JPWO2016080399A1 - 哺乳動物の標的ゲノム領域にdnaをノックインする方法及び細胞 - Google Patents
哺乳動物の標的ゲノム領域にdnaをノックインする方法及び細胞 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2016080399A1 JPWO2016080399A1 JP2016560242A JP2016560242A JPWO2016080399A1 JP WO2016080399 A1 JPWO2016080399 A1 JP WO2016080399A1 JP 2016560242 A JP2016560242 A JP 2016560242A JP 2016560242 A JP2016560242 A JP 2016560242A JP WO2016080399 A1 JPWO2016080399 A1 JP WO2016080399A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dsb
- plasmid
- grna
- target sequence
- site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 23
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 87
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 82
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 57
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 45
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 32
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 claims description 28
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 39
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 12
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 5
- 101100329196 Homo sapiens CYP2D6 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 3
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 101150010738 CYP2D6 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 2
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010001237 Cytochrome P-450 CYP2D6 Proteins 0.000 description 1
- 102100021704 Cytochrome P450 2D6 Human genes 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 1
- 101710105527 Type II restriction enzyme FokI Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
項1. 細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gを切断可能な少なくとも1つの人工ヌクレアーゼシステムG、ドナーDNA及び二種類の一本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)を細胞に導入する工程を含み、前記人工ヌクレアーゼシステムGは細胞ゲノム上の1又は2の標的配列Gを切断して細胞ゲノム上に2つの二本鎖DNA切断(DSB)部位を生じさせ、二種類のssODNは細胞ゲノムの標的配列Gの切断により生じた一方のDSB部位g1とドナーDNAの上流側導入部位D1に相補性を有するUp-ssODN並びに細胞ゲノムの他方のDSB部位g2とドナーDNAの下流側導入部位D2に相補性を有するDown-ssODNであり、二種類のssODN(Up-ssODNとDown-ssODN)により細胞ゲノムの1つ又は2つの標的配列Gにおける2つのDSB部位g1,g2の間にドナーDNAがノックインされることを特徴とする、ドナーDNAを細胞ゲノムにノックインする方法。
項2. ドナーDNAが細胞内で発現可能な遺伝子構築物である、項1に記載の方法。
項3. ドナーDNAが1又は2の標的配列を有するプラスミドであり、人工ヌクレアーゼシステムは、Cas9ヌクレアーゼと細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gに対応する1又は2のガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼとドナーDNAの1又は2の標的配列Dに対応する1又は2のガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDを包含し、人工ヌクレアーゼシステムGにより細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDによりドナーDNAプラスミド上の1又は2の標的配列Dを切断してゲノムにノックインされるプラスミド由来のドナーDNAの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせる、項1に記載の方法。
項5. 細胞ゲノム上に2つの標的配列G1、G2、プラスミド上に1つの標的配列Dを有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列G1,G2に各々対応するガイドRNA-G1(gRNA-G1) 、ガイドRNA-G2(gRNA-G2)を含む人工ヌクレアーゼシステムG1、G2と、Cas9ヌクレアーゼと標的配列Dに対応するガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDとを包含し、gRNA-G1、G2が各々標的配列G1、G2の相補鎖を含み、gRNA-Dが標的配列Dの相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムG1、G2により標的配列G1,G2を切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDにより標的配列Dを切断してプラスミド由来のドナーDNAの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Up-ssODN)で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Down-ssODN)で結合する、項3に記載の方法。
