KR101561965B1 - 디스코이딘 도메인 수용체 2 활성을 조절하는 물질의 동정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 디스코이딘 도메인 수용체 2 (discoidin domain receptor 2, DDR2)의 과잉 활성 기전을 저해하는 물질을 DDR2 의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환의 치료제로 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

디스코이딘 도메인 수용체 2 활성을 조절하는 물질의 동정 방법 {Method for screening agents to modulate the activity of discoidin domain receptor 2}

본 발명은 디스코이딘 도메인 수용체 2 (discoidin domain receptor 2, DDR2)의 과잉 활성 기전을 저해하는 물질을 DDR2 의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환의 치료제로 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

디스코이딘 도메인 수용체(discoidin domain receptor)는 콜라겐을 리간드로 하는 수용체 타이로신 카이네이즈 패밀리 중의 하나로, 1997년 보겔 등에 의해 처음 확인되었다.

디스코이딘 도메인 수용체 패밀리는 디스코이딘 도메인 수용체1 (DDR1) 과 디스코이딘 도메인 수용체2 (DDR2) 형 두 가지로 구성되어 있으며 이들은 다양한 세포에서 그 발현이 나타난다. 세포 외 도메인은 실질적으로 콜라겐에 부착하는 DS (디스코이딘) 도메인과 그 이후의 DS 유사 도메인으로 구성되어 있는데 콜라겐 부착은 DS 도메인이 베타배럴 구조를 구성할 때 한쪽의 룹 구조에 의해 부착된다고 밝혀졌다. 최근 X-레이 구조 연구를 통하여 DS 유사 도메인의 구조가 확인 되었는데 흥미롭게도 여기에는 칼슘 부착 부위가 확인되었다.

디스코이딘 도메인 수용체의 세포 내 세포질 노출 부위는 상당히 긴 세포막 근처 부위와 그 이후의 타이로신 카이네이즈 부분으로 구성되어 있다. 최근 Src 타이로신 카이네이즈가 디스코이딘 도메인 수용체 2의 740번 타이로신을 인산화 하는 것이 이 수용체의 활성화를 위해서 필요하다는 것이 알려졌다. 이것은 이 수용체가 Src 비수용체 타이로신 카이네이즈와 긴밀한 관계를 가지고 그 기능을 수행할 수 있음을 암시한다.

또한, 디스코이딘 도메인 수용체1(DDR1)과 2(DDR2)의 기능은 여러 세포에서 발현되며 그 역할을 수행하는 것으로 알려졌다. 가장 특징적인 기능으로는 피부 섬유화 세포, 혈관 평활근 세포, 간 조직 내의 간 성상 세포 및 섬유화 세포, 신장 섬유화 세포와 메산지알 세포, 폐 섬유아세포 및 기도 평활근 세포등의 조직 섬유화 병변에 관여하는 세포에서 발현되며 이들 세포의 성장과 세포외 매트릭스 단백질의 생성과 분비를 촉진하는 것이다. 또한 이 수용체는 상피세포가 미요브라스트 형태의 세포로 전이되는 EMT (epithelial-mesenchymal transition) 현상에 관여한다는 보고가 있었다. 이러한 결과들로부터 이 수용체가 조직의 세포외 기질(ECM) 단백질 과잉 생산과 섬유화 병변에서 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 이 수용체는 대식세포, 랑거한스세포 등 일부 면역세포에서도 발현되어 면역기능에도 관여할 가능성을 보여주었다.

실제로 이 수용체의 비정상적인 발현이 여러 인간 질환 병변에서 보고되어 왔다. 대표적인 것으로 조직 경화 병변인 간경화, 신장경화, 폐경화 그리고 동맥경화 병변 등에서 병변 조직 부위에 이 수용체 단백질의 발현이 증가되는 현상이 관찰되었다 (Leitinger B, Annu Rev Cell Dev Biol. 2011, 27:265-90; Carafoli F, Hohenester E, Biochim Biophys Acta. 2013 Oct, 1834 (10):2187-94). 이 사실은 이들 수용체가 조직 경화증 질환에서 ECM (extracellular matrix) 발현을 유발하는 파이브로틱 세포에서 발현되어 이들 세포의 증식에 직접적으로 관여하고 또한 이 단백질이 EMT 를 직접적으로 유발하는 역할을 통해서 조직 섬유화 질환 유발 및 진행의 주요 인자 역할을 할 수 있음을 제안한다.

또한, 지난 연구들에서 이 수용체 단백질이 여러 인간 암세포나 조직에서 증가된 발현을 보여주는 경우가 관찰되었으며 또한 일부 암세포들에서 DDR1과 DDR2 유전자의 단백질 코딩 부분에서 특이적인 돌연변이가 관찰되었다. 흥미 있는 사실은 DDR2의 돌연변이 중 특정 돌연변이 (L63V, I638F)는 직접적인 암 촉진 (proto-oncogenic) 활성을 보인다는 것이 발암 에세이를 통하여 제시되었다. (Valiathan RR et al., Cancer Metastasis Rev. 2012 Jun, 31(1-2):295-321; Hammerman PS et al., (2011) Cancer Discovery, Vol. 1(1):78-89)

이와 같이, 디스코이딘 도메인 수용체 2가 여러 인간 질환의 유발과 관련이 있다는 보고가 많이 있다. 그러나, 이 단백질의 활성이 세포 내에서 어떻게 조절 되는가에 대해서는 아직 밝혀진 것이 없다. 이 활성의 조절 기작에 이상이 생기면 디스코이딘 도메인 수용체 2의 세포 내에서의 활성이 비정상적으로 바뀔 수 있다. 따라서 이 활성의 조절 기작을 밝히고 이를 기반으로 그 조절 기작을 제어할 수 있는 방법이나 물질의 발굴은 디스코이딘 도메인 수용체 2의 활성의 비정상성으로 인해 유발되는 질환의 치료법 개발을 위해 중요하다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 생체 내에서 디스코이딘 도메인 수용체 2의 비정상적인 활성을 조절할 수 있는 방법이 곧 이 수용체 단백질의 비정상성이 원인이 되는 질환의 치료법으로 유용하게 사용될 수 있다는 점에 착안하여, 먼저 이 수용체 단백질의 활성을 조절하는 기작을 밝히고 이를 기반으로 이 수용체 단백질의 활성을 조절하는 물질을 찾는 새로운 방법을 개발하고자 하였다.

