KR20080080676A - 인산화된 ｃｏｐ１ 분자 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20080080676A KR1020087018674A KR20087018674A KR20080080676A KR 20080080676 A KR20080080676 A KR 20080080676A KR 1020087018674 A KR1020087018674 A KR 1020087018674A KR 20087018674 A KR20087018674 A KR 20087018674A KR 20080080676 A KR20080080676 A KR 20080080676A
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Abstract

본 발명은 COP1 분자 및 COP1 활성의 조절제 및 이의 진단 및 치료 용도를 포함하여 이를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 분자는 대상에서 DNA 손상을 검출하고 DNA 손상에 대한 반응 및 p53 활성을 조절하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명은 또한 COP1 활성을 조절할 수 있는 시험 화합물의 스크리닝에 사용하기 위한 시약 및 키트를 제공한다.
COP1 분자, DNA 손상, p53 활성, 화합물, 스크리닝, 시약, 키트

Description

인산화된 ＣＯＰ１ 분자 및 그의 용도 {PHOSPHORYLATED COP1 MOLECULES AND USES THEREOF}
관련 출원
본원은 그 전부가 본원에 참고로 포함된, 2005년 12월 31일 출원된 미국 특허 가출원 60/755,412를 기초로 한 우선권 및 이익을 주장한다.
본 발명은 COP1 및 DNA 손상에 대한 진단제 및 치료제 분야에 관한 것이다.
게놈 통합성은 포유동물에서 세포 및 조직 항상성 유지의 필수조건이다. 따라서, 특정 군의 단백질을 잠재적인 게놈 변동을 방지하기 위해 고안된 회로 (circuit)에 연결시켰다. 혈관확장성 운동실조증 (Ataxia Telangiectasia: A-T)은 이환된 개체가 세포 수준에서 심한 게놈 불안정성을 보이는 희귀한 상염색체 열성 질환이다1. 혈관확장성 운동실조증 돌연변이된 단백질 키나제 (ATM)의 돌연변이는 A-T와 연관되고, 게놈 통합성 유지를 위해 형성된 DNA-손상 반응 네트워크의 중요한 성분으로서 ATM을 관련시킨다2. ATM은 부분적으로 p53, BRCA1, 및 Chk2를 포함한 핵심 기질을 인산화함으로써 기능한다. ATM 기질의 인산화는 DNA 손상 후 및 종양 발생의 초기 단계에서 검출된다9.
종양 억제제 p53은 DNA 손상 활성화 경로에 연관된다. p53이 존재하지 않는 마우스에서는 일반적으로 비정배수 (aneuploidy)를 보이는 림프종 및 육종이 발생하는 반면에1 0, 세포 주기 정지만이 가능한 돌연변이체 p53을 갖는 마우스에서는 이배체 염색체 수를 갖는 종양이 형성된다11. p53은 그의 산물이 세포 주기 정지, 노화, 또는 아폽토시스 (apoptosis)에 관련되는 중요한 유전자의 발현을 유도하는 스트레스 활성화된 전사 인자로서 기능함으로써 그의 종양 억제제 특성을 발휘한다. 염기쌍 돌연변이를 갖는 체세포의 증식 지연은 세포가 그 자체의 게놈의 복제 또는 세포 분열 전에 미스매치를 복구하는 것으로 가능하게 한다. ATM은 전사 공동활성화제 p300의 동원을 촉진함으로써1 3 p53 표적 유전자의 트랜스액티베이션 (transactivation) 활성을 증가시키는 S15 상의 N-말단12에서 직접 p53을 인산화한다. 또한, ATM은 p53을 음조절 (negative regulation)하는 그의 능력을 감소시키는 MDM2 및 MDMX를 인산화한다14 -16. p53은 유방암 및 난소암에서 과다발현되는 COP1을 포함하여3 ,4 E3 유비퀴틴 리가제5에 의해 음조절된다.
<발명의 개요>
한 측면에서, 본 발명은 세포에서 COP1 폴리펩티드를 검출함으로써 ATM 폴리펩티드를 포함하는 세포에서 DNA 손상을 검출하는 방법을 제공하고, 여기서 ATM 폴 리펩티드에 의한 COP1 폴리펩티드의 인산화, 또는 대조군에 비교할 때 COP1 폴리펩티드의 수준 감소는 DNA 손상을 나타낸다.
ATM 폴리펩티드는 인간 ATM 폴리펩티드일 수 있고/있거나 COP1 폴리펩티드는 인간 COP1 폴리펩티드일 수 있다. 인산화는 세린 인산화일 수 있다. COP1 폴리펩티드는 COP1 폴리펩티드, 예를 들어 인간 COP1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 377-400에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 또는 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 펩티드는 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 인산화가능한 아미노산 잔기 상에서 인산화될 수 있다.
상기 방법은 ATM 폴리펩티드의 검출을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 COP1 분자의 ATM 분자에 대한 결합은 DNA 손상을 나타내고/내거나, COP1 E3-리가제 활성의 활성화, COP1 자가-유비퀴틴화 (auto-ubiquitination)의 활성화, p53-COP1 복합체의 붕괴, COP1-의존성 p53 유비퀴틴화의 감소, COP1의 세포질/핵 비의 증가, COP1 폴리펩티드의 전환, 또는 COP1 폴리펩티드의 분해의 검출을 추가로 포함할 수 있고/있거나, 세포에서 p53 분자의 검출을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 대조군에 비교할 때 p53 분자의 발현 수준의 증가, 또는 p53 활성의 증가는 DNA 손상을 나타낸다. p53 분자는 인간 p53 분자 및/또는 야생형 p53 분자일 수 있다. p53 분자는 p53 폴리펩티드일 수 있다. p53 폴리펩티드는 p53 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출할 수 있다. p53 활성은 p53-의존성 트랜스액티베이션의 활성화, p53-유도 아폽토시스의 활성화, p21 분자의 활성화, p21 프로모 터의 유도, p21 mRNA 수준의 증가, 또는 PUMA 프로모터의 유도일 수 있다.
DNA 손상은 방사선 조사 (예를 들어, 이온화 방사선 조사 또는 자외선 조사, 또는 방사선 치료) 또는 화합물 (예를 들어, 알킬화제, 예를 들어 화학치료제)에 의해 야기될 수 있다. 세포 (예를 들어, 암세포, 예를 들어 유방암, 난소암, 대장암, 폐암, 또는 전이 세포 암세포)는 DNA가 손상되었거나 DNA가 손상될 위험이 있을 수 있다. 암세포는 암 치료 중이거나 또는 그 노출이 DNA 손상을 야기할 수 있는 방사선 또는 화합물에 노출된 대상 (예를 들어, 인간)으로부터 입수할 수 있다. 암 치료는 DNA 손상을 야기하는 것으로 알려진 것일 수 있거나 DNA 손상을 야기하는 것으로 의심되고 있는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포를 COP1 폴리펩티드의 분해를 증가시키는 화합물에 노출시킴으로써 세포에서 DNA 손상에 대한 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 화합물은 ATM 분자, 예를 들어 활성화된 ATM 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 화합물은 COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드에 대한 결합을 증가시키거나, ATM 폴리펩티드에 의한 COP1 폴리펩티드의 인산화를 증가시킬 수 있다.
별도의 측면에서, 본 발명은 COP1 폴리펩티드 및 ATM 폴리펩티드를 COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드에 대한 결합을 증가시키는 화합물과 접촉시킴으로써 COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드와의 상호작용을 증가시키는 방법을 제공한다.
별도의 실시태양에서, 상기 방법은 결합이 COP1 폴리펩티드의 분해, COP1 E3-리가제 활성의 활성화, COP1 자가-유비퀴틴화의 활성화, COP1-p53 복합체의 붕괴, COP1-의존성 p53 유비퀴틴화의 감소, COP1 폴리펩티드의 세포질/핵 비의 증가, 또는 p53 분자의 발현 수준의 증가를 야기하는지를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 접촉은 세포, 예를 들어 DNA 손상이 존재하거나 존재할 위험이 있는 세포 (예를 들어, A-T 세포 또는 암세포)에서 DNA 손상에 대한 반응을 증가시킬 수 있다. DNA 손상에 대한 반응은 세포 아폽토시스 또는 p53 활성화를 포함할 수 있다. p53 활성화는 p53-의존성 트랜스액티베이션의 활성화, p53-유도 아폽토시스의 활성화, p21 분자의 활성화, p21 프로모터의 유도, 또는 PUMA 프로모터의 유도일 수 있다. COP1 폴리펩티드는 인간 COP1 폴리펩티드일 수 있고/있거나 ATM 폴리펩티드는 인간 ATM 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명은 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 아미노산 잔기의 인산화를 증가시키고/시키거나 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387의 인산화를 증가시킬 수 있는 화합물을 고려한다.
본 발명은 또한 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 잔기를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 COP1 폴리펩티드 또는 그의 단편; 인간 COP1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 377-400에 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 인산화될 수 있는 아미노산 잔기 (예를 들어, 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 잔기) 상에서 인산화를 갖는 폴리펩티드; 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 잔기에서 세린 대신에 트레오닌, 글루타메이트 또는 아스파르테이트의 치환을 포함하는 COP1 폴리펩티드; 및 COP1 모방 (mimetic) 화합물을 제공한다. 한 실시태양에서, 폴리펩티드는 S387에서 다른 잔기로의 잔기 변경을 포함하는 COP1 폴리펩티드 서열을 포함한다.
별도의 측면에서, 본 발명은 세포에서 DNA 손상을 촉진시키기에 적합한 조건 하에서 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 COP1 폴리펩티드를 인큐베이팅하고, COP1 폴리펩티드의 분해가 시험 화합물의 존재 하에 증가되는지를 결정함으로써 ATM 분자를 포함하는 세포에서 DNA 손상에 대한 반응을 증가시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공하고, 여기서 COP1 폴리펩티드의 분해를 증가시키는 화합물은 DNA 손상에 대한 반응을 증가시키는 화합물이다. 상기 결정은 대조군과 비교하여 수행할 수 있다. ATM 분자는 COP1 폴리펩티드를 인산화할 수 있다.
별도의 실시태양에서, 방법은 COP1 E3-리가제 활성의 활성화, COP1 자가-유비퀴틴화의 활성화, COP1-p53 복합체의 붕괴, COP1-의존성 p53 유비퀴틴화의 감소, COP1 폴리펩티드의 세포질/핵 비의 증가, p53 활성의 증가, 또는 p53 분자의 발현 수준의 증가가 화합물에 의해 증가되는지를 결정하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 증가는 화합물이 DNA 손상에 대한 반응을 증가시키는 화합물임을 나타낸다. p53 활성은 p53-의존성 트랜스액티베이션의 활성화, p53-유도 아폽토시스의 활성화, p21 분자의 활성화, p21 프로모터의 유도, 또는 PUMA 프로모터의 유도일 수 있다. DNA 손상 촉진에 적합한 조건은 방사선 조사일 수 있다. DNA 손상에 대한 반응은 세포 아폽토시스 또는 p53 활성화를 포함할 수 있다.
별도의 측면에서, 본 발명은 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 COP1 폴리펩티드를 ATM 폴리펩티드와 함께 인큐베이팅하고, 시험 화합물이 COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드에 대한 결합을 증가시키거나 안정화시키는지를 결정함으로써 COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드와의 상호작용을 증가시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공하고, 여기서 COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드에 대한 결합을 증가시키거나 안정화시키는 시험 화합물은 COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드와의 상호작용을 증가시키는 화합물이다.
별도의 측면에서, 본 발명은 인간 COP1의 아미노산 잔기 377-400에 실질적으로 동일하거나 상동성인 아미노산 서열을 주성분으로 하는 단리된 펩티드, 또는 도 6에 제시된 아미노산 서열을 주성분으로 하는 단리된 펩티드를 제공한다. 별도의 실시태양에서, 펩티드는 SQ 모티프에서 세린의 치환 (예를 들어, 아스파르테이트 또는 글루타메이트 치환)을 포함할 수 있다.
별도의 측면에서, 본 발명은 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 잔기 상에 인산화를 포함하는 단리된 또는 재조합 인산화된 COP1 펩티드, 또는 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 아미노산 잔기에서 아스파르테이트 또는 글루타메이트 치환을 포함하는 단리된 또는 재조합 COP1 펩티드, 또는 COP1 모방 화합물을 제공한다.
별도의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 또는 모방체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 프로모터에 작동가능하게 연결된 벡터일 수 있다. 벡터는 추가로 프로모터에 작동가능하게 연결된 ATM 핵산 분자를 포함할 수 있다. 벡터는 숙주 세포에 존재할 수 있다.
별도의 측면에서, 본 발명은 인간 COP1의 세린 387에 상동성인 아미노산 잔기 상에서 인산화된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 시약을 제공한다. 별도의 실시태양에서, 본 발명은 상기 항체를 코딩하는 핵산 분자; 프 로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 포함하는 벡터; 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포; 및/또는 세포에서 인산화된 COP1 분자를 검출하기 위한 사용설명서와 함께 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
별도의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드, 펩티드 또는 모방체 또는 상기 폴리펩티드 또는 펩티드 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는, 대상에서 DNA 손상에 대한 반응 또는 p53 활성을 조절하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
별도의 측면에서, 본 발명은 COP1 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자 및 ATM 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 포유동물 세포를 제공한다. 포유동물 세포는 p53 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 추가로 포함할 수 있다. ATM 분자는 활성화될 수 있고/있거나 COP1 분자는 구성적으로 (constitutively) 인산화되거나 또는 비인산화 (예를 들어, S387의 돌연변이로 인한)될 수 있다.
또한, 본 발명은 또한 대상에게 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 모방체를 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서 DNA 손상 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 대상에게 치료 유효량의 화합물 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서 DNA 손상 또는 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 화합물 또는 폴리펩티드는 COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드에 대한 결합을 증가시키거나, ATM 폴리펩티드에 의한 상기 COP1 폴리펩티드의 인산화를 증가시킨다. 하나의 실시태양에 따르면, 화합물 또는 폴리펩티드는 COP1에 특이적으로 결합한다. 다른 실시태양에 따르면, 화합물 또는 폴리펩티드는 ATM에 특이적으로 결합한다. 또다른 실 시태양에 따르면, 화합물 또는 폴리펩티드는 비인산화된 COP1에 특이적으로 결합한다. 또다른 실시태양에 따르면, 화합물은 DNA 손상된 세포 또는 암에서 COP1 폴리펩티드의 인산화를 증가시키기에 효과적인 양으로 투여된다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 확인된 화합물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 모방체, 핵산, 및 화합물의, 대상에서 DNA 손상 또는 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 용도를 제공한다.
도 1A-E는 COP1이 IR 후에 전환되고 S387에 의존함을 보여준다. A, COP1 항정 상태 (steady-state) 수준은 IR에 노출시에 감소한다. B, COP1 mRNA 수준은 감소하지 않지만, IR에 노출시에 증가한다. C, COP1은 시클로헥사미드 펄스 추적 (pulse-chase)에 의해 평가할 때 IR 후에 전환된다. D, COP1에 대한 잠재적인 SQ 모티프. E, COP1-S387A는 IR에 노출시에 분해에 저항성이다.
도 2A-K: ATM은 COP1을 음조절한다. A, 내인성 ATM은 시험관 내에서 S387을 포함하는 COP1 GST-펩티드를 인산화시킬 수 있다. B, ATM은 S387을 생체 내에서 인산화시킨다. C, COP1은 생체 내에서 ATM과 상호작용하고, DNA 손상 후에 증가한다. D, 항정 상태 수준에서의 COP1 감소는 ATM-의존성이다. E, IR 후에 S387에서 COP1의 인산화는 ATM의 키나제 활성에 의존한다. F, 외인성 ATM은 Saos-2 세포에서 COP1 항정 상태 수준의 감소를 촉진시킨다. G, COP1의 ATM-유도된 감소는 26S 프로테아좀에 의해 매개된다. H, ATM은 COP1의 유비퀴틴화를 키나제-의존 방식으로 촉진시킨다. I, COP1-C136/139S RING 돌연변이체는 ATM-유도된 분해에 저항성이 다. J, S387에서의 포스페이트-모방체는 COP1의 자가-유비퀴틴화를 시험관 내에서 촉진시킨다. K, COP1-S387D는 증가된 전환 능력을 보인다.
도 3: ATM은 세포질로의 COP1 국재화를 촉진시킨다. A, COP1은 DNA 손상 후에 ATM-의존 방식으로 세포질로 국재화된다. B, COP1-S387D는 세포질 구획 (compartment)에 우세하게 국재화된다.
도 4A-I: p53의 COP1 음조절은 S387에서의 ATM 변형에 의해 약화된다. A, B, p53과의 COP1 상호작용은 DNA 손상에 노출시에 약해진다. C, COP1-S387D는 p53 결합에 덜 효과적이다. D, p53은 시험관 내에서 COP1-S387D에 결합하는 능력의 감소를 보인다. E, 시험관 내에서 p53의 COP1에 의한 유비퀴틴화는 S387D 돌연변이에 의해 억제된다. F, COP1-S387D는 p53 분해 효과가 더 작다. G, COP1-S387D는 p53-의존성 트랜스액티베이션 억제 효능이 더 작다. H, COP1-S387D는 p53 종양 억제제 기능의 음조절능이 없다. I, p53 축에 대한 ATM DNA 손상 반응 경로의 모델.
도 5: 전장 COP1 상의 S387은 시험관 내에서 ATM 인산화의 주요 부위이다.
도 6: S387에서 COP1 SQ3은 포유동물 오르토로그 (ortholog)에서 고도로 보존된다.
도 7: pS387 COP1 항체의 ELISA 특성화. 1 ng의 각각의 펩티드를 pS387 항체의 농도를 변경시키면서 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. HRP 2차 및 ECL은 펩티드에 대한 항체 결합을 검출하였다.