項7. 細胞ゲノム上に2つの標的配列G1、G2、プラスミド上に2つの標的配列D1、D2を有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列G1,G2に各々対応するガイドRNA-G1,G2(gRNA-G1,G2) を含む人工ヌクレアーゼシステムG1、G2と、Cas9ヌクレアーゼと標的配列D1、D2に対応するガイドRNA-D1、D2(gRNA-D1、D2)を含む人工ヌクレアーゼシステムD1、D2とを包含し、gRNA-G1、G2が各々標的配列G1、G2の相補鎖を含み、gRNA-D1、D2が標的配列D1、D2の相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムG1、G2により標的配列G1,G2を切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムD1、D2により標的配列D1、D2を切断してプラスミド由来のドナーDNAの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Up-ssODN)で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Down-ssODN)で結合する、項3に記載の方法。
項9. プラスミドの全部または一部がゲノムに導入された細胞。
項10. 前記プラスミドは1又は2の標的配列DをCas9により切断することにより生じた上流側及び下流側DSB部位D1,D2でゲノムに導入されてなる、項9に記載の細胞。
項11. プラスミドのゲノム上の導入位置は、ゲノムの1又は2の標的配列をCas9により切断することにより生じた2つのDSB部位の間である、項9又は10に記載の細胞。
項12. 細胞が受精卵である、項9〜11のいずれかに記載の細胞。
項13. 項9〜12のいずれか1項に記載の細胞を含む、プラスミドがゲノムに導入された非ヒト哺乳動物。
項14. ヒト由来の少なくとも1つの遺伝子を含むプラスミドがノックインされてヒト化された項13に記載の非ヒト哺乳動物。
(g1):標的配列G又はG1が人工ヌクレアーゼシステムG又はG1により切断されたときに上流側DSB部位g1を生じる潜在的g1、
(g2):標的配列G又はG2が人工ヌクレアーゼシステムG又はG2により切断されたときに下流側DSB部位g2を生じる潜在的g2、
(d1):標的配列D又はD1が人工ヌクレアーゼシステムD又はD1により切断されたときに上流側DSB部位d1を生じる潜在的d1、
(d2):標的配列D又はD2が人工ヌクレアーゼシステムD又はD2により切断されたときに下流側DSB部位d2を生じる潜在的d1、
Up-ssODN:ゲノムの上流側DSB部位g1とドナーDNAの上流側DSB部位d1の双方に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド、
Down-ssODN:ゲノムの下流側DSB部位g2とドナーDNAの下流側DSB部位d2の双方に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド。
実施例1
(1)実験方法
本実験には、Addgene(www.addgene.org/CRISPR)から入手したCas9発現プラスミド(hCas9: Addgene ID# 41815)およびgRNA発現プラスミド(pDR274: Addgene ID# 42250)を用いた。Cas9発現プラスミドはCas9遺伝子の上流にT7プロモーターを導入するなどの改良を加えた。pCAGプラスミドは理化学研究所バイオリソースセンターから入手し、GFP遺伝子およびヒトCYP2D6遺伝子を導入した。
(2)実験結果
本実験は、CRIPSR/Cas9という‘はさみ’を用いて、ラットRosa26遺伝子内の標的配列とpCAG-GFPプラスミド内の標的配列を同時に切断し、二種類のssODNという‘のり’を用いて、pCAG-GFPをラットRosa26内に正確かつ効率的にノックインするものである(図5a)。ラットRosa26遺伝子の第1エクソンと第2エクソンの間、およびpCAG-GFPのCAGプロモーター上流に標的配列を設計し、gRNAを作製した(表1、図6,7)。また、Rosa26切断部位の上流とpCAGプラスミド切断部位の下流、Rosa26切断部位の下流とpCAG-GFP切断部位の上流を結合するためのssODNを設計した(表2)。これらをpCAG-GFPとともに受精卵に導入した結果、得られた17匹の産子のうち、4匹に全身でのGFP発現が観察された(表4、図5b)。PCRの結果、6、7、8、11番個体でGFP特異配列の増幅が見られた(図5c)。Rosa26領域に組み込まれていることを確認するため、ラットRosa26のプライマーとpCAG-GFPのプライマーを組み合わせて検討した結果、6、7、11番個体で増幅が見られ、Rosa26領域に組み込まれていることが確認できた(図5c)。8番個体はpCAG-GFPの切断部位がゲノム上に存在することが確認された。シークエンス解析の結果、11番個体は上流、下流ともにssODNで設計した通りの配列でpCAG-GFPが導入されていることが確認された(図5d)。6番個体は上流で6塩基の欠損、7番個体は上流下流の両端で複数塩基の挿入または欠失が確認された。これらノックイン変異の他に、15匹でノックアウト変異が確認された(図8)。11番個体で得られたプラスミドノックイン変異は安定的に子孫に伝達された。また、オフターゲット配列の変異は観察されなかった。病理学的解析の結果、このノックイン系統は全身臓器でGFPが安定して発現していることが確認された(図9)。
Claims (14)
- 細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gを切断可能な少なくとも1つの人工ヌクレアーゼシステムG、ドナーDNA及び二種類の一本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)を細胞に導入する工程を含み、前記人工ヌクレアーゼシステムGは細胞ゲノム上の1又は2の標的配列Gを切断して細胞ゲノム上に2つの二本鎖DNA切断(DSB)部位を生じさせ、二種類のssODNは細胞ゲノムの標的配列Gの切断により生じた一方のDSB部位g1とドナーDNAの上流側導入部位D1に相補性を有するUp-ssODN並びに細胞ゲノムの他方のDSB部位g2とドナーDNAの下流側導入部位D2に相補性を有するDown-ssODNであり、二種類のssODN(Up-ssODNとDown-ssODN)により細胞ゲノムの1つ又は2つの標的配列Gにおける2つのDSB部位g1,g2の間にドナーDNAがノックインされることを特徴とする、ドナーDNAを細胞ゲノムにノックインする方法。
- ドナーDNAが細胞内で発現可能な遺伝子構築物である、請求項1に記載の方法。
- ドナーDNAが1又は2の標的配列を有するプラスミドであり、人工ヌクレアーゼシステムは、Cas9ヌクレアーゼと細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gに対応する1又は2のガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼとドナーDNAの1又は2の標的配列Dに対応する1又は2のガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDを包含し、人工ヌクレアーゼシステムGにより細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDによりドナーDNAプラスミド上の1又は2の標的配列Dを切断してゲノムにノックインされるプラスミド由来のドナーDNAの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせる、請求項1に記載の方法。