본 발명은 디스코이딘 도메인 수용체 2 (discoidin domain receptor 2, DDR2)의 활성을 조절하는 새로운 기전을 규명하고, 이를 이용하여 DDR2 의 활성을 저해함으로써 DDR2 의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환을 치료할 수 있는 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

현재 DDR2 의 비정상적 과잉 활성이 동맥경화, 간경화, 신장경화, 폐경화 및 암 전이 등에 직접적으로 관여함이 알려져있다. 본 발명자들은 세포 내에서 DDR2의 활성을 조절하는 새로운 기전을 규명하고 이를 활용하여 DDR2 의 활성을 조절하는 물질을 동정하는 새로운 방법을 제시한다.

먼저, 본 발명자들은 인간 DDR2 가 클로닝된 발현 벡터를 트랜스펙션하여 이를 다량 발현하는 세포주, 또는 자연적으로 DDR2 를 발현하는 세포주에서 DDR2 의 활성이 조절되는 기작을 이용하여 DDR2 의 비이상적 활성을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 확립하였다.

또한, 본 발명자들은 세포주에서 안정적으로 발현된 DDR2 단백질은 여러 가지 방법으로 그 활성이 조절되는 모드를 보여주었는데, 예를 들어, 세포에서 DDR2 단백질은 100, 110, 120 또는 130KD 크기의 단백질로 존재하고, 이 중에서 130 KD 형태만 리간드인 콜라겐과 결합하여 자가 인산화가 촉진 될 수 있는 기능적 형태라는 것이 확인하였다. 또한, DDR2 는 N-당화와 폴딩에 의한 활성 조절과 유비퀴틴 연관 단백질 분해 체계의 프로티오좀 활성에 의해 조절된다는 것이 확인하였다.

따라서, 본 발명자들은 DDR2 의 기능적 형태인 130KD 형의 발현을 억제할 수 있는 물질, 또는 유비퀴틴 연관 단백질 분해에 의한 DDR2 의 발현 증가를 억제할 수 있는 물질을, DDR2 의 비정상적 과잉 활성이 연관된 질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다는 결론에 이르게 되었다.

이에, 하나의 양태로서, 본 발명은

DDR2 를 발현하는 세포에 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 (Ubiquitin-dependent proteasome) 저해제를 처리하는 단계,

상기 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계, 및

DDR2 를 발현하는 세포에 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제를 처리했을 때 나타나는 DDR2 의 발현량 증가가, 후보 화합물의 처리에 의하여 저해되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는,

동맥경화, 간경화, 폐경화, 신장경화 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는DDR2 의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법은, DDR2가 유비퀴틴 의존성 단백질 분해 시스템에 의해서 세포 내에서 네거티브하게 조절된다는 발견에 기초한 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, DDR2를 HEK293 세포에서 발현시킨 후 발현된 DDR2의 안정성에 영향을 미치는 단백질 분해 시스템을 알기 위하여, 여러 단백질 분해 효소 저해제를 처리하여 실험하였다. 이때 유비퀴틴 의존성 단백질 분해 시스템의 구성요소인 26S 프로테아좀의 강력한 저해제인 MG132, 볼테조미브 (Bortezomib), 그리고 락타시스틴 (Lactacyctin)등을 각 농도별로 처리한 후 세포 파쇄액을 만들어 DDR2 특이적 항체를 이용한 웨스턴블로팅을 한 결과, 농도의존적으로 130 KD 형태를 비롯한 여러 분자량 형태의 DDR2의 발현량이 괄목할만하게 증가됨을 확인 할 수 있었다 (도 4).

반면, 또 다른 세포 단백질 분해 제거 체계인 오토파기 (autophagy)와 연관된 라이소좀 프로티아제에 대한 저해제인 펩신 A (Pepsin A), E64를 처리하였을 때는 DDR2 발현 증가에 영향을 주지 못하였다 (도 5).

또한, 암 세포종인 HT1080 세포와 MDA-MB-2 31세포, 그리고 혈관 평활근 세포 (VSMC)에 유비퀴틴 의존성 단백질 분해 시스템에 참가하는 프로테아좀 저해제인 MG132을 처리했을 때에도, 130 KD의 DDR2 발현량이 처리 농도 의존적으로 크게 유도되는 것을 확인 할 수 있었다. 반면, 다른 수용체 타이로신 카이네이즈인 IGF-1R, EphB4, EGFR은 이들 세포에서 MG132 처리에 의해 별다른 변화가 없었다 (도 6). 이러한 결과들은 DDR2가 유비퀴틴 의존성 단백질 분해 시스템에 의해서 세포 내에서 네거티브하게 조절됨을 나타내는 것이다.