도 8: 시험관 내 키나제 분석을 사용한 pS387 항체 특성화. FLAG-ATM 및 GST-COP1 또는 GST-COP1-S387A를 나타낸 억제제와 함께 또는 억제제 없이 인큐베이 팅하였다.
도 9: 내인성 COP1의 항정 상태 수준은 Saos-2에서 ATM의 동시 형질감염시에 감소한다. 10 ㎍의 ATM 또는 ATM-KD를 24시간 동안 형질감염시키고, 수준을 웨스턴 블로팅으로 평가하였다.
도 10: HEK293T로부터의 SDS-PAGE의 양호한 염색은 FLAG-COP1-WT, FLAG-COP1-S387D, 및 FLAG-COP1-RINGmt를 정제하였다.
도 11: COP1은 IR 처리 후에 세포질로 국재화된다. 10 Gy IR 처리 후에 H1299 세포에서 형질감염된 FLAG-COP1의 면역형광은 핵 COP1 분획을 희생시켜 세포질로 국재화된 COP1의 유의한 비율을 보여준다. 면역형광은 메탄올 고정 및 비오틴-스트렙타비딘 증폭 방법에 의해 수행하고, Zeiss Axiovert 200M 현미경으로 Cy5 필터 입방체를 사용하여 검출하는 하였다. DAPI를 사용하는 Vectashield (벡터 래보래토리스 (Vector Laboratories))를 DNA 염색에 이용하였다.
본 발명은 부분적으로는 ATM이 DNA 손상 또는 크로마틴 구조의 변경 후에 COP1과 상호작용하고 COP1을 인산화시킴을 입증한다. ATM에 의한 이러한 공유 변형은 COP1-p53 복합체를 붕괴시키고, COP1에 의한 유비퀴틴화, 분해, 및 p53 종양 억제제 기능의 음조절을 억제한다. 또한, COP1의 인산화는 자가-E3 분해 메카니즘에 관련되고, 이에 의해 COP1을 트랜스(trans)-유비퀴틴 리가제 활성으로부터 시스(cis)-유비퀴틴 리가제 활성으로 전환시키고, 이것은 인산화에 의한 RING-E3 리가제의 활성화의 첫번째 예이다. COP1의 인산화는 또한 COP1의 세포질/핵 국재화 비를 증가시킨다. 따라서, ATM에 의한 COP1의 인산화, 또는 COP1의 분해는 p53-의존성 종양 억제제 기능을 음조절하는 COP1의 능력을 저하시킨다. 특정 가설에 지지되지 않지만, ATM에 의한 COP1의 인산화, 또는 COP1의 분해는 p53 경로에 있어서 A-T 환자의 게놈 비정상에 대한 유의하게 지연된 반응에 대한 추가의 설명을 제공할 수 있다 (도 4I).
따라서, ATM에 의한 COP1의 인산화, 또는 COP1의 분해를 사용하여 DNA 손상을 검출할 수 있다.
본 발명의 다양한 대안적인 실시태양 및 실시예를 본원에서 설명한다. 상기 실시태양 및 실시예는 예시적인 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 생각하지 않아야 한다.
DNA 손상
"DNA 손상"은 DNA의 공유 변형을 야기하거나 그의 정상적인 이중 나선 입체형태로부터 일탈시킴으로써 DNA의 정상적인 기능에 영향을 주는 DNA에 대한 손상을 의미한다. DNA 손상은 복제 및 전사를 방해하는 구조적 왜곡, 및 염기쌍을 붕괴시키고 DNA 서열을 변경시킬 수 있는 점 돌연변이를 포함한다. 일반적으로, 세포가 DNA 손상을 받을 때, 세포 주기는 두 조사 지점 중의 하나 (G1/S 또는 G2/M)에서 정지한다. 세포 주기 정지는 DNA 복구 과정의 활성화를 야기할 수 있거나 (비교적 작은 DNA 손상시), 또는 아폽토시스를 유도할 수 있다 (매우 큰 DNA 손상의 경우).
DNA 손상은 내인성 과정, 예를 들어 염기의 산화 및 정상 대사로부터 생성된 반응성 산소 및 유리 라디칼에 의한 DNA 가닥 중단 (interruption)의 발생, 염기의 메틸화, 탈퓨린화 (예를 들어, 물 중의 DNA의 반응에 의한), 탈피리미딘화, DNA 복제 동안 DNA 폴리머라제에 의한 염기의 미스매치 등에 의해 자연발생적으로 야기될 수 있다. 또한, DNA 손상은 방사선 조사 (예를 들어, 자외선 조사, x-선, 감마선, 이온화 방사선 조사), 천연 독소 (예를 들어, 식물 독소), 합성 독소, 약물 (예를 들어, 암 화학 치료, 방사선 치료), 알킬화제 등과 같은 환경적 자극에 의해 발생할 수도 있다.
DNA 손상은 유전적인 유전 질환 및 환경적 자극에 대한 노출 결과로 발생하는 질환을 포함하는 다양한 질환을 야기하거나 이들 질환으로부터 발생할 수 있다. DNA 손상이 복합 요인인 질환은 루이스-바 (Louis-Bar) 증후군 또는 소뇌-눈피부 모세혈관 확장증으로도 불리는 혈관확장성 운동실조증 (A-T), 색소성 건피증, 코케인 (Cockayne) 증후군, 모발 유황 이영양증, 판코니 (Fanconi) 빈혈, 블룸 (Bloom) 증후군, 및 알츠하이머 (Alzheimer) 병을 포함한다. 또한, DNA 손상은 흡연의 결과로서 발생하여 예를 들어 심장 질병을 야기할 수 있거나, 또는 다른 질병, 예를 들어 암에 대한 치료의 결과로서 발생할 수 있다.
암
"암", "신생물", "이상증식", "암종", 또는 "종양"은 생리학적 기능을 보이지 않는 세포의 임의의 원치 않는 성장을 의미한다. 일반적으로, 신생물 또는 암의 세포, 예를 들어, 신생물성 세포는 정상적인 세포 분열 조절에서 벗어나 있다. 즉, 세포는 그 성장 또는 증식이 세포 환경 내의 통상적인 생화학적 및 물리적 영향에 의해 조절되지 않고, 조절되지 않은 성장, 국소 조직 침습, 전이 등의 특성을 보인다. 일반적으로, 신생물성 세포는 증식하여 양성 또는 악성인 세포의 클론을 형성한다. 따라서, 용어 암 또는 신생물은 기술적으로 양성이지만 악성이 될 위험이 있는 세포 성장을 포함한다. "악성"은 임의의 세포 종류 또는 조직의 비정상적인 성장 또는 증식을 의미한다. 악성 세포 또는 조직은 동일한 종류의 정상 세포 또는 조직과 비교할 때 역형성 또는 분화/배향 (orientation)의 상실을 억제할 수 있고, 침습 및 전이 능력을 보일 수 있다.
대부분의 암은 다음과 같은 3개의 넓은 조직학적 분류에 해당한다: 우세한 암으로서, 상피 세포 또는 장기의 외부 또는 내부 표면, 선 (gland), 또는 다른 신체 구조 (예를 들어, 피부, 자궁, 폐, 유방, 전립선, 위, 장)를 망라하는 세포의 암이고 전이되는 경향이 있는 암조; 연결 또는 지지 조직 (예를 들어, 뼈, 연골, 건, 인대, 지방, 근육)으로부터 유래된 육종; 및 골수 및 림프 조직으로부터 유래된 혈액 종양. 암종은 선암종 (일반적으로 분비할 수 있는 장기 또는 선, 예를 들어 유방, 폐, 결장, 전립선 또는 방광에서 발생하는)일 수 있거나 또는 편평 세포 암종 (편평 상피에서 시작하고 일반적으로 신체의 대부분의 영역에서 발생하는)일 수 있다. 육종은 골육종 또는 골원성 육종 (뼈), 연골육종 (연골), 평활근육종 (평활근), 횡문근육종 (골격근), 중피 육종 또는 중피종 (체강의 막상 내층), 섬유육종 (섬유 조직), 혈관육종 또는 혈관내피종 (혈관), 지방육종 (지방 조직), 신경아교종 또는 별아교세포종 (뇌에서 발견되는 신경성 연결 조직), 점액 육종 (원시 배아 연결 조직), 중간엽 또는 혼합 중배엽성 종양 (혼합 연결 조직 종류)일 수 있다. 혈액 종양은 골수의 혈장 세포에서 시작하는 골수종; "액상 암"일 수 있고 골수의 암이며, 골수성 또는 과립구성 백혈병 (골수양 및 과립구성 백혈구), 림프, 림프구성, 또는 림프모구성 백혈병 (림프양 및 림프구성 혈액 세포) 예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병 등, 또는 진성 적혈구 증가증 또는 적혈병 (각종 혈액 세포 산물이지만, 적혈구가 우세함)일 수 있는 백혈병; 또는 고형 종양이고 림프계의 선 또는 절에서 발생하며, 호지킨 (Hodgkin) 또는 비-호지킨 림프종, 버킷 (Burkitt) 림프종 등을 포함할 수 있는 림프종일 수 있다. 또한, 혼합형 암, 예를 들어 선편평 암종, 혼합 중배엽 종양, 암육종, 또는 기형암종도 존재한다.
또한, 암은 암이 시작되는 장기, 즉, "원발성 부위"를 기초로 하여, 예를 들어 유방, 뇌, 폐, 간, 피부, 전립선, 고환, 방광, 결장 및 직장, 자궁경부, 자궁 등의 암으로 명명될 수 있다. 이러한 명칭은 암이 원발성 부위와 상이한 신체의 다른 부분으로 전이된 경우에도 유지되고, 본 발명에 따른 암은 원발암, 및 전이된 암을 포함한다.
원발성 부위를 기초로 하여 명명된 암은 조직학적 분류와 상호관련될 수 있다. 예를 들어, 폐암은 일반적으로 편평 세포 암종, 선암종, 또는 대세포 암종일 수 있는 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암이다. 피부암은 일반적으로 기저세포암, 편평 세포암, 또는 흑색종, 예를 들어, 악성 흑색종이다. 림프종은 머리, 목 및 가슴과 관련된 림프절에서, 및 복부 림프절에서 또는 겨드랑이 또는 서혜부 림프절에서 발생할 수 있다. 암의 종류 및 단계의 확인 및 분류는 예를 들어 미국에서 암 발생 빈도 및 생존에 대한 정보의 권위있는 공급처이고 세계적으로 인정된 National Cancer Institute의 Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) 프로그램 (http://seer.cancer.gov/publicdata/access.html)에서 제공되는 정보를 사용하여 수행할 수 있다. SEER 프로그램의 발생 빈도 및 생존 데이타는 특정 암 부위 및 단계에 대한 표준 생존을 입수하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 최적 비교 군을 보장하기 위해서, 진단일 및 정확한 단계를 포함하는 특정 기준을 데이타베이스로부터 선택할 수 있다. 암의 확인은 또한 예를 들어 진단 매뉴얼, 예를 들어 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th edition, M.H. Beers and R. Barkow, eds., John Wiley and Sons, 1999]에 제시된 정보를 사용하여 수행할 수 있다.
또한, 암 또는 신생물의 예는 당업계에 공지된 변형된 무한증식 (immortalized) 세포, 고형 종양, 골수증식성 질환, 모세포종, 편평 세포암 (예를 들어 상피 편평 세포암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막 암, 간세포 암, 위장 또는 위 암, 예를 들어 위장관암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암종, 유방암, 대장암, 직장암, 결직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 장액 선암종, 자궁내막양 선암종, 투명 세포 선암종, 점액 선암종, 브레너 (Brenner) 종양, 기형종, 미분화세포종, 융모막암종, 섬유종, 과립층 세포 종양, 세르톨리 라이디히 (Sertoli-Leydig) 세포 종양, 미분화 난소 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 여성 외음부 암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 머리 및/또는 목의 암, 유잉 (Ewing) 육종, 혈관육종, 카포시 (Kaposi) 육종, 지방육종, 말초성 신경 상피종, 윤활막 육종, 호지킨병 등을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
폴리펩티드, 핵산 분자, 및 화합물
본 발명에 따른 화합물은 COP1 또는 ATM 핵산 분자, 폴리펩티드 및/또는 그의 이소형, 변이체, 모방체, 상동체, 유사체, 또는 단편을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 p53, p21, 및 다른 핵산 분자, 폴리펩티드 및/또는 그의 이소형, 변이체, 모방체, 상동체, 유사체, 또는 단편을 이용한다.
COP1 화합물
본원에서 사용되는 "COP1 분자"는 COP1 폴리펩티드; COP1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; COP1 핵산 분자; 및 그의 이소형, 변이체, 모방체, 상동체, 유사체, 또는 단편에 실질적으로 동일한 분자를 의미한다. COP1 분자는 기탁 번호 AF5O894O (인간), AAH82804 (마우스), NP_036061 (마우스), NP_001001740 (인간, 이소형 d24), NP_071902 (인간, 이소형 a), XP_468011 (오리자 사티바 (Oryza sativa)), XP_468010 (오리자 사티바), XP_463866 (오리자 사티바), AAM34692 (인간), AAH39723 (인간), BAB45239 (인간), P_ABG08243 (인간), AAD51094 (마우스), AAN86553 (브라시카 라파 (Brassica rapa) 아종 페키넨시스 (Pekinensis)), CAA98718 (사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), CAA04168 (아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), XM_477896 (오리자 사티바), XM_479164 (오리자 사티바), BK000438 (인간), AF508940 (인간), AF151110 (마우스), L24437 (아라비돕시스 탈리아나), P_AAY60008 (인간), P_ABJ19398 (인간), P_ABB11576(인간), P_ABG95247 (인간), P_AAW74797 (인간), P_ABP69180 (인간), P_AAB92798 (인간), XP_064815 (인간), 및/또는 P_AAG02591 (인간)에 제시된 것과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 및 그의 이소형, 변이체, 모방체, 상동체, 유사체, 또는 단편을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. COP1 분자는 문헌 ([Bianchi et al.,6], [Wang et al., 7] 또는 [Yi et al., 19])에 기재된 분자일 수 있다.
"실질적으로 동일한" 서열은 단지 본원에서 논의되는 바와 같은 하나 이상의 보존적 치환에 의해서, 또는 아미노산 또는 핵산 분자의 생물학적 기능을 파괴하지 않는 서열의 위치에 존재하는 하나 이상의 비-보존적 치환, 결실, 또는 삽입에 의해서만 참조 서열과 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이다. 상기 서열은 예를 들어 Align Program18 또는 FASTA를 사용하여 아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서 최적으로 정렬될 때 비교를 위해 사용된 서열에 10% 내지 99% 중의 임의의 값, 또는 보다 일반적으로는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55% 또는 60%, 또는 적어도 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 96%, 97%, 98%, 또는 99%로 높은 수준으로 동일할 수 있다. 폴리펩티드의 경우, 비교 서열의 길이는 적어도 2, 5, 10, 또는 15개의 아미노산, 또는 적어도 20, 25, 또는 30개의 아미노산일 수 있다. 다른 실시태양에서, 비교 서열의 길이는 적어도 35, 40, 또는 50개의 아미노산, 또는 60, 80, 또는 100개 초과의 아미노산일 수 있다. 핵산 분자의 경우, 비교 서열의 길이는 적어도 5, 10, 15, 20, 또는 25개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 30, 40, 또는 50개의 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시태양에서, 비교 서열의 길이는 적어도 60, 70, 80, 또는 90개의 뉴클레오티드, 또는 100, 200, 또는 500개 초과의 뉴클레오티드일 수 있다. 서열 동일성은 공개적으로 입수가능한 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 미국 53705 위스콘신주 메디슨 유니버시티 애비뉴 1710에 소재한 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터 (University of Wisconsin Biotechnology Center)의 지네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group)의 Sequence Analysis Software Package; 또는 내셔널 라이브러리 오브 메디신 (National Library of Medicine)으로부터 입수가능한 BLAST 소프트웨어, 또는 본원에 기재된 소프트웨어)를 사용하여 쉽게 측정할 수 있다. 유용한 소프트웨어의 예는 프로그램 Pile-up 및 PrettyBox를 포함한다. 상기 소프트웨어는 상이한 치환, 결실, 치환, 및 다른 변형에 상동성 정도를 할당함으로써 유사한 서열을 매치시킨다. 실질적으로 동일한 서열은 상동성인 서열, 예를 들어 본원에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 비-인간 종으로부터의 COP1 관련 서열을 포함한다.
별법으로 또는 추가로, 2개의 핵산 서열은 고 엄격성 조건 하에 혼성화할 경우에 "실질적으로 동일할" 수 있다. 일부 실시태양에서, 고 엄격성 조건은 예를 들어 0.5 M NaHPO4, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA, 및 1% BSA (분획 V)를 포함하는 버퍼에서 65℃의 온도에서, 또는 48% 포름아미드, 4.8x SSC, 0.2 M Tris-Cl, pH 7.6, 1x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 0.1% SDS를 포함하는 버퍼에서 42℃의 온도에서 적어도 500개의 뉴클레오티드 길이의 DNA 프로브를 사용하여 발생하는 혼성화에 대등한 혼성화를 허용하는 조건이다 (상기 조건은 고 엄격성 노던 또는 서던 혼성화에 전형적인 조건이다). 혼성화는 약 20 내지 30분, 또는 약 2 내지 6시간, 또는 약 10 내지 15시간, 또는 24시간 또는 그 초과의 시간에 걸쳐 수행할 수 있다. 또한, 분자 생물학자에 의해 통상적으로 수행되는 수많은 기술, 예를 들어 고 엄격성 PCR, DNA 서열결정, 단일 가닥 입체형태 다형성 분석, 및 계내 (in situ) 혼성화의 성공을 위해 고 엄격성 혼성화에 의존하고 있다. 노던 및 서던 혼성화에 대조적으로, 상기 기술은 대체로 비교적 짧은 프로브 (예를 들어, 보통 PCR 또는 서열결정을 위해 약 16개 이상의 뉴클레오티드 또는 계내 혼성화를 위해 약 40개 이상의 뉴클레오티드)를 사용하여 수행한다. 상기 기술에서 사용된 고 엄격성 조건은 분자 생물학의 당업자에게 공지되어 있고, 그 예는 예를 들어 본원에 참고로 포함된 문헌 [Ausubel et al.]8에서 볼 수 있다.