- 細胞ゲノム上に1つの標的配列G、プラスミド上に1つの標的配列Dを有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列Gに対応するガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼと標的配列Dに対応するガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDとを包含し、gRNA-Gが標的配列Gの相補鎖を含み、gRNA-Dが標的配列Dの相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムGにより標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDにより標的配列Dを切断してプラスミド由来のドナーDNAの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Up-ssODN)で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Down-ssODN)で結合する、請求項3に記載の方法。
- 細胞ゲノム上に2つの標的配列G1、G2、プラスミド上に1つの標的配列Dを有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列G1,G2に各々対応するガイドRNA-G1(gRNA-G1) 、ガイドRNA-G2(gRNA-G2)を含む人工ヌクレアーゼシステムG1、G2と、Cas9ヌクレアーゼと標的配列Dに対応するガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDとを包含し、gRNA-G1、G2が各々標的配列G1、G2の相補鎖を含み、gRNA-Dが標的配列Dの相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムG1、G2により標的配列G1,G2を切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDにより標的配列Dを切断してプラスミド由来のドナーDNAの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Up-ssODN)で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Down-ssODN)で結合する、請求項3に記載の方法。
- 細胞ゲノム上に1つの標的配列G、プラスミド上に2つの標的配列D1、D2を有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列Gに各々対応するガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼと標的配列D1、D2に対応するガイドRNA-D1、D2(gRNA-D1、D2)を含む人工ヌクレアーゼシステムD1、D2とを包含し、gRNA-Gが標的配列Gの相補鎖を含み、gRNA-D1、D2が標的配列D1、D2の相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムGにより標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムD1、D2により標的配列D1、D2を切断してプラスミド由来のドナーDNAの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Up-ssODN)で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Down-ssODN)で結合する、請求項3に記載の方法。
- 細胞ゲノム上に2つの標的配列G1、G2、プラスミド上に2つの標的配列D1、D2を有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列G1,G2に各々対応するガイドRNA-G1,G2(gRNA-G1,G2) を含む人工ヌクレアーゼシステムG1、G2と、Cas9ヌクレアーゼと標的配列D1、D2に対応するガイドRNA-D1、D2(gRNA-D1、D2)を含む人工ヌクレアーゼシステムD1、D2とを包含し、gRNA-G1、G2が各々標的配列G1、G2の相補鎖を含み、gRNA-D1、D2が標的配列D1、D2の相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムG1、G2により標的配列G1,G2を切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムD1、D2により標的配列D1、D2を切断してプラスミド由来のドナーDNAの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Up-ssODN)で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド(Down-ssODN)で結合する、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が受精卵である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- プラスミドの全部または一部がゲノムに導入された細胞。
- 前記プラスミドは1又は2の標的配列DをCas9により切断することにより生じた上流側及び下流側DSB部位D1,D2でゲノムに導入されてなる、請求項9に記載の細胞。
- プラスミドのゲノム上の導入位置は、ゲノムの1又は2の標的配列をCas9により切断することにより生じた2つのDSB部位の間である、請求項9又は10に記載の細胞。
- 細胞が受精卵である、請求項9〜11のいずれかに記載の細胞。
- 請求項9〜12のいずれか1項に記載の細胞を含む、プラスミドがゲノムに導入された非ヒト哺乳動物。
- ヒト由来の少なくとも1つの遺伝子を含むプラスミドがノックインされてヒト化された請求項13に記載の非ヒト哺乳動物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014235898 | 2014-11-20 | ||
JP2014235898 | 2014-11-20 | ||
PCT/JP2015/082279 WO2016080399A1 (ja) | 2014-11-20 | 2015-11-17 | 哺乳動物の標的ゲノム領域にdnaをノックインする方法及び細胞 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2016080399A1 true JPWO2016080399A1 (ja) | 2017-08-31 |
JP6772067B2 JP6772067B2 (ja) | 2020-10-21 |
Family
ID=56013934
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016560242A Active JP6772067B2 (ja) | 2014-11-20 | 2015-11-17 | 哺乳動物の標的ゲノム領域にdnaをノックインする方法及び細胞 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10362771B2 (ja) |
