemplo, o para evitar su colocación en condiciones en que el transportador fuera en cantidad más elevada que la proteína diana, y
- -
- por otra parte, para colocarse en condiciones de actividad a la vez para la proteína diana (que corresponde a la función) y el transportador si es necesario para el ensayo de medida en la etapa (c).
El método de detección y/o de cuantificación de
una función conocida objeto de la invención es destacable porque
permite evitar los faltas positivas debidos a interferencias de los
compuestos presentes en la muestra de partida durante la detección
y/o la medida de la función analizada en la etapa (c). En efecto,
debido al mismo principio del método de la invención, las
interacciones potenciales de los compuestos del medio inicial sobre
la detección y/o la cuantificación de la función a detectar y/o
cuantificar se reducen (por ejemplo por dilución de dicho medio
inicial al horno y a medida de las distintas etapas del
procedimiento de la invención, pero sobretodo por la especificidad
del ensayo funcional utilizado en la etapa (c) del procedimiento de
la invención). Además, el método de la invención que se une a
detectar y/o cuantificar una función, todas las moléculas de ácido
nucleico codificadoras de proteínas no funcionales o todas las
moléculas de ácido nucleico que presenta homologías de secuencia con
la secuencia buscada pero codificadora de una función diferente no
serán detectadas, lo que es una de las ventajas principales del
método de la invención con respecto a las técnicas del estado de la
técnica anterior.
El método de la invención ofrece la ventaja de
poder detectar específicamente una o varias secuencias dianas en una
muestra a analizar y de trabajar posteriormente directamente sobre
esta o estas secuencias dianas. La sensibilidad de este método se
explica por el coeficiente multiplicador de las etapas (b) y (c) que
corresponden respectivamente a la transcripción y a la traducción
del o de los genes preparados en la etapa (a) luego a la detección
y/o a la medida de la función que corresponde a la o a las proteínas
producidas en la etapa (b). Además, para aumentar la sensibilidad,
el método de la invención puede pasar después de la etapa de
transcripción por una etapa de amplificación de los transcritos
mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica tal
como la NASBA (Nucleic Acid Sequence-based
Amplification), la TMA (Transcription Mediated Amplification) antes
de la etapa de traducción. El método de la invención es, por otro
lado, rápido y reproductible, ya que se realizan todas las
reacciones in vitro, lo que permite estandarizar la detección
y franquear todos los problemas unidos a los ensayos de diagnóstico
in vivo, tal como la difusión membranal, la toxicidad celular
o el estado fisiológico de las células.
Conviene observar que en esta aplicación del
método de la invención, se pone de manifiesto la función buscada
gracias a la actividad de la proteína diana que se expresa in
vitro. En este caso, el método de la invención permite no
solamente poner de manifiesto la presencia de una o de varias
funciones de un proceso o de un organismo, sino también caracterizar
la actividad de la o de las proteínas correspondientes. Esta
caracterización, se puede también designar fenotipaje de la proteína
o de las proteínas expresadas según el procedimiento de la
invención, por oposición al genómico que es la caracterización de la
composición en ácidos nucleicos de la secuencia diana. El
diagnóstico de secuencias dianas corresponde también entonces al
diagnóstico de la función y a su caracterización. Se entiende por
ejemplo por caracterización, la definición del espectro de
inhibición de una proteína diana por inhibidores específicos o la
definición de una gama de pH en la cual la proteína diana es activa.
Si la función es una actividad enzimática, se puede tratar del
análisis de las condiciones óptimas de funcionamiento (pH,
temperatura y concentración en sales), de los parámetros cinéticos
(Vm y Km) y de los parámetros de inhibición (KI). Si la función es
una afinidad, se puede tratar de la determinación del Kd, o de la
molécula que tiene más afinidad para esta proteína. Se puede tratar
también de la determinación del tamaño de la proteína traducida o
del ARNm transcrito, y eventualmente de la secuenciación del gen
correspondiente.
A título de ejemplo, este método presente un
interés muy particular en el diagnóstico de la proteína diana que
corresponde a la proteinasa de ácido aspártico del virus HIV para
estudiar consecutivamente su sensibilidad a distintos inhibidores
específicos de proteinasas o antivíricos, cuando la secuencia diana
correspondiente está presente en una muestra de ácido nucleico.
La caracterización de una función representa la
determinación de las características de dicha función y en
particular la definición de sustancia(s) capaz(ces) de
modificar dicha o dichas función(ones). Se entiende por
sustancia los polinucleotidos, los péptidos, las proteínas, los
iones, las moléculas o composiciones químicas naturales o
sintéticas, hormonas, compuestos aromáticos, anticuerpos, fragmentos
de anticuerpos, genes, receptores celulares, aminoácidos,
glicopéptidos, lípidos, glicolípidos, azúcares, polisacáridos,
etc..., capaces de modificar la actividad de una o de varias
funciones de un organismo o de un proceso. Pudiendo estas dichas
sustancias corresponder a una o varias cabezas de series. Se puede
tratar de cualquier agente capaz de modificar la o las funciones tal
como las antivíricas, los inhibidores, los estimulantes, las
condiciones fisicoquímicas, las radiaciones o los tratamientos
térmicos. Esta caracterización se puede hacer en serie con la
detección y/o la cuantificación o de manera secuencial. Esta
caracterización de función permite efectuar análisis estadísticos.
En efecto, después de haber identificado distintas funciones o
diferentes variantes funcionales, es posible estudiar
individualmente por ejemplo su resistencia a una o a varias
sustancias. Esta forma de empleo del método de la invención se
realiza ventajosamente sobre una placa de microtitulación o sobre
una microplaca para estudiar por ejemplo, el comportamiento de
diferentes variantes genéticas de la función proteinasa de ácido
aspártico de HIV1 frente a varias antivíricas.
\newpage
En consecuencia, el método de la invención puede
incluir después de la etapa (c), un ensayo de dicha función con una
sustancia.
La detección y/o la cuantificación de distintas
funciones presentes en una muestra según el método de la invención
presentan una clara ventaja en el seguimiento de un organismo o de
un proceso. En efecto, el método de la invención permite detectar
y/o cuantificar por ejemplo las funciones de un virus y de un
componente celular. Este empleo de la invención encuentra por
ejemplo un interés muy particular en la detección y/o la
cuantificación de la presencia de un patógeno en un organismo (virus
o bacteria), que se puede (pueden) correlacionar para la detección
y/o la cuantificación de una función específica de dicho organismo
infectado o de la respuesta a la infección del organismo infectado
(por ejemplo producción del alfa-1-ácido
glicoproteína (AAG) en el caso de la infección por el virus
\hbox{del HIV).}
El método de la invención permite además efectuar
seguimientos de una o de varias funciones en distintas muestras.