일부 실시태양에서, 인간 COP1 분자는 기탁 번호 AF508940에 제시된 서열, 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시태양에서, 인간 COP1 핵산 분자는 다음 서열, 또는 그의 단편을 포함한다:
Figure 112008054668056-PCT00001
일부 실시태양에서, 인간 COP1 폴리펩티드는 다음 서열, 또는 그의 단편을 포함한다:
Figure 112008054668056-PCT00002
일부 실시태양에서, COP1 폴리펩티드는 인간 COP1 폴리펩티드의 아미노산 377-400, 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, COP1 펩티드는 서열 DSRTASQLDEFC, SRTASQ, RTASQ, TASQ, ASQ, SQLDE, SQLD, SQL, ASQL, TASQLD, RTASQLDE, 또는 SRTASQLDEF, 또는 이들과 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, COP1 펩티드는 3 내지 20개 중의 임의의 수의 아미노산 서열, 예를 들어 5개의 아미노산, 7개의 아미노산, 10개의 아미노산, 12개의 아미노산, 또는 15개의 아미노산을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않으며, 아미노산 서열은 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, COP1 폴리펩티드는 ATM 폴리펩티드에 직접 결합할 수 있거나, 또는 ATM 폴리펩티드에 의해 인산화될 수 있다. 일부 실시태양에서, COP1 폴리펩티드는 ATM에 의해 인산화될 수 있는 본원에서 제시된 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, COP1 폴리펩티드는 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 잔기 상에서 인산화된 또는 인산화될 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 서열은 예를 들어 도 6에 제시된다. 일부 실시태양에서, COP1 분자는 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 아미노산 잔기에서 구성적으로 인산화된 COP1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시태양에서, COP1 분자는 인산화가능한 아미노산 잔기 대신에 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387의 치환을 포함하는 COP1 폴리펩티드를 포함한다.
"인산화된" COP1 단백질 또는 폴리펩티드는 생체 내에서 인산화될 수 있는 임의의 아미노산 잔기 (예를 들어, 세린, 트레오닌, 티로신, 히스티딘) 상에서 번역후 변형된다. 본 발명의 맥락에서, 인산화된 COP1 폴리펩티드는 일반적으로 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387 (S387)에 상동성인 아미노산 잔기 상에서 인산화된다. "비인산화된" COP1 폴리펩티드는 예를 들어 잔기의 인산화될 수 없는 아미노산으로의 돌연변이에 의해, 생체 내에서 인산화될 수 있는 아미노산 잔기 상에서 인산화되지 않을 수 있다. 폴리펩티드 서열에서 세린의 알라닌으로의 돌연변이는 예를 들어 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 인산화될 수 없는 단백질을 생성시킨다. 인간 COP1 폴리펩티드의 위치 387에 상동성인 위치에서 세린 대신에 알라닌을 갖는 COP1 폴리펩티드는 상기 "비인산화된" COP1 폴리펩티드이다. 비인산화된 COP1 폴리펩티드는 또한 예를 들어 생체 내에서 S387 상에서 인산화될 수 있지만, 예를 들어, 키나제 억제제, 예를 들어 ATM 키나제 억제제와 같은 억제제의 존재에 의해; 인산화 부위를 방해하는 항체에 의해; 또는 포스파타제의 활성에 의해 인산화되지 않는 폴리펩티드일 수 있다. "구성적으로 인산화된" COP1 폴리펩티드는 예를 들어 생체 내에서 인산화될 수 있는 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 아미노산 잔기에서 돌연변이를 갖는 폴리펩티드로서, 상기 돌연변이는 그 아미노산 잔기에서의 인산화를 모방하고, 생성되는 폴리펩티드는 인산화된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 갖는다. 일반적으로, 인산화가능한 잔기의 글루탐산 또는 아스파르트산 잔기로의 돌연변이는 구성적 인산화를 야기한다. 일부 실시태양에서, 인산화된 또는 구성적으로 인산화된 COP1 펩티드는 서열 DSRTA(pS/T/Y/D/E)QLDEFC, SRTA(pS/T/Y/D/E)Q, RTA(pS/T/Y/D/E)Q, TA(pS/T/Y/D/E)Q, A(pS/T/Y/D/E)Q, (pS/T/Y/D/E)QLDE, (pS/T/Y/D/E)QLD, (pS/T/Y/D/E)QL, A(pS/T/Y/D/E)QL, TA(pS/T/Y/D/E)QLD, RTA(pS/T/Y/D/E)QLDE, SRTA(pS/T/Y/D/E)QLDEF를 가질 수 있고, 이로 제한되지 않으며, 여기서 "pS/T/Y/D/E"는 세린, 트레오닌, 또는 티로신 인산화, 또는 아스파르테이트 또는 글루타메이트 대신에 인산화가능한 세린의 치환을 의미한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물은 COP1 폴리펩티드의 모방체를 포함한다. 일반적으로, 모방 화합물은 COP1 폴리펩티드, 예를 들어 비인산화된 또는 인산화된 COP1 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기재된 펩티드에 실질적으로 동일한 COP1 폴리펩티드 또는 S387에 상동성인 아미노산 잔기 상에서 인산화된 COP1 폴리펩티드를 기초로 한 것이고, 예를 들어 펩티드-유사 2차 구조를 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 모방 화합물은 COP1 활성 또는 선택성을 증가시킬 수 있거나, 모방체 효과의 연장을 위해 감소된 분해 특징을 보일 수 있다. 모방 화합물은 작용제 또는 길항제 (억제제)일 수 있다. 모방 화합물은 예를 들어, 시클릭 펩티드, 펩티드 유사체, 속박된 (constrained) 펩티드, 스캐폴드 (scaffold) 모방체, 비-펩티드 모방체, 펩티드 핵산 등을 포함할 수 있다. 모방 화합물은 ATM 폴리펩티드에 0.001 pm 내지 1 μM, 예를 들어 적어도 500 nM, 10O nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM, 10 pM 등의 임의의 값의 결합 친화도로 결합할 수 있다. 모방 화합물은 분자량이 2000 Da 미만, 예를 들어, 1500 Da, 1000 Da, 또는 500 Da일 수 있다. 예시적인 COP1 모방 화합물은 "SQ" 모티프 내의 세린이 인산화된 또는 구성적으로 인산화된 화합물, 및/또는 펩티드 구조 또는 서열이 본원에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 바와 같이 변형되거나 화합물을 포함하여 서열 SRTASQ, RTASQ, TASQ, ASQ, SQLDE, SQLD, SQL, ASQL, TASQLD, RTASQLDE, SRT ASQLDEF를 포함하는 화합물을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물은 인산화된 COP1 분자 또는 인산화된 그의 단편을 모방하는 COP1 모방 화합물을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물은 COP1에, 예를 들어 인산화된 COP1, 예를 들어 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 아미노산 잔기 상에서 인산화된 COP1 펩티드에, 또는 서열 SRTASQ, RTASQ, TASQ, ASQ, SQLDE, SQLD, SQL, ASQL, TASQLD, RTASQLDE, SRTASQLDEF를 포함하는 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 시약 (예를 들어, 펩티보디 (peptibody))을 포함한다. 상기 항체는 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있거나, 인간화 항체일 수 있다. 상기 펩티보디는 면역글로불린 항체 (예를 들어, IgG1-4)의 Fc 부분에 부분에 융합된 COP1에 특이적으로 결합하는 펩티드일 수 있다. 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체 또는 다른 시약은 항원을 인식하여 결합하지만, 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하고 결합하지 않는다. 예를 들어, COP1 항체는 COP1 분자에 특이적으로 결합하지만, 암 세포 또는 조직, 또는 DNA 손상이 존재하는 세포에 존재하는 것과 같은 임의의 다른 분자에는 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 실시태양에서, COP1 항체 또는 다른 시약은 인간 COP1 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 다른 종으로부터의 COP1 분자에는 특이적으로 결합하지 않을 수 있다. 일부 실시태양에서, COP1 항체 또는 다른 시약은 인산화된 COP1 분자에 특이적으로 결합할 수 있지만, 비-인산화된 COP1 분자에는 특이적으로 결합하지 않을 수 있다. 일부 실시태양에서, COP1 항체 또는 다른 시약은 특정 아미노산 잔기, 예를 들어 인간 COP1 폴리펩티드의 S387 상에서 인산화된 COP1 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 다른 아미노산 잔기 상에서 인산화된 COP1 분자에는 특이적으로 결합하지 않을 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 시약은 예를 들어 항원에 대한 친화도가 샘플 내의 다른 참조 분자에 대한 항체 또는 시약의 친화도보다 적어도 10, 100, 1000 또는 10000배 더 크다.
일부 실시태양에서, COP1 분자는 COP1 폴리펩티드를 코딩하는 COP1 핵산 분자, 또는 COP1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 시약을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
다른 화합물
본원에서 사용되는 바와 같은 "혈관확장성 운동실조증 돌연변이된" 또는 "ATM 분자"는 ATM 폴리펩티드; ATM 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; ATM 핵산 분자; 및 그의 이소형, 단편, 상동체, 유사체, 또는 변이체에 실질적으로 동일한 분자이다. ATM 분자는 기탁 번호 Q13315 (인간), NM_007499 (마우스), NM_138292 (인간), NM_000051 (인간), NM_114689 (아라비돕시스 탈리아나), BC022307 (인간), BC061584 (인간), XM_777432 (성게), BC007023 (인간), XM_680015 (제브라피쉬 (zebrafish)), XM_236275 (래트), AAB65827 (인간) 등에 제시된 것과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, ATM 폴리펩티드는 활성화되고 키나제 활성을 갖는다. 일반적으로, ATM 폴리펩티드는 야생형 COP1 분자, 또는 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 아미노산 잔기 상에서 인산화될 수 있는 COP1 분자를 인산화시킬 수 있다. ATM 키나제 활성은 예를 들어 DNA 손상, 예를 들어, 이온화 방사선 조사, 또는 DNA 손상을 야기할 수 있는 화합물에 의해 생성시킬 수 있다. ATM 키나제 활성은 본원에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 바와 같이 평가할 수 있다. 일부 실시태양에서, ATM 분자는 COP1 분자에 결합하고/하거나 COP1 분자를 인산화시킬 수 있는 ATM 폴리펩티드, 또는 그의 단편을 포함한다.
"p53"은 393개의 아미노산의 인단백질을 코딩하는 효능있는 종양 억제제 단백질이다. p53은 많은 암에서 음조절되거나 돌연변이된다. p53의 부재 또는 불활성화는 암 발생의 원인이 될 수 있다. 매우 다양한 p53 돌연변이가 존재한다. "야생형" p53은 정상적인, 즉, 비-암성 세포에서 발견되는 p53, 또는 암에 상호관련되는 돌연변이를 갖지 않는 p53이다. 샘플의 p53 상태 (예를 들어, 샘플이 야생형 또는 돌연변이체 p53을 포함하는지의 여부)는 미국 특허 6,090,566 (Vogelstein et al.,)에 기재된 바와 같이 또는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 평가할 수 있다. p53 분자는 예를 들어 기탁 번호 P04637에 제시된 것과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
p21 또는 "WAF1/Cip1"은 처음에 사이클린-의존 키나제의 보편적인 억제제로 설명되었다. 이것은 p53-의존성 및 p53-비의존성 메카니즘 모두에 의해 유도되고, 세포 증식의 억제제로서 제시되었다.
폴리펩티드, 핵산 분자, 및 시험 화합물의 제조
예를 들어 목적하는 특징, 예를 들어 향상된 안정성 등을 갖는 생물학적으로 동등한 폴리펩티드를 얻기 위해서 펩티드의 생물학적 기능을 실질적으로 변경시키지 않으면서 폴리펩티드의 구조를 일부 변형 및 변경시킬 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 화합물은 또한 생물학적 기능에 영향을 주지 않는 아미노산 또는 다른 치환에 의해 본 발명의 COP1 폴리펩티드의 서열의 일부와 상이한 생물학적으로 동등한 펩티드 또는 모방체로 확장된다.
예를 들어, COP1 화합물은 예를 들어 COP1 펩티드 또는 펩티드 유사체 또는 모방체의 임의의 위치에서, 예를 들어 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 위치에서 아미노산 잔기를 다른 보존적 아미노산 잔기, 즉, 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387 대신에 유사한 물리적, 생물학적 또는 화학적 특성을 갖는 잔기, 예를 들어, 트레오닌, 글루타메이트 또는 아스파르테이트로, 또는 비-보존적 아미노산 잔기로 교체하거나 결실시키거나 삽입하고, 예를 들어 화합물이 ATM 폴리펩티드에 결합하거나, 또는 활성화된 ATM 폴리펩티드에 의해 인산화되거나, p53/COP1 복합체를 붕괴시키는 능력에 대해 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 상기 화합물은 본 발명의 임의의 진단, 치료제, 스크리닝 등의 방법에서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존된 아미노산 치환"은 펩티드의 제시된 위치에서 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 의미하고, 여기서 치환은 관련 기능을 실질적으로 상실시키지 않으면서 이루어질 수 있다. 상기 변경을 형성할 때, 가능한 아미노산 잔기의 치환은 측쇄 치환체의 상대적인 유사성, 예를 들어, 그들의 크기, 전하, 소수도, 친수도 등을 기초로 하여 이루어질 수 있고, 상기 치환은 통상적인 시험에 의해 펩티드의 기능에 대한 그의 효과에 대해 분석될 수 있다. 일부 실시태양에서, 보존된 아미노산 치환은 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 아미노산 잔기를 인산화가능한 아미노산, 예를 들어 트레오닌 또는 티로신으로, 또는 인산화 모방체, 예를 들어 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 천연 단백질에서 통상 발견되는 L-아미노산, D-아미노산 및 변형된 상기 아미노산을 의미한다. 따라서, 본 발명의 아미노산은 예를 들어 2-아미노아디프산; 3-아미노아디프산; 베타-알라닌; 베타-아미노프로피온산; 2-아미노부티르산; 4-아미노부티르산; 피페리딘산; 6-아미노카프로산; 2-아미노헵탄산; 2-아미노이소부티르산; 3-아미노이소부티르산; 2-아미노피멜산; 2,4 디아미노부티르산; 데스모신; 2,2'-디아미노피멜산; 2,3-디아미노프로피온산; N-에틸글리신; N-에틸아스파라긴; 히드록시리신; 알로-히드록시리신; 3-히드록시프롤린; 4-히드록시프롤린; 이소데스모신; 알로-이소류신; N-메틸글리신; 사르코신; N-메틸이소류신; 6-N-메틸리신; N-메틸발린; 노르발린; 노르류신; 및 오르니틴을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 아미노산 잔기가 유사한 친수성 값 (예를 들어, ± 2.0, 또는 ± 1.5, 또는 ± 1.0, 또는 ± 0.5 내)을 갖는 다른 아미노산 대신에 치환된 보존된 아미노산 치환이 이루어질 수 있고, 여기서 히드로파틱 지수 (hydropathic index)가 약 -1.6인 아미노산, 예를 들어 Tyr (-1.3) 또는 Pro (-1.6)일 수 있고, 아미노산 잔기에게 다음과 같은 값이 부여된다 (본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,554,101에 상세히 기재된 바와 같이): Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); Ile (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); 및 Trp (-3.4).
별도의 실시태양에서, 아미노산 잔기가 유사한 히드로파틱 지수 (예를 들어, ± 2.0, 또는 ± 1.5, 또는 ± 1.0, 또는 ± 0.5 내)를 갖는 다른 아미노산 대신에 치환된 보존된 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 상기 실시태양에서, 각각의 아미노산 잔기에는 그의 소수성 및 전하 특징을 기초로 하여 다음과 같은 히드로파틱 지수가 부여될 수 있다: Ile (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); 및 Arg (-4.5).
별도의 실시태양에서, 보존적 아미노산 치환은 공개적으로 입수가능한 유사성 매트릭스의 패밀리를 사용하여 이루어질 수 있다23 -29. PAM 매트릭스는 진화 모델로부터 유도된 카운트 (count)를 기초로 하는 반면에, Blosum 매트릭스는 정렬 내의 고도로 보존된 블록으로부터 유도된 카운트를 이용한다. PAM 또는 Blosum 매트릭스에서 0 초과의 유사성 스코어를 사용하여 보존적 아미노산 치환을 형성할 수 있다.
별도의 실시태양에서, 아미노산 잔기가 동일한 클래스의 다른 아미노산 잔기 대신에 치환된 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산은 다음과 같이 비-극성, 산성, 염기성 및 중성 클래스로 분류된다: 비-극성: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; 산성: Asp, Glu; 염기성: Lys, Arg, His; 중성: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.