또한, 암을 유발하는 것으로 알려진 DDR2 점 돌연변이 종인 DDR2-I638F와 DDR2-L63V 의 경우 MG132을 처리하더라도 발현의 변화가 없었는데, 이는 DDR2가 특정 점 돌연변이에 의해 유비퀴틴 의존성 단백질 분해 시스템에 의해서 세포 내에서 네거티브하게 조절되는 작용을 받지 않을 때는 암 유발과 같은 비정상적 활성을 보일 수 있음을 나타내는 것이다.

따라서, 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 활성이 저해된 상태에서 DDR2의 발현 증가를 억제할 수 있는 물질은 DDR2 의 비정상적 과잉 활성이 연관된 질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은, DDR2 를 발현하는 세포에 유비퀴틴 의존성 프로테아좀(Ubiquitin-dependent proteasome) 저해제를 처리하는 단계를 포함한다.

인간 DDR2 의 아미노산 서열은 공지된 데이터베이스, 예를 들어 NCBI 에서 확인할 수 있다. 인간 DDR2 의 유전자 서열은 NCBI 등록번호 BC052998, 아미노산 서열은 NCBI 등록번호 AAH52998에 등재되어 있다.

DDR2 를 발현하는 세포는 인간 DDR2 가 클로닝된 발현 벡터를 도입하여 이를 다량 발현하는 세포주, 또는 자연적으로 DDR2 를 발현하는 세포주, 예를 들어 암 세포 또는 혈관 평활근 세포일 수 있다.

프로테아좀은 세포 및 모든 진핵세포의 세포질 내 일차적인 단백분해 성분이다. 프로테아좀은 세포 대사의 다양한 기능에서 핵심적인 역할을 하며, 일차적 기능은 미스-폴딩된, 비 기능성 단백질의 분해이다. 프로테아좀의 타겟은 대개 분해를 위해 올리고머릭 형태의 유비퀴틴의 부착으로 마킹된다. 유비퀴틴은 매우 보존적인 76개의 아미노산길이의 단백질로서, 타겟 단백질에 공유적으로 결합된다. 이러한 유비퀴틴화 자체는 가역적이며, 유비퀴틴 분자는 타겟 분자로부터 복수의 유비퀴틴 하이드로라제에 의해 다시 제거될 수 있다. 타겟 단백질의 유비퀴틴화 및 프로테아좀성 단백분해 간의 관계는 통상 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 시스템으로 칭해진다.

본 발명에서, 유비퀴틴 의존성 프로테아좀의 저해제는 당업계에 널리 알려진 물질을 사용할 수 있으며, 예를 들어 MG132, 볼테조미브 (Bortezomib), 또는 락타시스틴 (Lactacyctin)를 사용할 수 있다. MG132은 N-카보벤족시-L-류시닐-L-류시닐-L-류시날을 말하며, zLLL로도 칭한다.

본 발명의 스크리닝 방법은, 상기 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제가 처리된 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, DDR2를 발현하는 세포에 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제와 후보 화합물은 순차적으로 처리되거나 동시에 처리될 수 있다.

"후보 화합물"이란 DDR2 활성을 저해할 것으로 예상되는 후보 물질을 의미한다. 이러한 후보 물질에는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물뿐만 아니라, 단백질, 탄수화물, 핵산분자 (RNA, DNA 등) 및 지질과 같은 고분자 화합물 및 복수의 화합물의 복합체 등이 포함될 수 있다.

이 때, 후보 화합물은 유효량의 범위 내에서 처리하도록 한다. 유효량이란 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미하는 것으로, 유효량 범위 이하에서는, 정확한 결과를 얻을 수 없으므로, 유효량 범위 내에서 억제능을 측정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 스크리닝 방법은, DDR2 를 발현하는 세포에 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제를 처리했을 때 나타나는 DDR2 의 발현량 증가가, 후보 화합물의 처리에 의하여 저해되는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다. 이 때, 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제만 처리한 경우의 DDR2 의 발현량보다, 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제 및 후보 화합물을 처리한 경우의 DDR2 의 발현량이 감소하는 경우, 해당 후보 화합물을 치료제로 선택할 수 있다.

DDR2 의 발현량의 변화를 확인하기 위하여 당업계에서 통상 사용되는 기술들을 적용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, DDR2 에 특이적인 항체를 사용하여 DDR2 의 발현의 증감 여부를 검출할 수 있다. 예를 들어, 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제만 처리했을 때의 항원-항체 복합체 형성량과, 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제 및 후보 화합물을 처리한 경우의 항원-항체 복합체 형성량을 비교하여 저해 여부를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체 형성량의 절대적 또는 상대적 차이는 분자생물학적 또는 조직학적 분석으로 확인 가능하며, 이러한 분석법에는 웨스턴블로팅, 면역침전 및 면역염색 등이 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은

DDR2 를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계, 및

상기 세포에서 130KD 의 DDR2 의 발현량이 감소하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는,

동맥경화, 간경화, 폐경화, 신장경화 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는DDR2 의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법은, DDR2 의 130 KD 형태만 리간드인 콜라겐과 결합하여 자가 인산화가 촉진 될 수 있는 기능적 형태라는 발견에 기초한 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, DDR2를 HEK293 세포에서 발현시킨 후 세포 파쇄액으로부터 DDR2 를 면역침강한 후 이를 다시 DDR2 항체로 웨스턴블로팅을 하였다. 그 결과, 130 KD, 120 KD, 그리고 110 KD 3가지 분자량 형태의 DDR2 단백질 형태들이 발현함을 확인할 수 있었다 (도 1). 또한, 이 때 면역 침강한 시료를 타이로신을 특이적으로 인식하는 항체로 웨스턴블로팅을 한 결과, 130KD 형태만 타이로신이 인산화된 것으로 나타났다 (도 1). 이것은 130 KD, 120 KD, 그리고 110 KD 3가지 분자량 형태의 DDR2 단백질 중에 130 KD 형태만 리간드인 콜라겐과 결합하여 자가 인산화가 촉진 될 수 있는 기능적 형태라는 것을 의미한다.

