KR20070074619A - Ｃｏｐ１ 분자 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다양한 암에서 COP1 과다발현을 검출하기 위한 진단, 예측 및 치료 용도를 제공한다. 본 발명의 방법 및 용도는 p53 발현을 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 COP1 및 p53 결합을 저해하는 시험 화합물에 대해 스크리닝하는데 사용하기 위한 시약 및 키트를 제공한다.

암, COP1 과다발현, p21, p53, 진단, 치료, 루시퍼라제

Description

ＣＯＰ１ 분자 및 그의 용도 {COP1 MOLECULES AND USES THEREOF}

본 발명은 암 진단제 및 치료제 분야에 속한다.

전통적인 종양 억제제로서 p53의 역할은 잘 확립되어 있다 <1>. 생화학적으로, p53은 p53 컨센서스 결합 부위를 갖는 프로모터로부터 전사를 활성화시키는 스트레스 활성화된 서열 특이적 전사 인자로서 기능한다 <2>. 또한, p53은 또한 전사의 강력한 리프레서 (repressor)로서 기능하여 유전자를 추가로 조절한다 <3>. 따라서, p53은 혈관신생, 항-세포자멸 (anti-apoptosis) 및 세포주기 진행에 관여하는 유전자 억제 이외에도, 세포주기 정지, 세포자멸 및 DNA 복구에 관여하는 유전자 집단의 전사를 활성화시킴으로써 다양한 스트레스 신호, 예를 들어 몇 가지만 열거하면 DNA 손상, 뉴클레오티드 고갈 및 발암 유전자 활성화로부터 세포를 보호한다. p53 활성화의 생리학적 결과는 본질적으로 성장 정지 또는 세포자멸을 일으켜 세포가 유전적으로 손상된 게놈을 복제하는 것을 방지한다.

p53은 전부는 아니더라도 일부 암에서 음적으로 (negatively) 조절되거나 돌연변이되는 강력한 종양 억제제 단백질이다 <26, 27>. 인간 악성종양에서 p53 유전자에서 높은 빈도의 변경, 또는 p53 경로의 탈조절된 성분은 발암을 방지하는 p53 완전성의 중요성을 강조한다. 이는 6개월령에 종양이 자발적으로 발병한 p53 녹아웃 (knockout) 마우스로부터의 관찰로 추가로 입증된다 <4>. 암에서 p53 유전자 변경의 실제 빈도는 20-80％인 것으로 추정된다. 광범위한 변동은 종양 기원의 조직, 검출 방법, 및/또는 분석되는 유전자의 구역에 기인할 수 있다. 예를 들어, 유방 종양에서, 유전자 변경의 추정 빈도는 약 20％인 반면, 상기 빈도는 소세포 폐암종의 경우 >70％로 극적으로 증가한다 <5, 6>. 난소 종양은 일반적으로 야생형 p53 유전자를 갖는다 <28>.

스트레스를 받지 않은 세포에서 p53은 유비퀴틴을 E2 효소, 예를 들어 UbcH5b로부터 다중 리신 잔기 상의 기질에 또는 기질-컨쥬게이팅된 유비퀴틴 상에 전달하여 폴리유비퀴틴 사슬을 생성시키는 Pirh2 <7> 및 MDM2 <8-10>과 같은 E3 리가제에 대한 기질 인식에 따른 프로테아좀-의존성 경로에 의해 신속하게 전환된다 (turned over). 일단 K48-연결된 폴리유비퀴틴 사슬 길이가 4 이상에 도달하면, 기질은 분해를 위해 기질을 표적으로 하는 프로테아좀의 성분, 예를 들어 hRad23a <11>에 의해 인식될 수 있다. 따라서, MDM2 <25> 및 Pirh2 <7>는 p53의 음적 조절인자이다. Pirh2 및 MDM2는 p53-유도가능 유전자이어서 <7, 12, 13>, p53 반응을 끄기 위해 사용될 수 있는 음적 피드백 루프를 생성시키고 세포주기 진행을 허용한다.

아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) COP1은 식물 광형태발생을 억제하는 기능을 하는 링 핑거 (RING finger)-함유 단백질이다. AtCOP1은 광-매개 유전자 발현을 음적으로 조절함으로써 모종 발달을 제어하고 <14>, 마이크로어레이 (microarray) 분석은 AtCOP1이 전부는 아니지만 대부분의 광-반응성 유전자를 조절 한다는 것을 나타낸다 <15, 16>. 이는 암부에서 광-성장된 식물의 전형적인 표현형을 나타내는 COP/DET/FUS 단백질의 기능 손실 (loss-of-function) 돌연변이체에 의해 예시될 수 있다 <17>. 기계학적으로, 이는 광-매개 발달의 양적 (positive) 조절인자, 예를 들어 LAF1 <18> 및 HY5 <19>를 억제하는 AtCOP1의 능력에 기인한다. COP1은 시험관 내에서 고유한 E3-리가제 활성을 갖고 <29, 30>, 기질로서 LAF1을 이용할 수 있다. COP1은 식물에서 중요한 광-매개 발달 스위치이지만, 포유동물 세포에서 그의 역할은 덜 확립되어 있다 <20>.

<발명의 개요>

본 발명은 대상의 암에서 COP1 수준 또는 활성을 검출하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. 추가의 실시태양에서, 진단 방법은 대상의 암에서 p53 수준 또는 활성을 검출하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 검출된 p53 분자는 야생형 p53 분자이다. 다른 실시태양에서, p53 분자는 인간 p53 분자이다. 다른 실시태양에서, p53 분자는 p53에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출된다. 진단 방법의 추가의 실시태양에서, 암에서의 p53의 핵산 서열이 서열결정된다. 또다른 실시태양에서, p53 분자는 p53-의존성 트랜스활성화 (transactivation)의 억제, p53-유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소 중 하나 이상으로 이루어진 군 중에서 선택된 p53 활성 분석을 사용하여 검출된다. 다른 실시태양에 따라, 진단 방법은 상기 샘플에서 p21 분자의 검출 단계를 포함한다. 다른 실시태양에 따라, 진단되는 대상은 인간이다. 또다른 실시태양에 따라, 진단되는 암은 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 및 전이 세포암 중 하나 이상 으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 또다른 실시태양에 따라, 진단되는 암은 장액 선암종, 자궁내막양 선암종, 투명 세포 선암종 및 점액 선암종으로 이루어진 군 중에서 선택된다.

본 발명은 대상으로부터의 샘플에서 COP1 분자를 검출하는 것을 포함하는, 대상에서 암 치료법의 효능을 모니터링하거나 예후를 평가하기 위한 방법에 관한 것이고, 여기서 대조군에 비해 상기 COP1 분자의 과다발현의 감소가 암 치료법이 효과적임을 나타낸다. 한 실시태양에서, 방법은 상기 샘플에서 p53 분자를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 또다른 실시태양에서, 검출되는 p53 분자는 야생형 p53이다. 또다른 실시태양에서, p53 분자는 p53-의존성 트랜스활성화의 억제, p53-유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소 중 하나 이상으로 이루어진 군 중에서 선택된 p53 활성을 관찰함으로써 검출된다. 한 실시태양에서, 평가되는 암 치료법은 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 및 전이 세포암 중 하나 이상으로 이루어진 군 중에서 선택되는 암의 치료를 위한 것이다. 한 실시태양에서, 평가되는 암 치료법은 장액 선암종, 자궁내막양 선암종, 투명 세포 선암종 및 점액 선암종으로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택되는 암의 치료를 위한 것이다.

본 발명은 대상에게 COP1의 발현을 억제하는 제1 화합물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암으로 진단되거나 암에 걸릴 위험이 있는 대상에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 방법은 대상에게 MDM2 또는 Pirh2의 발현을 억제하는 제2 화합물의 치료 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 또다른 실시태양에서, 제1 또는 제2 화합물은 암을 암 치료법에 대해 민감 화시킨다. 또 다른 실시태양에서, 제1 또는 제2 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 삼중 가닥 형성 올리고뉴클레오티드 및 siRNA 분자로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택된다. 방법은 제1 및/또는 제2 화합물의 투여 전, 투여 동안 또는 투여 후에 암 치료법의 과정 동안 유용할 수 있는 하나 이상의 다른 치료제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 치료되는 암은 야생형 p53을 발현한다. 또다른 실시태양에서, 치료되는 암은 대조군에 비해 COP1을 과다발현한다. 또다른 실시태양에서, 치료되는 암은 감소된 p53 수준 또는 대조군에 비해 감소된 활성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 치료되는 암은 대조군에 비해 감소된 p21 발현 수준을 나타낸다.

본 발명은 COP1 분자의 p53 분자에 대한 결합을 저해하는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 시험 화합물은 COP1 리가제 활성을 추가로 억제할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 방법은 상기 시험 화합물이 COP1 활성을 조정하는지 결정하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, COP1 활성은 p53의 분해, p53의 유비퀴틴화, p53-의존성 트랜스활성화의 억제, p53 유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, COP1은 인간 COP1 분자이다. 또다른 실시태양에서, p53은 인간 p53 분자이다. 한 실시태양에서, 스크리닝 방법은 COP1/p53의 결합의 파괴 또는 억제를 측정하는 분석이다. 또다른 실시태양에서, 스크리닝 방법은 리포터 유전자 분석이다. 추가의 실시태양에서, 스크리닝 방법은 COP1 활성을 검출하는 추가 단계를 포함하고, 여기서 활성은 p53의 분해, p53의 유비퀴틴화, p53-의 존성 트랜스활성화의 억제, p53 유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택된다.

본 발명은 포유동물 세포를 COP1에 결합하는 시험 화합물로 처리하고, 처리된 세포에서 p53을 검출하는 단계를 포함하는, p53의 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 검출 단계는 p53의 분해, p53의 유비퀴틴화, p53 트랜스활성화의 억제, p53 유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소로 이루어진 군 중 하나 이상을 측정하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 포유동물 세포는 COP1을 발현하도록 유전공학처리된다. 한 실시태양에서, 포유동물 세포는 p53을 발현하도록 유전공학처리된다.

본 발명은 암으로 진단되거나 암에 걸릴 위험이 있는 대상에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, COP1 분자의 발현을 억제하거나 COP1 리가제 활성을 억제하는 화합물의 용도에 관한 것이다. 한 실시태양에 따르면, 화합물은 COP1을 표적으로 하는 RNAi이다. 다른 실시태양에 따르면, 의약은 MDM2 또는 Pirh2의 발현을 억제하는 화합물, 또는 MDM2 또는 Pirh2의 발현을 억제하는 화합물을 COP1-억제 화합물과 함께 투여하는 것에 관련된 정보를 제공하는 의약용 라벨 (label)을 포함한다. 다른 실시태양에 따르면, 의약은 MDM2 분자의 발현 또는 활성을 억제하는 화합물을 추가로 포함하고/하거나 MDM2 억제제를 투여하기 위한 지시서 (instruction)를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에 따르면, 의약은 Pirh2의 발현 또는 활성을 억제하는 화합물을 추가로 포함하고/하거나 Pirh2 억제제를 투여하기 위한 지시서를 포함할 수 있다.

본 발명은 세포에서 COP1을 과다발현시키고, COP1을 과다발현하는 세포에서 p53을 검출하는 단계를 포함하는, 포유동물 세포에서 p53의 활성을 억제하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 p53 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자, 및 포유동물 COP1 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 포유동물 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 p53 분자의 발현을 증가 또는 감소시키는 비-코딩 서열 (예를 들어, 프로모터/인핸서 서열 또는 안티센스 서열)을 COP1 분자 발현을 증가 또는 감소시키는 비-코딩 서열과 조합하여 또는 COP1 분자를 코딩하는 분자와 조합하여 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 COP1 분자의 발현을 증가 또는 감소시키는 비-코딩 서열 (예를 들어, 프로모터/인핸서 서열 또는 안티센스 서열)을 p53 분자 발현을 증가 또는 감소시키는 비-코딩 서열과 조합으로 또는 p53 분자를 코딩하는 분자와 조합으로 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 COP1 분자 발현 또는 활성을 변경시키도록 유전공학처리되면서, p53이 발현되지 않거나 돌연변이체로서 발현되도록 게놈상 변경된 p53에 대한 코딩 서열을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 p53 분자 발현 또는 활성을 변경시키도록 세포를 유전공학처리하면서, COP1이 발현되지 않거나 돌연변이체로서 발현되도록 게놈상 변경된 COP1에 대한 코딩 서열을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포에 관한 것이다.

본 발명은 감소된 COP1 활성 및 감소된 MDM2 활성을 갖도록 유전공학처리되고, 임의로 p53 발현 또는 활성을 변경시키도록 추가로 유전공학처리된 포유동물 세포를 제공한다. 본 발명은 감소된 COP1 활성 및 감소된 Pirh2 활성을 갖도록 유전공학처리되고, 임의로 p53 발현 또는 활성을 변경시키도록 추가로 유전공학처리된 포유동물 세포를 제공한다. 본 발명은 감소된 COP1 활성, 감소된 MDM2 활성 및 감소된 Pirh2 활성을 갖도록 유전공학처리되고, 임의로 변경된 p53 발현 또는 활성을 갖도록 추가로 유전공학처리된 포유동물 세포를 제공한다. 본 발명은 감소된 MDM2 활성, 감소된 Pirh2 활성 및 증가된 COP1 활성을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포를 제공한다. 본 발명은 감소된 COP1 활성을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포를 제공한다. 본 발명은 감소된 p53 활성 및 증가되거나 정상적인 COP1 활성을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포를 제공한다. 한 실시태양에서, 활성은 p53 또는 COP1 분자를 표적으로 하는 RNAi의 방법에 의해 감소된다.

본 발명은 COP1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 서열 특이적 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 핵산 분자, p53 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 트랜스활성화 도메인을 포함하는 제2 핵산 분자, 및 상기 서열 특이적 DNA 결합 도메인에 의해 인식될 수 있는 서열에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 제3 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 p53 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 서열 특이적 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 핵산 분자, COP1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 트랜스활성화 도메인을 포함하는 제2 핵산 분자, 및 상기 서열 특이적 DNA 결합 도메인에 의해 인식될 수 있는 서열에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 제3 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 재조합 COP1 분자를 재조합 p53 분자와 병용하는 것을 포함하는 분석, 예를 들어, 시험관내 유비퀴틴 분석, COP1/p53 결합 분석, COP1 리가제 분석 및 p53 활성 분석을 제공한다.

본 발명은 샘플에서 COP1 분자를 검출하기 위한 시약, 및 암 세포를 포함하는 샘플에서 COP1 분자를 검출하기 위한 지시서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 한 실시태양에서, 암 세포는 야생형 p53 발현 암세포이다. 또다른 실시태양에서, 암 세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 결장암 세포, 폐암 세포, 및 전이 세포암 세포 중 하나 이상으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 또다른 실시태양에서, 암은 장액 선암종, 자궁내막양 선암종, 투명 세포 선암종, 및 점액 선암종 중 하나 이상으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 한 실시태양에서, 키트는 샘플에서 p53 분자를 검출하기 위한 시약을 추가로 포함한다.

본 발명은 COP1의 발현을 억제하는 화합물을 제약학상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시태양에서, 제약 조성물은 MDM2 또는 Pirh2의 발현을 억제하는 화합물을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 삼중 가닥 형성 올리고뉴클레오티드 및 siRNA 분자로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물 및 방법의 한 실시태양에서, COP1 분자는 p53에 결합하는 인간 COP1 또는 그의 변이체의 적어도 일부를 포함한다. 본 발명의 방법의 한 실시태양에서, p53 분자는 COP1에 결합하는 인간 p53 또는 그의 변이체의 적어도 일부를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 다른 실시태양에서, COP1 분자는 p53 에 결합하는 인간 COP1 또는 그의 변이체의 적어도 일부를, 리가제 활성을 갖는 COP1의 부분과 조합으로 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 COP1, p53, p21, MDM2 및 Pirh2의 억제제는 COP1, p53, p21, MDM2 및 Pirh2에, 또는 COP1, p53, p21, MDM2 및 Pirh2를 코딩하는 유전자 (상기 유전자의 비번역 구역 포함)에 결합함으로써 억제한다.

도 1a-e. COP1 및 그의 p53과의 상호작용. a, Flag-펩티드 기반 용출로부터의 은-염색된 SDS 겔. 밑줄로 지표한 질량 분광법에 의한 매칭 (matching) 펩티드를 갖는 p53 단백질의 서열 (하부 패널) (서열 1). b, COP1은 생체 내에서 외인성 p53과 상호작용한다. Saos-2 세포를 지시된 바와 같이 형질감염시키고, 면역침전시키고 면역블로팅하였다 (웨스턴 블로트, WB). c, COP1은 생체 내에서 내인성 p53과 상호작용한다. U2-OS 세포를 지시된 바와 같이 COP1을 사용하여 또는 사용하지 않고 형질감염시키고, 면역침전시키고 면역블로팅하였다. d, 내인성 p53은 내인성 COP1과 상호작용한다. U2-OS 세포를 항-p53 또는 항-Myc로 면역침전시키고, 항-COP1로 면역블로팅하였다. e, COP1은 시험관 내에서 p53과 상호작용한다. GST 또는 GST-p53을 시험관내 번역된 HA-COP1과 함께 인큐베이팅하고, 결합된 COP1을 항-HA 면역블로팅에 의해 검출하였다. 하부 패널은 HA-COP1의 20％총 인풋을 나타낸다.

도 2a-i. COP1은 p53 발현 및 트랜스활성화 활성을 음적으로 조절하고, MDM2 또는 Pirh2의 부재 하에 p53을 분해하는 능력을 유지한다. a, COP1은 외인성 p53 단백질의 항정 상태 (steady-state) 수준을 방해한다. COP1 또는 COP1ΔRING을 p53으로 Saos-2 (p53-null) 세포 내로 형질감염시키고, p53의 항정 상태 수준을 면역블로팅에 의해 평가하였다. b, COP1은 내인성 p53 단백질의 항정 상태 수준을 방해한다. COP1 또는 COP1ΔRING을 U2-OS 세포 내로 형질감염시키고, 내인성 p53의 항정 상태 수준을 면역블로팅에 의해 평가하였다. c, COP1은 p53 mRNA 수준을 변경시키지 않는다. COP1 또는 COP1ΔRING으로 형질감염된 U2-OS 세포로부터 RNA를 추출하고, p53 mRNA 수준을 실시간 PCR에 의해 평가하고, 베타-액틴 mRNA에 표준화시켰다. d, COP1은 p53 턴오버 (turnover)를 증가시킨다. HEK293T 세포를 COP1을 사용하여 또는 사용하지 않고 형질감염시키고, 내인성 p53의 반감기를 펄스-체이스 (pulse-chase) 대사적 표지에 의해 측정하였다. e, p53의 COP1 분해는 기능적 26S 프로테아좀을 요구한다. U2-OS 세포를 B에서와 같이 형질감염시키되, 단, 세포를 용해물 수집 6시간 전에 프로테아좀 억제제 ALLN으로 또는 그를 사용하지 않고 처리하였다. f, COP1은 생체 내에서 p53의 유비퀴틴화를 촉진한다. Saos-2 세포를 HA-유비퀴틴, p53 및 COP1 또는 COP1ΔRING으로 형질감염시키고, ALLN으로 처리하였다. 유비퀴틴화 p53을 항-HA를 사용하는 면역침전 및 항-p53을 사용하는 면역블로팅에 의해 검출하였다. g, COP1은 시험관 내에서 p53을 직접 유비퀴틴화시킨다. 세균 발현되고 정제된 유비퀴틴 성분을 지시된 바와 같이 시험관내-번역되고 면역침전된 p53과 함께 인큐베이팅하였다. 유비퀴틴화 p53을 항-Flag을 사용하여 검출하였고, 생성물 >53 kDa로서 나타났다. h, COP1은 p21 프로모터에 대한 p53의 트랜스활성화 기능을 축소시킨다. Saos-2 세포를 p21-Luc 리포터 및 내부 제어 pCMV-b-Gal 플라스미드를 갖는, p53 및 COP1 또는 COP1ΔRING으로 형질감염시켰다. RLU: 상대 광 단위. i, COP1은 p53-의존성 세포자멸을 방지한다. Saos-2 세포를 지시된 바와 같이 p53 및 COP1로 형질감염시켰다. 일시적으로 형질감염된 세포를 EGFP의 동시형질감염에 의해 선택하고, 생성되는 서브-G1 집단을 세포-사멸 추정을 위해 프로피듐 요오다이드 염색에 의해 평가하였다. j, COP1은 MDM2-독립적 방식으로 p53 분해를 촉진한다. p53/MDM2 null 마우스로부터 유래된 MEF를 지시된 바와 같은 구성체로 형질감염시키고, 용해물을 p53, 액틴, MDM2, 및 FLAG에 대한 항체로 면역블로팅하였다. k, COP1은 Pirh2-독립적 방식으로 p53 분해를 촉진한다. Saos-2 세포를 siRNA에 의해 Pirh2 고갈시키고, 후속적으로 p53 및 FLAG-COP1, 또는 MDM2로 형질감염시켰다. p53의 항정 상태 수준에 대한 영향을 면역블로팅에 의해 평가하였다. Pirh2 mRNA 제거를 실시간 PCR에 의해 확인하였다. l, COP1은 bax 프로모터로부터 p53-의존성 전사를 억제한다. Saos-2 세포를 리포터 bax-Luc 및 내부 제어 pCMV-βGal을 포함하는, p53 및 FLAG-COP1 또는 FLAG-COP1ΔRING으로 형질감염시켰다. 상대 트랜스활성화 활성은 루시퍼라제를 β-Gal 활성으로 표준화시킴으로써 평가하였다. m, COP1은 내인성 p53의 트랜스활성화 활성을 억제한다. U2-OS 세포를 증가량의 FLAG-COP1 또는 FLAG-COP1ΔRING을 갖는, pG13-Luc 또는 NS-Luc 및 pCMVβ-Gal로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후에, 세포를 10 μM 에토포시드 또는 DMSO로 처리하고, 루시퍼라제 활성을 처리 6시간 후 결정하였다.