Como ejemplo, se puede citar el seguimiento de las diferentes
variantes funcionales de distintas funciones características de una
infección por el virus HIV. La aparición de las diferentes variantes
funcionales es característica de los fenómenos de resistencias a una
o a varias antivíricas. Según el desarrollo de esta resistencia,
distintos tejidos llevarán diferentes variantes genéticas del virus,
el seguimiento de las diferentes variantes genéticas en distintos
tejidos dan entonces una indicación de la propagación de la
infección. Según los resultados de detección de las diferentes
variantes genéticas en distintos tejidos, el médico podrá juzgar
sobre el estado inmunitario de un paciente y de su capacidad de
luchar contra enfermedades oportunistas y prever para su enfermo
además un tratamiento por antivíricas, un tratamiento por
antibióticos y/o por antifúngicos.
Habida cuenta de la facilidad, del bajo coste y
de la rapidez del método de la invención, un seguimiento de la o de
las funciones se puede emplear de manera a efectuar periódicamente
la detección y la cuantificación de dicha o de dichas funciones. La
comparación de los resultados obtenidos en distintos tiempo y su
interpretación permite un seguimiento en el tiempo de la evolución
de un proceso.
Estos distintos seguimientos permiten al técnico
competente comprender el desarrollo de un proceso o de un organismo.
La interpretación de los resultados permitirá al técnico competente,
que emplea el procedimiento de la invención, tomar una decisión.
Las etapas del procedimiento de la invención se
pueden realizar sucesivamente o sucesivamente no sin interrupción o
no por el mismo operador. Se puede realizar sobre un dispositivo
automatizado que integra cada una de las etapas, o se pueden
realizar de maneras discontinuas, eventualmente por operadores
diferentes. Las muestras de ácidos nucleicos se pueden entonces
colocar sobre un soporte que puede corresponder por ejemplo a una
biomicroplaca o una placa de microtitulación que contiene de varias
decenas a varios millares de emplazamientos. Estos soportes se
conciben para permitir:
- -
- la preparación de las secuencias dianas (etapa a), y
- -
- la iniciación de las reacciones de transcripción y de traducción (etapa b) y para la revelación de la molécula transportadora (etapa c).
La invención se puede también realizar con la
ayuda de un kit.
En una primera forma de realización este kit
comprende: los medios de revelación de la función, un ARN
polimerasa, secuencias nucleotídicas para la preparación de las
moléculas de ácidos nucleicos que comprenden el o los genes que
permiten la expresión de la o de las proteínas que corresponden a la
función detectada y/o cuantificada, los cuatro nucleótidos
trifosfatos, las mezclas necesarias para dicha preparación, para la
transcripción y la traducción, eventualmente de los testigos.
En una segunda forma de realización este kit
comprende:
- -
- eventualmente los productos necesarios para la preparación de las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden el o los genes que permiten la expresión de la o de las proteínas que corresponden a la función detectada y/o cuantificada, y
- -
- cualquier soporte como placa de microtitulación o microplaca que contiene: los medios de revelación de la función un ARN polimerasa, los cuatro nucleótidos trifosfatos, las mezclas de transcripción y de traducción, eventualmente de los testigos.
Los kits y los soportes se pueden considerar para
la detección y/o la cuantificación simultánea o no simultánea de una
o de varias funciones que corresponden a uno o varios procesos o a
uno o varios organismos.
Un soporte que presenta una serie de
emplazamientos se puede utilizar para el empleo de un método de la
invención, caracterizado porque cada uno de dichos emplazamientos
permite la detección y/o la medida de una función diferente.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán en los ejemplos de realización de la invención, que
siguen y que se refieren a los dibujos adjuntos en los cuales:
- La figura 1 es una representación esquemática
del método de la invención,
- La figura 2 es una representación esquemática
de la aplicación del método de la invención al diagnóstico del virus
HIV,
- La figura 3 es una representación esquemática
de la aplicación de la invención al diagnóstico de Mycobacterium
tuberculosis,
- La figura 4 representa la detección de la
actividad total o de la actividad de las gamas poliresistentes por
el método de la invención,
- La figura 5 representa la detección de la carga
viral por el método de la invención, y
- La figura 6 representa la caracterización del
efecto de un inhibidor sobre una muestra positiva con respecto a un
testigo negativo por el método de la invención.
Los siguientes casos permiten ilustrar distintas
posibilidades del método de la invención.
1) Caso nº 1: Los cebadores utilizados en
la etapa (a) del procedimiento de la invención permiten detectar y
cuantificar la actividad de transcriptasa inversa del virus HIV.
La tabla 1 siguiente muestra que la utilización
de cebadores discriminantes en la etapa (a) del método de la
invención permite detectar por un ensayo funcional en la etapa
(c):
- -
- la ausencia de la función de transcriptasa inversa en la muestra 3, por lo tanto, la ausencia del virus HIV, y
- -
- la presencia de la función de transcriptasa inversa en las muestras 1 y 2, por lo tanto, la presencia del virus HIV en las muestras 1 y 2. El virus HIV está presente en mayor cantidad en la muestra 2 que en la muestra 1.
| Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | |
| Cebadores discriminantes utilizados en la etapa (a) | + | +++ | - |
2) Caso nº 2: los cebadores no
discriminantes se utilizan en la etapa (a) del método de la
invención para detectar en cada muestra la presencia potencial de
una actividad de transcriptasa inversa.
La tabla 2 siguiente muestra que la utilización
de cebadores no discriminantes en la etapa (a) del método de la
invención permite detectar por un ensayo funcional en la etapa
(c):
- -
- La ausencia de función de transcriptasa inversa en la muestra 3, por lo tanto, la ausencia de virus, y
- -
- La presencia de la función de transcriptasa inversa en las muestras 1 y 2, por lo tanto, la presencia de virus que posee una función de transcriptasa inversa en las muestras 1 y 2. La función de transcriptasa inversa está presente en mayor cantidad en la muestra 2 que en la muestra 1.