또한, 여러 분자량 형태로 발현된 DDR2를 포함하는 HEK293-DDR2 세포 파쇄액에 엔도 H 글라이코시데이즈(Endo H) 를 이용하여 절단 반응을 하면 110KD, 120KD 형태는 100KD 형태로 전환되지만 130KD 형태는 이러한 절단에 전혀 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다 (도 2). 이러한 결과는 110KD이나 120KD 형태는 N-당화에 의한 막 단백질의 성숙이 아직 완전히 이루어지지 않은 형태인 반면, 130 KD 형태는 N-당화에 의한 단백질 성숙이 완전히 이루어져 세포원형질막에 존재 하며 수용체로서의 기능을 할 수 있는 형태임을 나타내는 것이다. 일반적으로 DDR2와 같은 막 수용체 단백질은 완전히 N-당화 반응을 완결해야 비로소 세포 원형질막으로 이동하여 막 수용체로서의 기능성을 가진 역할을 할 수 있다. DDR2는 콜라겐에 대한 막 수용체로서 세포 밖에 처리된 콜라겐에 의해 활성화되며 이때 세포질 도출 도메인 부위에 타이로신에 자기 인산화가 나타난다. 이 사실은 도 1에서 보여준 바와 같이 130 KD 분자량 형태의 DDR2 단백질만 콜라겐을 처리하면 타이로신 인산화가 관찰된다는 사실과 일치한다. 즉 130KD 분자량 형태의 DDR2 단백질이 N-당화 과정을 마치고 성숙되어 세포막으로 이동하며 존재하면서 리간드와 결합할 수 있는 기능적 형태임을 보여준다.

따라서, DDR2 의 기능적 형태인 형태인 130KD 형의 발현을 억제할 수 있는 물질은 DDR2 의 비정상적 과잉 활성이 연관된 질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은, DDR2 를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계를 포함한다.

이 때, DDR2 의 정의, DDR2 를 발현하는 세포의 범위, 후보 화합물의 의미 등은 상술한 바와 같다.

본 발명의 스크리닝 방법은, 상기 후보 화합물이 처리된 세포에서 130KD 의 DDR2 의 발현량이 감소하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다. 이 때, 상기 후보 화합물이 처리된 세포에서 130KD 의 DDR2 의 발현량이, 후보 화합물을 처리하지 않은 세포에서의 130KD 의 DDR2 의 발현량보다 감소한다면, 해당 후보 화합물을 치료제로 선택할 수 있다.

DDR2 의 발현량의 변화를 확인하기 위하여 당업계에서 통상 사용되는 기술들을 적용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, DDR2 에 특이적인 항체를 사용하여 DDR2 의 발현의 증감 여부를 검출할 수 있으며, 이러한 분석법에는 웨스턴블로팅, 면역침전 및 면역염색 등이 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일구현예로, 130KD 의 DDR2 를 발현하는 세포주는, 다음과 같은 방법으로 배양하는 것을 예시할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, HEK293-DDR2 세포를 글루코스를 없앤 배지에서 24 시간 배양하면 발현된 DDR2 가 모두 100KD 형태를 보이나 (100 KD 형태는 DDR2에 N-당화가 일어나지 않은 형태임), 이 상태의 세포에 다시 글루코스를 첨가하여 배양하면 배양시간에 따라 점차적으로 110 KD, 120 KD, 그리고 130 KD 형태의 증가된 분자량을 가지는 DDR2를 발현함을 확인할 수 있었다 (도 3).

이 실험은 HEK293-DDR2 세포 배양에서 배양 배지에서 글루코스를 제거하고 일정시간 배양하여 DDR2형태를 N-당화가 전혀 일어나지 않은 형태로 만든 후에, 다시 배양배지에 글루코스를 첨가함으로써 이후 시간에 따라 DDR2의 N-당화 정도가 점차 성숙되어 증가하면서 110KD, 120KD, 그리고 최종적으로 130KD 형태로 N-당화의 성숙도가 증가하는 것을 관찰 할 수 있음을 보여준다. 또 다른 의미로 이 실험은 기능성을 가진 형태인 130KD 형태를 포함한 여러 형태의 DDR2를 발현하는 것이 가능 할 수 있음을 보여준다. 따라서 이러한 방식으로 용이하게 기능성을 가진 형태인 130KD 형태를 포함한 여러 형태의 DDR2를 HEK293 세포배양에서 관찰 할 수 있다.

본 발명에서 DDR2 의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환은 동맥경화, 간경화, 폐경화, 신장경화 및 암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 스크리닝 방법은 DDR2 의 비정상적 과잉 활성이 연관된 질환의 치료제를 발굴하기 위한 하나의 방법으로서 유용하다.