보존적 아미노산 변화는 대응하는 D-아미노산에 의한, 보존적 D-아미노산에 의한, 또는 유전자에 의해 코딩되지 않는 천연 형태의 아미노산에 의한 L-아미노산의 치환, 및 L-아미노산의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 유전자에 의해 코딩되지 않는 천연 아미노산은 베타-알라닌, 3-아미노-프로피온산, 2,3-디아미노 프로피온산, 알파-아미노이소부티르산, 4-아미노-부티르산, N-메틸글리신 (사르코신), 히드록시프롤린, 오르니틴, 시트룰린, t-부틸알라닌, t-부틸글리신, N-메틸이소류신, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, 노르류신, 노르발린, 2-나프틸알라닌, 피리딜알라닌, 3-벤조티에닐 알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 페니실라민, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 베타-2-티에닐알라닌, 메티오닌 술폭시드, 호모아르기닌, N-아세틸 리신, 2-아미노 부티르산, 2-아미노 부티르산, 2,4-디아미노 부티르산, p-아미노페닐알라닌, N-메틸발린, 호모시스테인, 호모세린, 시스테인산, 엡실론-아미노 헥산산, 델타-아미노 발레르산, 또는 2,3-디아미노부티르산을 포함한다.
별도의 실시태양에서, 보존적 아미노산 변화는 친수성 또는 소수성, 크기 또는 부피, 또는 전하와 같은 고려사항을 기초로 한 변화를 포함한다. 아미노산은 일반적으로 주로 아미노산 측쇄의 특성에 따라 소수성 또는 친수성으로 특성화할 수 있다. 소수성 아미노산은 문헌 [Eisenberg et al.30]의 정규화된 컨센서스 (normalized consensus) 소수성 규모를 기초로 하여 0 초과의 소수성을 보이고, 친수성 아미노산은 0 미만의 친수성을 보인다. 유전자에 의해 코딩되는 소수성 아미노산은 Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Met 및 Trp을 포함하고, 유전자에 의해 코딩되는 친수성 아미노산은 Thr, His, Glu, Gln, Asp, Arg, Ser, 및 Lys을 포함한다. 유전자에 의해 코딩되지 않는 소수성 아미노산은 t-부틸알라닌을 포함하는 한편, 유전자에 의해 코딩되지 않는 친수성 아미노산은 시트룰린 및 호모시스테인을 포함한다.
소수성 또는 친수성 아미노산은 그들의 측쇄의 특징을 기초로 하여 추가로 하위 분류될 수 있다. 예를 들어, 방향족 아미노산은 하나 이상의 치환체, 예를 들어 -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR 등 (여기서, R은 독립적으로 (C1-C6) 알킬, 치환된 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알케닐, 치환된 (C1-C6) 알케닐, (C1-C6) 알키닐, 치환된 (C1-C6) 알키닐, (C5-C20) 아릴, 치환된 (C5-C20) 아릴, (C6-C26) 알크아릴, 치환된 (C6-C26) 알크아릴, 5-20원 헤테로아릴, 치환된 5-20원 헤테로아릴, 6-26원 알크헤테로아릴 또는 치환된 6-26원 알크헤테로아릴임)을 포함할 수 있는 적어도 하나의 방향족 또는 이종방향족 고리를 포함하는 측쇄를 갖는 소수성 아미노산이다. 유전자에 의해 코딩되는 방향족 아미노산은 Phe, Tyr 및 Trp을 포함하고, 유전자에 의해 코딩되지 않는 방향족 아미노산은 페닐글리신, 2-나프틸알라닌, 베타-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌-3-플루오로페닐알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다.
비극성 아미노산은, 2개의 원자에 의해 공통적으로 공유되는 한 쌍의 전자가 일반적으로 2개의 원자 각각에 의해 균등하게 유지되는 결합을 갖고 (즉, 측쇄는 극성이 아니다) 생리학적 pH에서 비대전되는 측쇄를 갖는 소수성 아미노산이다. 유전자에 의해 코딩되는 무극성 아미노산은 Gly, Leu, Val, Ile, Ala, 및 Met를 포함하는 반면, 유전자에 의해 코딩되지 않는 무극성 아미노산은 시클로헥실알라닌을 포함한다. 무극성 아미노산은 지방족 탄화수소 측쇄를 갖는 소수성 아미노산인 지방족 아미노산을 포함하도록 추가로 하위 분류될 수 있다. 유전자에 의해 코딩되는 지방족 아미노산은 Ala, Leu, Val, 및 Ile을 포함하는 한편, 유전자에 의해 코딩되지 않는 지방족 아미노산은 노르류신을 포함한다.
극성 아미노산은, 2개의 원자에 의해 공통적으로 공유되는 전자쌍이 원자의 하나에 보다 근접하게 유지되는 하나의 결합을 갖고 생리학적 pH에서 비대전되는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산이다. 유전자에 의해 코딩되는 극성 아미노산은 Ser, Thr, Asn, 및 Gln을 포함하는 한편, 유전자에 의해 코딩되지 않는 극성 아미노산은 시트룰린, N-아세틸 리신, 및 메티오닌 술폭시드를 포함한다.
산성 아미노산은 측쇄 pKa 값이 7 미만인 친수성 아미노산이다. 산성 아미노산은 일반적으로 수소 이온의 상실에 의해 생리학적 pH에서 음 대전된 측쇄를 갖는다. 유전자에 의해 코딩되는 산성 아미노산은 Asp 및 Glu을 포함한다. 염기성 아미노산은 측쇄 pKa 값이 7 초과인 친수성 아미노산이다. 염기성 아미노산은 일반적으로 히드로늄 이온과의 회합에 의해 생리학적 pH에서 양 대전된 측쇄를 갖는다. 유전자에 의해 코딩되는 염기성 아미노산은 Arg, Lys, 및 His을 포함하고, 유전자에 의해 코딩되지 않는 염기성 아미노산은 비-시클릭 아미노산 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산, 및 호모아르기닌을 포함한다. 당업자는 상기 분류가 절대적이지 않으며, 아미노산이 2 이상의 범주로 분류될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 아미노산은 알려진 거동 및/또는 특정 분석을 기초로 하거나 기확인된 아미노산과 비교하여 특징적인 화학적, 물리적, 또는 생물학적 특성을 기초로 하여 분류할 수 있다. 아미노산은 또한 아미노산-유사 측쇄를 갖는 2관능성 모이어티 (moiety)를 포함할 수 있다.
보존적 변화는 또한 예를 들어 아미노산의 관능성 측쇄기의 반응에 의해 비-유도체화된 잔기 대신에 화학적으로 유도체화된 모이어티의 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 치환은 그의 유리 아미노기가 아민 히드로클로라이드, p-톨루엔 술포닐기, 카르보벤즈옥시기, t-부틸옥시카르보닐기, 클로로아세틸기 또는 포르밀기로 유도체화된 화합물을 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 유리 카르복실기는 유도체화되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 종류의 에스테르 또는 히드라지드를 형성할 수 있고, 측쇄는 유도체화되어 유리 히드록실기에 대해 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성하거나 또는 히스티딘의 이미다졸 질소에 대해 N-im-벤질히스티딘을 형성할 수 있다. 펩티드 유사체 또는 모방체는 또한 예를 들어 메틸화, 알킬아민, 예를 들어 에틸아민, 에탄올아민, 또는 에틸렌 디아민에 의한 C-말단 아미노산의 아미드화, 또는 아미노산 측쇄의 아실화 또는 메틸화 (예를 들어 리신의 엡실론 아미노기의 아실화)에 의해 화학적으로 변경된 아미노산을 포함한다. 또한, 펩티드 유사체 또는 모방체는 펩티드의 아미드 연결을 치환된 아미드 (예를 들어, 화학식 -C(O)-NR의 기, 여기서 R은 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알케닐, (C1-C6) 알키닐, 치환된 (C1-C6) 알킬, 치환된 (C1-C6) 알케닐, 또는 치환된 (C1-C6) 알키닐) 또는 아미드 연결의 동배체 (isostere) (예를 들어, -CH2NH-, -CH2S, -CH2CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -C(O)CH2-, -CH(OH)CH2-, 또는 -CH2SO-)임)로 대체하는 것을 포함할 수 있다.
화합물은 예를 들어 중합 또는 컨쥬게이션에 의해 공유 연결되어 단일중합체 또는 이종중합체를 형성할 수 있다. 일반적으로 작은 중성 분자, 예를 들어 생리학적 조건 하에 대전되지 않는 아미노산으로 이루어진 스페이서 및 링커를 사용할 수 있다. 연결은 많은 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기가 펩티드 말단에 첨가될 수 있고, 여러 펩티드가 제어된 산화에 의해 공유결합될 수 있다. 별법으로, 이종2관능성 물질, 예를 들어 디술피드/아미드 형성제 또는 티오에테르/아미드 형성제를 사용할 수 있다. 또한, 화합물은 예를 들어 암세포 또는 DNA 손상이 존재하는 세포를 표적화하거나 또는 암세포 또는 DNA 손상이 존재하는 세포의 성장 또는 증식을 억제하거나, 또는 암세포 또는 DNA 손상이 존재하는 세포의 사멸을 유도할 수 있는 다른 화합물에 연결될 수 있다. 화합물은 예를 들어 시클릭 부분을 보유함으로써 속박될 수 있다.
펩티드 또는 펩티드 유사체 또는 모방체는 표준 화학적 기술, 예를 들어 용액 또는 고체상 합성 방법을 사용한 자동화 합성에 의해 합성될 수 있다. 자동화 펩티드 합성기는 상업적으로 입수가능하고, 당업계에 공지된 기술을 이용한다. 펩티드 및 펩티드 유사체 또는 모방체는 또한 예를 들어 문헌 [Sambrook, et al.31] 또는 [Ausubel et al.8]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 COP1 또는 ATM 핵산 분자 또는 그의 단편에 실질적으로 동일하거나 COP1 또는 ATM 핵산 분자 또는 그의 단편에 상보성인 핵산 분자를 포함한다. 상기 핵산 분자는 예를 들어 프로브 또는 프라이머로서 본 발명의 분석 및 방법에 사용될 수 있다. "프로브" 또는 "프라이머"는 상보성 서열 (표적)을 포함하는 제2 DNA 또는 RNA 분자에 염기쌍을 형성할 수 있는 규정된 서열의 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자이다. 생성되는 하이브리드 분자의 안정성은 발생하는 염기쌍의 정도에 의존하고, 프로브와 표적 분자 사이의 상보성 정도, 및 혼성화 조건의 엄격성 정도와 같은 파라미터에 의해 영향받는다. 혼성화 엄격성 정도는 온도, 염 농도, 및 유기 분자, 예를 들어 포름아미드의 농도와 같은 파라미터에 의해 영향받고, 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정된다. 본원에 기재된 핵산 서열, 또는 그의 일부에 특이적인 프로브 또는 프라이머의 길이는 프로브 또는 프라이머가 사용되는 목적 및 조건에 따라 적어도 8개의 뉴클레오티드로부터 500개 초과의 뉴클레오티드까지, 그 사이의 임의의 값을 포함하는 임의의 정수일 수 있다. 예를 들어, 프로브 또는 프라이머는 8, 10, 15, 20, 또는 25개 뉴클레오티드 길이일 수 있거나, 또는 적어도 30, 40, 50, 또는 60개 뉴클레오티드 길이일 수 있거나, 또는 100, 200, 500, 또는 1000개 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본원에서 설명되는 핵산 분자에 특이적인 프로브 또는 프라이머는 본원에서 설명되는 핵산 분자에 20-30% 초과의 서열 동일성, 또는 적어도 55-75%의 서열 동일성, 또는 적어도 75-85%의 서열 동일성, 또는 적어도 85-99%의 서열 동일성, 또는 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
프로브 또는 프라이머는 예를 들어 증폭에 의해 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 또는 클로닝된 DNA 세그먼트로부터 유도될 수 있고, 단일 개체로부터의 단일 유전자의 전부 또는 일부를 나타내는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열을 포함할 수 있다. 프로브는 특유한 서열 (예를 들어, COP1 또는 ATM 핵산 분자에 대해 100% 동일)을 가질 수 있고/있거나 공지의 서열을 가질 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 화학적으로 합성될 수 있다.
프로브 또는 프라이머는 당업자에게 공지된 방법에 의해 방사능에 의해 또는 비-방사능에 의해 검출가능하게 표지될 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 핵산 혼성화를 수반하는 방법, 예를 들어 핵산 서열결정, 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 핵산 증폭, 단일 가닥 입체형태 다형성 (SSCP) 분석, 제한 단편 다형성 (RFLP) 분석, 서던 혼성화, 노던 혼성화, 계내 혼성화, 전기영동 이동도 전환 분석 (EMSA), 및 당업자에게 공지된 다른 방법에 사용될 수 있다.
또한, 핵산 분자는 세포에서 표적 분자의 발현을 저하시키기 위해 사용될 수 있는 안티센스 분자, siRNA 분자, 또는 삼중 나선 분자일 수 있다.
일부 실시태양에서, 시험 화합물은 유기 소분자를 포함한다. "유기 소분자"는 분자량이 약 50 달톤 초과 및 약 2500 달톤 미만, 바람직하게는 약 2000 달톤 미만, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 1000 달톤, 보다 더 바람직하게는 약 200 내지 약 500 달톤인 천연 또는 합성 유기 분자를 의미한다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 COP1/ATM 상호작용, 예를 들어, 인산화 또는 결합을 매개할 수 있는 펩티드, 핵산 분자, 모방체 또는 소분자, 항체 또는 다른 시약을 포함한다.
후보 또는 시험 화합물은 당업계에 공지된 방법에 따라 천연 산물 또는 합성 (또는 반-합성) 추출물의 큰 라이브러리 또는 화학적 라이브러리로부터 확인할 수 있다. 의약 발견 및 개발 분야의 당업자는 시험 추출물 또는 화합물의 정확한 공급원이 본 발명의 방법(들)에 중요하지 않음을 이해할 것이다. 따라서, 실질적으로 임의의 수의 화학 추출물 또는 화합물을 본원에 기재된 예시적인 방법에 따라 스크리닝할 수 있다. 상기 추출물 또는 화합물의 예는 식물-, 진균-, 원핵세포- 또는 동물-계 추출물, 발효 브로쓰 (broth), 및 합성 화합물, 및 존재하는 화합물의 변형체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 사카라이드-, 지질-, 펩티드-, 및 핵산-계 화합물을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 수의 화합물의 무작위 또는 유도된 합성 (예를 들어, 반-합성 또는 완전 합성)을 위해 많은 방법을 이용할 수 있다. 합성 화합물 라이브러리는 상업적으로 입수가능하다. 별법으로, 세균, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리는 바이오틱스 (Biotics, 영국 석세스), 제노바 (Xenova, 영국 슬로우), 하버 브랜치 오셔노그래픽 인스티튜트 (Harbor Branch Oceanographic Institute, 미국 플로리다주 포트 피어스), 및 파마마르 (PharmaMar, 미국 매사추세츠주)와 같은 많은 공급처로부터 상업적으로 입수가능하다. 또한, 천연 및 합성 생산된 라이브러리는 필요한 경우 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 표준 추출 및 분획화 방법에 의해 생산한다. 또한, 필요한 경우, 임의의 라이브러리 또는 화합물은 표준 화학적, 물리적, 또는 생화학적 방법을 사용하여 쉽게 변형된다.
조 추출물이 예를 들어 COP1/ATM 상호작용을 증가시키는 것으로 밝혀진 경우, 관찰된 효과에 작용하는 화학 성분을 분리하기 위해 양성 선도 추출물의 추가의 분획화가 필요하다. 따라서, 추출, 분획화, 및 정제 과정의 목적은 COP1/ATM 상호작용 증가 활성을 갖는 조 추출물 내의 화학적 물질의 철저한 특성화 및 확인이다. 화합물의 혼합물에서 활성을 검출하기 위한 본원에 기재된 바와 동일한 분석을 사용하여 활성 성분을 정제하고 그의 유도체를 시험할 수 있다. 상기 분균일 추출물의 분획화 및 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다. 필요한 경우, 치료에 유용한 물질로 밝혀진 화합물은 당업계에 공지된 방법에 따라 화학적으로 변형된다. 치료, 예방, 진단, 또는 다른 가치가 있는 것으로 확인된 화합물은 예를 들어 암 또는 방사선 손상에 대한 임의의 동물 모델을 사용하여 후속적으로 분석할 수 있다.
진단, 치료, 예방 및/또는 스크리닝 용도, 분석, 및 시약
본 발명에 따른 화합물, 조성물 (예를 들어, 제약 조성물), 및 방법은 DNA 손상을 진단 또는 검출하기 위해, 대상에서 DNA 손상에 대한 반응 및/또는 p53 활성을 조절하기 위해, 또는 대상에서 DNA 손상에 대한 반응 및/또는 p53을 조절하기에 유용한 시험 화합물을 스크리닝 또는 확인하기 위해 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상은 인간, 비-인간 영장류, 래트, 마우스, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 파리, 벌레 등일 수 있다. 대상은 임상 환자, 임상 시험 자원자, 실험 동물 등일 수 있다. 대상은 암 또는 DNA 손상이 존재하거나 발생할 위험이 있는 것으로 의심되거나, 암 또는 DNA 손상으로 진단되었거나, 또는 암 또는 DNA 손상이 존재하지 않는 것으로 확인된 대조 대상이거나, 또는 DNA 손상 또는 암이 유도된 대상일 수 있다. 한 바람직한 실시태양에서, 대상은 인간이다.
본원에서 논의되는 바와 같이, DNA 손상은 COP1 발현 수준의 감소를 측정하거나 또는 COP1 인산화를 측정함으로써 진단 또는 검출될 수 있고, 여기서 COP1 발현의 감소는 DNA 손상을 나타내고, 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 아미노산 상의 COP1 인산화의 존재는 DNA 손상을 나타낸다.