도 3a-d. COP1의 siRNA 제거는 p53 단백질의 축적을 일으키고 G1 정체 (arrest)를 유발한다. a, COP1의 siRNA 제거는 p53 단백질의 항정 상태 수준을 증가시키고, p21 및 Pirh2 유전자의 트랜스활성화를 증가시킨다. U2-OS 및 H1299 세포를 대조군으로서 COP1 또는 역전된 COP1에 siRNA 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 용해물을 지시된 항체로 면역블로팅하고, 표적 유전자의 mRNA를 실시간 PCR로 검출하였다. b, c, COP1의 siRNA 제거는 p53-의존성인 G1 정체를 유발한다. U2-OS (B) 또는 H1299 (C) 세포를 siRNA 올리고뉴클레오티드로 COP1 또는 역전된 COP1에 형질감염시키고, 세포 주기 프로필을 프로피듐 요오다이드 염색 및 FACS에 의해 결정하였다. d, 2가지 추가의 다른 siRNA 올리고에 의한 COP1의 제거는 단백질 수준에서 p53의 축적을 일으킨다. U2-OS 세포를 COP1 siRNA2 또는 COP1 siRNA3으로 형질감염시키고 용해시켰다.

도 4a-e. siRNA에 의한 COP1, Pirh2 및 MDM2 제거는 p53을 안정화시키고 활성화시킨다. a, COP1의 제거는 p53을 안정화시킨다. U2-OS 세포를 siRNA 올리고뉴클레오티드로 COP1, MDM2 및/또는 Pirh2에 형질감염시키고, 후속적으로 지시된 기간 동안 펄스-체이싱하였다. 이어서, 용해물을 수거하고 항p53으로 면역침전시키고, 포스포르이미저 (phosphorimager) 상에서 정량하였다. b, p53의 트랜스활성화 활성은 COP1의 감소시 증가된다. U2-OS 세포를 지시된 siRNA 올리고뉴클레오티드 및 p21-Luc 리포터로 형질감염시키고, 상대 트랜스활성화 활성은 루시퍼라제를 내부 형질감염 대조군, pCMV-베타-Gal 활성으로 표준화시킴으로써 결정하였다. c, p53 및 하류 표적 p21은 COP1의 제거에 반응하여 단백질 수준에서 축적하고, MDM2의 동시-제거에 의해 더욱 자극된다. b로부터의 용해물을 p53, p21, COP1 및 MDM2 에 대한 항체로 프로빙하였다. d, COP1은 정상 세포에서 p53을 음적으로 조절한다. BJ 섬유모세포를 c에서와 같이 siRNA 올리고뉴클레오티드로 형질감염시키고, 용해물을 수거하고 p53, p21, 액틴, MDM2 및 COP1에 대한 항체로 면역블로팅하였다. e, siRNA에 의한 COP1 및 MDM2의 제거는 U2-OS 세포를 IR-유발 세포 사멸에 민감화시킨다. U2-OS 세포를 지시된 바와 같이 siRNA 올리고뉴클레오티드로 예비-처리하고, 20 Gy IR에 노출시키고 프로피듐 요오다이드 염색에 의해 세포 사멸을 결정하였다.

도 5a-e. COP1은 p53-유도가능 유전자이다. a, COP1 프로모터 상에서 p53 컨센서스 부위의 확인. 밑줄로 지표한 서열은 p53 10량체 (decamer)를 나타낸다. b, COP1 프로모터로부터의 p53 컨센서스 부위는 p53-의존성 전사를 실행할 수 있다. p53에 대한 COP1 컨센서스 부위의 2개 카피를 pGL3-프로모터 루시퍼라제 리포터 구성체의 상류에 도입하고, 야생형 p53 또는 돌연변이체 p53 R175H로 동시형질감염시켰다. 상대 활성은 pCMV-베타-Gal 활성에 대해 표준화시킴으로써 결정하였다. c, COP1 mRNA는 p53에 의해 유도된다. H1299 세포를 p53 또는 R175H 돌연변이체로 형질감염시키고, RNA를 단리하고 COP1 mRNA에 특이적인 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 실행하고, b-액틴 mRNA로 표준화시켰다. d, COP1 단백질 수준은 p53에 의해 증가된다. c로부터의 용해물을 p53, p21, 액틴 및 COP1에 대한 항체로 면역블로팅하였다. e, COP1 단백질 수준은 IR에 반응하여 증가된다. U2-OS 세포를 10 Gy IR로 조사하고, 8시간 후 수거하였다. 용해물을 p53, 액틴 및 COP1에 대한 항체로 면역블로팅하였다.

도 6a-c. 쥐 조직에서 COP1 발현. a: 정상 고환에서 COP1의 ISH 분석. 좌측 패널은 명시야 (bright-field)를 나타내고, 우측 패널은 암시야 (dark-field)를 나타낸다. b: 제1 스트랜드 cDNA 패널을 사용하는 전장 COP1의 RT-PCR. c: 전장 COP1 발현의 노던 (Northern) 블로트 분석.

도 7a-d. 난소 선암종에서 COP1 과다발현. a: 난소 종양으로부터의 cop1 mRNA의 실시간 PCR 분석. RNA를 정상 대조군과 매칭시켜 종양 샘플로부터 제조하고, 실시간 PCR Taqman 분석하였다. 데이타는 매칭된 정상 cop1 mRNA에 대한 증가 배수로서 나타내고, RPL19 mRNA에 표준화시켰다. b: ISH에 의한 cop1 mRNA의 과다발현. cop1 발현은 신생물 상피세포에서 명백하지만, 기질과 관련되지 않았다; 정상 난소 조직은 음성이었다. c: 난소 선암종에서 단백질 수준에서 COP1의 과다발현. b에서와 동일한 사례의 난소 선암종은 신생물 상피세포의 세포질 및 핵에서 COP1 면역반응성을 나타내지만, 기질과 관련되지 않는다. d: 난소 종양에서 p53 유전자 상태 및 COP1 과다발현과 p21 mRNA에서 증가와의 상관관계. DNA를 A로부터의 샘플로부터 추출하고, p53 유전자의 엑손 5-8을 PCR 실행하고, 생성물을 DNA 서열결정에 의해 분석하고 야생형 (wt) 또는 돌연변이체 (mu)로 지정하였다. p53 유전자 상태 아래의 그래프는 COP1을 과다발현하는 a로부터의 동일한 샘플이 또한 p21 mRNA가 감소되었음을 보여준다. p21 mRNA의 상대적 수준은 a에서와 같이 실시간 PCR에 의해 결정하고, RPL19 mRNA에 표준화시켰다. 데이타는 p21 메시지에서 감소 배수로서 나타낸다.

도 8a-g. 유방 선암종에서 COP1 과다발현. 32 사례의 유방 선암종을 포함한 조직 마이크로어레이를 COP1 발현에 대해 면역조직화학에 의해 평가하였다. COP1 면역반응성은 32 유방 선암종 사례 중 25 사례에서 확인되었다. a: 신생물 상피에서 COP1 면역반응성을 보이는 대표적인 유방 선암종. b: a에 나타낸 사례의 보다 고 배율. c: 동일한 유방 선암종 사례는 신생물 상피에서 p53 면역반응성에 대해 음성이지만, 산재된 기질 세포는 양성이었다. d: c에 나타낸 사례의 보다 고 배율. e: 유방 선암종의 한 사례에서 양성 p53 면역반응성. 총 3/32 사례가 p53에 대해 양성이었다. f: e에 나타낸 사례의 보다 고 배율. g: p53 돌연변이, 아미노산 치환 C242F를 일으키는 G 대 T 전환을 E 및 F에 나타난 IHC 양성 사례에서 확인하였다. 원 배율: x1OO (a, c 및 e); x200 (b, c 및 f).

도 9a-b. 유방 종양에서 COP1 및 p53 항정 상태 수준. a: 정상 유방 또는 종양 샘플로부터 용해물을 수거하고, p53, COP1 및 액틴에 대한 항체를 사용하여 면역블로팅하였다. b: 유방 종양 샘플 내의 p53 유전자 상태. DNA를 a의 샘플로부터 추출하고, p53 유전자의 인트론-엑손 경계 및 엑손 5-8의 PCR을 실행하고, 생성물을 DNA 서열결정에 의해 분석하였다.

본 발명은 부분적으로 COP1이 다양한 암에서 과다발현됨을 증명하고, 종양 억제제 단백질인 p53이 COP1-상호작용 단백질임을 확인하였다. 기능적으로, COP1은 프로테아좀을 통해 p53을 분해시키고, MDM2-비의존 방식으로 생체 내에서 p53을 직접 유비퀴틴화시키고, 시험관 내에서 p53 트랜스활성화 가능성을 억제하고, p53-유발 세포자멸을 억제한다. 또한, COP1의 siRNA 제거는 p53을 안정화시키고 하류 표적 유전자, p21의 트랜스활성화를 증가시켜, 결과적으로 세포를 세포주기의 G1 상에 정체시킨다. COP1은 또한 자동조절 피드백 루프에 참여하는 p53-유도가능 유전자로서 확인되었다. 또한, COP1을 과다발현하는 암은 p21 mRNA의 감소를 보인다.

따라서, COP1의 과다발현은 다양한 암 또는 세포 종류를 진단하기 위해 이용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 야생형 p53을 발현하는 세포 또는 조직에서 COP1의 과다발현은 암의 진단이다.

본 발명의 다양한 별도의 실시태양 및 예를 본원에 기재한다. 이들 실시태양 및 예는 예시적인 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

비정상적 세포 증식

용어 "세포 증식 질환" 및 "증식 질환"은 일정 정도의 비정상적 세포 증식과 관련되는 질환을 나타낸다. 한 실시태양에서, 세포 증식 질환은 암이다.

용어 "암", "신생물", "신생체 (neoplasia)", "암종", "암성" 또는 "종양"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물 내의 생리학적 조건을 나타내거나 설명하는 의미이다. 일반적으로, 신생물 또는 암의 세포, 예를 들어, 신생물 세포는 정상 세포 분열 대조군, 즉, 그의 성장 또는 증식이 세포성 환경에서 보통의 생화학적 및 물리적 영향에 의해 조절되지 않는 세포로부터 방출되고, 비조절된 성장, 국소 조직 침투, 전이 등의 특징을 나타낸다. 일반적으로, 신생물 세포는 증식하여 양성 또는 악성인 세포의 클론을 형성한다. 따라서, 용어 암 또는 신생물은 기술적으로 양성이지만 악성으로 될 위험이 있는 세포 성장을 포함한다. "악성종양"은 임의의 세포 종류 또는 조직의 비정상적 성장 또는 증식을 의미한다. 악성 세포 또는 조직은 동일한 종류의 정상 세포 또는 조직에 비해 역형성 (anaplasia) 또는 분화/방향성의 손실을 나타낼 수 있고, 침투 및 전이 능력을 나타낼 수 있다.

본원에서 사용되는 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식과 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 나타낸다.

대부분의 암은 3가지 넓은 조직학적 분류 내에 속한다: 암종 (이는 주된 암이고 상피세포, 또는 장기, 선 또는 다른 신체 구조체 (예를 들어, 피부, 자궁, 폐, 유방, 전립선, 위, 장)의 외부 또는 내부 표면을 덮는 세포의 암이며, 전이하는 경향이 있다); 육종 (이는 연결 또는 지지 조직 (예를 들어, 뼈, 연골, 건, 인대, 지방, 근육)로부터 유래된다); 및 혈액 종양 (이는 골수 및 림프 조직으로부터 유래된다). 암종은 선암종 (일반적으로 분비할 수 있는 장기 또는 선, 예를 들어 유방, 폐, 결장, 전립선 또는 방광에서 발병한다)일 수 있거나, 편평세포 암종 (편평상피에서 유래하고, 일반적으로 신체의 대부분의 부위에서 발병한다)일 수 있다. 육종은 골육종 또는 골원성 육종 (뼈), 연골육종 (연골), 평활근육종 (평활근), 횡문근육종 (골격근), 중피 육종 또는 중피종 (체강의 막상 내층), 섬유육종 (섬유 조직), 혈관육종 또는 혈관내피종 (혈관), 지방육종 (지방 조직), 신경아교종 또는 성상세포종 (뇌에서 발견되는 신경성 연결 조직), 점액육종 (원시 배아 연결 조직), 중간엽 또는 혼합 중배엽 종양 (혼합 연결 조직 종류)일 수 있다. 혈액 종양은 골수의 혈장 세포에서 유래하는 골수종; "액상 암"일 수 있고 골수의 암이며 골수성 또는 과립구성 백혈병 (골수양 및 과립구성 백혈구), 림프성, 림프구성 또는 림프모구성 백혈병 (림프양 및 림프구성 혈액 세포), 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병 등, 또는 진성 적혈구 증가증 또는 적혈병 (다양한 혈액 세포 생성물, 그러나 적혈구가 우세함)일 수 있는 백혈병; 또는 고형 종양일 수 있고 림프계의 선 또는 절에서 발병하고, 호지킨 (Hodgkin) 또는 비-호지킨 림프종, 버킷 (Burkitt) 림프종 등을 포함할 수 있는 림프종일 수 있다. 또한, 혼합 종류의 암, 예를 들어 선편평세포 암종, 혼합 중배엽 종양, 암육종 또는 기형암종도 존재한다.

암은 또한 유래하는 장기, 즉 "원발 병소"에 기초하여 예를 들어, 유방, 뇌, 폐, 간, 피부, 전립선, 고환, 방광, 결장 및 직장, 경부, 자궁 등의 암으로 명명할 수 있다. 상기 명칭은 암이 원발 병소와 상이한 신체의 다른 부위로 전이하더라도 지속되고, 본 발명에 따른 암은 원발암 및 전이된 암을 포함한다.

원발 병소를 기초로 명명된 암은 조직학적 분류와 상호관련될 수 있다. 예를 들어, 폐암은 일반적으로 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암이고, 이는 편평세포 암종, 선암종 또는 대세포 암종일 수 있고; 피부암은 일반적으로 기저세포 암, 편평세포암, 또는 흑색종, 예를 들어, 악성 흑색종이다. 림프종은 머리, 목 및 가슴과 관련된 림프절과 복부내 림프절 또는 액와 또는 서혜 림프절에서 발생할 수 있다. 암의 종류와 단계의 확인 및 분류는 예를 들어, 미국에서 암 발생률 및 생존률에 대한 권위있는 정보원이고 전세계에서 인정되는 NCI (National Cancer Institute (http://seer.cancer.gov/publicdata/access.html))의 Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) 프로그램에서 제공되는 정보를 이용하여 수행할 수 있다. SEER 프로그램의 발생률 및 생존률 데이타는 특정 암 부위 및 단계에 대한 표준 생존율을 평가하기 위해 이용할 수 있다. 예를 들어, 최적 비교군을 보장하기 위해, 진단일 및 정확한 단계를 포함하는 데이타베이스로부터 특수한 기준을 선택할 수 있다. 암의 확인은 예를 들어 진단 매뉴얼 (예를 들어, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17^th edition, M.H. Beers and R. Barkow, eds., John Wiley and Sons, 1999)에 제공된 정보를 이용하여 또한 수행할 수 있다.

암 또는 신생물의 예는 당업계에 공지된 바와 같이 형질전환된 불사 세포, 고형 종양, 골수 증식 질병, 모세포종, 편평세포암 (예를 들어, 상피 편평세포암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종, 복막의 암, 간세포 암, 위암, 예를 들어 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암종, 유방암, 결장암, 직장암, 결직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 장액 선암종, 자궁내막양 선암종, 투명 세포 선암종, 점액 선암종, 브레너 (Brenner) 종양, 기형종, 미분화세포종, 융모막암종, 섬유종, 과립층 세포 종양, 세르톨리 라이디히 세포 종양, 미분화된 난소암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문 암종, 음경 암종, 머리 및/또는 목의 암, 유잉 (Ewing) 육종, 혈관육종, 카포시 (Kaposi) 육종, 지방육종, 말초 신경상피종, 윤활막 육종, 호지킨 병 등을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 암은 암 세포 또는 조직이 COP1 분자를 과다발현하거나, COP1 활성이 상향조절되는 임의의 암을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 암은 암 세포 또는 조직이 또한 야생형 p53 분자를 발현하는 임의의 암을 포함한다.

폴리펩티드, 핵산 분자, 및 시험 화합물

본 발명에 따른 화합물은 COP1 및 p53 핵산 분자, 폴리펩티드 및/또는 그의 유사체, 변이체, 상동체 및 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 화합물은 본 발명의 임의의 진단, 예측, 치료, 스크리닝 방법 등에서 사용될 수 있다. 화합물은 예를 들어, COP1 또는 p53 펩티드 또는 펩티드 유사체의 임의의 위치에서 아미노산 잔기를, 다른 보존적 아미노산 잔기, 즉, 유사한 물리적, 생물학적 또는 화학적 특성을 갖는 잔기, 또는 비-보존적 아미노산 잔기로 교체하거나 결손시키거나 삽입하고, p53 (화합물이 COP1 분자인 경우) 또는 COP1 (화합물이 p53 분자인 경우)에의 결합을 매개하는 화합물의 능력에 대해 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물은 MDM2, Pirh2 또는 p21 분자일 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 COP1 또는 p53에, 예를 들어 돌연변이체 또는 야생형 p53에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 상기 항체는 예를 들어 인간화 항체일 수 있다.

항체는 항원을 인식하여 결합하지만 샘플 내의 다른 분자를 실질적으로 인식하여 결합하지는 않을 때 항원에 "특이적으로 결합한다". 예를 들어, COP1 항체는 COP1 분자에는 특이적으로 결합하지만, 암 세포 또는 조직에 존재하는 것과 같은 임의의 다른 분자에는 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 실시태양에서, COP1 항체는 인간 COP1 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 다른 종의 COP1 분자에는 특이적으로 결합하지 않을 수 있다. 다른 예에서, p53 항체는 p53 분자에 특이적으로 결합하지만, 암 세포 또는 조직에 존재하는 것과 같은 임의의 다른 분자에는 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 실시태양에서, p53 항체는 인간 p53 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 다른 종의 p53 분자에 특이적으로 결합하지 않을 수 있다. 일부 실시태양에서, p53 항체는 돌연변이체 p53 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 야생형 p53 분자에 특이적으로 결합하지 않을 수 있다. 일부 실시태양에서, p53 항체는 야생형 p53 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 돌연변이체 p53 분자에 특이적으로 결합하지 않을 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어 항원에 대한 친화도가 샘플 내의 다른 참조 분자에 대한 항체의 친화도보다 적어도 10, 100, 1000 또는 10000배 더 크다.

본원에서 사용되는 "COP1 분자"는 COP1 폴리펩티드; COP1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; COP1 핵산 분자; 및 그의 이소형, 단편, 유사체 또는 변이체와 실질적으로 동일한 분자를 나타낸다. 예를 들어, COP1 분자는 p53에 결합하는 능력 및/또는 COP1 리가제 활성을 갖는 포유동물로부터 유래된 COP1 폴리펩티드의 이소형, 단편, 유사체, 또는 변이체를 포함할 수 있다.

COP1 분자는 기탁 번호 AAH82804 (마우스), NP_036061 (마우스), NP_001001740 (인간, 이소형 d24), NP_071902 (인간, 이소형 a), XP_468011 (벼 (Oryza sativa)), XP_468010 (벼), XP_463866 (벼), AAM34692 (인간), AAH39723 (인간), BAB45239 (인간), P_ABG08243 (인간), AAD51094 (마우스), AAN86553 (브라시카 라파 아종 페키넨시스 (Brassica rapa subsp . Pekinensis)), CAA98718 (사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)), CAA04168 (아라비돕시스 탈리아나), XM_477896 (벼), XM_479164 (벼), BK000438 (인간), AF508940 (인간), AF151110 (마우스), L24437 (아라비돕시스 탈리아나), P_AAY60008 (인간), P_ABJ19398 (인간), P_ABB11576(인간), P_ABG95247 (인간), P_AAW74797 (인간), P_ABP69180 (인간), P_AAB92798 (인간), XP_064815 (인간), 및/또는 P_AAG02591 (인간)에 기재된 것에 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자와 그의 이소형, 단편, 유사체 또는 변이체를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. COP1 분자는 문헌 [Bianchi et al.<30>, Wang et al.<39>, 또는 Yi et al<20>]에 기재된 분자일 수 있다. COP1 분자는 COP1의 도메인, 예를 들어, 기탁 번호 NP_071902의 잔기 136-177 (RING 도메인); 기탁 번호 NP_071902의 잔기 231-306 (코일드-코일드 (coiled-coiled) 도메인); 및/또는 기탁 번호 NP_071902의 잔기 410-727 (WD40 도메인)에 대응하는 서열을 포함하는 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, COP1 폴리펩티드는 p53 폴리펩티드에 직접 결합하고/하거나 p53 활성 또는 기능을 억제할 수 있는 본원에 기재된 서열에 실질적으로 동일한 분자를 포함한다. 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, COP1 폴리펩티드는 p53을 음적으로 조절하기 위해 동형이량체 (homodimer)를 형성할 수 있다. 따라서, COP1 분자는 동형이량체화할 수 있는 본원에 기재된 서열에 실질적으로 동일한 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본원에 기재된 서열을 갖는 COP1 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 본 발명에 따른 특정 방법, 예를 들어, COP1 발현 수준을 검출함에 의한 특이적 암, 예를 들어, 유방암의 진단 방법으로부터 특이적으로 제외될 수 있다.

"p53"은 393개의 아미노산 인단백질을 코딩하는 강력한 종양 억제제 단백질이다 <26,27>. p53은 많은 암에서 음적으로 조절되거나 돌연변이된다 <40-43>. p53의 부재 또는 불활성화는 암에 기여할 수 있다. 다양한 p53 돌연변이가 존재한다. "야생형" p53은 정상 (즉, 비-암성) 세포에서 발견되는 p53 또는 암과 상관된 돌연변이를 갖지 않는 p53이다. 샘플의 p53 상태 (예를 들어, 샘플이 야생형 또는 돌연변이체 p53을 포함하는지)는 예를 들어, 미국 특허 6,090,566 (Vogelstein et al.)에 기재된 바와 같이, 또는 본원에 설명되거나 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 평가할 수 있다. p53 분자는 예를 들어 기탁 번호 P04637에 기재된 것과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 이들 서열에 의해 코딩되는 핵산 분자를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.

MDM2 또는 Pirh2 분자는 유비퀴틴을 E2 효소, 예를 들어 UbcH5b로부터 다중 리신 잔기 상의 기질에 또는 기질-컨쥬게이팅된 유비퀴틴 상에 전달하여 폴리유비퀴틴 사슬을 생성시키는 리가제 <7-10>를 포함하고, p53의 음적 조절인자이다 <7,25>. MDM2 또는 Pirh2 분자는 기탁 번호 AF527840 (MDM2) 및 AF255666 (Pirh2)에 기재된 것과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 분자 및 이들 서열에 의해 코딩되는 핵산 분자를 포함한다.

p21 또는 "WAF1/Cip1"은 원래 시클린-의존성 키나제의 일반 억제제로서 설명되었다. 이는 p53-의존 및 p53-비의존 기전에 의해 유발되고, 세포 증식의 억제제로서 포함하였다. P21 분자는 기탁 번호 U03106에 기재된 것과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 분자 및 이들 서열에 의해 코딩되는 핵산 분자를 포함한다.

"실질적으로 동일한" 서열은 본원에 논의된 하나 이상의 보존적 치환에 의해서만, 또는 아미노산 또는 핵산 분자의 생물학적 기능을 파괴하지 않는 서열의 위치에 놓인 하나 이상의 비-보존적 치환, 결손 또는 삽입에 의해 참조 서열과 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이다. 상기 서열은 아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서 예를 들어 제넨테크 (Genentech)에 의해 개발된 Align-2 프로그램을 사용하여 비교용으로 사용된 서열에 최적으로 정렬될 때 10％ 내지 99％, 보다 일반적으로 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 55％ 또는 60％, 또는 적어도 65％, 75％, 80％, 85％, 90％, 또는 95％, 또는 96％, 97％, 98％, 또는 99％로 동일할 수 있다. 폴리펩티드에 대해, 비교 서열의 길이는 적어도 2, 5, 10 또는 15개 아미노산, 또는 적어도 20, 25 또는 30개 아미노산일 수 있다. 별도의 실시태양에서, 비교 서열의 길이는 적어도 35, 40 또는 50개 아미노산, 또는 60, 80, 또는 100개 아미노산 초과일 수 있다. 핵산 분자에 대해, 비교 서열의 길이는 적어도 5, 10, 15, 20 또는 25개 뉴클레오티드, 또는 적어도 30, 40 또는 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 별도의 실시태양에서, 비교 서열의 길이는 적어도 60, 70, 80 또는 90개 뉴클레오티드, 또는 100, 200 또는 500개 뉴클레오티드 초과일 수 있다.

본원에서 "아미노산 서열 동일성 비율 (％)"은 서열을 정렬시키고, 최대 서열 동일성 비율을 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후, 선택된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율으로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST (National Library of Medicine software), BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적에서, 아미노산 서열 동일성 ％값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용함으로써 아래 설명된 바와 같이 얻어진다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크. (Genentech, Inc.)에서 창작하여, 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, 미국 워싱턴 디.씨., 20559)에 사용자 문서화로 출원하였고, 여기서 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어, 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.

별법으로 또는 추가로, 2개의 핵산 서열은 높은 엄격도 조건 하에 혼성화하면 "실질적으로 동일할" 수 있다. 혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자에 의해 쉽게 결정가능하고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 및 염 농도에 의존적인 실험적 계산이다. 일반적으로, 보다 긴 프로브는 적절한 어닐링 (annealing)을 위해 보다 높은 온도를 요구하는 반면, 보다 짤은 프로브는 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 그들의 용융 온도 미만에서 환경 내에 존재할 때 재어닐링하는 변성된 DNA의 능력에 좌우된다. 프로브와 혼성화가능 서열 사이의 목적하는 상동성의 정도가 더 클수록, 사용될 수 있는 상대 온도는 더 높다. 따라서, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만드는 경향이 있는 반면, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있을 것이다. 혼성화 반응의 엄격도의 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해서는 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.

한 실시태양에 따라, 혼성화는 높은 엄격도 조건 하에 있다. 본원에서 사용되는 "엄격한 조건" 또는 "높은 엄격도 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 나트륨 도데실 술페이트를 사용하거나; (2) 혼성화 동안 변성제, 예를 들어 포름아미드, 예를 들어, 42℃에서 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ Ficoll/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 갖는 50 mM 인산나트륨 버퍼, pH 6.5를 갖는 50％ (v/v) 포름아미드를 사용하거나; (3) 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 중에서 10분 세척에 이어 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC를 사용한 10분 높은-엄격도 세척과 함께, 42℃에서 50％ 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 파이로인산나트륨, 5 x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS 및 10％ 덱스트란 술페이트를 사용하는 용액 중 철야 혼성화인 것으로 확인될 수 있다.

"중정도 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 것으로서 확인될 수 있고, 상기 설명된 것보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 ％SDS)의 사용을 포함한다. 중정도 엄격한 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 철야 인큐베이션에 이어, 필터를 약 37-50℃에서 1 x SSC 중에서 세척하는 것이다. 당업계의 숙련인은 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알 것이다.

혼성화는 약 20 내지 30분, 또는 약 2 내지 6시간, 또는 약 10 내지 15시간, 또는 24시간 이상의 기간에 걸쳐 수행할 수 있다. 높은 엄격도 혼성화는 또한 분자 생물학자에 의해 일상적으로 수행되는 많은 기술, 예를 들어 높은 엄격도 PCR, DNA 서열결정, 단일 가닥 구조 다형 분석, 및 계내 혼성화 (in situ hybridization)의 성공을 위한 토대가 된다. 노던 및 서던 (Southern) 혼성화에 대조적으로, 상기 기술은 보통 비교적 짧은 프로브 (예를 들어, PCR 또는 서열결정을 위해 보통 약 16 뉴클레오티드 이상, 및 계내 혼성화를 위해 약 40개 뉴클레오티드 이상)를 사용하여 수행된다.

생물학적으로 동등한 폴리펩티드를 얻기 위해 펩티드의 생물학적 기능을 실질적으로 변경하지 않으면서 폴리펩티드의 구조에서 일부 변형 및 변화가 이루어질 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 생물학적 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산 치환에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 서열의 일부와 상이한 생물학적으로 동등한 펩티드로 연장한다.

본원에서 사용되는 용어 "보존된 아미노산 치환"은 관련 기능의 실질적인 손실 없이 치환이 이루어질 수 있는 펩티드 내의 주어진 위치에서 하나의 아미노산의 다른 것으로의 치환을 의미한다. 상기 변화를 이루기 위해, 유사한 아미노산 잔기의 치환이 측쇄 치환체, 예를 들어, 그들의 크기, 전하, 소수성, 친수성 등의 상대적인 유사성을 기초로 이루어질 수 있고, 상기 치환은 일상적 시험에 의해 펩티드의 기능에 대한 영향에 대해 분석될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 단백질에서 일반적으로 발견되는 L-아미노산, D-아미노산, 및 변형된 상기 아미노산을 의미한다. 따라서, 본 발명의 아미노산은 예를 들어 2-아미노아디프산; 3-아미노아디프산; 베타-알라닌; 베타-아미노프로피온산; 2-아미노부티르산; 4-아미노부티르산; 피페리딘산; 6-아미노카프로산; 2-아미노헵탄산; 2-아미노이소부티르산; 3-아미노이소부티르산; 2-아미노피멜산; 2,4-디아미노부티르산; 데스모신; 2,2'-디아미노피멜산; 2,3-디아미노프로피온산; N-에틸글리신; N-에틸아스파라긴; 히드록시리신; 알로-히드록시리신; 3-히드록시프롤린; 4-히드록시프롤린; 이소데스모신; 알로-이소류신; N-메틸글리신; 사르코신; N-메틸이소류신; 6-N-메틸리신; N-메틸발린; 노르발린; 노르류신; 및 오르니틴을 포함할 수 있다.

일부 실시태양에서, 아미노산 잔기가 유사한 친수도값 (예를 들어, ± 2.0, 또는 ± 1.5, 또는 ± 1.0, 또는 ± 0.5 값 내에서)을 갖는 다른 것으로 치환되는 보존된 아미노산 치환이 이루어질 수 있고, 여기서 다음은 수치 (hydropathic) 지수가 약 -1.6인 아미노산일 수 있고, 예를 들어, Tyr (-1.3) 또는 Pro (-1.6)이 아미노산 잔기에 배정된다 (본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,554,101에 상세히 설명된 바와 같이): Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); Ile (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); 및 Trp (-3.4).

별도의 실시태양에서, 아미노산 잔기가 유사한 수치 지수 (예를 들어, ± 2.0, 또는 ± 1.5, 또는 ± 1.0, 또는 ± 0.5 값 내에서)를 갖는 다른 것으로 치환되는 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 상기 실시태양에서, 각각의 아미노산 잔기는 다음과 같이 그의 소수성 및 전하 특징을 기초로 수치 지수에 배정될 수 있다: Ile (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); 및 Arg (-4.5).

별도의 실시태양에서, 보존적 아미노산 치환은 유사성 행렬의 공개적으로 이용가능한 패밀리를 사용하여 이루어질 수 있다 (Altschul, S.F. 1991. "Amino acid substitution matrices from an information theoretic perspective." Journal of Molecular Biology, 219: 555-665; Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M., Orcutt, B.C. 1978. "A model of evolutionary change in proteins." In "Atlas of Protein Sequence and Structure" 5(3) M.O. Dayhoff (ed.), 345-352, National Biomedical Research Foundation, Washington; States, D.J., Gish, W., Altschul, S.F. 1991. "Improved Sensitivity of Nucleic Acid Database Search Using Application-Specific Scoring Matrices" Methods: A companion to Methods in Enzymology 3(1): 66-77; Steven Henikoff and Jorja G. Henikoff. 1992 "Amino acid substitution matrices from protein blocks." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89(biochemistry): 10915-10919; M.S. Johnson and J.P. Overington. 1993. "A Structural Basis of Sequence Comparisons: An evaluation of scoring methodologies." Journal of Molecular Biology. 233: 716-738. Steven Henikoff and Jorja G. Henikoff. 1993. "Performance Evaluation of Amino Acid Substitution Matrices." Proteins: Structure, Function, and Genetics. 17: 49-61; Karlin, S. and Altschul, S.F. 1990. "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes" Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 2264-2268). PAM 행렬은 진화 모델로부터 유래된 카운트 (count)에 기초하는 반면, Blosum 행렬은 정렬 내의 고도 보존된 블록으로부터 유래된 카운트를 이용한다. PAM 또는 Blosum 행렬에서 0을 초과하는 유사성 스코어가 보존적 아미노산 치환을 이루기 위해 사용될 수 있다.

별도의 실시태양에서, 아미노산 잔기가 동일한 클래스의 다른 것으로 치환되는 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산은 다음과 같이 비극성, 산성, 염기성 및 중성 클래스로 나누어진다: 비극성: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; 산성: Asp, Glu; 염기성: Lys, Arg, His; 중성: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.

보존적 아미노산 변화는 대응하는 D-아미노산에 의한, 보존적 D-아미노산에 의한, 또는 천연의 유전적으로 코딩되지 않은 형태의 아미노산에 의한 L-아미노산의 치환, 및 L-아미노산의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 천연의 유전적으로 코딩되지 않은 아미노산은 베타-알라닌, 3-아미노-프로피온산, 2,3-디아미노 프로피온산, 알파-아미노이소부티르산, 4-아미노-부티르산, N-메틸글리신 (사르코신), 히드록시프롤린, 오르니틴, 시트룰린, t-부틸알라닌, t-부틸글리신, N-메틸이소류신, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, 노르류신, 노르발린, 2-나프틸알라닌, 피리딜알라닌, 3-벤조티에닐 알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 페니실라민, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 베타-2-티에닐알라닌, 메티오닌 술폭시드, 호모아르기닌, N-아세틸 리신, 2-아미노 부티르산, 2-아미노 부티르산, 2,4-디아미노 부티르산, p-아미노페닐알라닌, N-메틸발린, 호모시스테인, 호모세린, 시스테인산, 엡실론-아미노 헥산산, 델타-아미노 발레르산 또는 2,3-디아미노부티르산을 포함한다.

별도의 실시태양에서, 보존적 아미노산 변화는 친수성 또는 소수성, 크기 또는 부피, 또는 전하의 고려에 기초한 변화를 포함한다. 아미노산은 일반적으로 주로 아미노산 측쇄의 특성에 따라 소수성 또는 친수성으로 특성화될 수 있다. 문헌 [Eisenberg et al., J. MoI. Bio. 179:125-142, 184]의 표준화 컨센서스 소수성 스케일을 기초로 소수성 아미노산은 0 초과의 소수성을 나타내고, 친수성 아미노산은 0 미만의 친수성을 나타낸다. 유전적으로 코딩된 소수성 아미노산은 Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Met 및 Trp를 포함하고, 유전적으로 코딩된 친수성 아미노산은 Thr, His, Glu, Gln, Asp, Arg, Ser 및 Lys을 포함한다. 유전적으로 코딩되지 않은 소수성 아미노산은 t-부틸알라닌을 포함하는 한편, 유전적으로 코딩되지 않은 친수성 아미노산은 시트룰린 및 호모시스테인을 포함한다.

소수성 또는 친수성 아미노산은 그들의 측쇄의 특징을 기초로 더욱 세분될 수 있다. 예를 들어, 방향족 아미노산은 하나 이상의 치환체, 예를 들어 -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO₂, -NO, -NH₂, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH₂, -C(O)NHR, -C(O)NRR 등 (여기서, R은 독립적으로 (C₁-C₆) 알킬, 치환 (C₁-C₆) 알킬, (C₁-C₆) 알케닐, 치환 (C₁-C₆) 알케닐, (C₁-C₆) 알키닐, 치환 (C₁-C₆) 알키닐, (C₅-C₂₀) 아릴, 치환 (C₅-C₂₀) 아릴, (C₆-C₂₆) 알크아릴, 치환 (C₆-C₂₆) 알크아릴, 5-20원 헤테로아릴, 치환 5-20원 헤테로아릴, 6-26원 알크헤테로아릴 또는 치환 6-26원 알크헤테로아릴이다)을 포함할 수 있는 적어도 하나의 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 측쇄를 갖는 소수성 아미노산이다. 유전적으로 코딩된 방향족 아미노산은 Phe, Tyr 및 Trp를 포함하는 한편, 유전적으로 코딩되지 않은 방향족 아미노산은 페닐글리신, 2-나프틸알라닌, 베타-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다.

무극성 아미노산은 생리학적 pH에서 전하를 띄지 않고 2개의 원자에 의해 공유되는 전자쌍이 일반적으로 2개의 원자 각각에 의해 동등하게 유지되는 결합을 갖는 측쇄 (즉, 측쇄는 극성이 아니다)를 갖는 소수성 아미노산이다. 유전적으로 코딩된 무극성 아미노산은 Gly, Leu, Val, Ile, Ala 및 Met를 포함하는 한편, 유전적으로 코딩되지 않은 무극성 아미노산은 시클로헥실알라닌을 포함한다. 무극성 아미노산은 지방족 탄화수소 측쇄를 갖는 소수성 아미노산인 지방족 아미노산을 포함하도록 더욱 세분될 수 있다. 유전적으로 코딩된 지방족 아미노산은 Ala, Leu, Val 및 Ile를 포함하는 한편, 유전적으로 코딩되지 않은 지방족 아미노산은 노르류신을 포함한다.