도 1은 HEK293 세포에서 발현한 DDR2가 여러 형태의 분자량을 가지며 이중에 130 KD 형태만 리간드인 콜라겐과 결합하여 자가 인산화가 촉진 될 수 있는 기능적 형태임을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이다.
도 2는 여러 분자량 형태의 DDR2에 엔도 H (Endo H) 글라이코시데이즈를 이용하여 절단 반응을 하면 110KD, 120KD 형태는 100KD 형태로 전환되지만 130KD 형태는 이러한 절단에 전혀 영향을 받지 않음을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이다.
도 3은 DDR2를 발현하는 HEK293 세포를 글루코스를 없앤 배지에서 배양하면 DDR2가 모두 100KD 형태를 보이고 여기에 다시 배지에 글루코스를 첨가하여 배양하면 배양시간에 따라 점차적으로 110 KD, 120 KD, 그리고 130 KD 형태의 증가된 분자량을 가지는 DDR2를 발현함을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이다.
도 4는 DDR2를 발현하는 HEK293 세포에 유비퀴틴 의존성 26S 프로테아좀 저해제인 MG132, 볼테조미브 (Bortezomib), 그리고 락타시스틴 (Lactacyctin)을 처리하면 농도의존적으로 130 KD 형태를 비롯하여 여러 분자량 형태의 DDR2의 발현량이 괄목할만하게 증가함을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이다.
도 5는 DDR2를 발현하는 HEK293 세포에 라이소좀 프로티아제 저해제인 E64나 펩신 A를처리하면 여러 분자량 형태의 DDR2의 발현량의 증가함이 관찰되지 않음을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이다.
도 6은 HT1080세포와 MDA-MB-231세포와 혈관 평활근 세포 (VSMC)에 각각 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제인 MG132을 처리했을 때 130 KD의 DDR2 양이 처리 농도 의존적으로 크게 유도되지만 다른 수용체 타이로신 카이네이즈인 IGF-1R, EphB4, EGFR은 변화가 없음을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이다.
도 7은 여러 DDR2의 점 돌연변이종을 발현하는 HEK293 세포에 MG132을 처리하면 암 유발 돌연변이로 확인된 DDR2-I638F와 DDR2-L63V는 발현 변화가 없는 반면, 암 유발 활성이 확인되지 않은 DDR2-G253C와 DDR2-G774V의 경우는 와일드 형태의 DDR2와 마찬가지로 그 발현이 MG132 처리 농도 의존적으로 크게 증가되는 것을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포 배양과 화합물 처리

외부에서 트랜스펙션에 의해 DDR2를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주 (HEK293-DDR2)는 이전 문헌에서 밝힌 것을 사용하였으며 (Siddiqui, K., et al., (2009) Biol . Pharm . Bull . 32, 136-141) 10% FBS와 150 μg/mL penicillin-streptomycin (Gibco-BRL) 를 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. 혈관 평활근 세포(Vascular smooth muscle cell, VSMC)는 6주령의 BALB/c 생쥐의 동맥으로부터 이전 문헌에 기술한 방법에 의거하여 분리한 후 (Blank, R.S., et al., (1998) J. Cell Biol . 107, 299-306) 10% FBS와 150 μg/mL penicillin-streptomycin (Gibco-BRL)을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. HT1080과 MDA-MB-231 암 세포주는 10% FBS와 150 μg/mL penicillin-streptomycin (Gibco-BRL) 를 포함하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 배양하였다. 모든 세포 배양은 통상적인 방법으로 동물세포 배양기를 이용하여 37℃와 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 글루코스를 포함하지 않는 배양을 위해서는 글루코스가 없는 특수한 DMEM 배지를 Gibco-BRL사 (미국)로부터 구입하여 사용하였다. 콜라겐 코팅 배양 접시 배양이나 글루코스 제거 및 첨가, 그리고 유비퀴틴 프로테아좀 저해제 처리 실험 등은 배양배지에 FBS가 없는 상태에서 진행하였다. 유비퀴틴 프로테아좀과 라이소좀 프로티아제 저해제 화합물은 10mM 스톡으로 DMSO에 녹인 후 세포배양에 사용하였다.

실시예 2. 웨스턴블로팅과 면역침강

6웰 배양 접시에 300-1000 μl 의 1x램리 버퍼 용액을 가하여 배양 접시의 세포를 녹여낸 후 이를 100℃에서 2분간 가열하고 12,000rpm에서 마이크로센트리퓨지를 이용하여 원심 분리후 상층액을 회수하여 세포파쇄액 시료를 얻었다. 이 시료들에 포함된 특정 단백질의 양을 웨스턴블로팅 기법을 이용하여 측정하였다. 즉 시료들을 7.5% SDS-폴리 아크릴 아마이드젤에서 전기영동으로 분리하고 이를 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 이 멤브레인을 TBS 버퍼에 녹인 5% 스킴밀크 용액에서 2시간 동안 배양하고 500-5000배 정도 묽혀지도록 정량하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체를 가하고 2시간 실온에서 배양하였다. 본 실험에서 사용한 항체들은 구매하여 사용하였다. 즉 DDR2에 대한 항체는 R&D 시스템사에서 구매하였다. 인산화 타이로신을 특이적으로 인식하는 항체는 셀 시스날링사 (미국)에서 구매하였다. 그리고 IGF-1R, EphB4, EGFR, GAPDH 에 대한 항체는 산타크루즈사(미국) 에서 구매하여 사용하였다. 배양을 마친 멤브레인을 TBS 버퍼로 5번 씻은 후에 TBS 버퍼에 적당히 묽힌 HRP가 결합된 2차 항체를 가한 후 1시간 배양하고 다시 멤브레인을 TBS 버퍼로 5번 씻었다. 이 멤브레인에서의 케미루미네슨스 신호 강도를 케미루미네슨스 신호 발생 키트 (GE 헬쓰케어, UK)와 X-레이 필름을 이용하여 오토라디오그라피 기법으로 가시화하였다. 면역 침강 시료는 다음과 같은 실험으로 얻었다. 6 웰접시에 배양된 HEK293-DDR2 세포를 300 μl의 HEPES (pH 7.5), 0.15 M NaCl, 10% glycerol, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1mM sodium vanadate, 10mM sodium pyrophosphate, 100mM NaF , 프로테아제 저해제 칵테일 (BMS)을 포함하는 세포 파쇄액을 가하여 배양접시로부터 긁어낸 후 10분간 얼음 속에서 방치하였다. 이것을 12,000 rpm에서 4℃에서 10분간 원심 분리 후 상층액을 취하였다. 여기에 5μg 의 DDR2에 대한 항체를 가한 후 1시간 정도 4℃에서 배양 후 여기에 다시 40 μl의 아가로즈에 부착한 프로테인 A 비드 50% 슬러리를 가하고 다시 한 시간 동안 서서히 회전하면서 배양하였다. 이를 12000 rpm에서 4℃에서 10분간 원심 분리하여 비드를 회수하였다. 이 비드를 위에 기술한 세포 파쇄액을 이용하여 3번 정도 씻어주었다. 이 비드에 1x램리 버퍼를 가한 후 100℃에서 2분간 가열하였다.