"검출"은 물질의 존재 또는 부재의 결정 또는 물질의 양의 정량을 포함하고자 한 것이다. 따라서, 상기 용어는 정량적 및 정성적 결정을 위한 본 발명의 화합물, 조성물, 및 방법의 용도를 의미한다. 일반적으로, 검출을 위해 사용된 특정 기술은 본 발명의 실시에 중요하지 않다. 예를 들어, 본 발명에 따른 "검출"은 당업계에 공지되거나 아래에서 설명되는 방법을 사용하여, 예를 들어 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 아미노산 잔기에서 COP1 폴리펩티드의 인산화의 변경; COP1, ATM, p21, 또는 p53 유전자, 게놈, 또는 핵산 분자 또는 COP1, ATM, p21, 또는 p53 폴리펩티드의 존재 또는 부재; COP1, ATM, p21, 또는 p53 유전자의 돌연변이; COP1, ATM, p21, 또는 p53 핵산 분자, 예를 들어 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준의 변경; COP1 폴리펩티드의 생물학적 기능/활성 (예를 들어, COP1 리가제 활성, p53 전환, p53-의존성 트랜스액티베이션 활성의 억제) 또는 p53 폴리펩티드의 생물학적 기능/활성 (예를 들어, p53 결합, p53-의존성 트랜스액티베이션, COP1 결합, p21의 트랜스액티베이션 등)의 변경의 검출을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, "검출"은 야생형 p53의 검출을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, "검출"은 돌연변이체 p53의 검출을 포함할 수 있다. 검출은 대조군에 비해 10% 내지 90%의 임의의 값, 또는 30% 내지 60%의 임의의 값, 또는 100% 초과의 변경 (증가 또는 감소)을 정량하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 대조군에 비해 2배 내지 10배의 임의의 값, 예를 들어, 3배, 5배, 7배, 또는 이를 초과하는 값, 예를 들어, 50배 또는 100배의 변경을 정량하는 것을 포함할 수 있다.
반응의 "증가", 또는 상호작용, 예를 들어, 결합 또는 인산화의 증가는 대조군에 비해 10% 내지 90%의 임의의 값, 또는 30% 내지 60%, 또는 100% 초과의 수준으로 반응 또는 상호작용을 촉진하거나, 또는 기존재하는 반응 또는 상호작용을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 증가는 대조군에 비해 2배 내지 10배의 임의의 값, 예를 들어, 3배, 5배, 7배, 또는 이를 초과하는 값, 예를 들어, 50배 또는 100배의 증가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 "증가"는 당업계에 공지되거나 아래에서 설명되는 방법을 사용하여, 예를 들어 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 아미노산 잔기에서 COP1 폴리펩티드의 인산화의 변경; COP1, ATM, p21, 또는 p53 핵산 분자, 예를 들어 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준의 변경; COP1 폴리펩티드의 생물학적 기능/활성 (예를 들어, COP1 리가제 활성, p53 전환, p53-의존성 트랜스액티베이션 활성의 억제) 또는 p53 폴리펩티드의 생물학적 기능/활성 (예를 들어, p53 결합, p53-의존성 트랜스액티베이션, COP1 결합, p21의 트랜스액티베이션 등)의 변경의 증가 또는 촉진을 포함할 수 있다.
발현의 "감소"는 대조군과 비교하여, 예를 들어 실질적인 DNA 손상이 존재하지 않는 세포에 의해서 정상적으로 생산되는 발현 수준에 비해, 특정 분자, 예를 들어 COP1의 폴리펩티드 발현의 감소를 의미한다. 또한, COP1 분자의 발현 감소를 보이는 세포는 p53 분자 (예를 들어, p53 폴리펩티드)의 증가된 발현 또는 p21 분자 (예를 들어, p21 mRNA)의 증가된 발현, 또는 증가된 p53 또는 p21 활성을 보일 수 있다. 상기 증가 또는 감소는 대조군에 비해 10% 내지 90%의 임의의 값, 또는 30% 내지 60%의 임의의 값, 또는 100% 초과일 수 있거나, 또는 대조군에 비해 2배 내지 10배의 임의의 값, 예를 들어, 3배, 5배, 7배, 또는 이를 초과하는 값, 예를 들어, 50배 또는 100배의 변경일 수 있다. 과다발현 또는 증가, 또는 감소 또는 저하의 정확한 양은 과다발현 또는 감소가 통계적으로 유의하다면 중요하지 않다.
"대조군"은 기준선 발현 또는 활성을 결정할 때 사용하기 위해 얻은 샘플을 포함한다. 따라서, 대조군 샘플은 예를 들어 DNA 손상 (표준 기술에 의해 결정됨)이 존재하지 않는 세포; 비-암성 세포 또는 조직, 예를 들어 대상의 종양 또는 암성 세포를 둘러싸는 세포; 암 또는 DNA 손상 질환을 갖지 않는 대상; 암 또는 DNA 손상이 발생할 위험이 존재하는 것으로 의심되지 않는 대상; 또는 상기 대상으로부터 유도된 세포 또는 세포주로부터 많은 수단에 의해 얻을 수 있다. 또한, 대조군은 기확립된 표준물질을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따라 수행되는 임의의 시험 또는 분석은 확립된 표준물질과 비교할 수 있고, 매번 비교를 위한 대조군 샘플을 얻을 필요가 없다. 시험관 내 유비퀴틴화 분석에서, 대조군은 p53 분자를 유비퀴틴화하는 능력이 감소된 COP1 분자 (예를 들어, 그의 리가제 도메인에 결함이 있는 분자, 예를 들어 COP1ΔRing)일 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 키나제 분석에서, 대조군은 키나제 활성이 제거된 ATM, 인산화되는 것으로 알려져 있거나 또는 인산화가능하지 않은 COP1 분자 등일 수 있다.
본 발명에 따른 시약은 본원에 기재된 화합물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물을 포함하는 세포, 예를 들어, 포유동물 세포를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 세포은 재조합 ATM, 재조합 COP1 및/또는 재조합 p53 분자를 포함하도록 예를 들어 재조합 기술에 의해 공학처리될 수 있다. 상기 포유동물 세포는 예를 들어 COP1/ATM 상호작용 (예를 들어, 결합 및/또는 인산화)을 증가시키거나, p53/COP1 결합을 붕괴시키거나 또는 p53 또는 COP1 활성을 증가시키는 시험 화합물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 상기 세포는 시험 화합물과 함께 인큐베이팅되고, 세포 주기, ATM 키나제 활성, p21 발현, p53 유도 아폽토시스, p53 의존성 트랜스액티베이션, COP1 리가제 활성 등의 변경에 대해 분석될 수 있다. 리포터 기반 구성체, 예를 들어 p21-루시퍼라제는 배경으로서의 내부 Renilla 루시퍼라제 리포터 및 실시간 RT-PCR 기술과 함께 사용될 수 있다. 상기 포유동물 세포는 예를 들어 COP1 분자, ATM 분자 또는 p53 분자를 발현하도록 공학처리될 수 있는 p53 야생형 세포주 (U2-OS 세포), p53 부재 세포주 (H1299), ATM 부재 세포주 (GM02052 또는 GM09607)와 같은 기존의 세포주에서 공학처리될 수 있다. 따라서, COP1 또는 ATM 분자는 A-T 세포, 암세포, 조직, 또는 세포 용해물에 제공될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 세포 및/또는 세포주는 상업적인 공급처, 예를 들어, ATCC (미국 버지니아주 매나서스)로부터 입수할 수 있다.
본 발명에 따른 분석은 표준 공급원으로부터 입수한 샘플을 사용하여 표준 과정에 의해 생체 내에서, 시험관 내에서, 또는 생체 외에서 수행할 수 있다. 마이크로어레이 (microarray), 예를 들어 조직 마이크로어레이를 사용할 수 있다. 생체 내 분석은 예를 들어 잭슨 래보래토리 (Jackson Laboratory, 미국 메인주 바 하버)로부터 입수할 수 있는 암 또는 DNA 손상에 적합한 동물 모델에서 수행할 수 있다.
일부 실시태양에서, ATM, COP1 또는 p53 발현 또는 활성에 결함이 있는 동물 모델을 사용할 수 있다. "샘플"은 대상으로부터 단리된 임의의 장기, 조직, 세포, 또는 세포 추출물, 예를 들어 암 또는 DNA 손상이 존재하는 포유동물로부터 단리된 샘플일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 환자 (인간 또는 동물), 시험 대상, 또는 실험 동물로부터 얻은, 뼈, 뇌, 유방, 결장, 근육, 신경, 난소, 전립선, 망막, 피부, 골격근, 내장, 고환, 심장, 간, 신장, 위, 췌장, 자궁, 부신, 편도, 비장, 연조직, 말초혈, 전혈, 적혈구 농축물, 혈소판 농축물, 백혈구 농축물, 혈액 세포 단백질, 혈장, 혈소판-풍부 혈장, 혈장 농축물, 혈장의 임의의 분획화로부터의 침전물, 혈장의 임의의 분획화로부터의 상등액, 혈장 단백질 분획, 정제된 또는 부분 정제된 혈액 단백질 또는 다른 성분, 혈청, 정액, 포유동물 초유, 젖, 소변, 대변, 타액, 뇌척수액, 심막액, 복막액, 태반 추출물, 양수, 동결침전물, 동결상등액, 세포 용해물, 포유동물 세포 배양액 또는 배양 배지, 발효 산물, 복수, 혈액 세포에 존재하는 단백질, 고형 종양, 또는 임의의 다른 표본, 또는 그의 임의의 추출물로부터의 세포 또는 조직 (예를 들어, 생검 또는 부검으로부터)을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 샘플에서 암성 세포를 비암성 세포로부터, 또는 DNA 손상이 존재하는 세포를 비손상 세포로부터 분리하는 것이 바람직할 수 있다.
샘플은 또한 정상적인 또는 형질전환된 세포 (예를 들어, 재조합 DNA 또는 모노클로날 항체 기술을 통한)에 의해 세포 배양액에 생산된 생성물을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 샘플은 또한 비-포유동물 대상, 예를 들어 곤충 또는 벌레로부터 단리된 임의의 장기, 조직, 세포, 또는 세포 추출물을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 또한, "샘플"은 대상으로부터 직접 단리되지 않은, 실험 조건 하에서 생성된 세포 또는 세포주일 수 있다. 또한, 샘플은 세포가 존재하지 않거나, 인공적으로 유도되거나 합성된 것일 수 있다. 샘플은 암성이거나 또는 DNA 손상이 존재하는 것으로 알려져 있거나, 암성이거나 또는 DNA 손상이 존재하는 것으로 의심되거나, 또는 암성이 아니거나 또는 DNA 손상을 갖지 않는 것으로 생각되는 (예를 들어, 정상적인 또는 대조군) 세포 또는 조직으로부터 유도될 수 있다.
COP1, p53, 또는 ATM 핵산 분자 또는 폴리펩티드 발현 또는 활성, 또는 COP1/ATM 또는 COP1/p53 결합은 면역조직화학 (IHC), 계내 혼성화 (ISH), 노던 블로팅, 폴리머라제 연쇄 반응 (예를 들어, 실시간 정량적 PCR 또는 RT-PCR), 항체 기반 분석, 예를 들어 면역침전, 면역형광, 웨스턴 블로팅 등을 포함하는 많은 기술을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 샘플로부터 유도된 PCR 산물의 서열결정, 단일 가닥 입체형태 다형성 (SSCP) 분석, 또는 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석과 같은 방법을 사용하여 COP1 또는 p53 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있고; 면역침전, RIA, ELISA 또는 웨스턴 블로팅을 사용하여 COP1 또는 ATM 또는 p53 폴리펩티드의 수준 또는 결합을 측정할 수 있고; 노던 블로팅은 COP1 또는 p53 mRNA 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있고, 또는 PCR은 COP1 또는 ATM 또는 p53 핵산 분자의 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 분석은 전구체, 단편 (예를 들어, 세포질내 단백질 분해에 의해 생성됨), 번역후 변형된 형태 등을 포함하는 임의의 또는 모든 형태의 COP1 또는 ATM 또는 p53의 검출을 포함한다. 본 발명의 방법은 COP1 관련 생물학적 활성, 예를 들어 자가-유비퀴틴화, p53 분해, p53의 유비퀴틴화, p53 트랜스액티베이션의 억제, p53 유도 아폽토시스의 억제, p21 mRNA의 감소 등에 대한 분석을 포함한다. 본 발명의 방법은 ATM 관련 생물학적 활성, 예를 들어 키나제 활성의 분석을 포함한다.
일부 실시태양에서, 대상의 세포는 생체 내에서, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의로 검출가능하게 표지된 항체 (예를 들어, COP1 항체, 및 임의로, ATM 또는 p53 항체)에 노출될 수 있고, 항체의 세포에 대한 결합은 예를 들어 방사능의 외부 스캐닝 또는 생검의 분석에 의해 평가할 수 있다. 분석은 검출가능하게 표지된 분자, 즉, 분자의 존재를 표시하고 확인하기 위한 임의의 수단, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머, 유전자 또는 그의 단편, 펩티드, 또는 cDNA 분자를 사용하여 수행할 수 있다. 분자를 검출가능하게 표지하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 방사성 표지 (예를 들어, 동위원소, 예를 들어 32P 또는 35S) 및 비방사성 표지, 예를 들어 효소 표지 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제), 화학발광 표지, 형광 표지 (예를 들어, 플루오레세인), 생체 발광 표지, 또는 프로브에 부착된 리간드의 항체 검출을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 상기 정의에는 간접 수단에 의해 검출가능하게 표지된 분자, 예를 들어 관찰되거나 분석될 수 있는 제2 모이어티 (예를 들어 플루오레세인-표지된 스트렙타비딘)에 결합된 제1 모이어티 (예를 들어, 비오틴)에 결합된 분자가 포함된다. 표지는 또한 디곡시게닌, 루시퍼라제, 및 아에쿠오린을 포함한다.
일부 실시태양에서, 대상에서 세포는 DNA 손상에 대한 반응 또는 p53 활성을 조절하기 위해 생체 내에서 본원에 기재된 COP1 화합물에 노출될 수 있다. COP1 화합물은 COP1 폴리펩티드 또는 그의 단편, 유사체, 모방체, 또는 변이체를 코딩하는 핵산 분자일 수 있다.
제약 조성물, 투여량 및 투여
본 발명의 화합물은 리포좀, 항원보강제, 또는 임의의 제약상 허용되는 담체의 존재 하에 단독으로 또는 다른 화합물 (예를 들어, 핵산 분자, 소분자, 모방체, 펩티드, 또는 펩티드 유사체)과 조합되어 포유동물, 예를 들어, 인간, 마우스 등에게 투여하기 적합한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 대상에서 DNA 손상에 대한 반응, p53 활성, COP1 활성 또는 ATM 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 치료 화합물은 COP1 분자 또는 핵산 분자, 또는 그의 소분자, 모방체, 펩티드, 또는 펩티드 유사체, 예를 들어, 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 인산화가능한 아미노산 잔기를 갖는 COP1 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명에 따른 화합물은 만성적으로 또는 간헐적으로 제공될 수 있다. "만성" 투여는 초기 치료 효과 (활성)를 유지하도록 단기간의 급성 투여 대신에 연장된 기간 동안 연속적으로 화합물(들)을 투여하는 것을 의미한다. "간헐적" 투여는 특정 화합물의 처리가 실시되지 않는 기간이 사이에 존재하는 처리이다.
화합물을 암으로 고통받거나 암의 전증상이 있는 대상에게 투여하기 위한 적합한 제제 또는 조성물을 제공하기 위해 통상적인 제약 실무가 사용될 수 있다. 임의의 적절한 투여 경로, 예를 들어 비경구, 정맥내, 피하, 근내, 두개내, 안와내, 안내, 심실내, 낭내, 척수내, 경막내, 수조내, 복강내, 비내, 에어로졸, 국소, 또는 경구 투여가 사용될 수 있다. 치료 제제는 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 존재할 수 있고; 경구 투여를 위해, 제제는 정제 또는 캡슐제 형태로 존재할 수 있고; 비내 제제의 경우 분말, 점비액, 또는 에어로졸 형태로 존재할 수 있다.
제제를 제조하기 위한 당업계에 공지된 방법은 예를 들어 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" (19th edition), ed. A. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa]에서 확인할 수 있다. 비경구 투여용 제제는 예를 들어 부형제, 멸균수, 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 또는 수소화된 나프탈렌을 포함할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 화합물의 방출 조절에 사용될 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식가능 주입 시스템, 및 리포좀을 포함한다. 흡입을 위한 제형은 부형제, 예를 들어 락토스를 함유할 수 있거나, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액일 수 있거나, 또는 점비액 형태로 또는 겔로서 투여하기 위한 유성 용액일 수 있다. 신생물성 성장에 대한 치료 또는 예방 또는 억제 조성물의 경우, 화합물은 암 및 목적하는 결과에 따라 DNA 손상 또는 암 성장 또는 진행을 예방하거나, 억제하거나, 느리게 하기에 충분한 양으로 개체에게 투여될 수 있다. 종양 성장의 치료를 위한 화합물의 효능의 척도는 다음 중 하나 이상의 관찰가능한 및/또는 측정가능한 감소 또는 부재를 포함한다: DNA 손상이 존재하는 세포의 수의 감소; 암세포의 수의 감소 또는 암세포의 부재, 종양 크기의 감소; 암세포의 주변 장기로의 침윤의 억제 (즉, 방지, 억제, 지연 또는 정지); 종양 전이의 억제 (즉, 방지, 억제, 지연 또는 정지); 일정 정도로 종양 성장의 억제; 및/또는 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상의 일정 정도로의 경감, 및 이환률 및 사망률의 감소, 또는 암세포 또는 DNA 손상이 존재하는 세포의 아폽토시스 또는 세포 사멸의 증가.