La tabla 2 siguiente muestra también que la
utilización de cebadores discriminantes en la etapa (a) del método
de la invención permite detectar por un ensayo funcional en la etapa
c):
- -
- la presencia de HIV en la muestra 1, y
- -
- la presencia de HBV en la muestra 2.
| Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | |
| Cebadores no discriminantes | + | +++ | - |
| Cebadores específicos del RT de HIV | + | - | - |
| Cebadores específicos del RT de HBV | - | +++ | - |
3) Caso nº 3: Se emplean algunos ensayos
funcionales diferentes en la etapa c del procedimiento de la
invención para detectar una polimerasa en función de su
termoresistencia.
La tabla 3 siguiente muestra que el método de la
invención permite detectar por distintos ensayos funcionales en la
etapa (c):
- -
- la presencia de una polimerasa preferencial activa a 100ºC en la muestra 1,
- -
- La presencia de una polimerasa activa a 50ºC en la muestra 2, y
- -
- la presencia de una polimerasa activa únicamente a 100ºC en la muestra 3.
| Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | |
| Ensayo funcional a 60º | + | +++ | - |
| Ensayo funcional a 100º | +++ | + | +++ |
4) Casos nº 4: Un ensayo funcional se
puede realizar en presencia de distintos sustratos para detectar y
cuantificar las distintas funciones presentes en una muestra. Este
ensayo funcional puede permitir por ejemplo detectar una actividad
polimerasa.
La tabla 4 siguiente muestra que el método de la
invención permite detectar por un ensayo funcional realizado en la
etapa (c):
- -
- la presencia de una actividad ADN polimerasa, ADN dependiente y ARN dependiente en la muestra 1,
- -
- La presencia de una actividad ADN polimerasa y ADN dependiente en la muestra 2,
- -
- La presencia de una actividad ADN polimerasa y ARN dependiente en la muestra 3, y
- -
- El ensayo funcional en ausencia de sustrato es un testigo negativo que permite validar la detección.
| Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | |
| Ensayo funcional + ADN | + | + | - |
| Ensayo funcional + ARN | + | - | + |
| Ensayo funcional sin sustrato | - | - | - |
5) Caso nº 5: Este caso representa por
ejemplo la detección del virus HIV en las muestras sanguíneas 1, 2 y
3. Se realizan dos ensayos funcionales para controlar la
especificidad de la detección.
La tabla 5 siguiente muestra que la utilización
de conjunto de cebadores discriminantes en la etapa a) del método de
la invención sobre distintas muestras sanguíneas permite detectar
por ensayos funcionales diferentes realizados en la etapa (c):
- -
- la presencia de HIV en la muestra 1,
- -
- ausencia de HIV en la muestra 3, y
- -
- un error en la muestra 2.
| Ensayo funcional que permite revelar | Ensayo funcional que permite revelar | |
| la actividad inversa transcriptasa | la actividad proteinasa en ácido aspártico | |
| Ensayo 1 | + | + |
| Ensayo 2 | + | - |
| Ensayo 3 | - | - |
6) Caso nº 6: Este caso se refiere a la
detección y la cuantificación de los microorganismos siguientes:
- -
- Aeromonas hydrophila se caracteriza por las actividades ONPG, LDC, ESC y OX,
- -
- Escherichia coli 1 se caracteriza par ONPG, LDC, ODC y UE,
- -
- Salmonela arizonae se caracteriza por ONPG, LDC y ODC, y
- -
- Vibirio alginolyticus se caracteriza por LDC, ESC y OX.
La tabla 6 siguiente muestra que la utilización
de conjunto de cebadores discriminantes en la etapa (a) del método
de la invención sobre distintas muestras permite detectar mediante
ensayos funcionales diferentes en la etapa (c) y en función de
distintos carnés de identidad funcionales de microorganismo:
- -
- La presencia de aeromonas hydrophila en la muestra a,
- -
- La presencia de E. coli 1 en la muestra b,
- -
- La ausencia de microorganismo en la muestra c,
- -
- La presencia de Vibrio alginolyticus en la muestra d, y
- -
- La presencia de Salmonella arizonae en la muestra e.
| ONPG | LDC | ODC | UE | ESC | OX | |
| Muestra a | +++ | + | - | - | + | +++ |
| Muestra b | +++ | +++ | ++ | + | - | - |
| Muestra c | - | - | - | - | - | - |
| Muestra d | - | + | - | - | ++ | +++ |
| Muestra e | +++ | +++ | +++ | - | - | - |
Entre las proteínas virales necesarias para el
ciclo de multiplicación del virus del HIV, se puede apuntar la
proteinasa de ácido aspártico. La presencia de esta proteína puede
servir para diagnosticar la infección de un paciente por el
retrovirus.
Tal como se muestra en la figura 2, después de
una extracción de los ácidos nucleicos de una extracción sanguínea,
una etapa de amplificación permite amplificar el gen de la
proteinasa de ácido aspártico de HIV si el paciente está infectado
por el virus e integrar el promotor, el terminador de la T7 ARN
polimerasa y un sitio RBS en la secuencia diana.
La molécula transportadora preparada en la etapa
(a) es un péptido que contiene sitios de corte específicos de la
proteinasa de HIV. Este péptido se une por enlace covalente
respectivamente en N y C terminal a una molécula fluorescente (tal
como, por ejemplo, la fluoresceína) y a un "quencher" de esta
última (tal como, por ejemplo, la rodamina).
El gen diana amplificado se coloca en un tubo
cargado con una mezcla de transcripción/traducción acoplada
(componentes necesarios para la transcripción y la traducción).
Luego se añade la molécula transportadora. Ventajosamente, el medio
de la reacción de transcripción y de traducción está compuesto bien
sea de un extracto celular de traducción de E. coli, o bien
de un extracto celular de traducción de células eucariotas.
Si la proteinasa de ácido aspártico es ausente de
la muestra ensayada, no se escinde el transportador. La fluoresceína
y la rodamina se encuentran entonces en un medio ambiente
suficientemente próximo para garantizar una transferencia de energía
de tipo FRET (fluorescence resonance energy of transfert). Después
de la exposición del péptido transportador a una longitud de onda
dada (alrededor de 490 nm), solamente la fluorescencia roja del
"quencher" será detectable.