EP (1) | EP3222718A4 (ja) |
JP (1) | JP6772067B2 (ja) |
WO (1) | WO2016080399A1 (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016073990A2 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Editas Medicine, Inc. | Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing |
WO2016100819A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting |
AU2016326711B2 (en) | 2015-09-24 | 2022-11-03 | Editas Medicine, Inc. | Use of exonucleases to improve CRISPR/Cas-mediated genome editing |
EP3433363A1 (en) | 2016-03-25 | 2019-01-30 | Editas Medicine, Inc. | Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use |
US11236313B2 (en) | 2016-04-13 | 2022-02-01 | Editas Medicine, Inc. | Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof |
WO2018001241A1 (zh) | 2016-06-28 | 2018-01-04 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | 一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用 |
US20180305719A1 (en) * | 2017-04-19 | 2018-10-25 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Vectors For Integration Of DNA Into Genomes And Methods For Altering Gene Expression And Interrogating Gene Function |
EP3652312A1 (en) | 2017-07-14 | 2020-05-20 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
WO2019072241A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | NON-HUMAN ANIMAL GENETICALLY MODIFIED WITH PD-1 HUMAN OR CHIMERIC |
WO2019222545A1 (en) | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Synthego Corporation | Methods and systems for guide rna design and use |
US20220186263A1 (en) * | 2019-04-05 | 2022-06-16 | Osaka University | Method for producing knock-in cell |
WO2021243283A1 (en) * | 2020-05-28 | 2021-12-02 | University Of Southern California | Scalable trio guide rna approach for integration of large donor dna |
CN111718932A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-29 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种新型的基因编辑动物生物反应器制备方法及应用 |
BR112023020553A2 (pt) * | 2021-04-07 | 2023-12-12 | Univ Leland Stanford Junior | Métodos de seleção celular e composições relacionadas |
CN114317536B (zh) * | 2021-11-30 | 2024-03-19 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 基于CRISPR/Cas9构建uPA转基因小鼠的制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012532598A (ja) * | 2009-07-08 | 2012-12-20 | カイマブ・リミテッド | 動物モデルおよび治療用分子 |
WO2014093635A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation |
WO2014172470A2 (en) * | 2013-04-16 | 2014-10-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of mutating, modifying or modulating nucleic acid in a cell or nonhuman mammal |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004180679A (ja) | 2002-11-19 | 2004-07-02 | Mitsubishi Chemicals Corp | ゲノムdnaを再構成する方法 |
MX2009013371A (es) | 2007-06-13 | 2010-01-25 | Sterrenbeld Biotechnologie North America Inc | Proceso para producir proteina exogena en la leche de mamiferos transgenicos. |
CN103228130B (zh) * | 2010-06-17 | 2016-03-16 | 科马布有限公司 | 动物模型及治疗分子 |
-
2015
- 2015-11-17 US US15/528,506 patent/US10362771B2/en active Active
- 2015-11-17 JP JP2016560242A patent/JP6772067B2/ja active Active
- 2015-11-17 EP EP15861997.3A patent/EP3222718A4/en not_active Withdrawn