극성 아미노산은 생리학적 pH에서 전하를 띄지 않지만, 2개의 원자에 의해 공유되는 전자쌍이 원자들 중 하나에 의해 더욱 가깝게 유지되는 하나의 결합을 갖는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산이다. 유전적으로 코딩된 극성 아미노산은 Ser, Thr, Asn 및 Gln을 포함하는 한편, 유전적으로 코딩되지 않은 극성 아미노산은 시트룰린, N-아세틸 리신 및 메티오닌 술폭시드를 포함한다.

산성 아미노산은 측쇄 pKa 값이 7 미만인 친수성 아미노산이다. 산성 아미노산은 대개 생리학적 pH에서 수소 이온의 손실로 인해 음전하를 띈 측쇄를 갖는다. 유전적으로 코딩된 산성 아미노산은 Asp 및 Glu를 포함한다. 염기성 아미노산은 측쇄 pKa 값이 7 초과인 친수성 아미노산이다. 염기성 아미노산은 대개 생리학적 pH에서 히드로늄 이온과의 회합 때문에 양전하를 띈 측쇄를 갖는다. 유전적으로 코딩된 염기성 아미노산은 Arg, Lys 및 His를 포함하는 한편, 유전적으로 코딩되지 않은 염기성 아미노산은 비-환식 아미노산 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산 및 호모아르기닌을 포함한다.

당업자는 상기 분류가 절대적인 것이 아니고 아미노산은 하나 이상의 카테고리로 분류될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 아미노산은 특수한 분석을 기반으로 또는 앞서 확인된 아미노산과 비교하여 공지된 거동 및/또는 특징적 화학적, 물리적, 또는 생물학적 특성을 기초로 분류될 수 있다. 아미노산은 또한 아미노산-유사 측쇄를 갖는 이중관능성 잔기를 포함할 수 있다.

보존적 변화는 또한 예를 들어, 아미노산의 관능성 측쇄기의 반응에 의해 유도화되지 않은 잔기에 대한 화학적으로 유도화된 잔기의 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 이들 치환은 그의 유리 아미노기가 아민 히드로클로라이드, p-톨루엔 술포닐기, 카르보벤족시기, t-부틸옥시카르보닐기, 클로로아세틸기 또는 포르밀기로 유도화된 화합물을 포함할 수 있다. 유사하게, 유리 카르복실기는 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 종류의 에스테르 또는 히드라지드를 형성하도록 유도화될 수 있고, 측쇄는 히스티딘의 이미다졸 질소에 대해 유리 히드록실기 또는 N-im-벤질히스티딘에 대해 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성하도록 유도화될 수 있다. 펩티드 유사체는 또한 예를 들어, 메틸화, 알킬아민, 예를 들어 에틸아민, 에탄올아민, 또는 에틸렌 디아민에 의한 C-말단 아미노산의 아미드화, 또는 아미노산 측쇄의 아실화 또는 메틸화 (예를 들어, 리신의 엡실론 아미노기의 아실화)에 의해 화학적으로 변경된 아미노산을 포함한다. 펩티드 유사체는 또한 펩티드에서 아미드 연결기의 치환 아미드 (예를 들어, 화학식 -C(O)-NR의 기, 여기서 R은 (C₁-C₆) 알킬, (C₁-C₆) 알케닐, (C₁-C₆) 알키닐, 치환 (C₁-C₆) 알킬, 치환 (C₁-C₆) 알케닐, 또는 치환 (C₁-C₆) 알키닐) 또는 아미드 연결기의 동위체 (isostere) (예를 들어, -CH₂NH-, -CH₂S, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (시스 및 트란스), -C(O)CH₂-, -CH(OH)CH₂- 또는 -CH₂SO-)로의 교체를 포함할 수 있다.

화합물은 예를 들어, 동종중합체 또는 이종중합체를 형성하도록 중합화 또는 공액화에 의해 공유 연결될 수 있다. 대개 작은 중성 분자, 예를 들어 생리학적 조건 하에 전하를 띄지 않는 아미노산으로 구성된 스페이서 및 링커가 사용될 수 있다. 연결은 많은 방식으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기가 펩티드 말단에 첨가될 수 있고, 다수 펩티드가 제어된 산화에 의해 공유 결합될 수 있다. 별법으로, 헤테로이중관능제, 예를 들어 디술피드/아미드 형성제 또는 티오에테르/아미드 형성제가 사용될 수 있다. 화합물은 또한 예를 들어, 암 세포를 표적으로 하거나 암 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있는 다른 화합물에 연결될 수 있다. 화합물은 또한 환식 부분을 가짐으로써 구속될 수 있다.

펩티드 또는 펩티드 유사체는 표준 화학 기술에 의해, 예를 들어, 용액 또는 고체상 합성 방법을 사용하는 자동 합성에 의해 합성할 수 있다. 자동 펩티드 합성기는 상업적으로 이용가능하고, 당업계에 공지된 기술을 이용한다. 또한, 펩티드 및 펩티드 유사체는 예를 들어 문헌 [예를 들어, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, 또는 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, 1994]에 기재된 것과 같은 표준 방법을 이용하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 COP1, MDM2, p21 또는 p53 핵산 분자 또는 그의 단편에 실질적으로 동일하거나, COP1, MDM2, p21 또는 p53 핵산 분자 또는 그의 단편에 상보성인 핵산 분자를 포함한다. 상기 핵산 분자는 예를 들어 본 발명의 분석 및 방법에서 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. "프로브" 또는 "프라이머"는 상보성 서열을 포함하는 제2 DNA 또는 RNA 분자 (표적)에 염기쌍을 형성할 수 있는 규정된 서열의 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자이다. 생성되는 하이브리드 분자의 안정성은 발생하는 염기쌍 형성 정도에 의존하고, 프로브와 표적 분자 사이의 상보성 정도, 및 혼성화 조건의 엄격도 정도와 같은 파라미터에 의해 영향을 받는다. 혼성화 엄격도의 정도는 온도, 염 농도, 및 유기 분자, 예를 들어 포름아미드의 농도와 같은 파라미터에 의해 영향을 받고, 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정된다. 본원에 기재된 핵산 서열 또는 그의 일부에 특이적인 프로브 또는 프라이머는 프로브 또는 프라이머가 사용되는 목적 및 조건에 따라 8개 이상의 뉴클레오티드 내지 500개 초과의 뉴클레오티드 사이의 임의의 값으로 길이가 변할 수 있다. 예를 들어, 프로브 또는 프라이머는 8, 10, 15, 20 또는 25개 뉴클레오티드 길이일 수 있거나, 적어도 30, 40, 50 또는 60개 뉴클레오티드 길이일 수 있거나, 100, 200, 500 또는 1000개 뉴클레오티드 길이 초과일 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자에 특이적인 프로브 또는 프라이머는 본원에 기재된 핵산 서열에 대해 20-30％ 초과의 서열 동일성, 또는 적어도 55-75％의 서열 동일성, 또는 적어도 75-85％의 서열 동일성, 또는 적어도 85-99％의 서열 동일성, 또는 100％의 서열 동일성을 가질 수 있다.

프로브 또는 프라이머는 예를 들어 증폭에 의해 게놈 DNA 또는 cDNA로부터, 또는 클로닝된 DNA 세그먼트로부터 유도될 수 있고, 단일 개체로부터의 단일 유전자의 전부 또는 일부를 나타내는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열을 포함할 수 있다. 프로브는 특유한 서열 (예를 들어, COP1 또는 p53 핵산 분자에 대해 100％ 동일성) 및/또는 공지의 서열을 가질 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 화학적으로 합성할 수 있다.

프로브 또는 프라이머는 당업자에게 공지된 방법에 의해 방사성으로 또는 비-방사성으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 핵산 혼성화를 수반하는 방법, 예를 들어 핵산 서열결정, 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 핵산 증폭, 단일 가닥 구조 다형 (SSCP) 분석, 제한 단편 다형 (RFLP) 분석, 서던 혼성화, 노던 혼성화, 계내 혼성화, 전기영동 이동성 변화 분석 (EMSA) 및 당업자에게 공지된 다른 방법을 위해 사용될 수 있다.

또한, 핵산 분자는 예를 들어 세포 내 표적 분자의 발현을 감소시키도록 사용될 수 있는 안티센스 분자, siRNA 분자, 또는 삼중 나선 분자일 수 있다. 핵산에 대해 본원에서 사용되는 "안티센스"는 핵산 분자, 예를 들어 유전자, 예를 들어 COP1, mdm2, p21 또는 p53 유전자의 코딩 가닥에 상보성인 핵산 서열을 의미한다. 일부 실시태양에서, 안티센스 핵산 분자는 둘 모두 세포에서 발현될 때 상보성 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준을 저하시킬 수 있는 분자이다. 일부 실시태양에서, 폴리펩티드 수준은 상보성 안티센스 핵산 분자를 발현하지 않고 해당 유전자만을 발현하는 세포에서 폴리펩티드 수준에 비해 적어도 10％ 내지 적어도 25％, 또는 적어도 25％ 내지 적어도 50％, 또는 적어도 50％ 내지 적어도 75％, 또는 적어도 75％ 내지 100％, 또는 적어도 2배 내지 적어도 10배의 임의의 값, 또는 100배로 저하된다.

"siRNA" 분자 또는 "RNAi" 분자는 이중 가닥 RNA를 형성하는 핵산을 나타내고, 상기 이중 가닥 RNA는 siRNA가 유전자 또는 표적 유전자와 동일한 세포에서 발현될 때 유전자 또는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 능력을 갖는다. 따라서, "siRNA"는 상보성 가닥에 의해 형성되는 이중 가닥 RNA를 의미한다. 혼성화하여 이중 가닥 분자를 형성하는 siRNA의 상보성 부분은 대개 실질적인 또는 완전한 동일성을 갖는다. 한 실시태양에서, siRNA는 표적 유전자에 실질적인 또는 완전한 동일성을 갖고 이중 가닥 siRNA를 형성하는 핵산을 의미한다. siRNA의 서열은 전장 표적 유전자, 또는 그의 하위 서열에 대응할 수 있다. 일반적으로, siRNA는 적어도 약 15-50개 뉴클레오티드 길이이고 (예를 들어, 이중 가닥 siRNA의 각각의 상보성 서열은 15-50개 뉴클레오티드 길이이다), 이중 가닥 siRNA는 약 15-50개 염기쌍 길이, 바람직하게는 약 20-30개 염기 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 20-25개 또는 약 24-29개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다 (전문을 본원에 참고로 포함시킨 PCT/US03/07237 참조). siRNA 분자 또는 RNAi 분자는 siRNA 또는 RNAi가 표적 핵산을 발현하는 세포에서 발현될 때 핵산의 발현을 적어도 약 10％ 감소시키는 경우 표적 핵산에 대해 "특이적"이다.

핵산 분자를 포함하여 본원에서 논의되는 치료제는 그의 생체이용률, 약동학적 및 약력학적 특성을 개선시키기 위해 변형 또는 합성될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 치료 핵산 분자는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결기로 합성할 수 있다.

일부 실시태양에서, 시험 화합물은 작은 유기 분자를 포함한다. "작은 유기 분자"는 분자량이 약 50 달톤 초과 및 약 2500 달톤 미만, 바람직하게는 약 2000 달톤 미만, 바람직하게는 약 100 내지 약 1000 달톤, 보다 바람직하게는 약 200 내지 약 500 달톤인 천연 또는 합성 유기 분자를 의미한다. 작은 유기 분자는 유비퀴틴 리가제 억제제, 예를 들어 Ro106-9920 및 그의 유사체일 수 있다 <44>.

본 발명의 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 COP1/p53 상호작용 또는 결합을 저해할 수 있는 항체를 포함한다. 또한, 시험 화합물은 COP1/p53 상호작용 또는 결합을 저해할 수 있고/있거나 COP1 활성 (예를 들어, COP1 효소 활성)을 억제할 수 있는 펩티드, 핵산 분자, 또는 작은 분자를 포함할 수 있다.

후보 또는 시험 화합물은 당업계에 공지된 방법에 따라 천연 생성물 또는 합성 (또는 반합성) 추출물의 큰 라이브러리 또는 화학물질 라이브러리로부터 확인될 수 있다. 약물 발견 및 개발 분야의 숙련인은 시험 추출물 또는 화합물의 정확한 공급원은 본 발명의 방법(들)에 중요하지 않음을 이해할 것이다. 따라서, 실질적으로 임의의 수의 화학물질 추출물 또는 화합물이 본원에 기재된 예시적인 방법을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 상기 추출물 또는 화합물의 예는 식물, 진균, 원핵 또는 동물계 추출물, 발효 브로쓰 (broth), 및 합성 화합물과 기존 화합물의 변형을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 당류, 지질, 펩티드 및 핵산계 화합물을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 수의 화학물질 화합물의 무작위 또는 지정 합성 (예를 들어, 반합성 또는 전체 합성)을 생성하기 위해 많은 방법이 또한 이용가능하다. 합성 화합물 라이브러리는 상업적으로 이용가능하다. 별법으로, 세균, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리는 많은 공급원, 예를 들어 바이오틱스 (Biotics, 영국 서섹스), 제노바 (Xenova, 영국 슬라우), 하버 브랜치 오션그래픽 인스티튜트 (Harbor Branch Oceanographic Institute, 미국 플로리다주 포트 피어스), 및 파마마르 (PharmaMar, 미국 매사추세츠주)로부터 상업적으로 이용가능하다. 또한, 천연 및 합성 생산된 라이브러리는 원하는 경우 당업계에 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 표준 추출 및 분획화 방법에 의해 생산된다. 또한, 원하는 경우, 임의의 라이브러리 또는 화합물은 표준 화학적, 물리적 또는 생화학적 방법을 이용하여 쉽게 변형된다.

조질 추출물이 예를 들어 COP1/p53 상호작용을 억제하는 것으로 밝혀지면, 관찰된 효과를 갖는 화학 성분을 단리하기 위해 양성 선도 추출물의 추가 분획화가 필요할 수 있다. 따라서, 추출, 분획화, 및 정제 공정의 목적은 COP1/p53 결합 억제 활성을 갖는 조질 추출물 내의 화학 물질의 주의깊은 특성화 및 확인이다. 화합물의 혼합물에서 활성의 검출을 위해 본원에 기재된 동일한 분석이 활성 성분을 정제하고 그의 유도체를 시험하기 위해 사용될 수 있다. 상기 비균질 추출물의 분획화 및 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다. 원하는 경우, 치료에 유용한 물질로 나타난 화합물은 당업계에 공지된 방법에 따라 화학적으로 변형된다. 치료, 예방, 진단 또는 다른 목적에 유용한 것으로 확인된 화합물은 예를 들어 암에 대한 임의의 동물 모델을 이용하여 후속적으로 분석할 수 있다.

진단, 치료, 예방 및/또는 스크리닝 용도, 분석, 및 시약.

본 발명에 따른 화합물, 조성물 (예를 들어, 제약 조성물), 및 방법은 암을 진단하거나, 대상에서 암을 치료 또는 예방하거나, 암의 치료 또는 예방에 유용한 시험 화합물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 대상은 인간, 비인간 영장류, 래트, 마우스, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 파리, 벌레 등일 수 있다. 대상은 임상 환자, 임상 시험 자원자, 실험 동물 등일 수 있다. 대상은 암에 걸리거나 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 의심되거나, 암으로 진단되거나, 암에 걸리지 않은 것으로 확인된 대조 대상일 수 있다. 한 바람직한 실시태양에서, 대상은 인간이다.

암에 대한 진단 방법 및 암 진단의 임상 설명은 당업자에게 공지되어 있다. 본원에서 논의되는 바와 같이, COP1 발현 수준을 측정함으로써 다양한 암이 진단 또는 검출될 수 있고, 여기서 COP1의 과다발현이 암 진단을 나타낸다. "과다발현"은 대조군에 비해, 예를 들어, 비-암성 세포에 의해 정상적으로 생산되는 발현 수준에 비해 특정 분자, 예를 들어, COP1의 mRNA 또는 폴리펩티드 발현에서의 증가를 의미한다. COP1 분자의 과다발현을 나타내는 암은 또한 p53 분자 (예를 들어, p53 폴리펩티드)의 감소된 발현 또는 p21 분자 (예를 들어, p21 mRNA)의 감소된 발현을 나타낼 수 있다. 용어 "발현 수준에서의 감소"는 대조군에 비해, 예를 들어 비-암성 세포에 의해 정상적으로 생산되는 발현 수준에 비해 특정 분자, 예를 들어 p53 또는 p21의 mRNA 또는 폴리펩티드 발현의 감소를 의미한다. 상기 증가 또는 감소는 대조군에 비해 10％ 내지 90％, 또는 30％ 내지 60％, 또는 100％ 초과의 임의의 값일 수 있거나, 2배 내지 10배 이상의 임의의 값, 예를 들어, 100배의 변화일 수 있다. 과다발현 또는 감소가 통계적으로 유의하다면, 과다발현 또는 증가, 또는 감소 또는 감쇄의 정확한 양은 중요하지 않다.

본 발명에 따른 시약은 본원에 기재된 화합물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물을 포함하는 세포, 예를 들어 포유동물 세포를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 세포는 재조합 p53, 재조합 Pirh2, 재조합 MDM2, 및/또는 재조합 COP1 분자를 포함하도록, 또는 내인성 단백질 발현을 감소 또는 녹아웃시키도록, 또는 이들 단백질을 코딩하는 유전자를 변경시킴으로써 이들 단백질을 돌연변이시키도록, 예를 들어 재조합 기술에 의해 유전공학처리될 수 있다. 이들 분자의 발현 수준 또는 활성은 예를 들어 이들 분자에 대해 특이적으로 작용하는 siRNA 분자를 사용하여 감소될 수 있다. 상기 포유동물 세포는 예를 들어 p53/COP1 결합을 저해하거나 p53 또는 COP1 활성을 억제하는 시험 화합물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

예를 들어, 암 또는 세포 증식 질환을 치료하는데 사용하기 위한 시험 화합물을 스크리닝하기 위해, 대조군 세포는 감소된 또는 제로 수준의 p53을 발현하고 정상 또는 증가된 수준의 COP1을 발현할 수 있다. 시험 세포는 정상 또는 증가된 수준의 COP1 및 p53을 발현할 수 있다. 상기 세포를 시험 화합물과 함께 인큐베이팅하고, 세포주기, p21 발현, p53 유발 세포자멸, p53 의존성 트랜스활성화, COP1 리가제 활성 등에서의 변화에 대해 분석할 수 있다. 배경으로서 내부 루시퍼라제 리포터를 갖는 리포터 기반 구성체, 예를 들어 p21-루시퍼라제 및 실시간 RT-PCR 기술이 사용될 수 있다. 상기 포유동물 세포는 COP1 분자를 과다발현하도록 공학처리될 수 있는 기존 세포주, 예를 들어 p53 야생형 세포주 (U2-OS 세포), 또는 p53 null 세포주 (H1299)에서 유전공학처리될 수 있다.

본 발명에 따른 분석은 표준 원료로부터 표준 절차에 의해 수득한 샘플을 사용하여 생체내, 시험관내 또는 생체 외에서 수행할 수 있다. "샘플"은 대상으로부터 단리된 임의의 장기, 조직, 세포 또는 세포 추출물, 예를 들어 암에 걸린 포유동물로부터 단리된 샘플일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 뼈, 뇌, 유방, 결장, 근육, 신경, 난소, 전립선, 망막, 피부, 골격근, 장, 고환, 심장, 간, 신장, 위, 췌장, 자궁, 부신, 편도선, 비장, 연조직, 말초 혈액, 전혈, 적혈구 농축물, 혈소판 농축물, 백혈구 농축물, 혈액 세포 단백질, 혈장, 혈소판-풍부 혈장, 혈장 농축물, 혈장의 임의의 분획화에 의한 침전물, 혈장의 임의의 분획화에 의한 상등액, 혈장 단백질 분획, 정제된 또는 부분 정제된 혈액 단백질 또는 다른 성분, 혈청, 정액, 포유동물 초유, 젖, 소변, 대변, 타액, 뇌척수액, 심막액, 복강액, 태반 추출물, 양수, 동결침전물, 동결상등액, 세포 용해물, 포유동물 세포 배양물 또는 배양 배지, 발효 산물, 복수, 혈액 세포 내에 존재하는 단백질, 고형 종양, 또는 환자 (인간 또는 동물), 시험 대상 또는 실험 동물로부터 얻은 임의의 다른 시료 또는 그의 임의의 추출물로부터의 세포 또는 조직 (예를 들어, 생검 또는 부검으로부터)을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 암성 세포를 샘플 내의 비-암성 세포로부터 분리하는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 샘플은 정상 또는 형질전환된 세포 (예를 들어, 재조합 DNA 또는 모노클로날 항체 기술을 통해)에 의해 세포 배양액 내에서 생산된 생성물을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 샘플은 비포유동물 대상, 예를 들어 곤충 또는 벌레로부터 단리된 임의의 장기, 조직, 세포 또는 세포 추출물을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 또한, "샘플"은 대상으로부터 직접 단리되지 않은 실험실 조건 하에 생성된 세포 또는 세포주일 수 있다. 샘플은 또한 무세포이거나, 인공적으로 유도되거나 합성될 수 있다. 샘플은 암성으로 공지되거나, 암성으로 의심되거나, 암성이 아닌 것으로 생각되는 (예를 들어, 정상 또는 대조군) 세포 또는 조직으로부터의 것일 수 있다.

"대조군"은 기준선 발현 또는 활성을 결정하는데 사용하기 위해 얻은 샘플을 포함한다. 따라서, 대조군 샘플은 비-암성 세포 또는 조직으로부터, 예를 들어, 대상의 종양 또는 암성 세포를 둘러싸는 세포로부터; 암에 걸리지 않은 대상으로부터; 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 의심되지 않는 대상으로부터; 또는 상기 대상으로부터 유래된 세포 또는 세포주로부터를 포함하는 많은 수단에 의해 얻을 수 있다. 대조군은 또한 이전에 확립된 표준물을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따라 수행된 임의의 시험 또는 분석은 확립된 표준물과 비교될 수 있고, 매번 비교를 위해 대조군 샘플을 얻는 것이 필요하지 않을 수 있다. 시험관내 유비퀴틴화 분석에서, 대조군은 p53 분자를 유비퀴틴화하는 능력이 감소된 COP1 분자 (예를 들어, 그의 리가제 도메인, 예를 들어 COP1ΔRing에서 결함이 있는 분자)일 수 있다.

예를 들어, COP1 또는 p53 분자는 암 세포, 조직 또는 세포 용해물 내에 제공될 수 있거나, 재조합 기술을 이용하여 구성될 수 있다. 마이크로어레이, 예를 들어, 조직 마이크로어레이가 사용될 수 있다. 재조합 단백질, 세포 및/또는 세포주는 상업적인 공급원, 예를 들어 세포 또는 세포주의 경우 ATCC (미국 버지니아주 매나사스)로부터 입수할 수 있다.

암에 대해 적합한 동물 모델은 예를 들어 더 잭슨 래보래토리 (The Jackson Laboratory, 미국 메인주 바 하버)로부터 입수할 수 있다. 일부 실시태양에서, COP1 또는 p53 발현 또는 활성이 결여된 동물 모델을 사용할 수 있다.

COP1 또는 p53 핵산 분자 또는 폴리펩티드 발현 또는 활성, 또는 COP1/p53 결합은 면역조직화학 (IHC), 계내 혼성화 (ISH), 노던 블로팅, 폴리머라제 연쇄 반응 (예를 들어, 실시간 정량 PCR 또는 RT-PCR), 항체 기반 분석, 예를 들어 면역침전, 면역형광, 웨스턴 블로팅, 핵산 서열결정 등을 포함하는 다양한 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 샘플로부터 유래된 PCR 생성물의 서열결정, 단일 가닥 구조 다형 (SSCP) 분석, 또는 제한 단편 길이 다형 (RFLP) 분석과 같은 방법이 COP1 또는 p53 유전자에서 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수 있거나; 면역침전, RIA, ELISA 또는 웨스턴 블로팅이 COP1 또는 p53 폴리펩티드 또는 결합의 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있거나; COP1 또는 p53 유전자 또는 mRNA의 발현은 전사 또는 번역을 억제하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 또는 삼중 가닥 형성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 하향조절될 수 있거나; 노던 블로팅이 COP1 또는 p53 rnRNA 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있거나, PCR이 COP1 또는 p53 핵산 분자의 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 분석은 전구체, 단편 (예를 들어, 엔도단백분해적 분해에 의해 생성된), 번역후 변형된 형태 등을 포함하는 임의의 또는 모든 형태의 COP1 또는 p53의 검출을 포함한다. 본 발명의 방법은 COP1 관련 생물학적 활성, 예를 들어 p53 분해, p53의 유비퀴틴화, p53 트랜스활성화의 억제, p53 유발 세포자멸의 억제, p21 mRNA의 감소 등에 대한 분석을 포함한다.

일부 실시태양에서, 대상에서 세포는 임의로 검출가능하게 표지된, 예를 들어, 방사성 동위원소로 표지된 항체 (예를 들어, COP1 항체 또는 p53 항체 또는 둘 모두)에 생체내 노출될 수 있고, 세포에 대한 항체의 결합은 예를 들어 방사성에 대한 외부 스캐닝 또는 생검의 분석에 의해 평가될 수 있다.

분석은 검출가능하게 표지된 분자를 사용하여, 즉, 분자, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머, 유전자 또는 그의 단편, 펩티드, 또는 cDNA 분자의 존재를 표식하고 확인하기 위한 임의의 수단에 의해 수행할 수 있다. 분자를 검출가능하게 표지하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 방사성 표지 (예를 들어, ³²P 또는 ³⁵S와 같은 동위원소를 사용) 및 비방사성 표지, 예를 들어, 효소 표지 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 사용), 화학발광 표지, 형광 표지 (예를 들어, 플루오레세인을 사용), 생물발광 표지, 또는 프로브에 부착된 리간드의 항체 검출을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 간접적 수단에 의해 검출가능하게 표지된 분자, 예를 들어, 관찰하거나 분석할 수 있는 제2 잔기 (예를 들어 플루오레세인-표지된 스트렙타비딘)에 결합된 제1 잔기 (예를 들어 비오틴)와 결합되는 분자가 또한 본 정의에 포함된다. 표지는 또한 디곡시게닌, 루시퍼라제 및 애쿠오린을 포함한다.

"검출하는"은 물질의 존재 또는 부재를 결정하거나 물질의 양을 정량하는 것을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 용어는 정성 및 정량 결정을 위한 본 발명의 물질, 조성물 및 방법의 사용을 나타낸다. 일반적으로, 검출을 위해 사용된 특정 기술은 본 발명의 실시에 중요하지 않다. 예를 들어, 본 발명에 따른 "검출하는"은 당업계에 공지되거나 아래 설명된 방법을 이용하여 COP1, mdm2, p21 또는 p53 유전자, 게놈 또는 핵산 분자, 또는 COP1, mdm2, p21 또는 p53 폴리펩티드의 존재 또는 부재; COP1, mdm2, p21, 또는 p53 유전자의 돌연변이; COP1, mdm2, p21 또는 p53 핵산 분자, 예를 들어 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준에서의 변화; COP1 폴리펩티드 (예를 들어, COP1 리가제 활성, p53 턴오버, p53-의존성 트랜스활성화 활성의 억제) 또는 p53 폴리펩티드 (예를 들어, p53 결합, p53-의존성 트랜스활성화, COP1 결합, p21의 트랜스활성화 등)의 생물학적 기능/활성의 변화를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, "검출하는"은 야생형 p53을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, "검출하는"은 돌연변이체 p53을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 대조군에 비해 10％ 내지 90％, 또는 30％ 내지 60％의 임의의 값, 또는 100％ 초과의 변화 (증가 또는 감소)를 정량하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 2배 내지 10배 이상의 임의의 값, 예를 들어, 100배의 변화를 정량하는 것을 포함할 수 있다.

제약 ＆ 수의학 조성물, 투여량 및 투여

본 발명의 화합물은 리포좀, 보조제, 또는 임의의 제약학상 허용되는 담체의 존재 하에 단독으로 또는 다른 화합물 (예를 들어, 핵산 분자, 작은 분자, 펩티드, 또는 펩티드 유사체)과 조합으로 포유동물, 예를 들어, 인간, 마우스 등에 투여하기에 적합한 형태로 제공될 수 있다. 원하는 경우, 본 발명에 따른 화합물을 사용하는 처치는 암에 대한 보다 전통적인 기존 치료법, 예를 들어 화학요법, 예를 들어 알킬화제, 항-대사체, 항생제, 항-마이크로튜불 (microtubule) 화합물, 예를 들어, 아바스틴, CPT11, 옥사리플라틴, 방사선요법, 예를 들어 이온화 방사선 등과 함께 조합될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 치료 화합물은 COP1, p53, p21, MDM2 또는 Pirh2 분자에 대해 지정된 siRNA 분자를 포함한다. 본 발명에 따른 화합물은 만성적으로 또는 간헐적으로 제공될 수 있다. "만성" 투여는 초기 치료 효과 (활성)을 유지하기 위해 급성 단기 용량을 투여하는 대신 연장된 기간 동안 연속적으로 화합물(들)을 투여하는 것을 의미한다. "간헐적" 투여는 특정 화합물을 처치하지 않는 기간을 갖고 산재되는 처치이다.

암에 걸리거나 암에 대한 전증상의 대상에게 화합물을 투여하기 위해 적합한 제형 또는 조성물을 제공하기 위해 통상적인 제약 실무를 이용할 수 있다. 적절한 투여 경로, 예를 들어 비경구, 정맥내, 피하, 근내, 두개내, 안와내, 안내, 뇌실내, 낭내, 척수내, 경막내, 수조내, 복강내, 비내, 에어로졸, 국소 또는 경구 투여가 이용될 수 있다. 치료 제형은 액상 용액 또는 현탁액 형태일 수 있고; 경구 투여를 위해, 제형은 정제 또는 캡슐 형태일 수 있고; 비내 제형은 산제, 점비제 또는 에어로졸 형태일 수 있다.

제형 제조를 위한 당업계에 공지된 방법은 예를 들어 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" (19^th edition), ed. A. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa]에 제시되어 있다. 비경구 투여용 제형은 예를 들어 부형제, 멸균수 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 또는 수소화 나프탈렌을 포함할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 사용하여 화합물의 방출을 제어할 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달계는 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 체내삽입형 주입 시스템, 및 리포좀을 포함한다. 흡입용 제형은 부형제, 예를 들어, 락토스를 함유할 수 있거나, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액일 수 있거나, 점비제 형태로, 또는 겔로서 투여하기 위한 유성 용액일 수 있다. 치료 또는 예방 조성물에 대해, 화합물은 암에 따라 암 성장 또는 진행을 예방하거나, 억제하거나 지연시키기에 충분한 양으로 개체에 투여된다. 화합물의 효능의 측정치는 다음 중 하나 이상의 관찰가능하고/하거나 측정가능한 감소 또는 부재를 포함한다: 암 세포의 수 감소 또는 암 세포의 부재, 종양 크기에서 감소; 말초 장기 내로 암 세포 침윤의 억제 (즉, 예방, 억제, 지연 또는 정지); 종양 전이의 억제 (즉, 예방, 억제, 지연 또는 정지); 어느 정도로 종양 성장의 억제; 및/또는 어느 정도로 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 경감, 및 감소된 이환률 및 사망률.

본 발명에 따른 화합물의 "유효량"은 치료 유효량 또는 예방 유효량을 포함한다. "치료 유효량"은 필요한 투여량에서 및 필요한 기간 동안 목적하는 치료 결과, 예를 들어, 다음 중 하나 이상의 관찰가능하고/하거나 측정가능한 감소 또는 부재를 달성하기 위해 효과적인 양을 나타낸다: 암 세포의 수 감소 또는 암 세포의 부재, 종양 크기에서 감소; 말초 장기 내로 암 세포 침윤의 억제 (즉, 예방, 억제, 지연 또는 정지); 종양 전이의 억제 (즉, 예방, 억제, 지연 또는 정지); 어느 정도로 종양 성장의 억제; 및/또는 어느 정도로 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 경감, 및 감소된 이환률 및 사망률. 화합물의 치료 유효량은 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중 및 개인에서 목적하는 반응을 유발시키는 화합물의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 투여량 계획은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 치료 유효량은 또한 화합물의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료상 유익한 효과가 더 큰 양이다. "예방 유효량"은 필요한 투여량에서 및 필요한 기간 동안 목적하는 예방 결과, 예를 들어, 다음 중 하나 이상의 관찰가능하고/하거나 측정가능한 감소 또는 부재를 달성하기 위해 효과적인 양을 나타낸다: 암 세포의 수 감소 또는 암 세포의 부재, 종양 크기에서 감소; 말초 장기 내로 암 세포 침윤의 억제 (즉, 예방, 억제, 지연 또는 정지); 종양 전이의 억제 (즉, 예방, 억제, 지연 또는 정지); 어느 정도로 종양 성장의 억제; 및/또는 어느 정도로 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 경감, 및 감소된 이환률 및 사망률. 일반적으로, 예방 용량은 대상에서 질병에 앞서 또는 질병의 초기 단계에서 사용되어, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 수 있다. 화합물의 치료 또는 예방 유효량의 바람직한 범위는 0.1 nM-0.1 M, 0.1 nM-0.05 M, 0.05 nM-15 μM 또는 0.01 nM-10 μM의 임의의 값일 수 있다.

투여량 값은 경감시킬 병태의 중증도에 따라 변할 수 있음을 주지해야 한다. 임의의 특정 대상에서, 구체적인 투여량 계획은 개인의 필요, 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조정될 수 있다. 본원에 기재된 투여량 범위는 단지 예시적이고, 의료 담당자가 선택할 수 있는 투여량 범위를 제한하지 않는다. 조성물 내의 활성 화합물(들)의 양은 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 요인에 따라 다를 수 있다. 투여량 계획은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스 (bolus)가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 요구에 따라 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이함 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제형화하는 것이 유리할 수 있다.

백신 제형의 경우에, 면역원성 유효량의 본 발명의 화합물이 단독으로 또는 다른 화합물과 조합으로 면역학적 보강제, 예를 들어, 프로인트 (Freund) 불완전 면역보강제, 디메틸디옥타데실암모늄 히드록시드, 또는 수산화알루미늄과 함께 제공될 수 있다. 화합물은 또한 면역원성을 향상시키기 위해 담체 분자, 예를 들어 소 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌에 연결될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 화합물은 실질적인 독성을 일으키지 않고 사용되어야 한다. 본 발명의 화합물의 독성은 표준 기술을 이용하여, 예를 들어, 세포 배양액 또는 실험 동물을 시험하고 치료 지수, 즉, LD50 (집단의 50％에 치사량)와 LD100 (집단의 100％에 치사량)의 비를 결정함으로써 결정할 수 있다. 그러나, 일부 상황, 예를 들어 중증 질병 상태에서, 실질적 과량의 조성물을 투여하는 것이 필요할 수 있다.

실시예 1: 물질 및 방법

발현 벡터, 재조합 단백질, 및 항체

Flag-COP1은 선행 기술 문헌에 설명되었다 <33>. HA-COP1은 COP1을 pcDNA3.1+ (인비트로겐 (Invitrogen)) 내로 PCR 서브클로닝시켜 생성하고, GST-COP1은 COP1을 pGEX6P1 (파마시아 (Pharmacia)) 내로 서브클로닝시켜 생성하였다. pcDNA3.1+53, pG13-Luc, p21-Luc, bax-Luc, NS-Luc 및 pCMV-MDM2는 문헌에 설명되었다 <21,22,35>.

전장 COP1은 HEK293T 세포로부터 유래한 cDNA로부터 증폭시켰다. HA-COP1을 PCR에 의해 pcDNA3.1+ (인비트로겐) 내로 서브클로닝시키고, GST-COP1은 PCR에 의해 생성하여 pGEX6P1 (파마시아) 내로 서브클로닝시켰다. COP1-Luc 및 COP1mut-Luc는 2 카피의 p53 컨센서스 부위를 함유하거나, 또는 COP1 프로모터로부터 유래한 컨센서스 부위의 돌연변이체를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 pGL3-프로모터 (프로메가 (Promega)) 내로의 라이게이션에 의해 생성하였다.

모든 GST 재조합 단백질을 이. 콜라이 균주 BL21(DE3) 코돈+ (스트라타젠 (Stratagene)) 내에서 발현시키고, 1 mg/ml 라이소자임과 함께 초음파 처리하고, 프로테아제 억제제 믹스 (로슈 (Roche))를 사용하여 PBS 중 1％ TritonX-100으로 가용화시키고, 후속적으로 글루타티온 세파로스 4B 배치 방법을 이용하여 정제하고, 환원된 글루타티온으로 용출시키거나 PreScission 프로테아제 (파마시아)로 절단하였다. 재조합 단백질의 시험관내 전사/번역은 TnT Kit에 커플링된 T7/T3 (프로메가) 또는 Rapid Translation System (RTS) (로슈)를 사용하여 수행하였다.

항-p53 (DO-1; 칼바이오켐 (Calbiochem)), 항-p53 (1801; 비디 파밍엔 (BD Pharmingen)), 항-p53 (FL-393; 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology)), 항-p21 (Ab-1; 칼바이오켐), 항-MDM2 (2A10; 칼바이오켐), 항-Flag (M2; 시그마 (Sigma)), 항-Myc (9E10; 로슈), 항-His-HRP (로슈), 항-액틴 (ICN), 항-GST (B-14; 산타 크루즈 바이오테크놀로지) 및 항-HA (로슈)를 제조사의 권장사항에 따라 사용하였다. 항-COP1은 인간 COP1의 아미노산 71-270에 대해 생성된 모노클로날 항체이다.

세포, 형질감염, 리포터 및 세포자멸 분석

U2-OS, Saos-2, HEK293T 및 BJ 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 입수하고, McCoy의 5A (인비트로겐) 또는 DMEM (시그마) 배지 내에 유지하였다. p53^-/-/MDM2^-/-MEF를 10％ FBS 및 1x L-글루타민과 함께 DMEM에서 성장시켰다. H1299 세포를 RPMI에서 성장시켰다.

모든 형질감염은 제조사의 권장사항에 따라 Lipofectamine 2000 (인비트로겐), Oligofectamine (인비트로겐) 또는 Geneporter 2 (진 테라피 시스템즈 (Gene Therapy Systems))를 사용하여 수행하였다. p53의 항정 상태 수준에 대한 COP1 영향을 평가하기 위해, Saos-2 세포를 250 또는 500 ng pcDNA3.1+p53으로 증가량의 FLAG-COP1 또는 FLAG-COP1ΔRTNG과 함께 형질감염시키거나, U2-OS 세포를 증가량 (0.5, 1 및 2 ㎍)의 pCMV-FLAG-COP1 또는 pCMV-FLAG-COP1ΔRING을 사용하거나 사용하지 않고 형질감염시키고, 지시되는 경우 세포를 수거하기 전에 6시간 동안 50 μM ALLN으로 처리하였다.

리포터 분석을 위해, Saos-2 또는 H1299 세포를 증가량 (0.5, 1 및 2 ㎍)의 pCMV-FLAG-COP1 또는 pCMV-FLAG-COP1ΔRING을 사용하거나 사용하지 않으면서 150 또는 250 ng의 pcDNA3.1+p53 또는 pcDNA3.1+p53R175H, 100 ng의 p21-Luc, bax-Luc, COP1-Luc, COP1mut-Luc 또는 NS-Luc, 및 10 ng의 pCMVβ-Gal로 일시적으로 형질감염시켰다. 루시퍼라제 분석은 제조사의 지시에 따라 수행하고, β-갈락토시다제 활성 (프로메가)에 대해 표준화하였다.

p53-의존성 세포 사멸 분석을 위해, Saos-2 세포를 48시간 동안 1 ㎍의 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 및 5 ㎍ pcDNA3.1+, pcDNA3.1+p53, pCMV-FLAG-COP1 또는 pcDNA3.1+p53 및 pCMV-FLAG-COP1로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 수거하고, 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 분석하기 위해 프로피듐 요오다이드로 염색하였다. 형질감염된 세포를 선택한 후, 세포주기 프로필을 DNA 함량에 따라 결정하였다.

30 dTdT 오버행 (overhang)을 갖는 COP1 siRNA1 (AACUGACCAAGAUAACCUUGA) (서열 2), COP1 siRNA1 역전 (AAAGUUCCAAUAGAACCAGUC) (서열 3), COP1 siRNA2 (AAGACUUGGAGCAGUGUUACU) (서열 4), COP1 siRNA3 (AAGAGGUGUUGGAGUGUUGAC) (서열 5), Pirh2 siRNA1 (AACTGTGGAATTTGTAGG) (서열 6), Pirh2 B 역전 (AAGGAUGUUUAAGGUGUCAA) (서열 7), Pirh2 siRNA2 (AAUGUAACUUAUGCCUAGCUA) (서열 8), Pirh2 siRNA2 역전 (AAAUCGAUCCGUAUUCAAUGU) (서열 9) 및 MDM2 (AAGGAAUUUAGACAACCUGAA) (서열 10) siRNA 올리고뉴클레오티드를 제넨테크 또는 다마콘 (Dharmacon)에 의해 합성하였다. 실험에서 대조군 siRNA는 역전된 siRNA 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 나타낸다. U2-OS, H1299, Saos-2 및 BJ 세포를 siRNA 올리고뉴클레오티드로 24-36 h 간격으로 3회 형질감염시키고 접촉 억제를 방지하기 위해 필요한 경우 팽창시켰다.

면역침전 및 GST -풀 다운 (pull down) 분석

세포를 면역침전 (IP) 용해 버퍼 (1％ Triton X-IOO, 15O mM NaCl, 5O mM Tris, pH 7.4, 및 프로테아제 억제제 믹스) 또는 방사성면역침전 분석 (RIPA) 버퍼 (0.1％ SDS, 1％ NP-40, 15O mM NaCl, 0.5％ 데옥시콜레이트, 50 mM Tris, pH 7.4, 및 프로테아제 억제제 믹스) 중에서 용해시키고, 예비청정화시키고, 표적 항체 및 단백질 A/G PLUS 비드 (Pierce)로 면역침전시켰다. COP1-상호작용 단백질의 확인은 선행 기술 문헌 <33>에 설명된 바와 같이 수행하되, Flag-COP1을 안정하게 발현하는 U2-OS 세포를 생성시켰다.

GST 풀 다운 분석은 PBST (0.1％ Tween 20을 갖는 PBS) 중에서 시험관내 번역된 HA-COP1과 조합된 5 ㎍ GST 또는 GST-p53을 사용하여 수행하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 글루타티온 세파로스 4B 비드를 혼합물에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이팅하고, 후속적으로 PBST로 5회 세척하였다. GST-결합된 단백질을 SDS-PAGE시키고, 항-HA 및 항-GST로 면역블로팅하였다. IP를 필요한 경우 고염과 함께 용해 버퍼 내에서 세척하였다. 펄스-체이스 실험은 문헌에 기재된 바와 같이 수행하되 <7>, HEK293T 세포를 pCMV-Flag6a 또는 pCMV-Flag-COP1로 24 h 동안 형질감염시키고, U2-OS 세포를 지시된 바와 같이 siRNA 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다.

계내 혼성화 , 실시간 PCR , 및 노던 블로트

동위원소 계내 혼성화를 COP-1 특이적 688 bp ³³P-표지된 안티센스 리보프로브를 사용하여 문헌에 설명된 바와 같이 <23> 파라핀-함침 조직의 절편 및 및 조직 마이크로어레이 (TMA) 상에서 수행하였다. 상기 프로브는 뉴클레오티드 364에서 시작하여 COP-1에 대한 코딩 서열의 5' 1/2의 대부분을 덮는다. 각각의 혼성화 실 험에 포함되는 동일한 주형으로부터 전사된 센스 대조군 프로브는 임의의 조직에서 배경을 초과하는 시그날을 보이지 않았다. 정상 조직 및 난소 종양을 나타내는 TMA를 문헌에 기재된 바와 같이 구성하였다 <24>. 난소 종양 TMA는 정상 난소, 난관 및 자궁, 및 78개의 표면 상피 종양의 샘플로 이루어진다. 총 RNA는 Qiagen RNAeasy 키트를 사용하여 세포 또는 조직으로부터 추출하고, 프로브를 COP1, p21, RPL19 및 β-액틴 mRNA의 실시간 PCR을 위해 설계하였다. 모든 반응은 ABI 7700 서열 검출기를 사용하여 제조사의 권장사항에 따라 수행하였다.

마우스 다중 조직 노던 블로트 (클론테크 (Clontech))를 Church 버퍼 (35.5 g/L Na₂HPO₄, 0.17％ (v/v) H₃PO₄, 1％ (w/v) 소 혈청 알부민, 1 mM EDTA, 7％ (w/v) SDS) 중에서 전장 ³²P-표지된 쥐 COP1 cDNA에 65℃에서 철야 혼성화시켰다. 필터를 65℃에서 40 mM 인산나트륨 버퍼 pH 7.2/1％ (w/v) SDS로 세척하고, -70℃에서 필름에 노출시켰다.

시험관내 및 생체내 유비퀴틴화 분석

시험관내 유비퀴틴화 반응을 위해, 시험관내 번역된 p53을 항-p53 (DO-1 및 1801)로 면역침전시키고, PBST로 5회 세척하고, 단백질 A/G 비드 상에서 반응을 수행하였다. 10 ㎍ His-유비퀴틴 (보스톤 바이오켐 (Boston Biochem)) 또는 FLAG-유비퀴틴 (시그마), 20 ng의 Ubc5Hb (에이.지. 사이언티픽 (A.G. Scientific)), 20 ng 토끼 E1 (시그마), 및 500 ng GST-COP1 (E3) (20 μM ZnCl₂와 함께 30분 동안 실온에서 예비인큐베이팅한)을 50 mM Tris pH7.5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl₂ 및 2 mM DTT 를 포함하는 버퍼 중에서 총 부피 30 ㎕로 인큐베이팅하였다. 2시간 동안 3O℃에서 인큐베이션한 후, 반응물을 1％ SDS를 갖는 PBST 중에서 5분 동안 비등시키고, 이어서 항-p53 (DO-1 및 FL-393)으로 재면역침전시키기 위해 0.2％ SDS로 감소시켰다. 마지막으로, 샘플을 95℃에서 2-머캅토에탄올을 갖는 SDS 샘플 버퍼 중에서 인큐베이팅하고, SDS-PAGE 실행한 후 항-His-HRP (로슈) 또는 항-FLAG-HRP (M2)로 면역블로팅하여 p53의 유비퀴틴화 종을 검출하였다.

생체내 분석을 위해, H1299 또는 p53^-/-/MDM2^-/- MEF를 100 ng HA-Ub, 500 ng pcDNA3.1+p53, 2 ㎍ pCMV-FLAG6a, pCMV-FLAG-COP1 또는 pCMV-FLAG-COP1ΔRING로 형질감염시키고, 50 μM ALLN으로 2시간 동안 처리한 후 수거하고, 항-HA로 면역침전시키고, 항-p53 (DO-1)으로 웨스턴 블로팅하였다.

COP1 -상호작용 단백질의 확인

pcDNA3.1+로 동시형질감염시키고 G418 (인비트로겐) 내성에 대해 선택함으로써, pCMV-FLAG-COP1 또는 pCMV-FLAG6a를 발현하는 U2-OS 안정한 세포주를 생성하였다. FLAG 또는 FLAG-COP1 발현 클론을 팽창시키고, 50 μM ALLN으로 2시간 동안 처리한 후, 저장성 (hypotonic) 용해 버퍼 (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM HEPES pH7.9, 1 mM DTT, 프로테아제 억제제 믹스)를 사용하여 수거한 후 균질화시켰다. 이어서, 원심분리에 의해 청정화된 용해물을 항-FLAG M2 비드 (시그마)와 함께 인큐베이팅하였다. 철야 인큐베이션 후, 비드를 세척 버퍼 1 (20 mM HEPES pH7.9, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM EDTA, 25％ 글리세롤 및 프로테아제 억제제 믹 스)로 1회 세척하고 세척 버퍼 2 (0.1％ NP-40, 20 mM Tris pH7.5, 300 mM NaCl 및 프로테아제 억제제 믹스)로 5회 세척하였다. 결합된 단백질은 300 ㎍/ml FLAG 펩티드 (시그마)로 용출시키고, 후속적으로 SDS에 의해 분석하고 은 염색하였다. 관심있는 밴드를 절제하고, 트립신으로 계내 소화시키고, 생성되는 펩티드를 모세관 액체 크로마토그래피-이온 트랩 탠덤 (tandem) 질량 분광법에 의해 서열결정하였다.

p53 유전자 서열결정, 실시간 PCR , 및 웨스턴 블로트

종양 샘플을 단리하고, 격렬하게 볼텍싱하여 용해 버퍼 (1％ SDS, 20 mM Tris pH7.5, 2 mM EDTA, 400 mM NaCl)에 재현탁시키고, 500 ㎍/ml 프로테이나제 K (시그마)를 보충하고, 샘플이 완전 소화될 때까지 55℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 이어서, 샘플을 페놀-클로로포름-이소아밀 알콜 (25:24:1)과 1:1 비율로 재현탁시키고, 30분 동안 실온에서 인큐베이팅한 후, 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상부 수성층을 등부피의 이소프로판올에 재현탁시키고, 15분 동안 추가로 원심분리하였다. 생성되는 펠렛을 70％ 에탄올로 세척하고, 뉴클레아제 무함유 H₂O에 재현탁시켰다. 파라핀 함침 조직 마이크로어레이 샘플에 대해, DNA는 미세절개된 종양 조직을 30 ㎕ PicoPure 프로테이나제 K 추출 버퍼 (아크투러스 (Arcturus, 미국 캘리포니아주 마운트뷰)) 내에서 48시간 동안 65℃에서 인큐베이팅함으로써 추출하였다. 소화효소는 95℃에서 10분 동안 열 불활성화시키고, PCR 반응 (Expand High Fidelity PCR system, 로슈 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))에 직접 첨가하였다. 단리된 게놈 DNA를 M13-특이적 서열을 포함하는 p53 유전자의 엑손 5-8에 대해 다음 프라이머로 PCR 실행하였다:

엑손 5R (CAGGAAACAGCTATGACCAGCCCTGTCGTCTGTCCA) (서열 11)

엑손 5F (TGTAAAACGACGGCCAGTTTCAACTCTGTCTCCTTC) (서열 12)

엑손 6R (CAGGAAACAGCTATGACCTTAACCCCTCCTCCCAGAGA) (서열 13)

엑손 6F (TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCTGATTCCTCACTGAT) (서열 14)

엑손 7R (CAGGAAACAGCTATGACCTGTGCAGGGTGGCAAGTGGC) (서열 15)

엑손 7F (TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCGCACTGGCCTCATCTT) (서열 16)

엑손 8R (CAGGAAACAGCTATGACCAGGCATAACTGCACCCTTGG) (서열 17)

엑손 8F (TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTACTGCCTCTTGCTTCTC) (서열 18)

PCR 산물을 M13F 및 M13R 서열결정 프라이머로 형광 염료-터미네이터 (terminator) 화학 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티))을 이용하여 서열결정하였다.

실시간 PCR은 정상 및 종양 샘플로부터 단리된 총 RNA로부터 COP1, p21, Pirh2, b-액틴 및 RPL19에 대한 특이적 프로브를 사용하여 다음과 같이 수행하였다. 모든 반응은 ABI7700 서열 검출기를 사용하여 제조자의 권고에 따라 수행하였다.

RT-PCR 프라이머 서열: (모든 프라이머는 각각의 유전자에 대해 3'UTR의 세그먼트를 증폭시킨다).

ss.Pirh2-1290F - TCCTCTAAATGTGAATTTTGATGTAA (서열 19)

ss.Pirh2-1463R - TCCCAACTACTTTTATGGAATACCT (서열 20)

ss.Pirh2-1359T - TTTTCCAAAGTTTTCTATGTTTGGCTCAATTAGG (서열 21)

p21WAF1-1866F - GTGCTTAGTGTACTTGGAGTATTGG (서열 22)

p21WAF1-1939R - AGTCCAGGCCAGTATGTTACAG (서열 23)

p21WAF1-1893T - TCTGACCCCAAACACCTTCCAGC (서열 24)

b-액틴-1312F - AAAACTGGAACGGTGAAGGT (서열 25)

b-액틴-1380R - CGGCCACATTGTGAACTT (서열 26)

b-액틴-1356T - ATGCTCGCTCCAACCGACTGC (서열 27)

hCOP-2362F - CCTTTGGGACATTGGGAAT (서열 28)

hCOP-2436R - CCACCAAGAGCAGCAATGT (서열 29)

hCOP-2382T - CCCAGCCAACTCTCCACCATCAA (서열 30)

RPL19 서열:

DNA103410-432F AGCGGATTCTCATGGAACA (서열 31)

DNA103410-502R CTGGTCAGCCAGGAGCTT (서열 32)

DNA103410-453T TCCACAAGCTGAAGGCAGACAAGG (서열 33)

조직을 TLB (0.5％ NP40, 20 mM Tris pH7.5, 5 mM EDTA, 프로테아제 억제제 믹스 (로슈)) 중에 수거한 후 균질화시켰다. 용해물을 20,000 x g에서 60분 동안 원심분리에 의해 청정화시킨 후, SDS-PAGE 및 웨스턴 블로트 분석을 실행하였다. 멤브레인을 COP1, p53 (DO-1 및 1801, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), 및 액틴 (ICN)에 대한 항체로 프로빙하였다.

COP1 및 p53 에 대한 면역조직화학

조직을 수집하고 10％ 중성 완충 포르말린 중에 고정시키고, 파라핀 내에 함침시켰다. 유리 슬라이드 상에서 5μ 절편을 탈파라핀화하고 증류수에 수화시켰다. p53 염색을 위해, 슬라이드를 20분 동안 Dako Target Retrieval (다코 (Dako), S1700) 용액 중에서 99℃에서 인큐베이팅한 후, 슬라이드를 TBST로 세정하였다. 내인성 퍼옥시다제, 아비딘 및 비오틴을 각각 KPL 블로킹 버퍼 (KPL, 37-00-84) 및 Vector 아비딘/비오틴 키트 (벡터 (Vector), SP2001)을 사용하여 급랭시킨 후, TBST 세정하였다. 슬라이드를 30분 동안 3％ BSA/PBS 중 10％ 정상 말 혈청 중에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 슬라이드를 5 ㎍/ml 항-p53 항체 (노부스 바이올로지칼스 (Novus Biologicals), NB200-104) 중에서 60분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. TBST에서 세척한 후, 슬라이드를 2.5 ㎍/ml 비오티닐화 말 항-마우스 2차 항체 (벡터, BA2001)와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. TBST 세척 후, 슬라이드를 Vectastain ABC Elite Reagents (벡터, PK6100)과 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 슬라이드를 TBST로 세정하고, Pierce Metal Enhanced DAB와 함께 4분 동안 인큐베이팅하고, 물 중에서 세정하였다. 이어서, 슬라이드를 메이어스 (Mayer)의 헤마톡실린으로 대비염색하고, 탈수시키고, 탑재하고 명시야 관찰을 위해 커버글라스를 덮었다. COP1 염색을 위해, 슬라이드를 20분 동안 Dako Target Retrieval High pH 용액 (다코, S33O8) 중에서 99℃에서 인큐베이팅한 후, 슬라이드를 TBST 중에서 세정하였다. 내인성 퍼옥시다제, 아비 딘 및 비오틴을 각각 KPL 블로킹 버퍼 및 Vector 아비딘/비오틴 키트를 사용하여 급랭시킨 후, TBST 세정하였다. 슬라이드를 30분 동안 3％ BSA/PBS 중 10％ 정상 말 혈청 중에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 슬라이드를 1 ㎍/ml 항-COP1 (클론 1D5) 항체 중에서 60분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. TBST 중에서 세척한 후, 슬라이드를 2.5 ㎍/ml 비오티닐화 말 항-마우스 2차 항체와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. TBST 세척 후, 슬라이드를 Vectastain ABC Elite Reagents과 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 슬라이드를 비오티닐 티라미드 시약 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer), NEL700) 중에서 3분 동안 인큐베이팅한 후, TBST 세척한 후 Vectastain ABC Elite Reagents과 함께 30분 동안 인큐베이팅하였다. TBST 세척 후, 슬라이드를 Pierce Metal Enhanced DAB와 함께 4분 동안 인큐베이팅하고, 물 중에 세정하고, 메이어스 헤마톡실린으로 대비염색하고, 탈수시키고, 탑재하고 커버글라스를 덮었다.

실시예 2: p53 은 COP1 에 대한 기질이다.

COP1이 세포 과정을 조절하는 방식을 이해하기 위해, FLAG-태깅된 COP1을 안정하게 발현하는 U2-OS 세포로부터의 용해물 또는 빈 벡터를 항-FLAG로 면역침전시키고, 결합된 단백질을 FLAG 펩티드를 통해 용출시키고 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 특이적 밴드를 질량 분광법에 의해 서열결정하였다 (도 1a). 약 53 kDa에서 밴드의 질량 분광법 분석은 종양 억제제 단백질 p53으로부터 5 매칭 펩티드를 밝혔다. 상기 상호작용이 실제로 발생하는지를 확인하기 위해, p53-null Soas-2 세포를 p53 및 Myc-COP1으로 형질감염시키고, 항-p53 (DO-1)로 면역침전시키고 항-Myc로 면역 블로팅하였다 (도 1b). COP1은 단지 형질감염된 p53의 존재 하에 면역침전되었고, 이는 COP1이 p53과 상호작용할 수 있음을 나타낸다. 상기 상호작용은 형질감염된 COP1 및 내인성 p53에서도 또한 보인다 (도 1c). 또한, U2-OS 세포 내에서 내인성 단백질 수준에서 p53과 COP1 사이에 상호작용이 있었다 (도 1d). 시험관내-번역된 헤마글루티닌 (HA)-COP1은 시험관 내에서 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)-p53과 상호작용할 수 있었다 (도 1e).

일정량의 p53을 증가량의 FLAG-COP1, 또는 RING 핑거 도메인이 결핍되는 COP1의 돌연변이체, FLAG-COP1ΔRING로 형질감염시킴으로써, COP1이 p53 단백질의 항정 상태 수준에 영향을 끼치는 가능성을 평가하였다. COP1의 형질감염은 외인성 p53 단백질의 항정 상태 수준을 감소시켰고, 이는 RING 핑거 도메인의 결손시 폐기되었다 (도 2a). COP1이 내인성 p53의 항정 상태 수준에 영향을 미치는지 평가하기 위해, U2-OS 세포를 FLAG-COP1 또는 FLAG-COP1ΔRING으로 형질감염시켰다 (도 2b). 외인성 p53의 경우에서와 같이, COP1은 내인성 p53의 항정 상태 수준을 감소시킬 수 있었고, 이는 COP1의 RING 핑거 도메인에 의존적이었다.

p53 단백질 수준의 감소 기전을 보다 확실하게 조사하기 위해, COP1이 p53 유전자 전사를 억제하는지 결정하기 위해 p53 유전자에 대해 실시간 PCR을 수행하였다 (도 2c). U2-OS 세포에서 Flag-COP1 또는 Flag-COP1ΔRING의 형질감염은 p53 메신저 RNA 수준을 유의하게 변화시키지 않았다. 그러나, 펄스-체이스 분석을 이용하여, 인간 배 신장 HEK293T 세포에서 COP1의 형질감염은 빈 벡터 대조군에 비해 p53의 반감기의 명백한 감소를 보였고, 이는 COP1이 p53의 턴오버를 활성적으로 증 가시킴을 나타낸다. p53의 반감기가 COP1 과다발현에 의해 상당히 짧아지고, 이것이 p53 mRNA 효과 또는 MDM2 단백질 수준에 대한 임의의 직접적인 효과와 무관한 것을 가정하면, 상기 효과는 번역후일 수 있다.

상기 가정을 시험하기 위해, U2-OS 세포를 FLAG-COP1 또는 FLAG-COP1ΔRING로 형질감염시키고, DMSO 또는 프로테아좀 억제제 ALLN으로 처리하였다 (도 2e). ALLN을 첨가하면 Flag-COP1의 형질감염에 의해 앞서 감소된 p53 단백질의 수준을 현저하게 증가시켰고, 이는 COP1이 p53을 프로테아좀-매개 분해를 위해 지정함을 나타낸다.

프로테아좀을 통한 p53의 COP1-매개된 분해가 p53 유비퀴틴화의 결과인지 결정하기 위해, H1299 또는 Saos-2 세포를 p53, FLAG-COP1 또는 FLAG-COP1ΔRING, 및 HA-유비퀴틴으로 형질감염시켰다 (도 2f). 항-HA로 면역침전시키고 항-p53으로 면역블로팅시키면 FLAG-COP1의 동시형질감염에서만 p53의 유비퀴틴화 종의 존재를 밝혔다. 이들 데이타는 COP1이 유비퀴틴화에 의해 프로테아좀을 통한 분해에 대해 p53을 표적함을 제안한다.

COP1이 p53 분해를 조정하기 위해 MDM2 또는 Pirh2를 통해 작용하는지 확인하기 위해, siRNA에 의해 p53^-/-/MDM2^-/- 마우스 배 섬유모세포 (MEF), 또는 Pirh2이 고갈된 Saos-2 세포에서 p53 및 COP1 또는 COP1ΔRING을 사용한 일시적 형질감염을 수행하고, p53 항정 상태 수준에 영향을 미치는 그들의 능력을 평가하였다 (도 2j, k). 본질적으로, COP1은 MDM2- 및 Pirh2-함유 세포에서 달성된 p53의 음적 조절을 재현할 수 있었다. 이들 결과는 COP1이 p53을 조절하는데 있어서 MDM2에 독립적으로 기능할 수 있음을 시사한다.

COP1은 생체 내에서 p53의 유비퀴틴화를 조정하기 때문에 (도 2f), p53이 시험관 내에서 COP1에 대한 직접적 기질인지 결정하고자 하였다. GST 및 GST-COP1을 이. 콜라이에서 발현시키고, 정제하고, 후속적으로 시험관내 번역된 p53을 사용하는 유비퀴틴화 분석에 사용하였다 (도 2g). 모든 반응 성분 및 p53이 존재할 때에만 COP1이 p53을 직접 유비퀴틴화할 수 있었다. 따라서, 이들 데이타는 COP1이 p53에 대한 E3-리가제로서 역할을 함을 나타낸다.

실시예 3:

p53-의존성 트랜스활성화에 대한 COP1 과다발현의 효과를 결정하기 위해, Saos-2 세포를 p53 및 COP1 또는 COP1ΔRING, 및 p21-루시퍼라제 (Luc) 또는 bax-Luc로 형질감염시켰다 (도 2h, l). COP1을 첨가하면 p21 및 bax 프로모터로부터 트랜스활성화하는 p53의 능력을 현저하게 감소시켰다. 또한, 내인성 p53의 트랜스활성화 능력, 및 DNA 손상에 의해 유발된 능력은 COP1의 과다발현에 의해 동일한 방식으로 폐기되었다 (도 2m). p53을 음적으로 조절하는 COP1의 추가의 능력을 평가하기 위해, COP1이 Saos-2 세포에서 p53-유발 세포 사멸을 억제할 수 있는지 확인하였다 (도 2i). p53의 형질감염은 SubG1 집단에서 세포의 집단을 현저하게 증가시켰고; 그럼에도 불구하고, 이는 COP1의 동시형질감염에 의해 놀랍게 방해되었고, 이는 COP1이 p53-유발 세포 사멸을 억제함을 제안한다. COP1의 형질감염은 단독으로는 세포주기 분포에 뚜렷한 효과를 갖지 않았다.

보다 많은 생리학적 배경에서 COP1의 역할을 밝히기 위해, 내인성 COP1을 siRNA에 의해 제거하였고, 내인성 p53 항정 상태 수준에 대한 임의의 효과를 평가하였다 (도 3a). COP1의 녹다운 (knockdown)을 실시간 PCR 및 면역블로팅에 의해 평가하였다. U2-OS 세포에서 siRNA에 의한 COP1의 고갈은 p53 단백질의 명백한 축적을 일으켰다. 상기 결과는 2가지 추가의 독립적 siRNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 재현가능하였고 (도 3d), 이는 COP1이 스트레스를 받지 않은 세포에서 p53을 음적으로 조절함을 나타낸다. 상기 p53 단백질 수준의 극적인 축적을 고려하여, 본 발명자들은 다음에 p53이 그의 하류 표적 유전자, p21 및 Pirh2를 유도할 수 있는지 확인하였다. 실시간 PCR을 이용하여, COP1 제거에 반응하여 p21 및 Pirh2 mRNA에서 명백한 증가를 관찰하였고, 이는 p53-의존성 전사의 증가를 나타낸다. 또한, 총 p21 단백질 수준은 COP1 siRNA의 도입에 의해 극적으로 증가하였다. 반대로, COP1 siRNA 올리고뉴클레오티드의 p53-null 세포주 H1299 내로의 형질감염은 p21 단백질에 대해 또는 p21 및 Pirh2 mRNA 수준에 대해 영향을 미치지 않았다. 또한, U2-OS 세포에서 COP1의 고갈은 G1/S 비율에서 현저한 증가를 일으켰지만 (1.82에서 3.71로), H1299 세포에서 임의의 영향을 미치지 않았고 (도 3c), 이는 G1 정체가 p53-의존적 방식으로 발생하였음을 나타낸다.

COP1이 스트레스를 받지 않은 세포에서 p53 턴오버를 매개하는지 확인하기 위해, COP1이 고갈된 U2-OS 세포에서 펄스-체이스 분석을 수행하였다 (도 4a). COP1 단백질의 제거는 p53의 반감기를 대조군에 비해 2배 증가시켰다. Pirh2 및 MDM2가 펄스-체이스 분석 및 COP1과의 비교를 위해 siRNA에 의해 또한 제거되었다 다. Pirh2의 고갈은 p53의 반감기를 1.5배 증가시킨 반면, MDM2 제거는 p53의 반감기를 대조군에 비해 2배 증가시켰다. COP1을 MDM2 및 Pirh2의 환경에 놓기 위해, siRNA에 의한 COP1 및 Pirh2의 동시 제거는 p53 반감기의 추가의 향상을 일으켰다 (대조군에 비해 3.5배). 놀랍게도, COP1 및 MDM2를 함께 제거하면 p53 반감기를 상승적으로 8배 증가시켰다. 이는 동시의 Pirh2 고갈에 의해 더욱 향상되지 않았고, 이는 p53의 반감기가 상기 특정 시스템에서 최대치에 도달하였음을 제안한다. p53의 트랜스활성화 기능을 측정하기 위해 리포터 분석을 수행하였다 (도 4b). p53의 반감기에서의 증가와 일치하게, COP1, Pirh2 또는 MDM2의 제거시 p21 프로모터로부터 트랜스활성화가 적당히 증가하였고, MDM2의 제거로부터 최고 자극이 유도되었다. 이들 관찰은 또한 단백질 수준에서 확인되었다 (도 4c). COP1 및 MDM2의 동시 제거에 반응하여 p21 프로모터로부터 명백한 자극 및 단백질 수준에서의 증가가 또한 있었다 (도 4a, b). 모든 E3 리가제의 제거에 반응하여, p53 또는 p21 단백질 수준에서 (도 4c), 또는 프로모터 활성에서 추가의 향상이 없었음이 주목할 만하고 (도 4b), 이는 증식하는 세포가 p21 및/또는 p53에 대해 제한된 역치를 가질 수 있음을 제안한다. 또한, COP1, Pirh2 또는 MDM2의 제거는 정상 BJ 섬유모세포에서 p53 및 p21 항정 상태 수준을 증가시켰고, 이는 각각의 리가제가 정상 세포에서 p53을 음적으로 조절하는데 있어서 역할을 함을 나타낸다 (도 4d).

COP1 및 MDM2의 제거가 p53 반응을 일으켰음을 관찰하여, 이온화 방사선 (IR)-유발 세포 사멸에 대해 고도 저항성인 것으로 알려져 있으므로 <31>, U2-OS 세포에서 COP1 및/또는 MDM2의 고갈이 정상적인 DNA-손상 반응을 회복할 것인지 시 험하였다. U2-OS 세포를 siRNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 COP1 및/또는 MDM2에 형질감염시키고, 후속적으로 20 Gy IR로 처리하고, 프로피듐 요오다이드 염색에 의해 세포 사멸을 평가하였다 (도 4e). 대조군 siRNA로 예비처리된 U2-OS 세포는 IR 처리 후 세포 사멸에 대해 고도로 저항성이었지만; COP1 또는 MDM2 siRNA로 예비처리된 세포는 IR-유발 세포 사멸에 감수성인 세포 소집단을 생성시켰다. 더욱 놀랍게도, siRNA에 의한 COP1 및 MDM2의 동시 제거는 IR에 의한 세포 사멸에 협동적 민감화를 일으켰다.

COP1 은 음적 피드백 루프에 참여하는 p53 -유도가능 유전자이다.

MDM2 및 Pirh2가 자동조절 피드백 루프를 형성한다는 점에서, 본 발명자들은 COP1이 상기 조절 기전의 일부일 수 있는 가능성을 조사하였다. COP1 유전자의 프로모터 구역을 스캐닝하면 전사 개시 부위 (+1)에 대해 -2094 내지 -2073에서 p53 컨센서스 결합 부위 <32>의 존재를 밝혔다 (도 5a). 2 카피의 상기 컨센서스 부위 (COP1-Luc) 또는 상기 컨센서스 부위 버전의 돌연변이체 (COP1mut-Luc)를 최소 프로모터를 함유하는 루시퍼라제 리포터 유전자의 상류에 삽입하고, pcDNA3.1+, p53 또는 DNA-결합 돌연변이체, p53R175H와 함께 H1299 세포 내로 형질감염시켰다 (도 5b). p53의 형질감염은 COP1-Luc의 루시퍼라제 활성을 증가시키지만 COP1mut-Luc 리포터 구성체에서는 그렇지 않은 반면, p53R175H 돌연변이체는 COP1-Luc 또는 COP1mut-Luc에 대해 어떠한 현저한 효과를 갖지 않았다. 또한, p53의 형질감염은 실시간 PCR로 평가할 때 H1299 세포 내에서 COP1 mRNA 수준을 실질적으로 증가시켰다 (도 5c). 항-COP1을 사용한 웨스턴 블로트에 의해 총 COP1 단백질의 증가가 또 한 검출되었다 (도 5d). 또한, p53-의존성 전사를 활성화시키고 p53을 안정화시키는 IR로 처리한 U2-OS 세포는 비처리 세포에 비해 COP1 단백질 수준을 증가시켰다 (도 5e). 대조군으로서, IR 손상이 p53 반응을 유발시키는지 입증하기 위해 p21 및 p53 단백질 수준을 또한 면역블로팅에 의해 평가하였다. 종합하면, 이들 데이타는 COP1이 음적 피드백 루프에 참여하는 p53-유도가능 유전자임을 제안한다.

COP1 은 암 세포에서 과다발현된다.

포유동물 세포/조직에서 COP1 발현을 실시간 PCR 및 계내 혼성화 (ISH) 기술에 의해 조사하였다. 본 발명자들은 정상 쥐 조직에서 ISH (도 6a), RT-PCR (도 6b), 및 노던 블로트 (도 6c)에 의해 발현 분석을 수행하였다. ISH 분석은 cop1이 정상 쥐 골격근, 장 및 고환에서 발현되었음을 입증하였다. 고환에서, 라이디히 (Leydig) 세포에서 현저한 발현이 명백하지만, 생식 세포에서 또한 중정도 시그날이 존재하였다 (도 6a). 노던 블로트 패널은 cop1이 고환과 심장, 간 및 신장에서 발현되었음을 확인하였다 (도 6c). cDNA 패널 RT-PCR은 또한 cop1이 뇌, 위, 소장, 췌장, 부신, 자궁 및 전립선에서 발현되었음을 입증하였다. RT-PCR 및 노던 블로트 패널은 전장 cop1 mRNA 발현의 조직 분포에 대해 잘 일치하였다. 쥐 조직에 추가로, 본 발명자들은 ISH에 의해 인간 조직을 평가하였고, 정상 인간 편도선, 비장, 고환, 췌장 및 결장에서 cop1 발현을 확인하였다. 이는 정상 인간 고환, 흉선, 결장, 심장, 전립선, 비장, 장 및 간에서 노던 블로트에 의한 현저한 cop1 발현을 보여주는 선행 발견과 일치한다 <36>.

COP1 유전자 발현이 암에서 변경되는지 결정하기 위해, 총 RNA를 다양한 정 상 및 종양 샘플로부터 수거하고, 상대적인 cop1 발현을 실시간 PCR에 의해 및 RPL19 mRNA에 표준화시킴으로써 결정하였다. cop1 mRNA에서 정상 대조군보다 2-8배의 유의한 증가가 있었다 (도 7a). 따라서, 본 발명자들은 67 난소 선암종 사례의 0.6 mm 코어로 삼중으로 구성된 난소 조직 마이크로어레이 (TMA)에서 ISH에 대해 cop1 특이적 프로브를 사용하는 보다 큰 규모 연구를 수행하였다. 장액 선암종의 30％ (8/27) 사례는 악성 세포 내에서만 양성 시그날을 나타낸 반면, 기질 부분 (도 7b) 또는 정상 난소 조직 내에서 시그날이 관찰되지 않았다. 또한, 자궁내막양 선암종의 16％ (3/19) 사례 및 투명 세포 선암종의 27％ (3/11) 사례에서 COP1을 코딩하는 mRNA에 대해 양성 시그날을 나타냈다 (표 1).

조직 마이크로어레이 상에서 난소 선암종 사례의 요약. COP1 발현은 ISH 및 IHC에 의해 입증하였다.

코어 진단	ISH (#양성/총 사례)	IHC (#양성/총 사례)
장액 선암종	8/27	11/27
자궁내막양 선암종	3/19	12/19
투명 세포 선암종	3/11	4/11
점액 선암종	0/10	5/10
난소 선암종의 총 사례	14/67	32/67

COP1이 상기 종양에서 단백질 수준에서 과다발현되는 것을 확인하기 위해, COP1에 대한 특이적 항체를 사용하는 IHC 분석을 상기한 바와 동일한 난소 TMA 및 도 7a에서 RT-PCR에 사용된 난소 샘플에 대해 수행하였다. TMA에 대한 결과를 표 1에 요약하였고, 이는 47％ (11/27)의 장액 선암종, 63％ (12/19)의 자궁내막양 선암종, 36％ (4/11)의 투명 세포 선암종, 및 50％ (5/10)의 점액 선암종이 악성 세포의 핵 및 세포질 부분 내에서 강건한 COP1 면역반응성을 나타냈지만; 기질 내에서 시그날이 검출되지 않았음을 보여준다 (도 7c). 또한, 정상 조직은 COP1 항체와의 임의의 반응성에 대해 음성이었다. 종합하면, 상기 데이타는 COP1 mRNA 및 단백질이 악성 세포에서 특이적으로 과다발현됨을 나타낸다. ISH 및 IHC 데이타 (표 1)에서 잘 일치하였다; 자궁내막양 및 점액 선암종은 ISH 데이타에 비해 IHC에 의해 보다 높은 비율의 COP1 양성 샘플을 나타냈고, 이는 COP1의 전사후 조절을 제안한다.

이어서, 본 발명자들은 COP1을 과다발현하는 임의의 종양 샘플이 p53-의존성 반응에서 결함을 가졌는지 결정하고자 하였다. 상기 문제를 해결하기 위해, COP1을 과다발현한 (도 7a) 난소 종양에 대해 p53 표적 유전자에 대해 특이적인 프로브를 및 시클린-의존성 키나제 억제제, p21/WAF1를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였고, 정상 대조군 샘플에 비교하여 mRNA에서 변화 배수를 평가하였다. COP1을 과다발현한 샘플의 대부분은 매칭된 정상 대조군보다 p21 mRNA에서 유의한 감소를 보였다 (도 7d). 상기 결과는 p21의 전사를 활성화시키는 p53의 능력을 음적으로 조절하는 COP1과 일치한다.

p53이 난소암에서 돌연변이될 수 있음을 고려하면, p53의 특이적인 돌연변이체는 p21 프로모터로부터 트랜스활성화시키는 고유한 능력을 손실하므로 이들 샘플에서 p53 유전자 상태를 결정하는 것을 중요하다. 예를 들어, p53이 COP1이 과다발현되는 샘플에서 돌연변이되면, 관찰된 p21 mRNA의 하향 조절은 p53에 독립적일 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 엑손 5-8, 및 p53 돌연변이가 종종 확인되는 인트론-엑손 경계를 서열결정하였고, 이들 샘플의 7/8이 야생형이고, 1/8이 p53 DNA 결합 영역 내에 위치하고 정상 유방 상피세포를 불사시키는 것으로 나타난 R249S 돌연변이를 가졌음을 밝혔다 <37>. 또한, R249S 돌연변이체 난소 샘플 (수 8)은 정상적인 수준의 p21 mRNA을 가졌고, 이는 COP1에 의한 야생형 p53-의존성 전사의 억제와 일치한다.

COP1 특이적 항체를 사용하여, IHC를 1 mm 코어에 어레이된 32 사례의 유방 선암종을 갖는 TMA에서 수행하였다. 놀랍게도, 81％ (25/32)의 사례가 악성 세포에서 독점적으로 COP1 항체와 강한 면역반응성을 나타냈지만 (도 8a 및 8b), 기질 또는 정상 상피세포 내에서는 나타나지 않았다. 단백질 인산화에 의해 영향을 받지 않는 <38> 1801 p53-특이적 항체를 사용하는 IHC 분석으로 3/32 사례만이 양성 시그날을 갖는 것을 밝혔다 (도 8e 및 8f). 이와 반대로, COP1에 양성인 대부분의 사례는 p53에 음성이다 (도 8c 및 8d). p53이 DNA 손상제 또는 유전자 돌연변이에 의해 안정화되지 않으면 IHC에 의해 조직에서 검출하기 어려움을 고려하여, 유방 TMA로부터의 p53 유전자를 서열결정하여 상기 특정 샘플이 실제로 돌연변이체 p53임을 확인하였다 (도 8g). 3가지 사례의 각각에서 확인된 돌연변이는 다음과 같이 아미노산 치환을 일으켰다: C242F, P278S 및 R175H.

유방암 샘플에서 p53 및 COP1의 단백질 수준을 보다 정량적으로 비교하기 위해, 종양 용해물의 웨스턴 블로트 분석을 수행하였다 (도 9a, b). 항-COP1을 사용하는 면역블로팅은 정상 유방 조직 (샘플 N)에서 매우 약한 시그날을 보였지만 67％ (10/15)의 사례에서 COP1에서 유의한 증가가 검출되었고, 이는 COP1이 유방 선암종에서 실제로 과다발현되는 유방 TMA를 사용하는 선행 관찰 (도 8a 및 8b)을 확인한다. p53 수준은 53％ (8/15)의 사례에서 감소하였지만, 정상 유방 조직에 비해 20％ (3/15)의 사례에서 유의하게 증가하였다.

p53에 대한 COP1 과다발현의 결과를 추가로 해명하기 위해, 이들 샘플 내에서 p53 유전자 상태를 결정하는 것이 필요하였다. 따라서, 엑손 5-8을 서열결정하고, 인트론-엑손 경계 및 그 엑손에서 돌연변이에 대해 분석하였다. 27％ (4/16)의 사례가 엑손 8 내에 돌연변이를 가졌고 (도 9b): 샘플 T6 및 T12는 R290H 돌연변이를 가진 반면, 샘플 T7 및 T1O은 R273H 돌연변이를 가졌다. COP1이 유방 종양에서 과다발현될 때 p53의 항정 상태 단백질 수준은 야생형 p53 수준이 극적으로 감소되는 75％ (6/8)의 사례에서, COP1이 과다발현됨을 나타냈다. 25％ (2/8)의 사례만이 p53 수준에서 감소를 나타냈다. COP1이 과다발현되고 p53 수준에서 동반 감소가 관찰되지 않은 경우에, p53 유전자 상태는 돌연변이였고, 이는 COP1이 야생형 p53을 음적으로 조절하는 능력을 가짐을 나타낸다.

결과는 적어도 45％의 난소 선암종 및 80％의 유방 선암종이 COP1의 강한 과다발현을 가졌고, p53 기능 또는 항정 상태 단백질 수준의 결함은 야생형 p53을 함유하고 COP1을 과다발현하는 일부 샘플에서 보일 수 있지만, 돌연변이체 p53을 함유하고 COP1을 과다발현하는 샘플에서는 보이지 않음을 입증하였다 (도 7a-d 및 9a-b). COP1의 과다발현은 독점적으로는 아니지만 주로 야생형 p53 함유 암에서 검출되었고, 이는 COP1의 주요 역할 중 하나가 p53-의존성 종양 억제를 억제하는 것임을 나타낸다.

다양한 암에서 COP1 및 p53 수준의 조사는 다음 결과를 얻었다: 결장 선암종에 대해, 12/38 사례가 p53 양성이고, 12 p53 양성 사례 중 5 사례가 또한 COP1에 대해 양성이고, 8 사례가 COP1 양성 p53 음성이었고; 유방 선암종에 대해, 3/32 사례가 p53에 대해 양성이고, 3 p53 양성 사례 중 2 사례가 또한 IHC에 의해 COP1에 대해 양성이고, 23/32 사례는 COP1 양성 p53 음성이었고; 전이세포 암종 (신장, 전립선, 방광)에 대해, 3/3이 p53 및 COP1에 대해 양성이었고; 폐 선암종에 대해, 1/3이 p53 및 COP1에 대해 양성이었고; 림프종에 대해, 1/3이 p53 및 COP1에 대해 양성이었고; 난소 선암종에 대해, 32/67이 COP1 양성이었고, 서브타입 COP1 양성은 다음과 같았다: 장액 선암종 11/27; 자궁내막양 선암종 12/19; 투명 세포 선암종 4/11; 점액 선암종 5/10.

따라서, COP1은 유방암, 난소암 등을 포함한 많은 암에서 과다발현되고, 이는 야생형 p53 항정 상태 단백질 수준 또는 p53-의존성 전사의 감소를 수반한다. 또한, 본 발명자들은 난소 장액, 자궁내막양 선암종, 및 점액 선암종의 일부 사례에서 IHC에 의해 COP1을 검출하였고, 여기서 ISH에 의해 mRNA 수준에서 검출가능한 시그날이 관찰되지 않았으며, 이는 COP1 단백질의 항정 상태 수준의 증가는 증가된 전사보다 번역후 수준에서 또한 발생할 수 있음을 나타낸다.

참조문헌

다음 문헌을 본원에 참고로 포함한다.

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<다른 실시태양>

본 발명의 다양한 실시태양을 본원에 개시하지만, 당업자의 일반적인 지식에 따라 본 발명의 범위 내에서 많은 개조 및 변경이 이루어질 수 있다. 상기 변형은 실질적으로 동일한 방식으로 동일한 결과를 얻기 위해 본 발명의 임의의 측면에 대한 공지의 동등물의 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 기탁 번호는 뉴클레오티드 서열에 대해 GenBank, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), DNA database of Japan (DDBJ), 또는 Genome Sequence Data Base (GSDB), 및 폴리펩티드 서열에 대해 Protein Information Resource (PIR), SWISSPROT, Protein Research Foundation (PRF), 및 Protein Data Bank (PDB) (해석된 구조로부터의 서열), 및 GenBank, EMBL, DDBJ 또는 RefSeq의 뉴클레오티드 서열로부터의 주석이 달린 코딩 구역으로부터의 번역물을 포함하는 다수의 데이타베이스로부터의 기탁 번호를 나타낸다. 수치 범위는 범위를 규정하는 수를 포함한 것이다. 명세서에서, 단어 "포함하는"은 개방형 용어로서 사용되고, 어구 "포함하지만 제한되지 않는"에 실질적으로 동등하고, 단어 "포함하다"는 대응하는 의미를 갖는다. 본원에서 참조문의 인용은 상기 참조문이 본 발명에 대한 선행 기술임을 승인하는 것으로 해석되어서는 안된다. 모든 문헌은 각각의 개별 문헌을 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내는 것처럼 및 본원에 완전히 설명되는 것처럼 본원에 참고로 포함된다. 본 발명은 실질적으로 실시예와 도면을 참고로 앞서 설명된 바와 같이 모든 실시태양 및 변동을 포함한다.

Sequence Listing <110> GENENTECH, INC. <120> COP1 MOLECULES AND USES THEREOF <130> P2048PCT <140> PCT/US2004/034174 <141> 2004 10 14 <160> 33 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser 1 5 10 15 Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn 20 25 30 Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu 35 40 45 Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro 50 55 60 Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro 65 70 75 Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser 80 85 90 Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly 95 100 105 Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys 110 115 120 Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys 125 130 135 Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr 140 145 150 Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln 155 160 165 Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu 170 175 180 Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile 185 190 195 Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn 200 205 210 Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val 215 220 225 Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile 245 250 255 Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe 260 265 270 Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu 275 280 285 Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro 290 295 300 Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser 305 310 315 Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu 320 325 330 Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn 335 340 345 Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly 350 355 360 Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln 365 370 375 Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro 380 385 390 Asp Ser Asp <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 2 aacugaccaa gauaaccuug a 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 3 aaaguuccaa uagaaccagu c 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 4 aagacuugga gcaguguuac u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 5 aagagguguu ggaguguuga c 21 <210> 6 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 6 aactgtggaa tttgtagg 18 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 7 aaggauguuu aaggugucaa 20 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 8 aauguaacuu augccuagcu a 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 9 aaaucgaucc guauucaaug u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 10 aaggaauuua 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Claims (112)

1. 대상으로부터의 암 샘플에서 COP1 분자를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조군에 비해 상기 COP1 분자의 과다발현이 암의 지표인, 대상에서 암을 진단하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 샘플에서 p53 분자를 검출하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 p53 발현 수준의 감소 또는 p53 활성의 억제가 암의 지표인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 p53 분자가 야생형인 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 p53 분자가 인간 p53 분자인 방법.
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p53 분자가 p53 폴리펩티드인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 p53 폴리펩티드가 상기 p53 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출되는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 p53 폴리펩티드가 면역조직화학을 이용하여 검출되는 것인 방법.
8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p53 활성이 p53-의존성 트랜스활성화 (transactivation)의 억제, p53-유발 세포자멸 (apoptosis)의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소 중 하나 이상으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 COP1 분자가 인간 COP1인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 COP1 분자가 COP1 폴리펩티드인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 COP1 폴리펩티드가 상기 COP1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출되는 것인 방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 COP1 폴리펩티드가 면역조직화학을 이용하여 검출되는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 COP1 분자가 COP1 mRNA인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 COP1 mRNA가 계내 혼성화 (in situ hybridization)를 이용하여 검출되는 것인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플에서 p21 분자를 검출하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 p21 발현 수준의 감소가 암의 지표인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 야생형 p53 발현 암인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 및 전이 세포암 중 하나 이상으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 난소암이 장액 선암종, 자궁내막양 선암종, 투명 세포 선암종 및 점액 선암종으로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
20. 대상으로부터의 샘플을 제공하고;

    상기 샘플에서 COP1 분자를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조군에 비해 상기 COP1 분자의 과다발현의 감소가 암 치료법이 효과적임을 나타내는 것인, 대상에서 암 치료법의 효능을 모니터링하기 위한 방법.
21. 대상으로부터의 샘플을 제공하고;

    상기 샘플에서 COP1 분자를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조군에 비해 상기 COP1 분자의 과다발현의 감소가 개선된 예후를 나타내는 것인, 암에 걸린 대상에 대한 예후를 평가하기 위한 방법.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 샘플에서 p53 분자를 검출하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 p53 발현 수준의 증가 또는 p53 활성의 증가가 효과적인 암 치료법 또는 개선된 예후의 지표인 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 p53 분자가 야생형인 방법.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 p53 분자가 인간 p53 분자인 방법.
25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p53 분자가 p53 폴리펩티드인 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 p53 폴리펩티드가 상기 p53 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출되는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, 상기 p53 폴리펩티드가 면역조직화학을 이용하여 검출되는 것인 방법.
28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p53 활성이 p53-의존성 트랜스활성화의 억제, p53-유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소 중 하나 이상으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 COP1 분자가 인간 COP1인 방법.
30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 COP1 분자가 COP1 폴리펩티드인 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 COP1 폴리펩티드가 상기 COP1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출되는 것인 방법.
32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 COP1 폴리펩티드가 면역조직화학을 이용 하여 검출되는 것인 방법.
33. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 COP1 분자가 COP1 mRNA인 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 COP1 mRNA가 계내 혼성화를 이용하여 검출되는 것인 방법.
35. 제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플에서 p21 분자를 검출하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 p21 발현 수준의 감소가 암의 지표인 방법.
36. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
37. 제20항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 야생형 p53 발현 암인 방법.
38. 제20항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 및 전이 세포암 중 하나 이상으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 난소암이 장액 선암종, 자궁내막양 선암종, 투명 세 포 선암종 및 점액 선암종으로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
40. 대상에게 COP1의 발현을 억제하는 제1 화합물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암으로 진단되거나 암에 걸릴 위험이 있는 대상에서 암을 치료하는 방법.
41. 제40항에 있어서, 대상에게 MDM2 또는 Pirh2의 발현을 억제하는 제2 화합물의 치료 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 화합물이 안티센스 올리고뉴클레오티드, 삼중 가닥 형성 올리고뉴클레오티드 및 siRNA 분자로 이루어지는 군 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 화합물이 암을 암 치료법에 대해 민감화시키는 것인 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 암 치료법을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 화합물이 상기 암 치료법에 앞서 투여 되는 것인 방법.
46. 제44항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 화합물이 상기 암 치료법 동안 투여되는 것인 방법.
47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 치료법이 방사선요법 또는 화학요법을 포함하는 것인 방법.
48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 야생형 p53 발현 암인 방법.
49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, COP1이 대조군에 비해 암에서 과다발현되는 것인 방법.
50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, p53 발현 수준이 대조군에 비해 암에서 감소되는 것인 방법.
51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, p21 발현 수준이 대조군에 비해 암에서 감소되는 것인 방법.
52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
53. a) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 및 상기 제1 및 제2 폴리펩티드의 결합을 저해하기 위한 그의 능력에 대해 시험될 시험 화합물을 용기에 제공하는 단계; 및

    b) 상기 제2 폴리펩티드에 결합되거나, 그로부터 치환되거나, 그에 결합되는 것이 방지되는 상기 제1 폴리펩티드의 양을 측정하는 단계

    를 포함하고, 여기서, 상기 제1 폴리펩티드는 COP1 폴리펩티드이고 상기 제2 폴리펩티드는 p53 폴리펩티드이거나, 또는 상기 제1 폴리펩티드는 p53 폴리펩티드이고 상기 제2 폴리펩티드는 COP1 폴리펩티드이고; 여기서, 상기 제2 폴리펩티드에 결합된 상기 제1 폴리펩티드의 양을 감소시키거나, 상기 제2 폴리펩티드에 결합된 상기 제1 폴리펩티드를 치환시키거나, 상기 제1 폴리펩티드가 상기 제2 폴리펩티드에 결합하는 것을 방지하는 화합물은 COP1 분자의 p53 분자에 대한 결합을 저해하는 화합물로서 확인되는 것인, COP1 분자의 p53 분자에 대한 결합을 저해하는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 시험 화합물이 COP1 활성을 조정하는지 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
55. 제54항에 있어서, 상기 COP1 활성이 p53의 분해, p53의 유비퀴틴화, p53-의 존성 트랜스활성화의 억제, p53 유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, COP1이 인간 COP1인 방법.
57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, p53이 인간 p53인 방법.
58. a) 제1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 서열 특이적 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 핵산 분자, 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 트랜스활성화 도메인을 포함하는 제2 핵산 분자, 상기 서열 특이적 DNA 결합 도메인에 의해 인식될 수 있는 서열에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 제3 핵산 분자, 및 세포에서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드의 결합을 저해하는 그의 능력에 대해 시험될 시험 화합물을 제공하는 단계로서, 상기 제1 폴리펩티드는 COP1 폴리펩티드이고 상기 제2 폴리펩티드는 p53 폴리펩티드이거나, 또는 상기 제1 폴리펩티드는 p53 폴리펩티드이고 상기 제2 폴리펩티드는 COP1 폴리펩티드인 단계; 및

    b) 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계

    를 포함하고, 여기서 상기 리포터 유전자의 발현을 감소시키는 화합물이 COP1 분자의 p53 분자에 대한 결합을 저해하는 화합물인, COP1 분자의 p53 분자에 대한 결합을 저해하는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법.
59. 제58항에 있어서, 상기 시험 화합물이 COP1 활성을 조정하는지 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 COP1 활성이 p53의 분해, p53의 유비퀴틴화, p53-의존성 트랜스활성화의 억제, p53 유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, COP1이 인간 COP1인 방법.
62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, p53이 인간 p53인 방법.
63. 포유동물 세포를 COP1에 결합하는 시험 화합물로 처리하고, 처리된 세포에서 p53을 검출하는 단계를 포함하는, p53의 활성을 억제하는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법.
64. 제63항에 있어서, 검출 단계가 p53의 분해, p53의 유비퀴틴화, p53 트랜스활성화의 억제, p53 유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소로 이루어진 군 중 하나 이상을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 포유동물 세포가 COP1을 발현하도록 유전공학처리된 것인 방법.
66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 p53을 발현하도록 유전공학처리된 것인 방법.
67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, COP1이 인간 COP1인 방법.
68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, p53이 인간 p53인 방법.
69. 암으로 진단되거나 암에 걸릴 위험이 있는 대상에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, COP1 분자의 발현을 억제하거나 COP1 리가제 활성을 억제하는 화합물의 용도.
70. 제69항에 있어서, 암이 대조군에 비해 COP1 분자의 과다발현을 보이는 것인 용도.
71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 암이 대조군에 비해 암에서 p53 활성의 감소를 보이는 것인 용도.
72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 대조군에 비해 암에서 p53 수준의 감소를 보이는 것인 용도.
73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 대조군에 비해 암에서 p21 수준의 감소를 보이는 것인 용도.
74. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 p53이 암에서 발현되는 것인 용도.
75. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 COP1을 표적으로 하는 RNAi인 용도.
76. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, MDM2 또는 Pirh2의 발현을 억제하는 화합물의 사용을 추가로 포함하는 용도.
77. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, COP1이 인간 COP1인 용도.
78. 제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, p53이 인간 p53인 용도.
79. 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, MDM2가 인간 MDM2인 용도.
80. 제69항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, Pirh2가 인간 Pirh2인 용도.
81. 세포에서 COP1을 과다발현시키고, COP1을 과다발현시킨 세포에서 p53을 검출하는 단계를 포함하는, 포유동물 세포에서 p53의 활성을 억제하기 위한 방법.
82. 제81항에 있어서, 검출 단계가 p53의 분해, p53의 유비퀴틴화, p53-의존성 트랜스활성화의 억제, p53 유발 세포자멸의 억제 및 p21 mRNA 수준의 감소로 이루어진 군 중 하나 이상을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 포유동물 세포가 p53을 발현하도록 유전공학처리된 것인 방법.
84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, p53이 야생형 p53인 방법.
85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 MDM2 활성의 감소된 발현을 보이도록 유전공학처리된 것인 방법.
86. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 Pirh2 활성의 감소된 발현을 보이도록 유전공학처리된 것인 방법.
87. 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, COP1이 인간 COP1인 방법.
88. 제81항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, p53이 인간 p53인 방법.
89. 제81항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, MDM2가 인간 MDM2인 방법.
90. 제81항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, Pirh2가 인간 Pirh2인 방법.
91. p53 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자, 및 포유동물 COP1 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 포유동물 세포.
92. 감소된 COP1 활성 및 감소된 MDM2 활성을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포.
93. 감소된 COP1 활성 및 감소된 Pirh2 활성을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포.
94. 감소된 COP1 활성, 감소된 MDM2 활성 및 감소된 Pirh2 활성을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포.
95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, p53을 발현하도록 추가로 유전공학처리된 포유동물 세포.
96. 감소된 MDM2 활성, 감소된 Pirh2 활성 및 증가된 COP1 활성을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포.
97. 감소된 p53 활성 및 증가되거나 정상적인 COP1 활성을 갖도록 유전공학처리된 포유동물 세포.
98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 활성이 RNAi의 방법에 의해 감소되는 것인 포유동물 세포.
99. 제91항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, COP1 분자를 코딩하는 DNA 분자를 세포 내로 도입함으로써 COP1 활성이 증가되는 것인 포유동물 세포.
100. COP1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 서열 특이적 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 핵산 분자, p53 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 트랜스활성화 도메인을 포함하는 제2 핵산 분자, 및 상기 서열 특이적 DNA 결합 도메인에 의해 인식될 수 있는 서열에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 제3 핵산 분자를 포함하는 세포.
101. p53 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 서열 특이적 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 핵산 분자, COP1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 트랜스활성화 도메인을 포함하는 제2 핵산 분자, 및 상기 서열 특이적 DNA 결합 도메인에 의해 인식될 수 있는 서열에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 제3 핵산 분자를 포함하는 세포.
102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 리포터 유전자가 루시퍼라제인 포유동물 세포.
103. COP1 분자의 p53 분자에 대한 결합을 저해하는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한, 제91항 내지 제102항 중 어느 한 항 기재의 포유동물 세포의 용도.
104. 샘플에서 COP1 분자를 검출하기 위한 시약, 및 암 세포를 포함하는 샘플에서 COP1 분자를 검출하기 위한 지시서가 들어있는 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
105. 제104항에 있어서, 암 세포가 야생형 p53 발현 암세포인 키트.
106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 암이 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 및 전 이 세포암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 키트.
107. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 난소암이 장액 선암종, 자궁내막양 선암종, 투명 세포 선암종 및 점액 선암종으로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 키트.
108. 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 p53 분자를 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
109. 샘플에서 COP1 분자를 검출하기 위한 시약, 및 샘플에서 p53 분자를 검출하기 위한 시약을 포함하는 키트.
110. COP1의 발현을 억제하는 화합물을 제약학상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물.
111. 제110항에 있어서, MDM2 또는 Pirh2의 발현을 억제하는 화합물을 제약학상 허용되는 담체와 함께 추가로 포함하는 제약 조성물.
112. 제110항 또는 제111항에 있어서, 상기 화합물이 안티센스 올리고뉴클레오티드, 삼중 가닥 형성 올리고뉴클레오티드 및 siRNA 분자로 이루어진 군 중 하나 이 상으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.

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