Si la proteinasa de ácido aspártico está presente
en la muestra ensayada, se escinde el transportador. La fluoresceína
y la rodamina se separan entonces demasiado para garantizar una
transferencia de energía. Después de la exposición de los productos
de escisión a una longitud de onda dada (alrededor de 490 nm),
solamente la fluorescencia verde de la fluoresceína es
detectable.
Los testigos negativos y positivos se realizan en
paralelo. Corresponde respectivamente a una fracción de una reacción
PCR realizada sobre el ADN de un paciente sano y de un paciente
infectado.
Después de haber diagnosticado la presencia del
virus en un paciente, este método permite un ensayo consecutivo de
caracterización de la proteinasa de ácido aspártico: según la cepa
responsable de la infección viral, la proteinasa de ácido aspártico
presenta una sensibilidad variable a distintos inhibidores
específicos. Tal fenotipaje de la proteinasa de ácido aspártico
permitirá adaptar la terapia del paciente directamente después del
diagnóstico de la infección viral. Para eso, basta con incubar una
fracción de la reacción de amplificación en distintas reacciones de
transcripción/traducción por la que, cada una contiene un inhibidor
específico de proteinasa de ácido aspártico utilizado actualmente en
terapias antivirales, y de efectuar a continuación el ensayo de
actividad de la proteinasa de ácido aspártico con el péptido
FRET.
FRET.
Los métodos clásicos de diagnóstico de la
tuberculosis y de las infecciones micobacterianas se basan en el
examen microscópico y en el cultivo de muestras. Para paliar la
lentitud del diagnóstico clásico, se desarrollaron nuevas
técnicas.
En el marco del método de la invención, el
diagnóstico del patógeno se realiza utilizando por ejemplo como
diana una de sus inteínas. Las inteínas son intrones proteicos
recientemente descubiertos en el interior de secuencias proteicas.
Las inteínas poseen toda la información necesaria para su propia
excisión. Este proceso recientemente puesto de manifiesto es
comparable al corte y empalme de los ARN premensageros. Así, por
convención, la secuencia proteica interna se llama inteína y las dos
secuencias externas, exteínas (Perler, F. B., Davis E. O., Dean, G.
E., Gimble, F. S., Jack, W. E., Neff, N., Noren, C. J., Thorner, J.
y Belfort, M. (1994). Protein splicing elements: inteins and exteins
-a definition of terms and recommended nomenclature. Nucl. Acids
Research 22, 1125-1127). Este fenómeno de excisión
proteica específico es muy rápido. Estas inteínas se han descubierto
en grupos de genes muy diferentes y están a la vez presentes en las
procariotas y las eucariotas. La proteína RecA de Mycobacterium
tuberculosis contiene tal elemento. Otras Micobacterias
patógenas pueden poseer tal secuencia en RecA tal como
Mycobacterium leprae. Sin embargo, estos dos intrones
proteicos son de diferentes tamaños, en secuencia y en su
localización, lo que los hace muy específicos (Davis, E. O.,
Thangaraj, H. S., Brooks, P. C. y Colston, M. J. (1994), Evidence of
selection for protein introns in the recAs of pathogenic
mycobacteria. EMBO J. 13 (4), 699-703). Además estas
inteínas pueden poseer una actividad endonucleasa, capaz de
reconocer específicamente un megasitio.
El ensayo mostrado en la figura 3 es el
siguiente. Después de la extracción del ADN de la muestra a
analizar, una PCR permite amplificar el gen diana codificador de la
inteína integrándole el promotor, el terminador de la T7 ARN
polimerasa y un sitio RBS. A continuación, el producto de la PCR se
incuba en una mezcla de transcripción/traducción. A continuación, se
añade el transportador. Este transportador corresponde a una
secuencia polinucleotídica caracterizada por la presencia en 5' y en
3' respectivamente de una molécula de fluoresceína y de rodamina
unidas de manera covalente al ADN y en su centro del sitio de corte
específico de la inteína de RecA de Mycobacterium
tuberculosis.
Cuando se contamina la muestra por
Mycobacterium tuberculosis, la inteína producida en la
reacción de transcripción/traducción, escinde el transportador e
impide una transferencia de energía de tipo FRET (descrito en el
ejemplo anterior). Después de la exposición de la reacción de
transcripción/traducción a aproximadamente 490 nm, se observa una
coloración verde de la muestra. En ausencia de contaminación, el
transportador no se escinde y después de la exposición de la
reacción de transcripción/traducción a aproximadamente 490 nm, se
observa una coloración roja de la muestra.
Un testigo negativo está constituido por una
fracción de reacción PCR realizada sobre el ADN que no contiene
ningún patógeno. Un testigo positivo está constituido por una
fracción de reacción PCR realizada sobre el ADN de una muestra
contaminada por el patógeno buscado.
Las \beta-lactaminas
(penicilinas y cefalosporinas) representan la clase de antibióticos
más utilizada en terapia anti-infecciosa. Desde la
introducción en terapia de estas moléculas, se desarrollaron nuevas
resistencias a estos compuestos, favoreciendo la expansión de las
infecciones nosocomiales. Entre los distintos mecanismos de
resistencia adquiridos por los gérmenes, uno de los más importante
consiste en producir una enzima (\beta-lactamasa
TEM-1 (Sutcliffe J. G., 1978, Nucleotide sequence of
the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pBR322,
Proc. Natl. Acad, Sci. EE.UU. 75, 3737-3741) para
algunas enterobacterias por ejemplo, o
beta-lactamasa PSE para Pseudomonas
aeruginosa) capaz de hidrolizar el antibiótico antes de que haya
podido actuar. Existen algunos inhibidores de
\beta-lactamasas utilizados en sinergia con un
antibiótico, pero a medida de su utilización aparecieron nuevas
formas de \beta-lactamasas resistentes a estos
inhibidores.
La detección de la función de estas enzimas
representa, por lo tanto un excelente ensayo de diagnóstico de la
presencia de gérmenes resistentes a los antibióticos. Por otra
parte, la detección específica de beta-lactamasas
resistentes a los inhibidores es especialmente ventajosa, ya que
permite saber directamente si una muestra está contaminada por los
gérmenes poliresistentes (antibióticos e inhibidores), lo que
permite adaptar rápidamente la terapia.
Esta experiencia permite la detección específica
de gérmenes poliresistentes (resistencia a los antibióticos y
resistencia a un inhibidor beta-lactamasa: el ácido
clavulánico) que expresan una variante resistente
TEM-1, en una muestra contaminada por gérmenes
monoresistentes (resistencia solamente a los antibióticos).
Se centrifugaron 10 \mul de cultivo a DO600 =
2,3 y se recogió cada sedimento en 12 \mul de tampón de lisis
celular (10 mM Tris HCl a pH = 7,5, 1 mM de EDTA, 50 \mug/ml de
proteinasa K) y se incubaron durante 15 minutos a 55ºC luego durante
15 minutos a 80ºC. Se añadieron 9 \mul de cada uno de estos
lisatos a una mezcla de amplificación PCR que permite amplificar el
gen que confería la monoresistencia y el gen que confería la
poliresistancia así como las secuencias que permiten su expresión
in vitro. Se utilizaron 5 \mul de cada amplificación PCR
para realizar una transcripción in vitro tal como fue
descrita por Gurevich et al. (Gurevich V. A., Pokrovskaya I. D.,
Obukhova T. A. y Zozulya S., 1991, Preparative in vitro mRNA
synthesis using SP6 and T7 polymerases, Anal. biochem., 195,
207-213) se utilizaron 10 \mul de cada
transcripción para traducir in vitro las proteínas tal como
fueron descritas por Zubay (Zubay G., 1973, in vitro
synthesis of protein in microbial systems, Ann. Rev. Genet., 7,
267-287) sobre un volumen final de 100 \mul.
| Muestra | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| % de gérmenes resistentes a los antibióticos | 100 | 90 | 70 | 50 | 30 | 10 | 0 |
| % de gérmenes resistentes a los antibióticos | |||||||
| y al ácido clavulánico | 0 | 10 | 30 | 50 | 70 | 90 | 100 |
Se efectuaron dos tipos de ensayos de
actividad:
- -
- una medida de la actividad "total" beta-lactamasa utilizando como sustrato un antibiótico cromogénico: la nitrocefina. Se incubaron 10 \mul de la mezcla de traducción a 37ºC en un volumen final de 1 ml de tampón de revelación de la actividad (concentración final: NaP 50 mM a pH = 7,0, 100 \mug/ml de nitrocefina y 0,25 mM de DMSO). La reacción fue seguida por espectrofotometría a 486 nm.
- -
- Una medida de la actividad ``resistencia al ácido clavulánico utilizando como sustrato un antibiótico cromogénico: la nitrocefalina más una concentración dada de ácido clavulánico. Se incubaron 10 \mul de la mezcla de traducción a 25ºC durante 3 minutos en un volumen final de 1 ml de tampón I (concentración final de NaP 50mM a pH = 7,0, 1 \muM de ácido clavulánico). Luego se añadieron 100 \mug/ml de nitrocefalina y 0,25 mM final de DMSO, y la reacción fue seguida por espectrofotometría a 486 nm.
Les resultados se recogen en la tabla 8 que
indica la composición de las muestras.
La figura 4 indica que la actividad total
beta-lactamasa se detecta en todas las muestras con
un nivel comparable de actividad; por lo tanto, el ensayo permite
detectar simultáneamente dos funciones (resistente a los
antibióticos y poliresistente a antibióticos/ácido clavulánico).
Cuando el ensayo de detección se realiza en
presencia de ácido clavulánico, no se detecta ninguna actividad en
la muestra 1 (0% de gérmenes que tienen la doble resistencia), y se
detecta una actividad creciente para las muestras 2 a 7 que
contienen de 10 a 100% de gérmenes que tienen la doble resistencia.
Este ensayo de detección funcional es, por lo tanto, altamente
discriminante puesto que permite detectar la actividad de los
gérmenes poliresistentes en el seno de una población de gérmenes
monoresistentes.
Hay que señalar que la diferencia entre la
actividad total detectada en una muestra y la detectada únicamente
para los gérmenes poliresistentes no es igual a la actividad de los
gérmenes monoresistentes, ya que las enzimas de estos dos tipos de
gérmenes no tienen la misma actividad específica. Al conocer estas
actividades específicas, sería posible hacer esta correlación y
deducir la actividad de los gérmenes monoresistentes conociendo
exactamente la actividad total y la de los gérmenes
poliresistentes.
Por lo tanto, el método de la invención
permite:
- -
- realizar una discriminación por la función (revelación de la función resistencia al ácido clavulánico),
- -
- franquearse del ruido de fondo (detección específica de una población de gérmenes en el seno de una población de gérmenes similares), y
- -
- caracterizar una muestra: el primer ensayo funcional revela que las muestras 2 a 7 por ejemplo son positivas, y el segundo ensayo funcional permite revelar que contienen gérmenes poliresistentes.
De manera mucho más clásica es posible
discriminar dos funciones idénticas (función proteasa de HBV y
función proteasa de HIV) por una amplificación específica del o de
los genes de una de éstas (utilización por ejemplo cebadores de PCR
específicos del gen de la proteasa de HIV para detectarla en el seno
de una muestra que puede contener también el gen de la proteasa de
HBV). En este caso hipotético el ensayo funcional no es
necesariamente discriminante.
Se mide la carga viral de HIV-1
en distintas muestras.
Se realizaron las etapas a y b del método de la
invención. Se realizó la detección de la actividad (etapa c) de la
proteasa incubando a 37ºC 10 \mul de cada una de estas
traducciones (etapa b) con 60 \mul de tampón (2M de NaCl, 12 mM de
EDTA, 200 mM de acetato de sodio, 2 mM de DTT y 20% de DMSO) y 10
\muM final del péptido sustrato BACHEM M1865 (péptido
DABCYL-\gamma-Abu-Ser-Gin-Asn-Tyr-Pro-lle-Val-Gin-EDANS)
sobre un volumen final de 120 \mul. este péptido FRET tiene como
propiedad liberarse de la fluorescencia cuando se escinde por la
proteasa del virus HIV. Un diagnóstico positivo se caracteriza, por
lo tanto, por la aparición de una señal fluorescente cuando se
expone a los rayos UV.
La figura 5 ilustra las señales obtenidas para
las distintas muestras tomadas en el transcurso del tiempo. Las
intensidades de fluorescencia obtenidas para las diferentes señales
positivas corresponden a las distintas cargas virales. Al referirse
a una gama patrón, es, por tanto, posible cuantificar la señal
medida y deducir la cantidad de virus en cada muestra.
Una vez que se detecta una muestra como si fuera
positiva, el diagnóstico por el procedimiento de la invención
permite caracterizar la función detectada. La figura 5 ilustra el
efecto de concentraciones crecientes de un inhibidor de la proteasa
HIV (inhibidor no terapéutica: la pepstatina A) sobre la actividad
de la proteasa de la muestra.
Para eso, se incubaron 10 \mul de una
traducción que corresponde a una muestra a 37ºC con 60 \mul de
tampón (2M de NaCl, 12 mM de EDTA, 200 mM de acetato de sodio, 2 mM
de DTT y 20% de DMSO), 10 \muM del péptido sustrato BACHEM M 1865
(péptido
DABCYL-\gamma-Abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-lle-Val-Gin-EDANS)
y 0 ó 500 nM ó 1 \muM ó 10 \muM ó 30 \muM ó 60 \muM ó 80
\muM ó 100 \muM final de pepstatina A sobre un volumen final de
120 \mul. Se realizó la lectura por fluorimetría a una longitud de
onda de excitación de 340 nm y de emisión de 490 nm.
Se puede observar una correlación entre la
disminución de la actividad y el aumento de las concentraciones
crecientes en Inhibidores.
Fijando un límite máximo de sensibilidad (o de
resistencia) (por ejemplo 50% de la actividad perdida para una
incubación de 30 minutos con 50 mM de Inhibidor), es posible
determinar si esta proteasa es sensible o no a las inhibidores de
proteasa existentes, y adaptar en directo una terapia relativa a la
muestra tomada.
Esto demuestra que el método de la invención
permite detectar, cuantificar y caracterizar una función de un
organismo o de un proceso a partir de una sola muestra.
Estas experiencias se pueden realizar con todo
tipo de funciones específicas de organismos diferentes, o de un
mismo organismo, lo que permite entonces caracterizar distintos
dianas terapéuticos (detección y caracterización simultáneas de la
proteasa y de la transcriptasa inversa del virus HIV por
ejemplo).
Claims (26)
1. Métodos de diagnóstico de la presencia de un
organismo o del desarrollo de una enfermedad o de una infección o
también de células, en una muestra biológica, caracterizados
porque se detecta y/o se mide la función de una o de varias
proteínas específicas de dicho organismo o el desarrollo de una
enfermedad o de una infección o también de células, estando dichas
proteínas producidas en un sistema acelular a partir de ácidos
nucleicos de la muestra.
2. Método de diagnóstico de la presencia de un
organismo o del desarrollo de una enfermedad o de una infección o
también de células en una muestra biológica según la reivindicación
1, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- la preparación, a partir de los ácidos nucleicos de la muestra, de moléculas de ácidos nucleicos que comprenden los genes codificadores de una o de varias proteínas específicas de dicho organismo o el desarrollo de una enfermedad o de una infección o también de células y los elementos de control necesarios para la transcripción y la traducción de dicho o de dichos genes,
- b)
- la transcripción y la traducción en un sistema acelular de las moléculas de ácido nucleico preparadas en la etapa (a),
- c)
- el diagnostico de la presencia de un organismo o del desarrollo de una enfermedad o de una infección o también de células por detección y/o medida de la función de la o de las proteínas producidas en la etapa (b).
3. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
muestra es una muestra biológica bruta.
4. Método de diagnóstico según la reivindicación
3, caracterizado porque la muestra se toma a partir de
sangre, de tejidos, de orina o de cualquier otro líquido
corporal.
5. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha
función corresponde a una actividad enzimática.
6. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque después de
la detección y/o la medida de la función de la o de las proteínas
específicas, se secuencia la o las moléculas de ácido nucleico
codificador de la o de las proteínas específicas cuya función se
detecta y/o se mide.
7. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la detección
y/o la medida de la función de la o de las proteínas específicas se
realiza mediante cualquier ensayo funcional de la o de dichas
proteínas.
8. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque la detección
y/o la medida de la función de la o de las proteínas específicas se
realizan con la ayuda de una o de varias moléculas transportadoras
presentes en al menos una de las etapas (a), (b) o (c).
9. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha
función corresponde a un conjunto de proteínas específicas cuyos
genes se sitúan sobre el mismo fragmento de ADN como en el caso de
un operón, o en distintos sitios del ADN genómico.
10. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado porque dicha
función corresponde a un conjunto de proteínas específicas cuyos
genes se agrupan bajo la forma de un operón, y porque la etapa (a)
consiste en preparar a partir de la muestra de ácidos nucleicos, una
molécula de ácido nucleico que comprende los genes del operón
codificadores de las proteínas que corresponden a dicha función, si
están presentes en los ácidos nucleicos de la muestra, en 5' del
conjunto de dichos genes del operón, un promotor de ARN polimerasa,
eventualmente en 3' del conjunto de dichos genes del operón un
terminador de ARN polimerasa, y para cada uno de dichos genes su
sitio de fijación de los ribosomas natural.
11. Método de diagnóstico según la reivindicación
10, caracterizado porque el sitio de fijación de los
ribosomas de cada uno de los genes es el sitio de fijación de los
ribosomas natural, y porque en la etapa (b) se utiliza un extracto
de traducción preparado a partir de una fuente idéntica o próxima a
la de la que procede la muestra de ácidos nucleicos.
12. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado porque dicha
función corresponde a un conjunto de proteínas específicas cuyos
genes se sitúan en diferentes sitios del ADN genómico, y porque la
etapa (a) consiste en preparar, a partir de la muestra de ácido
nucleico, una o varias moléculas de ácido nucleico que comprende los
genes codificadores de las proteínas que corresponden a dicha
función, si están presentes en los ácidos nucleicos de la muestra,
en 5' de cada uno de dichos genes un promotor de ARN polimerasa y un
sitio de fijación de los ribosomas, y eventualmente en 3' de cada
uno de dichos genes un terminador de ARN polime-
rasa.
rasa.
13. Método de diagnóstico según la reivindicación
12, caracterizado porque el sitio de fijación de los
ribosomas es el sitio natural de cada uno de los genes u otro sitio
de fijación de los ribosomas más adaptado a la etapa (b) de
traducción.
14. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque
comprende:
- I)
- la medida de la función de una o de varias proteínas específicas de dicho organismo o el desarrollo, tal como se define en una cualquiera de dichas reivindicaciones 1 a 13, luego
- II)
- la comparación de dicha medida de la función eventualmente presente en la muestra con un valor patrón o un conjunto de valores patrones de dicha función medido sobre una o varias muestras patrones según un método de medida idéntico o equivalente al de la etapa (I).