본 발명에 따른 화합물의 "유효량"은 치료 유효량 또는 예방 유효량을 포함한다. "치료 유효량"은 목적하는 치료 결과, 예를 들어 다음 중 하나 이상의 관찰가능한 및/또는 측정가능한 감소 또는 부재를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 및 필요한 기간 동안 효과적인 양을 의미한다: DNA 손상이 존재하는 세포의 수의 감소; 암세포의 수의 감소 또는 암세포의 부재, 종양 크기의 감소; 암세포의 주변 장기로의 침윤의 억제 (즉, 방지, 억제, 지연 또는 정지); 종양 전이의 억제 (즉, 방지, 억제, 지연 또는 정지); 일정 정도로 종양 성장의 억제; 및/또는 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상의 일정 정도로의 경감, 및 이환률 및 사망률의 감소, 또는 암세포 또는 DNA 손상이 존재하는 세포의 아폽토시스 또는 세포 사멸의 증가. 화합물의 치료 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 화합물이 개체에서 요구되는 반응을 유도하는 능력과 같은 요인에 따라 상이할 수 있다. 투여 요법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 치료 유효량은 또한 치료상 유리한 효과가 화합물의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 압도하는 양이다. "예방 유효량"은 목적하는 예방 결과, 예를 들어 다음 중 하나 이상의 관찰가능한 및/또는 측정가능한 감소 또는 부재를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 및 필요한 기간 동안 효과적인 양을 의미한다: DNA 손상이 존재하는 세포의 수의 감소; 암세포의 수의 감소 또는 암세포의 부재, 종양 크기의 감소; 암세포의 주변 장기로의 침윤의 억제 (즉, 방지, 억제, 지연 또는 정지); 종양 전이의 억제 (즉, 방지, 억제, 지연 또는 정지); 일정 정도로 종양 성장의 억제; 및/또는 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상의 일정 정도로의 경감, 및 이환률 및 사망률의 감소, 또는 암세포 또는 DNA 손상이 존재하는 세포의 아폽토시스 또는 세포 사멸의 증가. 일반적으로, 예방 용량은 예방 유효량이 치료 유효량 미만일 수 있도록 질병 발생 전에 또는 질병의 보다 초기 단계에 대상에게 사용된다. 화합물의 치료 또는 예방 유효량의 바람직한 범위는 0.1 nM-O.1 M, 0.1 nM-0.05 M, 0.05 nM-15 μM 또는 0.01 nM-10 μM의 임의의 값일 수 있다.
투여량 값은 완화되어야 하는 병태의 심도에 따라 상이할 수 있다. 임의의 특정 대상에 대해, 특정 투여 요법은 개체의 필요성 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 걸쳐 조정할 수 있다. 본원에서 제시된 투여량 범위는 단지 예시적인 것으로서, 의사에 의해 선택될 수 있는 투여량 범위를 제한하는 것이 아니다. 조성물 내의 활성 화합물(들)의 양은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 투여 요법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여될 수 있거나, 수회의 분할 용량이 일정 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나 또는 용량은 치료 상황의 위급함 정도에 비례하여 감소하거나 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 유리할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 실질적인 독성을 일으키지 않고 사용되어야 한다. 본 발명의 화합물의 독성은 표준 기술을 이용하여, 예를 들어, 세포 배양액 또는 실험 동물에서 시험하고, 치료 지수, 즉, LD50 (집단의 50%에 대해 치사성인 용량)과 LD100 (집단의 100%에 대해 치사성인 용량)의 비를 결정함으로써 결정할 수 있다. 그러나, 중증 질병 상태와 같은 일부 상황에서는, 실질적으로 과량의 조성물을 투여하는 것이 필요할 수 있다.
일부 실시태양에서, 제약 조성물은 본 발명에 따른 화합물 (예를 들어, COP1 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 또는 그의 소분자, 모방체, 펩티드, 또는 펩티드 유사체)을 코딩하는 핵산 분자를 제약상 허용되는 담체와 조합하여 포함할 수 있다. 상기 제약 조성물은 임의의 적절한 기술, 예를 들어 바이러스 벡터 시스템을 사용하여 투여될 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 우두 바이러스 또는 다른 수두 바이러스, 헤르페스 바이러스 등을 포함할 수 있고, 상기 벡터의 투여를 위한 임의의 기술이 사용될 수 있다.
실시예 1: 물질 및 방법
발현 벡터, 재조합 단백질, 및 항체
FLAG-COP1, pcDNA3.1+p53, p21-Luc, bax-Luc, pGEX4T1-p53, 및 pGEX6P1-COP1은 문헌에 기재되어 있다3 , 21. GST-S387 펩티드는 인간 COP1 폴리펩티드의 아미노산 377-400을 포함하고, GST-S387-A 펩티드는 S387에서 알라닌 돌연변이를 갖는다. FLAG-ATM 및 FLAG-ATM-KD는 마이클 카스탄 (Michael Kastan) 교수 (St. Jude Children's Research Hospital, 미국 테네시주)로부터 기증받았다. 모든 돌연변이체 구성체는 Quickchange 부위 지정 돌연변이 유발 (스트라타젠 (Stratagene))에 의해 생성시켰다. 모든 GST 재조합 단백질은 이. 콜라이 (E. coli) 균주 BL21(DE3) 코돈+ (스트라타젠)에서 발현시키고, 글루타티온 세파로스 4B 배치 방법 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))을 사용하여 후속적으로 정제하였다. 항-p53 (DO-1) (칼바이오켐 (Calbiochem)), 항-p53pS15 (셀 시그날링 (Cell Signalling)), 항-p21 (Ab-1) (칼바이오켐), 항-FLAG (M2) (시그마 (Sigma)), 항-Myc (9E10) (로슈 (Roche)), 항-액틴 (아이시앤 (ICN)), 항-튜불린 (Ab6161) (앱캠 (Abcam)), 항-히스톤-H1 (SC8O3O) (산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology)), 항-GST (RPN1236) (지이 헬쓰케어) 및 항-HA (로슈)를 제조사의 권장 사항에 따라 사용하였다. 항-COP1은 문헌에 기재되어 있다3 , 22. 항-pS387은 펩티드 Ac-DSRTA(pS)QLDEFC-NH2를 항원으로서 사용하여 QCB에 의해 생성시키고 인산화된 및 비-인산화된 펩티드에 대해 후속적인 수회의 친화도 정제에 의해 정제한 토끼 폴리클로날 항체이다.
세포, 형질감염, 및 리포터 분석
U2-OS, Saos-2, HEK293T, 및 H1299 세포는 ATCC로부터 구입하여 10% FBS가 존재하는 McCoy의 5A (인비트로겐 (Invitrogen))에 유지시켰다. GM02052, GM03490, GM0637, 및 GM09607 섬유모세포는 코리엘 셀 레포지토리즈 (Coriell Cell Repositories)로부터 입수하여 15% FBS가 존재하는 MEM (ATCC)에 유지시켰다. 모든 형질감염은 제조사의 권장 사항에 따라 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 (인비트로겐)을 사용하여 수행하였다. 세포질 및 핵 추출은 10 Gy IR로 처리된 GM03490 및 GM02052 섬유모세포, 또는 100 ng의 다양한 COP1 구성체로 형질감염된 HEK293 및 U2-OS 세포를 사용하여 NE-PER (피어스 (Pierce)) 키트를 사용하여 수행하였다. p53의 항정 상태 수준에 대한 COP1의 영향을 평가하기 위해, Saos-2 세포를 150 ng pcDNA3.1+p53과 함께 증가량 (0.5, 1 및 2 ㎍)의 FLAG-COP1 또는 FLAG-COP1-S387D로 형질감염시켰다. 리포터 분석을 위해, Saos-2 세포를 증가량 (0.5, 1, 및 2 ㎍)의 pCMV-FLAG-COP1 또는 pCMV-FLAG-COP1-S387D를 사용하거나 사용하지 않으면서 150 ng pcDNA3.1+p53, 100 ng p21-Luc, 및 10 ng의 pRL-TK로 일시 형질감염시켰다. 이중 루시퍼라제 분석을 제조사 (프로메가 (Promega))의 지시에 따라 수행하였다.
면역침전, GST -풀 다운 ( pull down ) 분석, 및 펄스 추적 분석
세포를 방사성 면역침전 분석 (RIPA) 버퍼 (0.1% SDS, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0.5% 데옥시콜레이트, 50 mM Tris pH7.4, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 믹스)에 용해시키고, 사전에 투명하게 하고, 표적 항체 및 단백질 A/G PLUS 비드 (산타 크루즈 바이오테크놀로지)로 면역침전시켰다. 시험관 내 풀 다운 분석은 포유동물 세포로부터 정제된 FLAG-COP1 또는 FLAG-COP1-S387D와 조합된 GST 또는 GST-p53를 사용하여 PBST (0.1% Tween 20 및 1 mM DTT가 존재하는 PBS) 중에서 수행하고 부드럽게 회전시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. COP1-결합 단백질을 FLAG 펩티드 (시그마)로 용출시키고, SDS-PAGE 및 항-FLAG 및 항-GST를 사용한 면역블로트에 적용시켰다. 시클로헥사미드-추적 실험은 세포를 100 ㎍/ml CHX와 함께 인큐베이팅하고 표시된 시점에서 수거함으로써 수행하였다.
시험관 내 유비퀴틴화 및 키나제 분석
HEK293T 세포로부터 FLAG-COP1-WT 또는 FLAG-COP1-S387D를 정제하고, 50 mM Tris pH7.5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 20 μM ZnCl2, 2 mM DTT 및 2 μM 유비퀴틴 알데히드를 포함하는 버퍼 중에서 10 ㎍ 유비퀴틴 (보스톤 바이오켐 (Boston Biochem)), 2 ㎍ 비오티닐화-유비퀴틴 (보스톤 바이오켐), 20 ng의 UbcH5b (에이.지. 사이언티픽 (A.G. Scientific)), 20 ng 토끼 E1 (시그마)과 함께 인큐베이팅하였다. 표시된 경우에, 이. 콜라이로부터 정제된 100 ng의 GST-p53을 반응물에 포함시켰다. 부드럽게 교반하면서 2시간 동안 30℃에서 인큐베이팅한 후에, 반응물을 1% SDS가 존재하는 PBST 중에서 5분 동안 비등시키고, 항-FLAG 또는 항-p53 (FL393) (산타 크루즈 바이오테크놀로지)을 사용한 재-면역침전을 위해 PBST가 존재하는 0.1% SDS로 환원시켰다. 마지막으로, COP1 또는 p53의 유비퀴틴화된 종을 검출하기 위해 샘플을 SDS-PAGE, 이어서 스트렙타비딘-HRP (인비트로겐)을 사용한 면역블로팅에 적용하였다. 키나제 분석은 내인성 ATM 및 외인성 ATM을 사용하여 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다20. 워트마닌 (Wortmannin) (칼바이오켐) 및 카페인 (시그마)를 표시된 바와 같이 사용하였다.
콜로니 형성 분석
H1299 세포를 10-cm 페트리 (Petri) 접시 내로 플레이팅하고, 24 h 후 표시된 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 제오신 (Zeocin) (600 ㎍/ml) 내에서 10일 동안 선택하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 콜로니를 PBS로 2회 세척하고, 빙냉 메탄올 내에서 10분 동안 -2O℃에서 고정시킨 후, 메탄올을 흡인하면서 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액과 함께 10분 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 후속적으로 증류수로 세척하고 공기 건조시켰다. 20개 초과의 세포를 포함하는 염색된 콜로니를 도립 현미경으로 점수를 매기고 계수하였다. 3회의 독립적인 실험을 수행하고, 각각의 계수를 2회 반복하였다.
실시예 2: COP1 은 IR 에 노출시에 번역후 변형된다.
본 발명자들은 GM0637 섬유모세포를 사용하여 10 Gy IR에 의해 유도된 DNA 손상 후에 COP1의 항정 상태 수준을 조사하였다. COP1에 대한 항체로 프로빙한 용해물은 IR 30분 후의 빠른 시간에 COP1의 항정 상태 수준이 감소하기 시작하여 1시간 후에 거의 사라졌음을 보여주었다 (도 1A). 주목할 사실은 COP1 수준이 감소하기 시작하면서 p53의 항정 상태 수준이 증가하였다는 것이고, 이것은 하류 표적 유전자 p21의 활성화와 일치하는 것이었다 (도 1A 및 1B). COP1 단백질의 상기 감소 메카니즘을 규명하기 위해서, 실시간 PCR을 실시하여 COP1 로커스에서의 유전자 활성을 평가하였다. COP1 mRNA 수준은 IR-자극 후에 완만하게 증가하였다. 전통적인 p53-의존성 프로모터인 p21 및 PUMA 프로모터는 COP1 프로모터보다 훨씬 더 큰 규모의 IR 손상 후에도 유도되었다. 따라서, 상기 데이타는 COP1 단백질 수준의 감소가 COP1 mRNA 수준의 감소에 의한 것이 아닐 수 있음을 시사한다. 따라서, 상기 조절이 번역후 수준에서 가능한 것인지를 결정하기 위해 시클로헥사미드 (CHX) 펄스 추적 실험을 수행하였다. GM0637 섬유모세포 내에서, COP1 반감기는 30분 초과이었지만, 이것은 세포를 10 Gy IR에 노출시킨 후 7분만에 크게 감소되었다 (도 1C). 상기 데이타는 COP1이 IR에 노출될 때 번역후 변형됨을 제안한다.
실시예 3: COP1 변형은 ATM -의존성이다.
ATM은 DNA 손상-신호 전달 경로에 대한 1차 반응자이기 때문에, 잠재적인 ATM 인산화 부위를 결정하였다. 5개의 SQ 모티프 (도 1D)가 COP1 상에 존재하지만, SQ3 (S387)에 대한 관심이 특히 크고, 그 이유는 상기 세린 잔기의 알라닌으로의 돌연변이가 IR 후에 COP1의 항정 상태 수준의 감소를 억제하기 때문이다 (도 1E). S387이 ATM-매개 인산화를 위한 진정한 표적인지를 결정하기 위해서, GST 펩티드를 이. 콜라이로부터 정제하고, ATM 야생형 또는 ATM 부재 섬유모세포로부터 ATM을 면역침전시키는 시험관 내 키나제 분석을 위한 기질로서 사용하였다 (도 2A). 실제로, ATM은 S387을 포함하는 펩티드 (GST-COP1-WT) 및 전통적인 ATM 기질인 p53 S15 (GST-p53)를 인산화시킬 수 있었다1 7. 이와 대조적으로, ATM은 S387A 돌연변이를 포함하는 펩티드 (GST-COP1-A)를 인산화시킬 수 없었다. 전장 COP1이 ATM의 기질이고 S387이 COP1 상의 1차 SQ 부위인지를 확인하기 위해, 전장 COP1 및 COP1-S387A를 이. 콜라이로부터 정제하고, 시험관 내 키나제 분석에서 재조합 ATM 또는 ATM-KD와 함께 인큐베이팅하였다 (도 5). ATM-KD가 아니라, COP1과 ATM의 인큐베이팅은 COP1-S387A 돌연변이체 단백질과는 대조적으로 COP1로부터 강력한 포스포-신호를 생성시켰다. 상기 데이타는 S387이 시험관 내에서 ATM을 위한 주요 부위임을 시사한다. 따라서, 인산화된 S387에 대한 폴리클로날 포스포-특이적 항체를 토끼에서 생성시키고, 정제하고, 펩티드 ELISA (도 7) 및 ATM을 사용한 시험관 내 키나제 분석 (도 8)에 의해 특성을 규명하였다. ATM이 COP1을 생체 내에서 인산화시킬 수 있는지를 결정하기 위해서, HEK293T 세포를 ATM 또는 ATM-KD와 함께 또는 이들이 존재하지 않은 상태로 FLAG-COP1로 형질감염시켰다. 용해물을 FLAG 항체로 면역침전시키고, 항-pS387 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 적용하였다 (도 2B). pS387 COP1에 대응하는 특이적인 밴드는 ATM을 동시 형질감염시킬 때만 검출되었고, λ-포스파타제 처리시에 사라졌다.
ATM과 COP1 사이의 상호작용이 생체 내에 존재하는지를 결정하기 위해서, HEK293T 세포를 FLAG-ATM으로만, 또는 HA-COP1과 함께 형질감염시키고, 에토포시드-유도된 DNA 손상 또는 DMSO 비히클 대조군에 적용하였다 (도 2C). HA-COP1을 FLAG-ATM과 함께 형질감염시킬 때에만, 약하지만 항-HA 비드를 사용하여 ATM이 저하되었다. 그러나, HA-COP1를 사용하여 저하된 ATM의 양은 에토포시드로 세포를 처리한 경우에 크게 증가하였고, 이것은 COP1과 ATM 사이의 상호작용이 DNA-손상을 유도할 수 있음을 제안한다. IR 후에 항정 상태 수준 감소 및 COP1의 전환 증가 (각각 도 1A 및 1C)가 ATM의 존재에 의한 것인지를 평가하기 위해서, A-T 환자로부터 유래된 섬유모세포 (GM09607)를 IR로 처리하고 웨스턴 블로팅을 위해 다양한 시점에 수거하였다. 흥미롭게도, COP1 단백질의 항정 상태 수준의 감소는 ATM 부재 섬유모세포에서 결여되었다 (도 2D). 이것은 p53 안정화 및 p21 단백질 유도의 부재와 상호 관련되었다. 이어서, 항-pS387 항체를 ATM-WT 및 A-T 섬유모세포에서 ATM-인산화된 COP1을 프로빙하기 위해 사용하였다 (도 2E). 특히, COP1 pS387은 ATM-WT 섬유모세포 내에 DNA-손상 유도성 약물인 블레오마이신의 존재 하에서만 검출되었다. p53 pS15는 ATM-WT 섬유모세포에서 검출된 반면, A-T 섬유모세포에서는 거의 검출되지 않았다. pS387 COP1은 A-T 세포에서 검출될 수 없었고, 이는 상기 부위에서의 변형이 ATM-의존성임을 제안한다.