실시예 3. DDR2 점 돌연변이 벡터 제작 및 발현 세포주 제작

DDR2 유전자에 L63V, G253C, I638F, G774V 돌연변이 도입은 이전 문헌에서 서술한 DDR2 발현 벡터에 Stratagene (미국) 사가 제공하는 QuickChange® 키트와 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 각 점 돌연변이를 가지는 DDR2 발현벡터와 하이그로마이신 저항 유전자를 발현하는 벡터를 10:1 로 섞은 후 HEK293 세포에 통상적인 방법으로 리포펙타민 (GIBCO-BRL)을 이용하여 트랜스팩션 하고 이후 200μg/mL 의 하이그로마이신을 포함하는 배양배지에서 선택적으로 자라나는 세포주 클론들을 크로닝 한 후 각 클론에 대해 DDR2 발현을 각 세포 파쇄액에 대해 웨스턴블로팅으로 확인하여 각 DDR2 점 돌연변이 발현 세포주를 제작하였다.

실시예 4. 엔도 H 글라이코시데이즈 N- 당화 제거 에세이

오백만개의 DDR2를 발현하는 HEK293 세포를 500 μl 의 10 mM　Tris-HCl (pH 7.5), 1% Nonidet P-40, 1 mM　Na₃VO₄, 10 mM NaF, 프로티아제 저해제 칵테일 (Roche)을 포함하는 용액에서 파쇄하였다. 엔도 H 글라이코시데이즈에 의한 발현된 DDR2의 N-당화 제거 반응을 위해서 파쇄액 18 μl를 취한 후 여기에 2 μl의 10X 디네츄레이팅 버퍼 (5% SDS and 0.4 M DTT)를 가한 후 100 ℃에서 10 분간 가열하였다. 이것을 다시 10 μl 를 취한 후 37℃ 에서 2,000 U의 Endo H를 가하고 50 mM sodium citrate (pH 5.5) 버퍼에서 총 20 μl 반응액으로 밤새도록 반응을 진행하였다. Endo H를 포함하지 않은 콘트롤 (-Ez) 반응을 위해서는 Endo H 대신 같은 부피의 물을 가하였다. 반응 종료 후 1/2 부피의 3x램리버퍼를 가한 후 가열하고 이를 7.5 % SDS-PAGE에서 전기 영동 후 DDR2 를 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴블로팅을 하여 DDR2의 N-당화 제거에 따른 분자량 변화를 추적하였다.

실험결과

1. DDR2 를 발현하는 세포주의 확립 및 DDR2 의 발현 확인

먼저 본 발명의 목적을 이루기 위하여 인간 디스코이딘 도메인 수용체 2 유전자를 발현벡터에 삽입 후 HEK293 세포에 트랜스펙션하여 이 수용체를 안정적으로 다량 발현하도록 발굴된 HEK293 세포 (이하 이 세포를 HEK293-DDR2 라 칭한다)를 이용한다. 이러한 세포주는 성공적으로 외부에서 트랜스펙션한 DDR2 유전자를 안정적으로 발현함이 알려져 있다 (Siddiqui, K., et al., (2009) Biol . Pharm . Bull . 32, 136-141).

본 발명에서는 배양된 HEK293-DDR2 세포 주가 여러 분자량 형태로 디스코이딘 도메인 단백질을 발현함을 관찰하였다. 즉 콜라겐 코팅한 배양접시에서 4시간 배양된 HEK293-DDR2 세포의 파쇄액으로부터 발현된 디스코이딘 도메인 수용체 2를 면역침강을 한 후 이를 다시 DDR2 항체로 웨스턴블로팅을 하였다. 그 결과, 130 KD, 120 KD, 그리고 110 KD 3가지 분자량 형태의 DDR2 단백질 형태들이 발현함을 확인할 수 있었다 (도 1). 또한, 이 때 면역 침강한 시료를 타이로신을 특이적으로 인식하는 항체로 웨스턴블로팅을 한 결과, 130KD 형태만 타이로신이 인산화된 것으로 나타났다 (도 1). 이것은 130 KD, 120 KD, 그리고 110 KD 3가지 분자량 형태의 DDR2 단백질 중에 130 KD 형태만 리간드인 콜라겐과 결합하여 자가 인산화가 촉진 될 수 있는 기능적 형태라는 것을 의미한다.