15. Método de diagnóstico según la reivindicación
14, caracterizado porque dicha muestra patrón es cualquier
muestra que contiene:
- -
- una cantidad, ventajosamente conocida, del o de los genes codificadores de la o de las proteínas que corresponden a dicha función, y que entonces se someterá a un tratamiento de transcripción y traducción como en la etapa (b), luego la función de la o de las proteínas obtenida(s) se medirá según un procedimiento de medida idéntico o equivalente al de la etapa (c),
- -
- una cantidad, ventajosamente conocida, de la o de las proteínas que corresponden a dicha función, la cual se medirá según un procedimiento de medida idéntico o equivalente al de la etapa (c), y
- -
- una cantidad, ventajosamente conocida, de uno o varios organismos o procesos que poseen el o los genes codificadores de la o de las proteínas que corresponden a dicha función, la cual se medirá según un procedimiento de medida idéntico o equivalente al de la etapa (c).
16. Método de cuantificación de una función
conocida según una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15,
caracterizado porque dicha muestra patrón procede de un medio
idéntico o diferente del sobre el cual se realiza la etapa (I), y en
el caso de un medio idéntico tomado en un momento diferente.
17. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque la muestra
sobre la cual se realiza la etapa (I) contiene la muestra
patrón.
18. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 17, caracterizado porque en la etapa
(a), las secuencias de control del o de los genes codificadores de
la o de las proteínas que corresponden a dicha función son, para la
transcripción:
- -
- un promotor de ARN polimerasa en 5' de la hebra codificadora de dicho o de dichos genes,
- -
- eventualmente un terminador de ARN polimerasa en 3', y para la traducción:
- -
- un sitio de fijación de los ribosomas que puede ser o no el o los sitios de fijación naturales del o de los genes.
19. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 18, caracterizado porque en la etapa
(a), se preparan las moléculas de ácido nucleico por una reacción de
amplificación del o de los genes codificadores de las proteínas que
corresponden a dicha función.
20. Método según la reivindicación 19,
caracterizado porque la reacción de amplificación es del tipo
PCR o NASBA realizada con la ayuda de una o de varias parejas de
cebadores, cada uno constituido:
- -
- para el cebador sentido, de la secuencia hibridándose aguas arriba de una o de varias moléculas de ácido nucleico que comprende el o los genes codificadores de la o de las proteínas que corresponden a la función analizada, y de un promotor de ARN polimerasa y eventualmente un sitio de fijación de los ribosomas, y
- -
- para el cebador antisentido, de la secuencia hibridándose aguas abajo de una o de varias moléculas de ácido nucleico que comprende el o los genes codificadores de las proteínas que corresponden a la función analizada, y eventualmente de un terminador de ARN polimerisa.
21. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 20, caracterizado porque se detectan y/o
se miden al menos dos funciones, y porque en la etapa (a) se
preparan las moléculas de ácido nucleico codificadores de la o de
las proteínas que corresponden a cada una de dichas funciones, con
cebadores discriminantes o no discriminantes.
22. Método de diagnóstico según la reivindicación
21, caracterizado porque en la etapa (a) se utilizan
cebadores no discriminantes y porque en la etapa (c) se detectan y/o
se miden dichas funciones por ensayos funcionales que permiten
diferenciar dichas funciones.
23. Método de diagnóstico según la reivindicación
21, caracterizado porque en la etapa (a) se utilizan
cebadores discriminantes y entonces porque en la etapa (c) se
detectan y/o se miden dichas funciones por ensayos funcionales que
permiten o no diferenciar dichas funciones.
24. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 23, caracterizado porque después de
la etapa de transcripción, se realiza una etapa de amplificación del
transcrito.
25. Método de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 24, caracterizado porque después la
etapa (c), se ensaya el efecto de una sustancia, que no estaba
presente en la muestra, por la modificación de la función.
26. Utilización del método de diagnóstico según
una cualquiera de la reivindicación 1 a 25 para el seguimiento del
organismo, de la enfermedad o de la infección o también de las
células, especialmente, con fines de tratamiento.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9815487A FR2786787B1 (fr) | 1998-12-08 | 1998-12-08 | Methode d'analyse in vitro d'un phenotype connu a partir d'un echantillon d'acides nucleiques |
| FR9815487 | 1998-12-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2216592T3 true ES2216592T3 (es) | 2004-10-16 |
Family
ID=9533724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99957373T Expired - Lifetime ES2216592T3 (es) | 1998-12-08 | 1999-12-08 | Metodo de diagnostico basado en la funcion de una proteina producida en un sistema acelular, a partir de una muestra de acidos nucleicos. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8017318B1 (es) |
| EP (2) | EP1431401A3 (es) |
| JP (1) | JP2002531142A (es) |
| AT (1) | ATE259883T1 (es) |
| AU (1) | AU774181B2 (es) |
| CA (1) | CA2354607C (es) |
| DE (1) | DE69914940T2 (es) |
| ES (1) | ES2216592T3 (es) |
| FR (1) | FR2786787B1 (es) |
| IL (2) | IL143638A0 (es) |
| WO (1) | WO2000034512A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2805280B1 (fr) * | 2000-02-17 | 2005-01-14 | Proteus | Methode de detection d'une inteine specifique de mycobacterium tuberculosis et son utilisation pour le diagnostic de la tuberculose |
| US7319012B2 (en) | 2001-05-30 | 2008-01-15 | Gene Therapy Systems, Inc. | Protein arrays and methods and systems for producing the same |
| BR112022002365A2 (pt) | 2019-08-09 | 2022-04-26 | Nutcracker Therapeutics Inc | Métodos e aparelhos para fabricar e para remover material de uma composição terapêutica |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4557862A (en) * | 1983-10-28 | 1985-12-10 | University Patents, Inc. | Rhodamine derivatives as fluorogenic substrates for proteinases |
| WO1992007949A1 (en) * | 1990-11-05 | 1992-05-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army | Method for the in vitro production of protein from a dna sequence without cloning |
| US5235039A (en) * | 1991-06-10 | 1993-08-10 | Eli Lilly And Company | Substrates for hiv protease |
| JPH07184648A (ja) * | 1992-02-07 | 1995-07-25 | Kunitada Shimotoono | Ｈｃｖプロテイナーゼ活性物質、その製造法並びに同プロテイナーゼおよび同プロテイナーゼ阻害剤のアッセイ法 |
| AU4843893A (en) * | 1992-09-02 | 1994-03-29 | Scripps Research Institute, The | Coupled isothermal polynucleotide amplification and translation system |
| US5436131A (en) * | 1993-04-02 | 1995-07-25 | Merck & Co., Inc. | Color screening assay for identifying inhibitor resistant HIV protease mutants |
| AU693443B2 (en) * | 1993-04-08 | 1998-07-02 | Research Development Foundation | Cell free system for protein synthesis and use of chaperone proteins therein |
| GB9320562D0 (en) * | 1993-10-06 | 1993-11-24 | Zeneca Ltd | Novel assay and applications |
| US5709998A (en) * | 1993-12-15 | 1998-01-20 | The Johns Hopkins University | Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis |
| US6063562A (en) * | 1994-09-16 | 2000-05-16 | Sepracor, Inc. | In vitro method for predicting the evolutionary response of HIV protease to a drug targeted thereagainst |
| HUP9902418A3 (en) * | 1996-05-09 | 2001-10-29 | Dimensional Pharm Inc | Microplate thermal shift assay and apparatus for ligand development and multi-variable protein chemistry optimization |
| US6207371B1 (en) * | 1996-10-04 | 2001-03-27 | Lexicon Genetics Incorporated | Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same |
| JP4663824B2 (ja) * | 1996-12-31 | 2011-04-06 | ハイ スループット ジェノミクス インコーポレイテッド | 多重化分子分析装置および方法 |
| JP4524445B2 (ja) * | 1997-09-03 | 2010-08-18 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | タンパク質のスクリーニング方法 |
| US20030134779A1 (en) * | 1999-12-20 | 2003-07-17 | Diarra Moussa S. | Method and composition for treatment and/or prevention of antibiotic-resistant microorganism infections |
-
1998
- 1998-12-08 FR FR9815487A patent/FR2786787B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-12-08 EP EP04290402A patent/EP1431401A3/fr not_active Withdrawn
- 1999-12-08 EP EP99957373A patent/EP1137801B9/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 JP JP2000586945A patent/JP2002531142A/ja active Pending
- 1999-12-08 DE DE69914940T patent/DE69914940T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 AU AU15099/00A patent/AU774181B2/en not_active Ceased
- 1999-12-08 WO PCT/FR1999/003059 patent/WO2000034512A1/fr active IP Right Grant
- 1999-12-08 CA CA2354607A patent/CA2354607C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-08 AT AT99957373T patent/ATE259883T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-12-08 ES ES99957373T patent/ES2216592T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 IL IL14363899A patent/IL143638A0/xx active IP Right Grant
-
2000
- 2000-11-28 US US09/722,406 patent/US8017318B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-06-07 IL IL143638A patent/IL143638A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2354607A1 (fr) | 2000-06-15 |
| WO2000034512A1 (fr) | 2000-06-15 |
| EP1137801B1 (fr) | 2004-02-18 |
| AU774181B2 (en) | 2004-06-17 |
| EP1431401A3 (fr) | 2007-07-25 |
| AU1509900A (en) | 2000-06-26 |
| IL143638A0 (en) | 2002-04-21 |
| FR2786787B1 (fr) | 2002-04-19 |
| US8017318B1 (en) | 2011-09-13 |
| JP2002531142A (ja) | 2002-09-24 |
| DE69914940D1 (de) | 2004-03-25 |
| EP1137801B9 (fr) | 2004-10-06 |
| IL143638A (en) | 2007-10-31 |
| EP1431401A2 (fr) | 2004-06-23 |
| DE69914940T2 (de) | 2004-12-16 |
| CA2354607C (fr) | 2011-08-09 |
| ATE259883T1 (de) | 2004-03-15 |
| FR2786787A1 (fr) | 2000-06-09 |
| EP1137801A1 (fr) | 2001-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4472253B2 (ja) | 内部共生体細胞小器官の検査およびそれで識別可能な化合物 | |
| CN107557455A (zh) | 一种基于CRISPR‑Cas13a的特异性核酸片段的检测方法 | |
| ES2439951T3 (es) | Detección y cuantificación multiplex de ácidos nucleicos microbianos controlada de forma interna | |
| CN113322338B (zh) | 一种检测志贺氏菌的cda引物组、试剂盒及其应用 | |
| ES2605303T3 (es) | Detección cualitativa y cuantitativa de ácidos nucleicos microbianos | |
| Wang et al. | CRISPR-Cas13a cascade-based viral RNA assay for detecting SARS-CoV-2 and its mutations in clinical samples | |
| AU773714B2 (en) | Cell assay, method and reagents | |
| Shahbazi et al. | Development and evaluation of an improved quantitative loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Morganella morganii | |
| Ma et al. | Rapid detection of Aeromonas hydrophila with a DNAzyme-based sensor | |
| ES2216592T3 (es) | Metodo de diagnostico basado en la funcion de una proteina producida en un sistema acelular, a partir de una muestra de acidos nucleicos. | |
| Yang et al. | Hybridization chain reaction-assisted enzyme cascade genosensor for the detection of Listeria monocytogenes | |
| ES2234680T3 (es) | Pcr multiplex para la deteccion de infecciones por ehec. | |
| CN111295713B (zh) | 稳定同位素标记的核酸作为内标物的核酸定量方法及其用途 | |
| WO2021039777A1 (ja) | 関節リウマチを検査する方法 | |
| JP2007195421A (ja) | メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマー、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出方法及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法 | |
| JP5215726B2 (ja) | マウスニューモシスチス・カリニの検出方法 | |
| CN105567867A (zh) | 人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| US20230374570A1 (en) | Method and system for detecting fungal genes and kit for use with same | |
| US20240117404A1 (en) | Automatic Phagogram | |
| Li et al. | Target-enriched sequencing enables accurate identification of bloodstream infections in whole blood | |
| JP2000342261A (ja) | ブルクホルデリア・セパシアの検出法及び検出用キット | |
| AU1510000A (en) | Process for determination of the activity of a substance using an in vitro functional test | |
| CN116121424A (zh) | 一种可视化检测幽门螺旋杆菌的方法 | |
| CN104328211A (zh) | PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 | |
| Sun et al. | Label-free fluorescence detection of human 8-oxoguanine DNA glycosylase activity amplified by target-induced rolling circle amplification |