실시예 4: S387 에서의 ATM 인산화는 자가- 유비퀴틴화를 촉진시킴으로써 COP1 의 전환을 증가시키는데 충분하다.
외인성 ATM을 Saos-2 세포 내로 도입하고, 외인성 및 내인성 COP1 단백질의 항정 상태 수준을 평가하였다. 외인성 ATM의 도입은 외인성 또는 내인성 COP1의 항정 상태 수준에 대해 어떠한 효과도 갖지 못한 ATM-KD와는 대조적으로 외인성 및 내인성 COP1 단백질 수준을 크게 감소시켰다 (각각 도 2F 및 도 9). COP1은 IR에 노출 후에 전환되기 때문에, 본 발명들은 ATM에 의해 매개된 상기 전환이 26S 프로테아좀을 통한 것인지를 확인하고자 하였다. 따라서, Saos-2 세포를 HA-COP1 및 FLAG-ATM을 사용한 형질감염 후에 프로테아좀 억제제로 처리하였다 (도 2G). ATM의 형질감염은 COP1을 크게 감소시켰지만, 이러한 현상은 세포를 프로테아좀 억제제로 처리시에 완전히 사라졌고, 이것은 COP1의 ATM 인산화가 COP1의 프로테아좀-의존성 분해를 촉진시킴을 의미한다. 본 발명자들은 COP1이 ATM의 활성화에 반응하여 유비퀴틴화되는지 조사하였다. H1299 세포를 HA-태깅된 (tagged) 유비퀴틴, ATM 또는 ATM-KD, 및 COP1으로 형질감염시키고, 프로테아좀 억제제로 예비처리하여 용해물의 수거 전에 유비퀴틴화 생성물을 축적시켰다. COP1을 항-FLAG로 면역침전시키고, 유비퀴틴화된 종을 항-HA로 검출하였다 (도 2H). COP1 단독의 형질감염은 검출가능한 유비퀴틴 생성물의 낮은 풍부도를 보였지만, ATM이 COP1과 동시 형질감염된 경우에는 ATM-KD와의 동시 형질감염과 달리 유비퀴틴화된 COP1을 제시하는 상당한 신호가 존재하였다. ATM이 COP1의 유비퀴틴화 및 후속적인 분해를 촉진한다는 사실에 비추어, 본 발명자들은 COP1이 그 자체를 자가-유비퀴틴화시킨다면 ATM은 RING 돌연변이체의 COP1 분해를 촉진시킬 수 없다는 원리에 따라 ATM이 COP1의 RING 돌연변이체 (C136/139S)의 분해 신호를 보낼 수 있는지 결정하고자 하였다. Saos-2 세포를 FLAG-COP1 또는 FLAG-C136/139S 및 ATM 또는 ATM-KD로 형질감염시키고, COP1 단백질의 항정 상태 수준을 면역블로팅으로 평가하였다 (도 2I). 이전 실험에서 확인된 바와 같이, ATM은 COP1 항정 상태 수준의 급격한 감소를 야기한 반면에, ATM-KD는 어떠한 효과도 보이지 않았다. 이와 대조적으로, RING 돌연변이체는 ATM-유도된 분해에 반응하지 않았다. 상기 데이타는 ATM 인산화가 자가-유비퀴틴화 및 COP1의 후속적인 분해를 촉진함을 시사한다. 상기 문제를 추가로 확인하기 위해, 상기 세린 잔기 상의 인산화를 모방하기 위해 COP1-S387D 돌연변이체를 생성시키고, COP1-WT 및 COP1-RESfG 돌연변이체를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하는 시험관 내 자가-E3 유비퀴틴화 분석 (도 2J)을 위해 포유동물 세포로부터 정제하였다 (도 10). COP1-WT는 크지 않은 자가-E3 활성을 보였지만, COP1의 RING 돌연변이체는 그 자체를 유비퀴틴화할 수 없었다. 이와 대조적으로, S387D COP1 돌연변이체는 현저한 자가-E3 리가제 활성을 보였고, 이것은 ATM 인산화가 자가-E3 메카니즘을 통해 COP1 유비퀴틴화를 증가시킨다는 개념과 일치하는 것이다. S387D 돌연변이체가 시험관 내에서 증가된 자가-E3 리가제 활성을 갖는다면, 이것은 상기 돌연변이체가 생체 내에서 보다 빠른 속도로 전환되어야 함을 시사한다. 상기 가능성을 확인하기 위해, CHX 펄스 추적 실험을 FLAG-COP1 또는 FLAG-S387D로 형질감염된 U2-OS 세포에서 수행하였고, 세포를 CHX와 함께 인큐베이팅한 후 표시된 시점에서 수거하였다 (도 2K). 용해물의 웨스턴 블로팅은 형질감염된 COP1의 반감기가 50분 이하인 반면에, S387D 돌연변이체는 15분 이하의 반감기로서 신속하게 전환됨을 보여주었다. 따라서, 상기 데이타는 S387에서의 ATM 인산화가 자가-유비퀴틴화를 촉진시킴으로써 COP1의 전환을 증가시키는데 충분함을 나타낸다.
실시예 5: ATM 에 의한 S387 에서의 COP1 변형은 DNA 손상에 반응하여 COP1 의 세포질 풀 (pool)을 촉진시키는데 충분하다.
본 발명자들은 면역형광을 사용하여 H1299 세포에서 IR 전 및 후에 외인성 COP1의 국재화를 조사하였다 (도 11). 국재화 분석 결과, COP1은 DAPI를 사용한 동시 염색 및 영상 중첩에 의해 평가할 때 주로 핵 구획에 국재화되는 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, COP1은 10 Gy IR에 2시간 동안 노출될 때 주로 세포질 구획에 국재화되었다. 다음으로, 본 발명자들은 야생형 1차 섬유모세포 (GM03490) 또는 ATM에 대해 말단절단된 (truncated) 1차 섬유모세포 (GM02052) 내에서 내인성 COP1의 국재화를 생화학적 분획화에 의해 평가하였다. H1299 세포에서의 외인성 COP1 연구와 일치하게 (도 10), 내인성 COP1은 임의의 DNA 손상제가 없을 때 야생형 섬유모세포 및 A-T 섬유모세포에서 핵 분획에만 국재화되었다 (도 3A). 이와 반대로, 에토포시드로 처리 시에, 약 50%의 COP1가 GM03490 섬유모세포의 세포질 분획에 존재하는 반면에, 어떠한 검출가능한 세포질 COP1도 A-T 섬유모세포로부터 검출되지 않았다. 상기 데이타는 세포질 구획 내에서 COP1의 국재화가 ATM-의존성임을 제안한다. ATM이 S387 상에서 COP1을 인산화시키는 능력을 사용하여, 본 발명자들은 S387에서의 상기 변형이 세포질 국재화에 충분한지를 결정하고자 하였다. 따라서, COP1-S387D의 국재화를 10 Gy IR 전 및 후에 분석하고, HEK293T 세포에서 야생형 COP1과 비교하였다 (도 3B). WT-COP1은 약 1:1의 비율로 세포질 및 핵 구획에 국재화되었다. 이와 대조적으로, COP1-S387D 단백질은 임의의 DNA 손상제가 첨가되지 않을 때 4:1의 현저한 세포질/핵 국재화 비를 보였다. 또한, 세포를 IR로 처리하면 세포질/핵 COP1-S387D의 비를 추가로 증가시키지 못한 반면에, WT-COP1 세포질/핵 비는 1:1로부터 약 3:1로 증가하였다. 상기 데이타는 ATM에 의한 S387에서의 COP1의 변형이 DNA 손상에 반응하여 COP1의 세포질 풀을 촉진시키는데 충분함을 시사한다.
실시예 6: COP1 - S387D 는 p53 분해 및 p53 -의존성 유전자 트랜스액티베이션 억제시에 그 기능이 약화된다 .
H1299 세포 (p53-/-)를 HA-p53을 첨가하거나 또는 첨가하지 않은 상태로 FLAG-COP1을 코딩하는 구성체로 형질감염시키고, 블레오마이신으로 2시간 동안 처리하고, COP1과 p53 사이의 상호작용을 면역침전으로 결정하였다 (도 4A). 항-FLAG 항체를 사용한 COP1에 대한 웨스턴 블로팅은 HA-p53이 동시 형질감염된 경우에만 HA-비드에 대한 결합을 보여주었지만; 상기 상호작용은 DNA 손상이 블레오마이신에 의해 유도될 때 유의하게 억제되었다. 역 (reverse) IP를 사용하여 FLAG-COP1이 동시 형질감염된 경우에만 HA-p53이 항-FLAG 비드로 면역침전되는 유사한 결과를 얻었다 (도 4B). COP1이 DNA 손상 후에 S387에서 인산화된다면, 본 발명자들은 상기 변형이 p53/COP1 복합체의 붕괴에서 일정한 기능을 수행할 수 있는지를 결정하고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 COP1-S387D 돌연변이체가 세포에서 WT-COP1과 비교할 때 p53과 복합체를 형성하는 능력을 유지하는지를 면역침전에 의해 평가하였다 (도 4D). IP의 웨스턴 블로팅은 WT-COP1과 대조적으로 유의하게 더 적은 p53 (밀도계에 의해 평가할 때 ~3배)이 COP1-S387D과 복합체를 형성할 수 있음을 보여주었다. 또한, 본 발명자들은 정제된 COP1-S387D (도 9) 및 이. 콜라이에서 유도되어 정제된 GST-p53을 사용하여 상기 관찰 결과를 시험관 내에서 재구성할 수 있었고, 여기서 p53 결합의 5배 이하의 감소가 검출되었다 (도 4D). COP1과 p53 사이의 상호작용을 완전히 제거하지는 않지만, S387의 인산화가 COP1를 시험관 내에서 및 생체 내에서 p53에 대한 결합을 적어도 3배 더 불가능하게 만든다는 것은 분명하다. 또한, 이것은 시험관 내에서 p53을 유비퀴틴화시키는 COP1-S387D의 능력 감소와 상호관련된다 (도 4E). 따라서, 이러한 관찰은 ATM에 의한 S387에서의 COP1의 변형이 p53 종양 억제제 기능을 억제하는 COP1의 능력을 억제할 수 있음을 시사한다. 따라서, COP1-S387D가 일시 형질감염 분석에서 p53을 분해하는 능력을 유지하는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. COP1-WT 또는 COP1-S387D의 적정을 증가시키면서 Saos-2 세포를 p53으로 형질감염시켰다 (도 4F). 수거하여 항-p53으로 웨스턴 블로팅시킨 용해물은 COP1-WT의 동시 형질감염시에 p53 항정 상태 수준의 신속한 감소를 보인 반면에, COP1-S387D의 동시 형질감염시에는 p53 수준의 경미한 감소만이 존재하였다. 또한, 상기 데이타는 p21 단백질의 수준 및 p21 유전자 트랜스액티베이션 능력과 상호 관련되었다 (각각 도 4F 및 도 4G). 따라서, 상기 데이타는 COP1-S387D가 p53 분해 및 p53-의존성 유전자 트랜스액티베이션 억제시에 그 기능이 약화됨을 시사한다. 이러한 현상이 적합한 생리학적 판독치와 상호 관련됨을 확인하기 위해서, H1299 세포에서 p53-의존성 기능 억제시에 COP1-WT 및 COP1-S387D의 장기간의 효과를 모니터링하기 위해 콜로니 형성 분석을 수행하였다 (도 4H). p53의 형질감염은 콜로니를 거의 생존시키지 못한 반면에, COP1과 p53의 동시 형질감염은 p53 단독 (6 x 103 cfu), 및 COP1-WT 단독 형질감염 (72 x 103 cfu)에 비해 유의한 수의 콜로니 (25 x 103 cfu)를 구제하였다. 이와 크게 대조적으로, COP1-S387D는 p53 단독 (6 x 103 cfu) 및 COP1-S387D 단독 (77 x 103 cfu)에 비해 유의한 수의 콜로니 (6 x 103 cfu)를 회복시키지 못하였다.
참고 문헌
다음 간행물은 본원에 참고로 포함된다.
Figure 112008054668056-PCT00003
Figure 112008054668056-PCT00004
Figure 112008054668056-PCT00005
다른 실시태양
본 발명의 다양한 실시태양을 본원에 설명하였지만, 당업자의 통상적인 일반적인 지식에 따라 본 발명의 범위 내에 포함되는 많은 변용 및 변형이 가능하다. 이러한 변형은 실질적으로 동일한 방식으로 동일한 결과를 달성하기 위해 본 발명의 임의의 측면을 공지의 등가물로 치환하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 기탁 번호는 뉴클레오티드 서열에 대한 GenBank, European Molecular Biology laboratory (EMBL), DNA Database of Japan (DDBJ), 또는 Genome Sequence Data Base (GSDB), 및 폴리펩티드 서열에 대한 Protein Information Resource (PIR), SWISSPROT, Protein Research Foundation (PRF), 및 Protein Data Bank (PDB) (규명된 구조로부터의 서열), 및 GenBank, EMBL, DDBJ, 또는 RefSeq에서 뉴클레오티드 서열로부터의 주석이 달린 코딩 구역의 번역을 포함하여 다수의 데이타베이스로부터의 기탁 번호를 의미한다. 수치 범위는 그 범위를 규정하는 수치를 함께 포함하는 것이다. 본 명세서에서, 단어 "포함하는"은 구문 "를 포함하고, 이로 제한되지 않는"과 실질적으로 동등한, 제한이 없는 용어이고, 단어 "포함하다"는 대응하는 의미를 갖는다. 본원에서 참고 문헌의 인용은 그 참고 문헌이 본 발명의 선행기술임을 인정하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 모든 간행물은 마치 각각의 간행물이 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것처럼, 또한 본원에 그 전체가 제시된 것처럼 본원에 참고로 포함된다. 또한, 2005년 12월 31일 출원된 미국 가출원 60/755,412는 그 전부가 본원에 참고로 포함된다. 본 발명은 실시예 및 도면을 참고로 하여 상기 설명한 모든 실시태양 및 변형을 실질적으로 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Dornan, David <120> PHOSPHORYLATED COP1 MOLECULES AND USES THEREOF <130> 39766-0228-R1B.US <140> 11/644,293 <141> 2006-12-21 <150> 60/755,412 <151> 2005-12-31 <160> 54 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2196 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtctggta gccgccaggc cgggtcgggc tccgctggga caagccccgg gtcctcggcg 60 gcctcctcgg tgacttccgc ctcctcgtct ttatcctctt ccccgtcgcc gccttccgtg 120 gcggtttcgg cggcagcgct ggtgtccggc ggggtggccc aggccgccgg ctcgggcggc 180 ctcgggggcc cggtgcggcc tgtgttggtg gcgcccgccg tatcgggtag cggcggcggg 240 gcggtgtcca cgggcctgtc ccggcacagc tgcgcggcca ggcccagcgc cggcgtagga 300 ggcagcagct ccagcctagg cagcggcagc aggaagcgac ctctcctcgc ccccctctgc 360 aacgggctca tcaactccta cgaggacaaa agcaacgact tcgtatgccc catctgcttt 420 gatatgattg aagaagcata catgacaaaa tgtggccaca gcttttgcta caagtgtatt 480 catcagagtt tggaggacaa taatagatgt cccaagtgta actatgttgt ggacaatatt 540 gaccatctgt atcctaattt cttggtgaat gaactcattc ttaaacagaa gcaaagattt 600 gaggaaaaga ggttcaaatt ggaccactca gtgagtagca ccaatggcca caggtggcag 660 atatttcaag attggttggg aactgaccaa gataaccttg atttggccaa tgtcaatctt 720 atgttggagt tactagtgca gaagaagaaa caactggaag cagaatcaca tgcagcccaa 780 ctacagattc ttatggaatt cctcaaggtt gcaagaagaa ataagagaga gcaactggaa 840 cagatccaga aggagctaag tgttttggaa gaggatatta agagagtgga agaaatgagt 900 ggcttatact ctcctgtcag tgaggatagc acagtgcctc aatttgaagc tccttctcca 960 tcacacagta gtattattga ttccacagaa tacagccaac ctccaggttt cagtggcagt 1020 tctcagacaa agaaacagcc ttggtataat agcacgttag catcaagacg aaaacgactt 1080 actgctcatt ttgaagactt ggagcagtgt tacttttcta caaggatgtc tcgtatctca 1140 gatgacagtc gaactgcaag ccagttggat gaatttcagg aatgcttgtc caagtttact 1200 cgatataatt cagtacgacc tttagccaca ttgtcatatg ctagtgatct ctataatggt 1260 tccagtatag tctctagtat tgaatttgac cgggattgtg actattttgc gattgctgga 1320 gttacaaaga agattaaagt ctatgaatat gacactgtca tccaggatgc agtggatatt 1380 cattaccctg agaatgaaat gacctgcaat tcgaaaatca gctgtatcag ttggagtagt 1440 taccataaga acctgttagc tagcagtgat tatgaaggca ctgttatttt atgggatgga 1500 ttcacaggac agaggtcaaa ggtctatcag gagcatgaga agaggtgttg gagtgttgac 1560 tttaatttga tggatcctaa actcttggct tcaggttctg atgatgcaaa agtgaagctg 1620 tggtctacca atctagacaa ctcagtggca agcattgagg caaaggctaa tgtgtgctgt 1680 gttaaattca gcccctcttc cagataccat ttggctttcg gctgtgcaga tcactgtgtc 1740 cactactatg atcttcgtaa cactaaacag ccaatcatgg tattcaaagg acaccgtaaa 1800 gcagtctctt atgcaaagtt tgtgagtggt gaggaaattg tctctgcctc aacagacagt 1860 cagctaaaac tgtggaatgt agggaaacca tactgcctac gttccttcaa gggtcatatc 1920 aatgaaaaaa actttgtagg cctggcttcc aatggagatt atatagcttg tggaagtgaa 1980 aataactctc tctacctgta ctataaagga ctttctaaga ctttgctaac ttttaagttt 2040 gatacagtca aaagtgttct cgacaaagac cgaaaagaag atgatacaaa tgaatttgtt 2100 agtgctgtgt gctggagggc actaccagat ggggagtcca atgtgctgat tgctgctaac 2160 agtcagggta caattaaggt gctagaattg gtatga 2196 <210> 2 <211> 731 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Gly Ser Arg Gln Ala Gly Ser Gly Ser Ala Gly Thr Ser Pro 1 5 10 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Asp Gln Asp Asn Leu Asp Leu Ala Asn Val Asn Leu 225 230 235 240 Met Leu Glu Leu Leu Val Gln Lys Lys Lys Gln Leu Glu Ala Glu Ser 245 250 255 His Ala Ala Gln Leu Gln Ile Leu Met Glu Phe Leu Lys Val Ala Arg 260 265 270 Arg Asn Lys Arg Glu Gln Leu Glu Gln Ile Gln Lys Glu Leu Ser Val 275 280 285 Leu Glu Glu Asp Ile Lys Arg Val Glu Glu Met Ser Gly Leu Tyr Ser 290 295 300 Pro Val Ser Glu Asp Ser Thr Val Pro Gln Phe Glu Ala Pro Ser Pro 305 310 315 320 Ser His Ser Ser Ile Ile Asp Ser Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Pro Gly 325 330 335 Phe Ser Gly Ser Ser Gln Thr Lys Lys Gln Pro Trp Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Leu Ala Ser Arg Arg Lys Arg Leu Thr Ala His Phe Glu Asp Leu Glu 355 360 365 Gln Cys Tyr Phe Ser Thr Arg Met Ser Arg Ile Ser Asp Asp Ser Arg 370 375 380 Thr Ala Ser Gln Leu Asp Glu Phe Gln Glu Cys Leu Ser Lys Phe Thr 385 390 395 400 Arg Tyr Asn Ser Val Arg Pro Leu Ala Thr Leu Ser Tyr Ala Ser Asp 405 410 415 Leu Tyr Asn Gly Ser Ser Ile Val Ser Ser Ile Glu Phe Asp Arg Asp 420 425 430 Cys Asp Tyr Phe Ala Ile Ala Gly Val Thr Lys Lys Ile Lys Val Tyr 435 440 445 Glu Tyr Asp Thr Val Ile Gln Asp Ala Val Asp Ile His Tyr Pro Glu 450 455 460 Asn Glu Met Thr Cys Asn Ser Lys Ile Ser Cys Ile Ser Trp Ser Ser 465 470 475 480 Tyr His Lys Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Tyr Glu Gly Thr Val Ile 485 490 495 Leu Trp Asp Gly Phe Thr Gly Gln Arg Ser Lys Val Tyr Gln Glu His 500 505 510 Glu Lys Arg Cys Trp Ser Val Asp Phe Asn Leu Met Asp Pro Lys Leu 515 520 525 Leu Ala Ser Gly Ser Asp Asp Ala Lys Val Lys Leu Trp Ser Thr Asn 530 535 540 Leu Asp Asn Ser Val Ala Ser Ile Glu Ala Lys Ala Asn Val Cys Cys 545 550 555 560 Val Lys Phe Ser Pro Ser Ser Arg Tyr His Leu Ala Phe Gly Cys Ala 565 570 575 Asp His Cys Val His Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Thr Lys Gln Pro Ile 580 585 590 Met Val Phe Lys Gly His Arg Lys Ala Val Ser Tyr Ala Lys Phe Val 595 600 605 Ser Gly Glu Glu Ile Val Ser Ala Ser Thr Asp Ser Gln Leu Lys Leu 610 615 620 Trp Asn Val Gly Lys Pro Tyr Cys Leu Arg Ser Phe Lys Gly His Ile 625 630 635 640 Asn Glu Lys Asn Phe Val Gly Leu Ala Ser Asn Gly Asp Tyr Ile Ala 645 650 655 Cys Gly Ser Glu Asn Asn Ser Leu Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Leu Ser 660 665 670 Lys Thr Leu Leu Thr Phe Lys Phe Asp Thr Val Lys Ser Val Leu Asp 675 680 685 Lys Asp Arg Lys Glu Asp Asp Thr Asn Glu Phe Val Ser Ala Val Cys 690 695 700 Trp Arg Ala Leu Pro Asp Gly Glu Ser Asn Val Leu Ile Ala Ala Asn 705 710 715 720 Ser Gln Gly Thr Ile Lys Val Leu Glu Leu Val 725 730 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ser Arg Thr Ala Ser Gln Leu Asp Glu Phe Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Arg Thr Ala Ser Gln 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Thr Ala Ser Gln 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Ala Ser Gln 1 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ser Gln 1 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Gln Leu Asp Glu 1 5 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Gln Leu Asp 1 <210> 10 <211> 3 <212> PRT 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21 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Thr Tyr Asp Glu Gln Leu Asp 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ser Thr Tyr Asp Glu Gln Leu 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Ser Thr Tyr Asp Glu Gln Leu 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Thr Ala Ser Thr Tyr Asp Glu Gln Leu Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Arg Thr Ala Ser Thr Tyr Asp Glu Gln Leu Asp Glu 1 5 10 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ser Arg Thr Ala Ser Thr Tyr Asp Glu Gln Leu Asp Glu Phe 1 5 10 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Ser Arg Thr Ala Ser Gln 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Thr Ala Ser Gln 1 5 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Thr Ala Ser Gln 1 <210> 30 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Ser Gln 1 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ser Gln Leu Asp Glu 1 5 <210> 32 <211> 4 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15 <210> 54 <211> 16 <212> PRT <213> Rana <400> 54 Ser Asp Asp Ser Arg Thr Ala Ser Gln Leu Asp Glu Phe Gln Glu Cys 1 5 10 15

Claims (86)

  1. ATM 폴리펩티드를 포함하는 세포에서 COP1 폴리펩티드를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 ATM 폴리펩티드에 의한 상기 COP1 폴리펩티드의 인산화, 또는 대조군과 비교하여 상기 COP1 폴리펩티드의 발현 수준의 감소가 DNA 손상을 나타내는 것인, ATM 폴리펩티드를 포함하는 세포에서 DNA 손상을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ATM 폴리펩티드가 인간 ATM 폴리펩티드인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 COP1 폴리펩티드가 인간 COP1 폴리펩티드인 방법.
  4. 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산화가 세린 인산화인 방법.
  5. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 COP1 폴리펩티드가 상기 COP1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체가 인간 COP1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 377-400과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인식하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항체가 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인식하는 것인 방법.
  8. 제6 또는 7항에 있어서, 상기 펩티드가 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 인산화가능한 아미노산 잔기 상에서 인산화되는 것인 방법.
  9. 제1 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ATM 폴리펩티드를 검출하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 상기 COP1 분자의 상기 ATM 분자에 대한 결합이 DNA 손상을 나타내는 것인 방법.
  10. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, COP1 E3-리가제 활성의 활성화, COP1 자가-유비퀴틴화의 활성화, p53-COP1 복합체의 붕괴, COP1-의존성 p53 유비퀴틴화의 감소, COP1의 세포질/핵 비의 증가, COP1 폴리펩티드의 전환, 및 COP1 폴리펩티드의 분해로 이루어지는 군 중의 하나 이상을 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제1 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에서 p53 분자를 검출하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 대조군과 비교하여 상기 p53 분자의 발현 수준의 증가, 또는 p53 활성의 증가가 DNA 손상을 나타내는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 p53 분자가 인간 p53 분자인 방법.
  13. 제11 또는 12항에 있어서, 상기 p53 분자가 야생형 p53 분자인 방법.
  14. 제11 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p53 분자가 p53 폴리펩티드인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 p53 폴리펩티드가 상기 p53 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출되는 것인 방법.
  16. 제11 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p53 활성이 p53-의존성 트랜스액티베이션 (transactivation)의 활성화, p53-유도 아폽토시스의 활성화, p21 분자의 활성화, p21 프로모터의 유도, p21 mRNA 수준의 증가, 및 PUMA 프로모터의 유도로 이루어지는 군 중의 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제1 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 손상이 방사선 조사 또는 화합물에 의해 유발되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 방사선 조사가 이온화 방사선 조사 또는 자외선 조사인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 방사선 조사가 방사선 치료로 인한 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 화합물이 알킬화제 또는 화학치료제인 방법.
  21. 제1 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 DNA 손상이 존재하거나 손상의 위험이 있는 것인 방법.
  22. 제1 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 암세포인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 암세포가 유방암, 난소암, 대장암, 폐암, 및 전이세포암으로 이루어지는 군 중의 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제22 또는 23항에 있어서, 상기 암세포가 암 치료를 받는 대상으로부터 얻어진 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암 치료가 DNA 손상을 유발하는 것으로 알려져 있거나 유발하는 것으로 의심되는 것인 방법.
  26. 제24 또는 25항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
  27. 세포를 COP1 폴리펩티드의 분해를 증가시키는 화합물에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서 DNA 손상에 대한 반응을 증가시키는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 화합물이 ATM 분자를 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 ATM 분자가 활성화된 ATM 폴리펩티드인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 화합물이 상기 COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드에 대한 결합을 증가시키거나 ATM 폴리펩티드에 의한 상기 COP1 폴리펩티드의 인산화를 증가시키는 것인 방법.
  31. COP1 폴리펩티드 및 ATM 폴리펩티드를 상기 COP1 폴리펩티드의 상기 ATM 폴리펩티드에 대한 결합을 증가시키는 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, COP1 폴리펩티드와 ATM 폴리펩티드의 상호작용을 증가시키는 방법.
  32. 제30 또는 31항에 있어서, 상기 결합이 상기 COP1 폴리펩티드의 분해, COP1 E3-리가제 활성의 활성화, COP1 자가-유비퀴틴화의 활성화, COP1-p53 복합체의 붕괴, COP1-의존성 p53 유비퀴틴화의 감소, COP1 폴리펩티드의 세포질/핵 비의 증가, 및 p53 분자의 발현 수준의 증가 중의 하나 이상을 야기하는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 접촉이 세포에서 DNA 손상에 대한 반응을 증가시키는 것인 방법.
  34. 제27 내지 30항 및 33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 DNA 손상이 존재하거나 DNA 손상의 위험이 있는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 세포가 A-T 세포인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 세포가 암세포인 방법.
  37. 제27 내지 30항 및 33항 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 손상에 대한 반응이 세포 아폽토시스 또는 p53 활성화를 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 p53 활성화가 p53-의존성 트랜스액티베이션의 활성화, p53-유도 아폽토시스의 활성화, p21 분자의 활성화, p21 프로모터의 유도, 및 PUMA 프로모터의 유도로 이루어지는 군 중의 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  39. 제26 내지 38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 COP1 폴리펩티드가 인간 COP1 폴리펩티드인 방법.
  40. 제28 내지 39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ATM 폴리펩티드가 인간 ATM 폴리펩티드인 방법.
  41. 제27 내지 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 아미노산 잔기의 인산화를 증가시키는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 화합물이 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387의 인산화를 증가시키는 것인 방법.
  43. 제27 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 잔기를 포함하는 COP1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
  44. 제27 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 인간 COP1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 377-400과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  45. 제43 또는 44항에 있어서, 상기 화합물이 인산화될 수 있는 아미노산 잔기의 인산화를 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 방법.
  47. 제27 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 인간 COP1 폴리펩티드의 세린 387에 상동성인 잔기에 세린 대신에 트레오닌, 글루타메이트 또는 아스파르테이트의 치환을 포함하는 COP1 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  48. 제27 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 COP1 모방 화합물을 포함하는 것인 방법.
  49. COP1 폴리펩티드를 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 세포에서 DNA 손상을 촉진하기 위해 적합한 조건 하에 인큐베이팅하고, 상기 COP1 폴리펩티드의 분해가 상기 시험 화합물의 존재 하에 증가되는지 결정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 COP1 폴리펩티드의 분해를 증가시키는 화합물은 DNA 손상에 대한 반응을 증가시키는 화합물인, ATM 분자를 포함하는 세포에서 DNA 손상에 대한 반응을 증가시키는 화합물을 확인하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 결정이 대조군과 비교하여 수행되는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 ATM 분자가 상기 COP1 폴리펩티드를 인산화할 수 있는 것인 방법.
  52. 제49 내지 51항 중 어느 한 항에 있어서, COP1 E3-리가제 활성의 활성화, COP1 자가-유비퀴틴화의 활성화, COP1-p53 복합체의 붕괴, COP1-의존성 p53 유비퀴틴화의 감소, COP1 폴리펩티드의 세포질/핵 비의 증가, p53 활성의 증가 및 p53 분자의 발현 수준의 증가로 이루어지는 군 중의 하나 이상이 상기 화합물에 의해 증가되는지를 결정하는 것을 추가로 포함하고, 상기 증가가, 상기 화합물이 DNA 손상에 대한 반응을 증가시키는 화합물임을 나타내는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 p53 활성이 p53-의존성 트랜스액티베이션의 활성화, p53-유도 아폽토시스의 활성화, p21 분자의 활성화, p21 프로모터의 유도 및 PUMA 프로모터의 유도로 이루어지는 군 중의 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제49 내지 53항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 손상을 촉진하기 위한 적합한 조건이 방사선 조사인 방법.
  55. 제49 내지 54항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 손상에 대한 반응이 세포 아폽토시스 또는 p53 활성화를 포함하는 것인 방법.
  56. a) COP1 폴리펩티드를 ATM 폴리펩티드와 함께 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 인큐베이팅하고;
    b) 시험 화합물이 상기 COP1 폴리펩티드의 상기 ATM 폴리펩티드에 대한 결합을 증가시키거나 안정화시키는지 결정하는 것을 포함하고,
    여기서, 상기 COP1 폴리펩티드의 상기 ATM 폴리펩티드에의 결합을 증가 또는 안정화시키는 시험 화합물은 COP1 폴리펩티드와 ATM 폴리펩티드의 상호작용을 증가시키는 화합물인, COP1 폴리펩티드와 ATM 폴리펩티드의 상호작용을 증가시키는 화합물을 확인하는 방법.
  57. 인간 COP1의 아미노산 잔기 377-400에 실질적으로 동일하거나 상동성인 아미노산 서열을 주성분으로 하는 단리된 펩티드.
  58. 도 6에 제시된 아미노산 서열을 주성분으로 하는 단리된 펩티드.
  59. 제57 또는 58항에 있어서, 상기 펩티드가 SQ 모티프 내에서 세린의 치환을 포함하는 것인 펩티드.
  60. 제59항에 있어서, 상기 치환이 아스파르테이트 또는 글루타메이트 치환인 펩티드.
  61. 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 인산화를 포함하는 단리된 또는 재조합 인산화된 COP1 펩티드.
  62. 인간 COP1 폴리펩티드의 S387에 상동성인 아미노산 잔기에서 아스파르테이트 또는 글루타메이트 치환을 포함하는 단리된 또는 재조합 COP1 펩티드.
  63. 제57 내지 62항 중 어느 한 항의 펩티드의 COP1 모방 화합물.
  64. 제57 내지 62항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 제63항의 모방체를 코딩하는 핵산 분자.
  65. 프로모터에 작동가능하게 연결된 제64항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 ATM 핵산 분자를 추가로 포함하는 벡터.
  67. 제65 또는 66항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  68. 인간 COP1의 세린 387에 상동성인 아미노산 잔기 상에서 인산화된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 시약.
  69. 제68항에 있어서, 아미노산 서열이 S387 인산화된 인간 COP1인 시약.
  70. 제69항에 있어서, 시약이 항체인 시약.
  71. 제68항의 시약 또는 제70항의 항체를 코딩하는 핵산 분자.
  72. 프로모터에 작동가능하게 연결된 제71항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  73. 제72항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  74. 제68항의 시약 또는 제70항의 항체를, 세포에서 인산화된 COP1 분자를 검출하기 위한 사용설명서와 함께 포함하는 키트.
  75. 제57 내지 62항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 제63항의 모방체, 또는 상기 펩티드 또는 모방체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물.
  76. 대상에게 치료 유효량의 제57 내지 62항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 제63항의 모방체를 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서 DNA 손상 또는 암을 치료하는 방법.
  77. 대상에게 치료 유효량의 제64항에 따른 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서 DNA 손상 또는 암을 치료하는 방법.
  78. COP1 폴리펩티드의 ATM 폴리펩티드에 대한 결합을 증가시키는 화합물 및 ATM 폴리펩티드에 의한 상기 COP1 폴리펩티드의 인산화를 증가시키는 화합물로 이루어지는 군 중에서 선택된 화합물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 DNA 손상된 세포 또는 암을 치료하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 화합물이 DNA 손상된 세포 또는 암에서 COP1 폴리펩티드의 인산화를 증가시키기에 효과적인 양으로 투여되는 것인 방법.
  80. 제49항 또는 제56항의 방법에 따라 확인된 화합물.
  81. 대상에서 DNA 손상 또는 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 제57 내지 62항 중 어느 한 항의 펩티드, 제63항의 모방체 또는 제80항의 화합물의 용도.
  82. COP1 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자 및 ATM 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 포유동물 세포.
  83. 제82항에 있어서, p53 분자를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 추가로 포함하는 포유동물 세포.
  84. 제82 또는 83항에 있어서, 상기 ATM 분자가 활성화된 것인 포유동물 세포.
  85. 제82 내지 84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 COP1 분자가 구성적으로 인산화되거나 구성적으로 비인산화된 것인 포유동물 세포.
  86. 제85항에 있어서, COP1 분자가, S387에서 COP1 인산화를 억제하는 S387에서의 돌연변이에 의해 S387에서 구성적으로 비인산화된 것인 포유동물 세포.
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