2. DDR2 의 분자량에 따른 N- 당화 확인

도 1에서와 같이 여러 분자량 형태로 발현된 DDR2를 포함하는 HEK293-DDR2 세포 파쇄액에 엔도 H 글라이코시데이즈 (endoglycosidase H, Endo H) 를 이용하여 절단 반응을 하면 110KD, 120KD 형태는 100KD 형태로 전환되지만 130KD 형태는 이러한 절단에 전혀 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다 (도 2). 즉 엔도 H (Endo H) 글라이코시데이즈 반응전의 DDR2 (C)는 엔도 H를 첨가하여 밤새도록 N-당화 제거 반응을 하면 (+EZ) 130KD형태는 분자량의 변화가 전혀 없고 반면 110KD, 120KD 형태는 100KD 형태로 분자량이 전환되었다. 한편 이 실험에서 엔도 H를 첨가하지 않고 밤새도록 N-당화 제거 반응을 하는 경우는 (-EZ) 반응전과 비교하여 다른 점이 없었다. GAPDH 웨스턴블로팅은 본 실험에서 동일양의 세포 파쇄액 사용을 보여주기 위한 것이다.

이러한 결과는 110KD이나 120KD 형태는 N-당화에 의한 막 단백질의 성숙이 아직 완전히 이루어지지 않은 형태인 반면, 130 KD 형태는 N-당화에 의한 단백질 성숙이 완전히 이루어져 세포 원형질막에 존재 하며 수용체로서의 기능을 할 수 있는 형태임을 나타내는 것이다. 일반적으로 DDR2와 같은 막 수용체 단백질은 완전히 N-당화 반응을 완결해야 비로소 세포 원형질막으로 이동하여 막 수용체로서의 기능성을 가진 역할을 할 수 있다. DDR2는 콜라겐에 대한 막 수용체로서 세포 밖에 처리된 콜라겐에 의해 활성화되며 이때 세포질 도출 도메인 부위에 타이로신에 자기 인산화가 나타난다. 이 사실은 도 1에서 보여준 바와 같이 130 KD 분자량 형태의 DDR2 단백질만 콜라겐을 처리하면 타이로신 인산화가 관찰된다는 사실과 일치한다. 즉 130KD 분자량 형태의 DDR2 단백질이 N-당화 과정을 마치고 성숙되어 세포막으로 이동하며 존재하면서 리간드와 결합할 수 있는 기능적 형태임을 보여준다.

N-당화 과정에 따라 HEK293 세포에서 발현된 DDR2가 여러 분자량을 가진다는 또 하나의 증거는 N-당화가 일어나는 가능성을 예측하는 소프트웨어를 활용한 예측에서 찾아볼 수 있다. DDR2 내에서 N-당화가 일어나는 가능성이 가장 큰 것으로 예측된 213번 아스파라긴 아미노산을 글루타민으로 점 돌연변이를 한 DDR2 를 발현하는 HEK293 세포에서는, 130 KD 형태의 DDR2 단백질 대신 주로 110KD 형태의 DDR2 단백질이 관찰되었다. 이는, 213번 아스파라진에 N-당화가 130 KD 형태의 DDR2 단백질을 만드는데 중요함을 나타낸다. 이 사실은 110KD, 130 KD 등 여러 분자량으로 발현된 DDR2가 N-당화가 다르기 때문임을 다시 한번 증명한다.

3. 세포배양 방법에 따른 DDR2 성숙의 확인

HEK293-DDR2 세포를 글루코스를 없앤 배지에서 24 시간 배양하면 발현된 DDR2 는 웨스턴블로팅에서 모두 100KD 형태를 보인다. 따라서 이 100 KD 형태는 DDR2에 N-당화가 일어나지 않은 형태이다. 이 상태의 세포에 다시 글루코스를 첨가하여 배양하기 시작하면서, 배양시간에 따라 파쇄액을 만들어 DDR2 에 대한 웨스턴블로팅 실험을 한 결과, 배양시간에 따라 점차적으로 110 KD, 120 KD, 그리고 130 KD 형태의 증가된 분자량을 가지는 DDR2를 발현함을 확인할 수 있었다 (도 3).

이 실험은 HEK293-DDR2 세포 배양에서 배양 배지에서 글루코스를 제거하고 일정시간 배양하여 DDR2형태를 N-당화가 전혀 일어나지 않은 형태로 만든 후에, 다시 배양배지에 글루코스를 첨가함으로써 이후 시간에 따라 DDR2의 N-당화 정도가 점차 성숙되어 증가하면서 110KD, 120KD, 그리고 최종적으로 130KD 형태로 N-당화의 성숙도가 증가하는 것을 관찰 할 수 있음을 보여준다. 또 다른 의미로 이 실험은 기능성을 가진 형태인 130KD 형태를 포함한 여러 형태의 DDR2를 발현하는 것이 가능 할 수 있음을 보여준다. 따라서 이러한 방식으로 용이하게 기능성을 가진 형태인 130KD 형태를 포함한 여러 형태의 DDR2를 HEK293 세포배양에서 관찰 할 수 있다. 130KD 형태의 DDR2가 실제로 콜라겐에 반응하여 활성화되는 기능성을 가진 활성 형태라는 점에서 이러한 트랜스팩션한 DDR2를 안정적으로 배양하는 HEK293 세포주와 글루코스를 조절하는 세포배양 방법을 어떤 물질이 DDR2가 기능성을 가진 130KD 형태로 성숙되는 기작을 저해하는지를 판별하는 스크리닝에 사용할 수 있으며 이러한 130KD 형태의 DDR2 생성을 억제하는 활성을 가진 화합물은 DDR2의 비이상적 과잉 활성으로 야기되는 질환의 치료법에 유용하게 사용될 수 있다.

4. 유비퀴틴 의존석 단백질 분해 시스템에 의한 DRR2 발현 변화 확인

DDR2를 HEK293 세포에서 발현 후 발현된 DDR2의 안정성에 영향을 미치는 단백질 분해 시스템을 알기 위하여, 여러 단백질 분해 효소 저해제를 처리하여 실험하였다. 이때 유비퀴틴 의존성 단백질 분해 시스템의 구성요소인 26S 프로테아좀의 강력한 저해제인 MG132, 볼테조미브 (Bortezomib), 그리고 락타시스틴 (Lactacyctin)등을 각 농도별로 처리한 후 세포 파쇄액을 만들어 DDR2 특이적 항체를 이용한 웨스턴블로팅을 한 결과, 농도의존적으로 130 KD 형태를 비롯한 여러 분자량 형태의 DDR2의 발현량이 괄목할만하게 증가됨을 확인 할 수 있었다 (도 4).

반면, 또 다른 세포 단백질 분해 제거 체계인 오토파기 (autophagy)와 연관된 라이소좀 프로티아제에 대한 저해제인 펩신 A (Pepsin A), E64를 처리하였을 때는 DDR2 발현 증가에 영향을 주지 못하였다 (도 5).

또한, 암 세포종인 HT1080 세포와 MDA-MB-2 31세포, 그리고 혈관 평활근 세포 (VSMC)에 유비퀴틴 의존성 단백질 분해 시스템에 참가하는 프로테아좀 저해제인 MG132을 처리했을 때에도, 130 KD의 DDR2 발현량이 처리 농도 의존적으로 크게 유도되는 것을 확인 할 수 있었다. 반면, 다른 수용체 타이로신 카이네이즈인 IGF-1R, EphB4, EGFR은 이들 세포에서 MG132 처리에 의해 별다른 변화가 없었다 (도 6).

이러한 결과들은 DDR2가 유비퀴틴 의존성 단백질 분해 시스템에 의해서 세포 내에서 네거티브하게 조절됨을 나타내는 것이다.

5. DDR2 점 돌연변이에 따른 활성 확인

이전 보고에 따르면 DDR2 점 돌연변이 종이 여러 인간 암종에서 발견되었는데 본 발명에서는 이 중 4종의 점 돌연변이종 (L63V, G253C, I638F, G774V)의 DDR2를 각각 HEK293 세포에 트랜스펙션하여 이를 안정적으로 발현되는 세포 주를 확립하였다. 이들 세포 주에 MG132을 처리해본 결과, DDR2-I638F와 DDR2-L63V는 발현 변화가 없었고, DDR2-G253C와 DDR2-G774V의 경우는 와일드 형태의 DDR2와 마찬가지로 그 발현이 MG132 처리 농도 의존적으로 크게 증가되는 것이 관찰되었다 (도 7).

이전 문헌 (Hammerman PS et al., (2011) Cancer Discovery, Vol. 1(1):78-89) 에서 DDR2-I638F와 DDR2- L63V는 와일드형 DDR2와 다르게 암을 유발하는 활성을 가진 것으로 발표되었다. 이 사실과 본 발명에서 보여준 사실과 연관할 때 DDR2가 특정 점 돌연변이에 의해 유비퀴틴 의존성 단백질 분해 시스템에 의해서 세포 내에서 네거티브하게 조절되는 작용을 받지 않을 때는 암 유발과 같은 비정상적 활성을 보일 수 있음을 알 수 있다.

6. 결론

따라서 이러한 사실들에 비추어 유비퀴틴 의존성 프로테아좀에 의한 DDR2의 활성 조절 기작이 작동하지 않으면 암 등 여러 DDR2 의 비정상적 과잉 활성으로 인한 질환 유발에 기여한다고 볼 수 있다. 이러한 사실들에서 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 활성이 저해된 상태에서 DDR2의 발현 증가나 그 기능적 형태인 130KD 형의 발현을 억제할 수 있는 물질은 DDR2 의 비정상적 과잉 활성이 연관된 질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다. 따라서 DDR2를 발현하는 세포에서 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제를 처리하는 등의 방식으로 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 활성이 저해된 상태에서 DDR2의 발현 증가나 활성을 억제하는 물질을 스크리닝하는 것은 DDR2 의 비정상적 과잉 활성이 연관된 질환의 치료제를 발굴하기 위한 하나의 방법으로서 유용하다.

Claims (11)

1. 디스코이딘 도메인 수용체 2 (discoidin domain receptor 2, DDR2)를 발현하는 세포에 유비퀴틴 의존성 프로테아좀(Ubiquitin-dependent proteasome) 저해제를 처리하는 단계,
   상기 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계, 및
   DDR2 를 발현하는 세포에 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제를 처리했을 때 나타나는 DDR2 의 발현량 증가가, 후보 화합물의 처리에 의하여 저해되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는,
   동맥경화, 간경화, 폐경화, 신장경화 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는DDR2 의 과잉 활성에 의해 유발되는 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 DDR2 를 발현하는 세포는 DDR2 가 도입된 세포인 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 DDR2 를 발현하는 세포는 DDR2 를 발현하는 암 세포 또는 혈관 평활근 세포인 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제는 MG132 (N-카보벤족시-L-류시닐-L-류시닐-L-류시날), 볼테조미브 (Bortezomib), 또는 락타시스틴 (Lactacyctin)인 방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 DDR2 의 발현량을 DDR2 에 특이적인 항체를 이용하여 검출하는 것인 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 DDR2 의 발현량을 웨스턴블로팅, 면역침전법 또는 면역염색법에 의해 검출하는 것인 방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 DDR2 를 발현하는 세포에 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 저해제를 처리했을 때 나타나는DDR2　의 발현량 증가는, 130 KD 형태의 DDR2의 발현량의 증가를 포함하는 것인 방법.
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