- 2015-11-17 WO PCT/JP2015/082279 patent/WO2016080399A1/ja active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012532598A (ja) * | 2009-07-08 | 2012-12-20 | カイマブ・リミテッド | 動物モデルおよび治療用分子 |
WO2014093635A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation |
WO2014172470A2 (en) * | 2013-04-16 | 2014-10-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of mutating, modifying or modulating nucleic acid in a cell or nonhuman mammal |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
DOLLE M. E. ET AL., MUTAGENESIS, vol. Vol.11 No.1 (1996), JPN6019050509, pages 111 - 118, ISSN: 0004283146 * |
DONG ZHANGJI ET AL., INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRYAND CELL BIOLOGY, vol. Vol.55 (2014.10), JPN6016004950, pages 329 - 334, ISSN: 0004283148 * |
KIMURA Y., ET AL., SCIENTIFIC REPORTS, vol. Vol.4 (2014.10), JPN6016004949, pages 6545, ISSN: 0004283147 * |
PLATT RANDALL J., ET AL., CELL, vol. Vol.159 (2014.10), JPN6016004954, pages 440 - 455, ISSN: 0004283150 * |
SERUGGIA DAVIDE ET AL., TRANSGENIC RESEARCH, vol. Vol.23, No.5 (2014.10), JPN6016004953, pages 707 - 716, ISSN: 0004283149 * |
YANG HUI ET AL., CELL, vol. Vol.154 (2013), JPN6016004944, pages 1370 - 1379, ISSN: 0004283143 * |
吉見一人 他: "ゲノム編集法の新常識! CRISPR/Casが生命科学を加速する ラットにおけるゲノム編集技術革命 ノックアウト・", 実験医学, vol. Vol.32 No.11(2014.7), JPN6016004946, pages 1715 - 1720, ISSN: 0004283144 * |
山本卓 他: "1.部位特異的ヌクレアーゼを基盤とするゲノム編集技術", ウイルス, vol. Vol.64 No.1 (2014.06), JPN6016004947, pages 75 - 82, ISSN: 0004283145 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6772067B2 (ja) | 2020-10-21 |
WO2016080399A1 (ja) | 2016-05-26 |
US20170251647A1 (en) | 2017-09-07 |
EP3222718A4 (en) | 2018-05-30 |
US10362771B2 (en) | 2019-07-30 |
EP3222718A1 (en) | 2017-09-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6772067B2 (ja) | 哺乳動物の標的ゲノム領域にdnaをノックインする方法及び細胞 | |
JP6700306B2 (ja) | 受精前の卵細胞、受精卵、及び標的遺伝子の改変方法 | |
US11477969B2 (en) | Efficient non-meiotic allele introgression in livestock | |
JP2021121220A (ja) | Cas9タンパク質のマルチサイクルエレクトロポレーションによる遺伝子修飾非ヒト哺乳動物 | |
US20200017882A1 (en) | Engineering of humanized car t-cell and platelets by genetic complementation | |
Shrock et al. | CRISPR in animals and animal models | |
JP2019122390A (ja) | 大型家畜の接合体における標的化ゲノム編集 | |
JP2017513510A (ja) | ブタにおける多重遺伝子編集 | |
KR20150105475A (ko) | 유각의 가축 | |
US20190223417A1 (en) | Genetically modified animals having increased heat tolerance | |
JP7426120B2 (ja) | ノックイン細胞の作製方法 | |
US20210037797A1 (en) | Inducible disease models methods of making them and use in tissue complementation | |
US20160160238A1 (en) | Heterozygous modifications of tumor suppressor genes | |
JP2019505218A (ja) | 遺伝子相補によるヒト化腎臓の操作 | |
Beaton | Genetic linkage of multiple modifications in the pig |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181112 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200107 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200304 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200501 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200616 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200803 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200819 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200901 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200930 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6772067 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |