ES2227833T3 - Composiciones inmunogenicas para el receptor cck-b/gastrina y metodos para el tratamiento de tumores. - Google Patents

Composiciones inmunogenicas para el receptor cck-b/gastrina y metodos para el tratamiento de tumores.

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ES2227833T3 ES98923447T ES98923447T ES2227833T3 ES 2227833 T3 ES2227833 T3 ES 2227833T3 ES 98923447 T ES98923447 T ES 98923447T ES 98923447 T ES98923447 T ES 98923447T ES 2227833 T3 ES2227833 T3 ES 2227833T3
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Abstract

La invención se refiere a inmunógenos, a composiciones inmunogénicas y a un procedimiento para el tratamiento de los tumores dependientes de la gastrina. Los inmunógenos comprenden un péptido del receptor de CCK-B/gastrina conjugado con un separador y un portador inmunogénico. Los inmunógenos son capaces de producir anticuerpos in vivo que se unen al receptor de CCK-B/gastrina en las células tumorales, evitando de esta forma que las hormonas peptídicas que estimulan el crecimiento se unan a los receptores e inhibiendo el crecimiento de las células tumorales. Los inmunógenos también comprenden anticuerpos contra el receptor de CCK-B/gastrina para la inmunización pasiva. La invención también se refiere a procedimientos de diagnóstico para detectar tumores dependientes de la gastrina in vivo o a partir de una biopsia de tejidos utilizando los anticuerpos de la invención.

Description

Composiciones inmunogénicas para el receptor CCK-B/gastrina y métodos para el tratamiento de tumores.
Antecedentes de la invención
Se ha demostrado que varios tipos de tumores, por ejemplo, adenocarcinomas colorrectales, estomacales, pancreáticos y hepatocelulares, poseen receptores CCK-B/gastrina en sus membranas plasmáticas y que responden a la gastrina con una fuerte proliferación celular (Rehfeld, J. F., 1972, Upp et al., 1989 y Watson et al., 1993). Además, más recientemente se ha descubierto que muchas de estas células cancerígenas también secretan gastrina y, por tanto, realizan una ruta proliferativa autónoma o "bucle autocrino" ("autocrine loop") (Van-Solinge et al., 1993, Nemeth et al., 1993 y Seva et al., 1994).
Se han evaluado terapéuticamente varios antagonistas del receptor CCK-B/gastrina de alta afinidad, tanto in vitro como in vivo, en varios cánceres gastrointestinales de experimentación. Por ejemplo, se ha demostrado que proglumida, un derivado del ácido glutámico (Seva et al., 1990; Harrison et al., 1990); benzotript, un derivado N-acílico del triptófano; L-365.260, un derivado de la aspercilina (Bock et al., 1989) y CI-988, una molécula que imita la secuencia del pentapéptido C-terminal de CCK (colecistoquinina) (Hughes et al., 1990) neutralizan eficazmente los efectos de la gastrina exógena sobre el crecimiento de tumores gastrointestinales, tanto in vitro como in vivo (Watson et al., 1991 y Romani et al., 1994). Sin embargo, estos antagonistas tienen efectos secundarios tóxicos graves y carecen de especificidad ya que bloquean la acción de todos los ligandos potenciales del receptor, tales como gastrina-34 (G34) y CCK en las células normales. Recientemente, también se han descrito antagonistas sumamente potentes y selectivos del receptor CCK-B/gastrina, tales como YM022 (Yuki et al., 1997) y YF476 (Takinami et al., 1997).
La proglumida y el benzotript se han evaluado ampliamente en los estudios preclínicos. El principal problema de estos compuestos es su falta de potencia, requiriéndose concentraciones relativamente altas para desplazar a la gastrina-17 (G17).
Debido a la baja especificidad de esta clase de agentes que antagonizan la gastrina por el receptor CCK-B/gastrina, la inhibición del crecimiento tumoral puede que no se controle eficazmente con antagonistas de gastrina. Además, los receptores celulares que reconocen y se unen a las gastrinas no se unen a todos los inhibidores probados (Seva et al., 1994). Por tanto, si no se produce la inhibición completa de la unión de la gastrina al receptor en la cascada de crecimiento autocrina, entonces los antagonistas de la gastrina pueden ser incapaces de bloquear este mecanismo de estimulación del crecimiento tumoral.
Se conoce la secuencia de aminoácidos del receptor CCK-B/gastrina humano (Tarasova et al., 1994; Herget et al., 1994).
Ciertos péptidos derivados del receptor CCK-B/gastrina se han conjugado con proteínas transportadoras y se han usado para obtener anticuerpos. Por tanto, los antisueros obtenidos contra siete péptidos correspondientes a los aminoácidos del receptor 40-57, 118-217, 153-160, 198-217, 205-217, 288-294 y 356-371 reaccionaron con la proteína receptora desnaturalizada en inmunoblots (inmunotransferencias). Algunos de estos antisueros se utilizaron en tinciones inmunohistoquímicas para identificar la presencia del receptor en células parietales (Tarasova et al., 1994).
La localización del receptor CCK-B/gastrina en células estomacales se ha llevado a cabo usando anticuerpos purificados obtenidos contra péptidos conjugados derivados de los aminoácidos 42-55 y 253-264 (Helander et al., 1997).
Un anticuerpo policlonal obtenido contra un epítopo de G17 sérica, no descrito, se ha usado para medir los niveles séricos de gastrina tras hepatectomía parcial por tumores hepáticos en el hombre (Caplin et al., 1996).
Un antisuero contra el extremo amino terminal del receptor CCK-B/gastrina se ha usado para evaluar la expresión del receptor a partir de líneas celulares gastrointestinales que se sabe que contienen progastrina o gastrina extendida con glicina, mediante immunoblotting de membranas celulares extranucleares (Watson et al., 1995). El antisuero no se describió adicionalmente.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un inmunógeno que comprende un péptido activo ("inmunoimitador" ("immunomimic"), molécula imitadora que estimula la respuesta inmunológica) que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 conjugada con un transportador inmunogénico. La secuencia es la de los aminoácidos 5-21 del receptor CCK-B/gastrina, es decir, muy próxima al extremo N-terminal. Los anticuerpos producidos por este inmunógeno son específicos contra el receptor CCK-B/gastrina en células tumorales y bloquean los efectos estimuladores del crecimiento de la gastrina sobre el receptor. Evitan que las hormonas peptídicas G17 y G34 se unan a los receptores CCK-B/gastrina en las células tumorales dependientes de gastrina; por tanto, el crecimiento del tumor se detiene. Además, sorprendentemente, con la unión al receptor, los anticuerpos se internalizan y se translocan rápidamente al citoplasma y al núcleo de las células tumorales. Esta internalización puede producirse tan sólo a los 10 segundos tras la exposición de las células al anticuerpo. Esta rápida internalización del complejo anticuerpo/receptor, a su vez, hace que las células tumorales afectadas experimenten apoptosis o suicidio.
La invención proporciona además un inmunógeno de la invención, tal como se definió anteriormente, para su uso en el tratamiento de un estado maligno producido por el crecimiento celular maligno dependiente de gastrina y, especialmente, en el tratamiento de células tumorales dependientes de gastrina.
Los inmunógenos de la invención también pueden comprender un péptido espaciador unido a un extremo del péptido inmunoimitador. El transportador inmunogénico es preferiblemente una proteína transportadora tal como el toxoide diftérico, el toxoide tetánico o la albúmina sérica bovina. Tales espaciadores y transportadores se han descrito por los presentes solicitantes en el contexto de inmunógenos basados en péptidos de secuencia diferente, derivados de G17, véase por ejemplo, el documento WO 90/08774, página 16 y el documento WO 95/13297, página 2.
Los anticuerpos producidos por los inmunógenos anti-receptor CCK-B/gastrina se unen a los receptores CCK-B/gastrina en las células tumorales y evitan eficazmente la unión de las hormonas peptídicas a los receptores, inhibiendo así la ruta autocrina estimuladora del crecimiento de la división de las células tumorales y en última instancia, el crecimiento del tumor.
Otra realización de la invención proporciona anticuerpos para un inmunógeno de la invención, per se y para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de gastrina, es decir, en la inmunización pasiva. Cuando se administran a un paciente en una concentración suficiente para unirse a los receptores CCK-B/gastrina de las células tumorales, bloquean la unión de las hormonas peptídicas al receptor. La prevención de la unión de las hormonas a su receptor inhibe la ruta de estímulos del crecimiento de las células tumorales, inhibiendo así el crecimiento de los tumores dependientes de hormonas. En una realización preferida de este aspecto de la invención, los anticuerpos para el tratamiento en seres humanos pueden ser anticuerpos quiméricos, humanizados o monoclonales humanos, que pueden producirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Además, los anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina pueden conjugarse con moléculas citotóxicas, tales como la toxina colérica, o con moléculas radiactivas marcadas con radionúclidos, tales como ^{125}I o ^{131}I, para potenciar la destrucción de las células tumorales.
La invención también proporciona un método para diagnosticar un tumor que responde a gastrina, que comprende la detección inmunoquímica de los tumores dependientes de gastrina (que contienen el receptor CCK-B/gastrina) a partir de una biopsia tisular usando los anticuerpos de la invención. Los anticuerpos específicos anti-receptor CCK-B/gastrina de la invención pueden marcarse con un sistema de detección que utiliza compuestos tales como biotina, peroxidasa de rábano picante y fluoresceína para detectar los receptores CCK-B/gastrina en el tejido tumoral, usando procedimientos inmunoquímicos habituales.
La invención también proporciona el anticuerpo de la invención para su uso en el diagnóstico de un tumor colorrectal dependiente de gastrina in vivo. El método de tal uso comprende administrar el anticuerpo radiomarcado a un paciente, por ejemplo, mediante una inyección intravenosa y obtener la imagen del tumor mediante gammagrafía. En este aspecto de la invención, los anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina deben marcarse con un radionúclido tal como ^{111}Indio, ^{90}Itrio o ^{131}I.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos hacen referencia al péptido inmunoimitador del inmunógeno de la invención como GRP-1. Se hace referencia a otro péptido, GRP-4, para comparación. Este péptido corresponde a los aminoácidos 360-374 del receptor CCK-B/gastrina y tiene la SEQ ID NO: 2.
Las figuras 1A y 1B ilustran vistas esquemáticas del receptor CCK-B/gastrina y sus 7 dominios transmembrana, mostrándose GRP-1 Y -4 en el lado externo de la membrana plasmática.
La figura 2 muestra los datos de ELISA con anticuerpos obtenidos en conejos inmunizados con un inmunógeno del péptido 1 (= GRP-1) del receptor CCK-B/gastrina.
La figura 3 muestra los datos de ensayos ELISA con anticuerpos obtenidos en conejos inmunizados con un inmunógeno del péptido 4 (= GRP-4) del receptor CCK-B/gastrina.
La figura 4 es un gráfico que muestra los datos obtenidos de un ELISA - inhibición usado para evaluar la especificidad de los anticuerpos purificados por afinidad obtenidos contra el inmunógeno GRP1-TD.
La figura 4 es un gráfico de barras que muestra los datos en la inhibición de la unión de ^{125}I-G17 humana a células AR4-2J mediante inhibidores peptídicos.
La figura 6 es un gráfico de barras de la distribución celular de células tumorales AR4-2J de inmunomarcaje con oro.
La figura 7 es una fotografía de un análisis de Western blot de extractos de proteínas de membranas nucleares de células de adenocarcinoma usando anticuerpos obtenidos contra el péptido 1 (GRP-1).
La figura 8 es una fotografía de un análisis de Western blot de extractos de proteínas de membranas extranucleares y plasmáticas de células de adenocarcinoma usando anticuerpos obtenidos contra el péptido 1 (GRP-1).
La figura 9 es una representación gráfica que ilustra el peso del tumor C170HM2 de animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 10 es una representación gráfica que ilustra el área de la sección transversal de tumores C170HM2 de animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 11 es un gráfico de barras que muestra los pesos medios del tumor C170HM2 de animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 12 es un gráfico de barras que muestra el área media de la sección transversal de tumores C170HM2 de animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 13 es un gráfico de barras que muestra el número medio de tumores C170HM2 de animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 14 es un gráfico de barras que muestra la mediana del peso del tumor C170HM2 en metástasis hepáticas de animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 15 es un gráfico de barras que muestra la mediana del área de la sección transversal de tumores C170HM2 de animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 16 es un gráfico de barras que muestra la mediana del número de tumores C170HM2 en animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 17 es un gráfico de barras que muestra el número medio y su mediana de tumores hepáticos C170HM2 en animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 18 es un gráfico de barras que muestra el peso medio y su mediana del tumor hepático C170HM2 en animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 19 es un gráfico de barras que muestra los valores medios y su mediana del área de la sección transversal de metástasis de tumor hepático C170HM2 en animales control y tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina.
La figura 20 representa un gráfico que muestra la concentración de ^{125}I-anticuerpos radiomarcados en xenoinjertos de tumor hepático C170HM2 de ratones control (suero de conejo normal) y atímicos tratados con anti-GRP-1.
La figura 21 representa un gráfico de barras que muestra el número medio de tumores hepáticos C170HM2 por hígado de xenoinjertos de ratones control y atímicos tratados con anti-GRP-1.
La figura 22 representa un gráfico de barras que muestra el peso medio del tumor hepático C170HM2 de xenoinjertos de hígado de ratones control y atímicos tratados con anti-GRP-1.
La figura 23 representa Western blot de proteínas de xenoinjerto de tumor hepático C170HM2 de ratones control y atímicos tratados con anti-GRP-1.
La figura 24 es una fotografía de un corte histológico tomado con un microscopio óptico que muestra un corte teñido con hematoxilina/eosina de un xenoinjerto de tumor hepático C170HM2 de un ratón control.
La figura 25 es una fotografía de un corte histológico tomado con un microscopio óptico que muestra un corte teñido con hematoxilina/eosina de un xenoinjerto de tumor hepático C170HM2 de un ratón tratado con anticuerpos anti-GRP-1 de conejo.
Descripción detallada de la invención
Los inmunógenos de la invención también pueden comprender un péptido de extensión o espaciador adecuado para proyectar el péptido inmunoimitador fuera de la proteína transportadora y potenciar su capacidad para unirse a los receptores de linfocitos. Un péptido espaciador adecuado tiene la secuencia de aminoácidos SSPPPPC (espaciador de serina (Ser), SEQ ID NO.: 3 en la Lista de Secuencias). Sin embargo, también serían adecuados otros péptidos espaciadores. Los péptidos inmunoimitadores, con o sin el espaciador, se conjugan entonces con una proteína transportadora, tal como el toxoide diftérico, a través de un residuo de cisteína en el extremo carboxilo terminal. Los péptidos espaciadores no están inmunológicamente relacionados con los péptidos derivados del receptor CCK-B/gastrina y por tanto, deben potenciar, pero no determinar, la inmunogenicidad específica de los péptidos derivados del receptor.
La presencia y la densidad de receptores CCK-B/gastrina en las células tumorales en un paciente pueden determinarse haciendo reaccionar anticuerpos anti-receptor marcados, con una muestra obtenida de muestra de biopsia del tumor. Los anticuerpos anti-receptor pueden marcarse o bien con un marcador radioactivo, con un colorante o con un marcador fluorescente. Además, la capacidad de respuesta de las células tumorales a la gastrina puede evaluarse in vitro a partir de una muestra de biopsia de tumor del paciente usando técnicas habituales. Los pacientes que tienen tumores con muestras de biopsia positivas para el ensayo con anticuerpo anti-receptor CCK-B/gastrina son candidatos habituales para el tratamiento mediante los métodos de la invención.
Para el tratamiento del cáncer gastrointestinal, se administra al paciente una dosis eficaz que oscila desde 0,001 hasta 2 mg de inmunógeno. La dosis eficaz de inmunógeno debe poder provocar una respuesta inmunológica en un paciente que consiste en niveles eficaces de título de anticuerpo contra el receptor CCK-B/gastrina 1 - 3 meses después de la inmunización. Tras la inmunización de un paciente, la eficacia de los inmunógenos se monitoriza mediante procedimientos clínicos habituales, tales como ecografía y resonancia magnética nuclear (RMN), para detectar la presencia y el tamaño de los tumores. Los niveles de título de anticuerpos contra el receptor también pueden monitorizarse a partir de una muestra de sangre tomada del paciente. Deben administrarse inmunizaciones de refuerzo según se requiera para mantener un título de anticuerpo eficaz. El tratamiento eficaz de los cánceres dependientes de gastrina, tales como los adenocarcinomas estomacales, hepáticos, pancreáticos y colorrectales, según este método, deben dar como resultado la inhibición del crecimiento tumoral y una disminución en el tamaño del tumor.
Los anticuerpos obtenidos mediante los inmunógenos anti-receptor CCK-B/gastrina de la presente invención pueden tener efectos antitróficos contra los tumores dependientes de gastrina mediante tres mecanismos potenciales: (i) inhibición de la unión de la gastrina a su receptor, (ii) degradación o interrupción de la ruta de transducción de la señal de la proliferación de células tumorales; e (iii) inducción de apoptosis (o suicidio celular) en células en las que los complejos receptor/anticuerpo se internalizan y migran al núcleo.
Los anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina se administran a un paciente que posee un tumor que responde al receptor CCK-B/gastrina. Los anticuerpos se unen específicamente a los receptores CCK-B/gastrina en las células tumorales. La unión de los anticuerpos a los receptores evita la unión de la gastrina a su ligando en las membranas de las células y, por tanto, se inhibe la señal de crecimiento para las células tumorales dependientes de gastrina y el crecimiento del tumor se detiene. Los anticuerpos son preferiblemente anticuerpos quiméricos o humanizados, o fragmentos de los mismos, que se unen eficazmente al receptor diana y pueden producirse mediante técnicas habituales tales como las descritas en las patentes de los EE.UU. números 5.023.077, 5.468.494, 5.607.676, 5.609.870, 5.688.506 y 5.662.702. Estos anticuerpos producidos exógenamente también pueden ser útiles para destruir células tumorales que llevan el receptor CCK-B/gastrina en sus membranas plasmáticas, en virtud de que inhiben el crecimiento de las células tumorales o de que suministran una sustancia tóxica a la célula tumoral. La inhibición del crecimiento tumoral en este método de inmunización también se monitoriza mediante la obtención de imágenes por ecografía y RMN.
La eficacia de los anticuerpos en la inhibición del crecimiento de células tumorales y la destrucción de las células tumorales puede potenciarse conjugando moléculas citotóxicas con los anticuerpos anti-CCK-B/gastrina. Las moléculas citotóxicas pueden ser toxinas, por ejemplo, toxina colérica, ricino, \alpha-amanitina o moléculas radiactivas marcadas, por ejemplo con ^{125}I o ^{131}I, o agentes quimioterápicos, por ejemplo, arabinósido de citosina o 5-fluorouridina.
Además de los anticuerpos radiomarcados con ^{125}I o ^{131}I, los anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina también pueden marcarse con radionúclidos tales como ^{111}Indio o ^{90}Itrio. En este aspecto de la invención, los anticuerpos son útiles para la detección y el diagnóstico de tumores que poseen el receptor CCK-B/gastrina in vivo, mediante la administración de estos anticuerpos al paciente, y la detección de los anticuerpos unidos en las células tumorales que contienen el receptor CCK-B/gastrina. Tras permitir que los anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina radiomarcados alcancen el tumor, aproximadamente 1 - 2 horas tras la inyección, se obtiene la imagen de los "puntos calientes" ("hot spots") radiactivos usando procedimientos grammagráficos habituales, tal como se ha descrito anteriormente (Harrison, 1994).
Las composiciones en las que se administran inmunógenos para el tratamiento de tumores dependientes de gastrina en pacientes pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas sólidas, semisólidas y líquidas, tales como polvos, disoluciones líquidas, suspensiones, supositorios y disoluciones para inyección y para infusión. La forma preferida depende del modo deseado de administración y de las aplicaciones terapéuticas. Las composiciones comprenden los inmunógenos presentes y componentes adecuados farmacéuticamente aceptables, y pueden incluir otros agentes medicinales, vehículos, adyuvantes, excipientes, etc. Los adyuvantes adecuados pueden incluir nor-muramil dipéptido (nor-MDP, Peninsula Labs., CA) y aceites tales como Montanide ISA 703 (Seppic, Inc., París, Francia), que pueden mezclarse usando procedimientos habituales. Preferiblemente, las composiciones están en la forma de dosis unitarias. La cantidad de principio activo administrado para la inmunización o como un medicamento de una vez, o durante un periodo de tiempo, dependerá del sujeto que se esté tratando, de la manera y la forma de administración y del criterio del médico que trate.
Los anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina de la invención para la inmunización pasiva se administran preferiblemente a un paciente por vía intravenosa usando un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.
Ejemplo 1 Preparación de conjugados GRP1-TD y GRP4-TD
Se prepararon péptidos receptores CCK-B/gastrina mediante síntesis peptídica en estado sólido habitual. Para obtener inmunógenos capaces de inducir respuestas inmunológicas específicas, se sintetizó cada uno del péptido 1 y 4 que contenían la secuencia espaciadora SSPPPPC (SEQ ID NO.: 3 en la Lista de Secuencias) en su extremo carboxilo terminal. Estos péptidos se conjugaron posteriormente con grupos amino presentes en el transportador, toxoide diftérico ("TD"), a través del residuo de aminoácido del péptido terminal, cisteína, del espaciador utilizando un agente de unión heterobifuncional que contenía un éster succinimídico en un extremo y maleimida en el otro extremo del agente de unión mediante el Método A o el Método B, tal como se describen a continuación.
Método A
Tal como se ha descrito anteriormente en la patente de los EE.UU. número 5.023.077, la unión del péptido 1 o el 4 anteriores y el transportador se lleva a cabo tal como sigue. Se disolvió el péptido seco en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,0, con un exceso molar de treinta veces de ditiotreitol ("DTT"). La disolución se agitó bajo una atmósfera de gas nitrógeno saturada con agua durante cuatro horas. El péptido que contenía cisteína reducida se separó de los demás componentes mediante cromatografía en una columna de Sephadex G10 equilibrada con ácido acético 0,2 M. El péptido se liofilizó y se almacenó a vacío hasta su uso. El transportador se activó mediante tratamiento con el agente de unión heterobifuncional, por ejemplo, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido épsilon-maleimidocaproico ("EMCS") en proporciones suficientes para lograr la activación de aproximadamente 25 grupos amino libres por 10^{5} el peso molecular del transportador. En el caso específico del toxoide diftérico, esto equivale a la adición de 6,18 mg de EMCS (pureza del 75%) a cada 20 mg de toxoide diftérico.
La activación del toxoide diftérico se llevó a cabo disolviendo cada alícuota de 20 mg de toxoide diftérico en 1 ml de tampón fosfato de sodio 0,2 M, pH 6,45. Se disolvieron alícuotas de 6,18 mg de EMCS en 0,2 ml de dimetilformamida ("DMF"). En condiciones de oscuridad, se añadió EMCS gota a gota en cantidades de 50 microlitros ("\mul") al TD con agitación. Tras 2 horas de incubación en la oscuridad, la mezcla se cromatografió en una columna de Sephadex G50 equilibrada con tampón citrato de sodio 0,1 M, pH 6,0, que contenía EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,1 mM.
Se concentraron las fracciones que contenían toxoide diftérico activado con EMCS sobre una membrana de ultrafiltración PM 10 en condiciones de oscuridad. El contenido de proteína del concentrado se determinó por los métodos de Lowry o Bradford. El contenido de EMCS del transportador se determinó por incubación del transportador activado con cisteína-HCl seguido por la reacción con reactivo de Ellman 10 mM, ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) 10 mM. La diferencia de densidad óptica entre un tubo de blanco que contenía cisteína-HCl y el tubo de muestra que contenía cisteína-HCl y el transportador se tradujo en el contenido de grupos EMCS usando el coeficiente de extinción molar de 13,6 x 10^{3} para el ácido 5-tio-2-nitrobenzoico a 412 nm.
El contenido de cisteína reducida (-SH) del péptido también se determinó utilizando el reactivo de Ellman. Se disolvió aproximadamente 1 mg de péptido en 1 ml agua saturada con gas nitrógeno y una alícuota de 0,1 ml de esta disolución se hizo reaccionar con reactivo de Ellman. Utilizando el coeficiente de extinción molar del ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (13,6 x 10^{3}) se calculó la cisteína libre, -SH. Una cantidad de péptido que contenía suficiente -SH libre para reaccionar con cada 25 grupos amino activados por EMCS en el transportador se disolvió en tapón citrato de sodio 0,1 M, pH 6,0, que contenía EDTA 0,1 mM y se añadió gota a gota al transportador activado por EMCS en condiciones de oscuridad. Una vez que se había añadido toda la disolución peptídica al transportador, la mezcla se incubó durante la noche en la oscuridad bajo una atmósfera de gas nitrógeno saturada con agua.
El conjugado del péptido unido al transportador mediante EMCS se separó de los demás componentes de la mezcla mediante cromatografía en una columna de Sephadex G50 equilibrada con bicarbonato de amonio 0,2 M. El conjugado eluído en el volumen inicial ("void volume") de la columna se liofilizó y se almacenó desecado a 20ºC hasta su uso.
El conjugado resultante puede caracterizarse en cuanto al contenido en péptido mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, análisis de aminoácidos, aumento de peso, etc. Se determinó que los conjugados de los péptidos 1 y 4 con espaciador y toxoide diftérico producidos por este método tenían una razón de péptido / transportador eficaz de 5 - 35 moles de péptido por 100 kD de PM de transportador y todos se consideraron adecuados como inmunógenos para la inmunización de animales de prueba. Preferiblemente, el intervalo de péptido de 10 - 30 moles por 100 kD de PM de TD produjo una respuesta inmunológica eficaz.
Método B
En un método preferido, se prepararon conjugados que comprendían GRP1 acoplado a TD y el péptido GRP4 acoplado a TD, a temperatura ambiente tal como sigue. Se disolvió TD purificado (400 mg) en 20 ml de tampón fosfato 0,5 M, pH = 6,6, saturado con gas nitrógeno dando una disolución de TD de 20 mg/ml. La disolución de TD se colocó en una botella de vidrio ámbar oscuro de 60 ml (que sirvió como recipiente de reacción y depósito de filtración). El reactivo de acoplamiento EMCS (123,6 mg) se disolvió en 2,0 ml de dimetilformamida. Se añadió la disolución de EMCS gota a gota a la disolución de TD durante un periodo de 15 minutos con agitación continua. La botella se tapó y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y 45 minutos adicionales, para formar TD activado (M-TD). El M-TD se purificó entonces mediante diafiltración usando un sistema de ultrafiltración en canal fino de Amicon modelo TFC10, según el manual de funcionamiento I-113G con una membrana de ultrafiltración Diaflow XM50. El M-TD se lavó dos veces con volúmenes de 420 ml de tampón fosfato, concentrando hasta 20 ml cada vez, después se lavó una vez más con 420 ml de tampón citrato de sodio 0,1 M, pH = 6,0, que contenía EDTA 0,1 M y se concentró la disolución hasta 20 ml.
Para obtener el conjugado GRP1-TD, se colocaron 2,02 ml de disolución de M-TD (que contenía 22,3 mg de M-TD) en un vial de vidrio ámbar oscuro de 10 ml, después se disolvieron 13 mg del péptido GRP1 en tampón citrato dando 40 mg/ml de péptido y se añadió gota a gota a la disolución de M-TD con agitación. Para obtener el conjugado GRP4-TD, se colocaron 2,21 ml de disolución de M-TD (que contenía 24,4 mg de M-TD) en un vial de vidrio ámbar oscuro de 10 ml, después se disolvieron 13 mg del péptido GRP4 en tampón citrato dando 40 mg/ml de péptido y se añadió gota a gota a la disolución de M-TD con agitación.
Se dejó que las reacciones avanzaran durante la noche en la oscuridad. Cada conjugado se extrajo de los recipientes de reacción y se dializaron por separado en tubos de diálisis con un valor de corte de 12.000 - 14.000 de PM frente a 5 cambios de 500 ml de disolución de bicarbonato de amonio 0,1 M. Cada conjugado se liofilizó. Los conjugados se analizaron entonces mediante análisis de aminoácidos y se determinó que sus razones de péptido frente a sustitución de TD eran de 21,8 péptidos por 10^{5} el PM de TD para GRP1-TD y de 21,1 péptidos por 10^{5} el PM de TD para GRP4-TD.
Los conjugados de los péptidos 1 y 4 con espaciador y TD producidos por este método tienen una razón de péptido/transportador eficaz de 5 - 35 moles de péptido por 100 kD de PM de transportador y todos se consideran adecuados como inmunógenos. Un intervalo de razón preferida para producir una respuesta inmunológica eficaz es de 10 - 25 moles de péptido por 100 kD de PM de TD.
Preparación de inmunógenos
Se usaron inmunógenos que contenían péptido 1 o péptido 4 con un espaciador conjugado con TD, tal como se describió anteriormente para inmunizar conejos. Los inmunógenos se prepararon tal como sigue: El conjugado se disolvió en solución salina tamponada con fosfato de sodio 0,15 M, pH 7,3 hasta una concentración de 3,79 mg/ml. La disolución de conjugado se añadió al adyuvante Montanide ISA (703) (Seppic, Inc.) en una razón de 30 : 70 (peso :
peso) de disolución de conjugado con respecto a Montanide ISA 703, después la mezcla de homogeneizó usando un homogeneizador Silverson durante 3 minutos a 8.000 rpm para formar una emulsión que contenía 1 mg/ml de conjugado.
Inmunización y recogida de muestras
Se inyectó por vía intramuscular a conejos 0,1 ml de inmunógeno que consistía en 0,1 mg del conjugado GRP1-TD o GRP4-TD. A cada conejo se le administraron inyecciones de inmunógeno en las semanas 0 y 4. Se recogió sangre de cada conejo en las semanas 6 y 8 del experimento. Se preparó el suero de cada muestra de sangre y se almacenó a -20ºC hasta que se utilizó en ensayos para determinar la presencia de anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina.
Ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA)
Se utilizó un ELISA en fase sólida para detectar la reacción o la reacción cruzada de antisueros obtenidos contra el péptido 1 y el péptido 4 de cada conejo inmunizado. El ELISA se llevó a cabo recubriendo placas de 96 pocillos de poliestireno (IMMULON II, Dynatech) con 25 \mul/pocillo de 10 \mug/ml de péptido 1 unido a albúmina sérica bovina (BSA) ("GRP1-BSA"), o péptido 4 unido a antígeno BSA ("GRP4-BSA") en tampón glicina-HCl 0,1 M, pH 9,5. Las placas se incubaron durante la noche a 4ºC y posteriormente se lavaron con tampón.
Los antisueros obtenidos a partir de los conejos inmunizados se diluyeron en serie hasta un intervalo de 10^{-1} a 10^{-8} en tampón de hemaglutinación BSA-FTA al 1%, pH 7,2. Se incubaron 25 \mul de antisuero de prueba por pocillo con cada péptido de prueba durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la incubación, las placas se lavaron meticulosamente con tampón para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Cada pocillo se trató con 25 \mul de IgG de cabra anti-conejo biotinilada (H + L) diluida 1 : 1000 en tampón de dilución BSA-FTA al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar las placas para eliminar el reactivo anti-conejo no unido, cada pocillo se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con 25 \mul de conjugado de avidina-fosfatasa alcalina diluido 1 : 1000 en tampón de BSA-FTA al 1%. Las placas se lavaron meticulosamente para eliminar el reactivo de avidina-fosfatasa alcalina no unido, y se incubaron con 25 \mul de 1 mg/ml de fosfato de p-nitrofenilo ("PNPP") en tampón de dietanolamina al 10% que contenía un 0,01% de MgCl_{2}.6H_{2}O, pH 9,8. Se dejó que las placas se desarrollaran hasta que la absorbancia de la reacción, a una longitud de onda de 490 nm, alcanzó una densidad óptica de entre 0,8 a 1,5. Para probar la especificidad de los antisueros producidos por los conejos, también se inmunizaron los conejos con TD y, para las pruebas de ELISA, las placas se recubrieron con TD como antígeno para determinar la reactividad de los antisueros producidos contra el transportador.
La figura 2 muestra los resultados del ELISA usando péptido 1 / GRP1 y la figura 3 muestra los resultados del ELISA usando péptido 4 / GRP4 como el antígeno. Tal como se observa en la figura 2, los resultados del ELISA muestran que los conejos inmunizados con el conjugado péptido 1-separador-TD produjeron altos títulos de anticuerpo que se unían específicamente al péptido 1, tal como se indica por el anticuerpo que se une al péptido 1 incluso a altas diluciones (1 : 100.000) del antisuero. De manera similar, la figura 3 muestra que los conejos inmunizados con el conjugado péptido 4-espaciador-TD produjeron altos títulos de anticuerpos anti-péptido 4. Tal como se observa en las figuras 2 y 3, los conejos inmunizados contra cada péptido produjeron anticuerpos que se unían específicamente a cada péptido a pequeñas concentraciones de los antisueros. Los datos indican que los anticuerpos anti-péptido 1 y anti-péptido 4 tienen una gran capacidad para unirse a los péptidos 1 y 4 del receptor CCK-B/gastrina. Los datos también muestran que la inmunización de los conejos con los conjugados provoca potentes respuestas inmunológicas contra el péptido 1 y el péptido 4, respectivamente. Además, los conejos inmunizados con el conjugado del péptido 1 o del péptido 4 tenían una apariencia y comportamiento normales y no mostraron ningún síntoma de enfermedad o patología durante los experimentos.
Ejemplo 2
Los siguientes experimentos se realizaron para establecer la especificidad de los anticuerpos obtenidos en conejos contra el péptido GRP1-TD que contenía el espaciador de Ser descrito en el ejemplo 1, usando el Método B. Se llevó a cabo una serie de pruebas para evaluar la especificidad de los anticuerpos de conejo inducidos por inmunización con GRP1-TD y purificados por afinidad mediante inmunoadsorción sobre una columna de Sepharose con GRP1-Ser.
Se utilizó un ELISA-inhibición para evaluar la especificidad de los anticuerpos purificados por afinidad para el péptido GRP1-Ser. Los ensayos se realizaron tal como sigue: El conjugado GRP1-Ser-BSA se recubrió sobre placas de 96 pocillos (Immulon, de fondo en U) mediante incubación durante la noche de 50 \mul de disolución 2 \mug/ml de conjugado en tampón glicina (0,1 M, pH = 9,5) a 4ºC. Los Ac (anticuerpos) anti-GRP1 purificados por afinidad (en una concentración final de 10 ng/ml) se combinaron con varios inhibidores (en series de dilución 1 : 10) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los inhibidores incluyeron GRP1-Ser, GRP1 EPT, Ser, gastrina 17 humana (1-9)-espaciador de Ser (hG17(9)-Ser), GRP1 EPT + Ser, y tampón (sin inhibidor). El tampón de incubación consistió en PBS (solución salina tamponada con fosfato) + 0,5% de BSA + 0,05% de Tween 20 + 0,02% de NaN_{3}. En las etapas posteriores se utilizó el mismo tampón sin BSA. Las placas de 96 pocillos se lavaron para eliminar el GRP1-Ser-BSA no unido y se añadieron mezclas de Ac + inhibidor (50 \mul/pocillo). Tras 1 hora, las placas se lavaron y se añadió el conjugado de Ig de cabra anti-ratón (H + L)-fosfatasa alcalina (Zymed) (dilución 1 : 2000). Tras 1 hora de incubación, las placas se lavaron para eliminar el reactivo no unido y se añadieron 50 \mul/pocillo de sustrato pNPP (Sigma) (1 mg/ml) en tampón sustrato (PBS + 0,1 mg/ml de MgCl_{2} + 10% de dietanolamina + 0,02% de NaN_{3}). Tras una incubación de 60 minutos, se midió la absorbancia en un lector MRX (Dynatech Laboratories). Las muestras se aplicaron por duplicado y se calcularon las medias para cada concentración. La unión de fondo (establecida con anticuerpos anti-GnRH de conejo purificados por afinidad) se restó de todos los valores y se calculó el % de inhibición en relación con ausencia de inhibidor añadido (Ac anti-GRP1 + tampón) para cada inhibidor probado: % de inhibición = (100) (1-((A_{sin \ inhibición}- A_{inhibición}) / A_{sin \ inhibición}), en la que A = Absorbancia. Los resultados se muestran en la figura 4.
La figura 4 presenta el porcentaje de inhibición de la unión del anticuerpo como una función de la concentración de inhibidor. Como puede observarse en la figura, el péptido GRP1-Ser inhibió completamente la unión del anticuerpo a GRP1-Ser-BSA. Aproximadamente se logró un inhibición del 60% con el péptido GRP1 EPT, que no contiene la secuencia espaciadora de Ser, y mediante una mezcla equimolar de GRP1 EPT más el espaciador de Ser. El fracaso de estos péptidos para producir la inhibición completa sugiere que una proporción de anticuerpos era específica para un(os) epítopo(s) que comprende(n) elementos tanto de GRP1 como de las secuencias espaciadoras de Ser. No se obtuvo inhibición ni con la propia secuencia espaciadora de Ser ni con un péptido no relacionado que llevaba el espaciador de Ser ("hG17(9)-Ser", que consiste en nueve residuos del extremo amino terminal de hG17 seguidos por el espaciador de Ser). Estos resultados del ELISA demuestran que la preparación de anticuerpo purificado por afinidad era específica para el péptido GRP1-Ser, y que el 60% de la actividad de unión estaba dirigida contra el componente de epítopo del receptor de gastrina del péptido.
Ejemplo 3
Las células tumorales AR42J (European Collection of Animal Cell cultures, Porton Down, RU) se derivan de un adenocarcinoma pancreático de rata y se sabe que tienen receptores CCK-B/gastrina bien caracterizados. Por tanto, las células AR42J se probaron para confirmar la expresión del receptor CCK-B/gastrina y la especificidad del receptor por hG17 mediante inhibición por radioligando. Las células AR42J se cultivaron a 37ºC con 7% de CO_{2} en medio de cultivo RPMI 1640 completo (Sigma) complementado con 10% de FCS (suero de ternera fetal) (Gemini Bioproducts), glutamina 2 mM (JRH Biosciences), piruvato de sodio 1 mM (JRH B.) y gentamicina 50 \mug/ml (Gemini Bioproducts). Las células se recogieron de matraces en T de 175 cm^{2} (Falcon Plastics) con PBS que contenía 0,25% de EDTA, después se lavaron dos veces con PBS (sin EDTA) mediante centrifugación (400 x g durante 10 minutos). Las células se mantuvieron a 0 - 4ºC durante todas las manipulaciones. Se preparó una única suspensión celular en tampón y la concentración celular se ajustó a 10^{6} células/ml. Se añadieron alícuotas de 1 ml de la suspensión celular a tubos de cultivo de 12 x 75 mm, después las células se centrifugaron y los sobrenadantes se desecharon. Las células se resuspendieron en PBS (0,1 ml/tubo) que contenía G17 humana (hG17), hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) o sin péptido. Las concentraciones de péptido fueron de 1,0 ng/ml, 100 ng/ml y 10 \mug/ml. Se añadió a cada tubo una alícuota de 0,1 ml de ^{125}I-hG17 (NEN), que contenía aproximadamente 26.300 CPM (actividad específica, 2200 Ci/mmol). Los tubos se agitaron en vórtex, después se incubaron durante 15 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS, después se contaron en un contador \gamma (Wallac). Las muestras se aplicaron por duplicado. Se restaron los recuentos de fondo, después se calculó el % de inhibición de la unión de ^{125}I-hG17 por cada inhibidor usando la ecuación: % Inhibición = (100)(1-((CMP_{sin \ inhibición}-CPM_{inhibición})/CPM_{sin \ inhibición}).
Los resultados de las pruebas de inhibición por unión a radioligando se muestran en la figura 5, que presenta las medias (\pm EE) de los valores individuales. Tal como puede observarse en la figura, la unión de ^{125}I-hG17 a las células AR42J se inhibió por hG17. El grado de inhibición aumentó con la cantidad de inhibidor añadido, hasta un 32% de inhibición con 1 \mug de hG17 por tubo, la mayor concentración de péptido probada. A la inversa, GnRH no produjo inhibición a las dos concentraciones superiores probadas (el 6% de inhibición obtenido con 100 pg de GnRH se consideró no específica), lo que indica que la inhibición por hG17 era específica para la gastrina. Estos resultados confirmaron la expresión en la superficie celular del receptor de gastrina por las células tumorales AR42J.
Ejemplo 4
Se evaluó la unión de anticuerpos específicos para GRP1-Ser a las células AR42J mediante inmunofluorescencia. Las células AR42J se hicieron crecer tal como en los ejemplos anteriores y se recogieron, con rascadores para células, de matraces en T de 175 cm^{2} y se lavaron dos veces con tampón (PBS con 0,02% de NaN_{3}) mediante centrifugación (400 x g durante 7 min). Las células se mantuvieron a 0 - 4ºC durante todas las manipulaciones. Se preparó una única suspensión celular en tampón y la concentración celular se ajustó a 10^{6} células/ml. La suspensión celular se añadió a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (1 ml/tubo). Las células se sedimentaron mediante centrifugación y los sobrenadantes se aspiraron. Las células se resuspendieron en tampón (0,1 ml/tubo) que contenía inhibidores peptídicos (1,0 mg/ml). Los inhibidores incluían GRP1-Ser, GnRH, hG17(9)-Ser y tampón (sin inhibidor). Se añadieron anticuerpos, incluyendo anti-GRP1-Ser de conejo (100 \mug/ml), anti-TD de conejo purificado por afinidad (control negativo, 100 \mug/ml), antisuero anti-AR42J de ratón (control positivo, dilución 1:100, inactivado por calor) o suero de ratón normal, a los tubos apropiados y se mezclaron los contenidos. Las células se incubaron durante 1 hora, con mezclado ocasional. Las células se lavaron entonces tres veces con tampón, y se añadió 0,1 ml de IgG de cabra anti-conejo marcada con fluoresceína (Antibodies Incorporated) (diluido 1:50) por tubo. Las células tratadas con sueros de ratón se revelaron con un reactivo de IgG anti-ratón marcado con fluoresceína (Zymed). Las células se resuspendieron mediante agitación en vórtex, después se incubaron durante 1 hora. Las células se lavaron de nuevo tres veces, después se resuspendieron en glicerol : PBS (1:1, v:v), con 50 \mul/tubo. Se prepararon preparaciones frescas con el contenido de cada tubo y las células se examinaron usando un microscopio fluorescente Laborlux 12 (Leitz). La fluorescencia se puntuó en una escala del 0 al 4, representando el 0 la fluorescencia de fondo (obtenida con el suero de ratón normal) y representando el 4 la fluorescencia máxima (obtenida con el antisuero control positivo anti-AR42J de ratón).
Los resultados de las pruebas de inmunofluorescencia se presentan en la tabla 1. Tal como puede observarse en la tabla, las células AR42J tratadas con anticuerpos anti-GRP1-Ser en ausencia de inhibidores peptídicos presentaron una fuerte fluorescencia, lo que indica que el anticuerpo se une a las células. Los anticuerpos anti-TD de conejo no produjeron tinción fluorescente, lo que demuestra que la tinción observada con los anticuerpos anti-GRP1-Ser no fue una consecuencia de la unión no específica a la superficie celular por la inmunoglobulina de conejo. Además, se demostró que la unión era específica para el péptido GRP1-Ser. La adición de GRP1-Ser inhibió completamente la unión, mientras que péptidos no relacionados, incluyendo hG17(9)-Ser y GnRH, no producían inhibición. Dado que el epítopo de GRP1 comprende los residuos 5 - 21 del receptor de gastrina, se concluyó que los anticuerpos anti-GRP1-Ser eran específicos para el receptor de gastrina expresado por las células AR42J.
TABLA 1
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Ejemplo 5
Se cultivaron células AR42J, pasos números 16 - 18, en medio RPMI-1640 que contenía 10% de FCS y glutamina 2 mM. Todas las células se mantuvieron a 37ºC en 5% de CO_{2} en aire al 100% de humedad, se hicieron crecer hasta el 80% de confluencia en matraces T75 (Falcon, Londres, RU) y se realizó un paso tras un tratamiento con 0,02% de EDTA para llevar las células adherentes a suspensión. Las células se incubaron durante 10, 30 segundos, 30 minutos y 1 hora con anticuerpo anti-receptor CCK-B/gastrina (aRG) generado en conejos con un inmunógeno del péptido 1 del receptor CCK-B/gastrina de la invención, tal como se describe en el ejemplo 1, que se ha purificado mediante cromatografía de afinidad en una columna preparada con el péptido 1.
Las células se fijaron en glutaraldehído al 1% durante una hora y se prepararon para estudios de microscopía inmunoelectrónica (InmunoEM) usando técnicas habituales. Las suspensiones celulares se centrifugaron dos veces a 2000 rpm durante 2 minutos y después los sedimentos celulares se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El sedimento de células se infiltró con resina plástica LR-White. Se cortaron cortes ultrafinos de 70 - 90 nm de espesor y se colocaron en rejillas de níquel recubiertas de Pioloform. Estas rejillas se colocaron en suero de cabra normal (Dako, High Wycombe, RU) en albúmina sérica bobina (BSA) al 0,1% (Sigma, Poole, Dorset) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las rejillas se enjuagaron con PBS, después se incubaron con un anticuerpo secundario, anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con biotina (marcado con oro), diluido a 1:50 en BSA al 1%, durante 1 hora a temperatura ambiente. Se realizaron experimentos control sin anticuerpo secundario. Tras el lavado final con PBS, las rejillas se contratiñeron en acetato de uranilo acuoso saturado durante 3 minutos y citrato de plomo de Reynold durante 3 minutos. Se contaron las partículas de oro en la membrana celular, en el citoplasma, en la membrana nuclear y dentro del núcleo. Un observador independiente contó 25 células/rejilla. Para los controles, se expusieron células AR42J a anticuerpos durante menos de 1 segundo y se usaron células hepáticas que carecían de receptor CCK-B/gastrina. Las células AR42J expuestas a IgG normal también se usaron como controles para determinar la unión no específica de los anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina. Los resultados de estos experimentos se muestran en la tabla 2 y en la figura 6.
TABLA 2 Distribución de partículas de inmunomarcaje con oro del receptor CCK-B/gastrina dentro de células AR42J
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Tal como se demuestra en la tabla 2 y en la figura 6, las partículas de anticuerpo de inmunomarcaje con oro unidas al receptor CCK-B/gastrina se localizaron en la membrana plasmática, el citoplasma, la membrana nuclear y la matriz nuclear de las células de adenocarcinoma, lo que demuestra adicionalmente que el complejo anticuerpo/receptor se internaliza en las células.
Tal como se observa en la tabla 2, los estudios de inmunoEM que usan un antisuero dirigido contra el extremo amino terminal del receptor CCK-B/gastrina muestran que tras una hora de incubación, la distribución del anticuerpo anti-receptor CCK-B/gastrina con inmunomarcaje con oro se internaliza rápidamente, ya que el 12% del complejo anticuerpo-receptor está asociado con la membrana celular, el 36,6% está dentro del citoplasma, el 7,9% está en la membrana nuclear y, bastante sorprendentemente, el 43,5% está dentro del núcleo de la célula. Se encuentran zonas de intensa inmunorreactividad del receptor CCK-B/gastrina dentro del núcleo en la cromatina, lo que puede sugerir sitios de unión específicos para la regulación del ADN.
Los estudios de microscopía electrónica con anti-inmunoglobulina conjugada con perlas de oro (inmunomarcaje con oro) revelan que se produce un recambio extremadamente rápido del complejo anti-receptor/receptor en las células tumorales; tan sólo 10 segundos tras la exposición a los anticuerpos pueden detectarse los complejos en el núcleo de la célula, tal como se observa en la figura 6.
Ejemplo 6
Se hicieron crecer líneas celulares de adenocarcinoma, concretamente AR42J, HCT116, C170HM2, LoVo, ST16 y MGLVA1, in vitro y se recogieron tal como se describe en el ejemplo 3. Las células procedentes de 30 matraces T-75 se suspendieron en 5 ml de tampón de homogeneización (hidrogenocarbonato de sodio 1 mM, cloruro de magnesio 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 nM, cloruro de sodio 40 mM, 10 \mul de leupeptina, pepstatina 1 \muM, EDTA 5 mM [Sigma]). La homogenización se llevó a cabo mediante 5 ráfagas de 5 segundos de duración en un homogenizador. Para las membranas extranucleares, los desechos tisulares se sedimentaron mediante centrifugación a 500 g, 7 minutos, 4ºC. El sedimento se desechó y el sobrenadante se centrifugó a 500 g, 4ºC para eliminar los desechos adicionales. El sobrenadante se volvió a centrifugar a 48.000 g, 1 hora, 4ºC. El sedimento que contenía la preparación de membrana extranuclear se suspendió en disolución Tris/NP-40 (TRIZMA 0,1 M, 0,5% de NONIDET P40 [Sigma Chemical]).
Para las preparaciones de membrana nuclear, tras la homogenización en un segundo tampón de homogeneización (Tris-HCl 25 mM, pH 7,4, 0,1% de TRITON 100, sacarosa 0,32 M, MgCl_{2} 3 mM, EGTA 2 mM, tetraclorhidrato de espermina 0,1 mM, PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) 2 mM, clorhidrato de bezomidina 10 mM, clorhidrato de aminoacetonitrilo de EGTA 3 mM [Sigma]), se sedimentaron los desechos tisulares mediante centrifugación a 400 g, durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento se resuspendió en sacarosa al 55% (0,2 M) en agua de calidad para HPLC. Esta mezcla se centrifugó a 60.000 g durante 1 hora a 4ºC. El sedimento se lavó con NONIDET P40 al 0,4% en tampón de homogenización sin TRITON 100. El sedimento se centrifugó a 700 g durante 15 min a 4ºC y se resuspendió en tampón de homogenización sin TRITON 100.
El contenido de proteínas se determinó mediante el método de Lowry (usando un kit de Pierce). Las muestras que contenían 10 - 15 \mug de proteína se cargaron sobre un gel de electroforesis PAGE de poliacrilamida con gradiente del 8 - 16% de Tris/glicina (sistemas Novex R y D) en tampón Tris/glicina y se desarrolló durante 90 minutos a 125 voltios constantes, 36 mA. El gel se fijó en ácido acético glacial al 10% durante 1 hora y las muestras se secaron en una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron en BSA al 1% durante 1 hora, seguido por incubación con antisuero de GRP1 (con y sin preabsorción) durante 1 hora. Se detectó la unión a anticuerpos mediante el método del complejo avidina : biotina-peroxidasa, usando diaminobencideno como sustrato. Los resultados del análisis de Western blot (inmunotransferencia) usando antisuero de conejo obtenido contra el péptido 1 (antisuero anti-GRP1 de conejo) se muestran en la figura 7 y en la figura 8.
Tal como se muestra en la figura 7, los marcadores de peso molecular proteico oscilan desde 116, 66, 45 y 26 kDa. La inmunotransferencia muestra una banda inmunorreactiva anti-péptido 1 prominente que se localiza a aproximadamente 43 kDa en todas las células de adenocarcinoma estudiadas, es decir, HCT116, C170HM2, LoVo, ST16 y MGLVA1, excepto en una (AP5LV). Esta proteína corresponde a una forma truncada del receptor CCK-B/gastrina. Algunas líneas celulares (HCT116 y C170HM2) muestran al menos otras 3 bandas, que oscilan en un peso molecular de entre 60 y 100 kDa. Los datos indican que los anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina pueden reconocer y unirse a varias isoformas del receptor CCK-B/gastrina en las células tumorales.
La figura 8 muestra un Western blot de membrana extranuclear (MEN) y plasmática de las células de adenocarcinoma C170HM2 y HCT116. Tal como se muestra en la figura 8, las líneas celulares de adenocarcinoma probadas para los receptores CCK-B/gastrina de la MEN demuestran la existencia de dos bandas fuertemente teñidas: una de aproximadamente 43 kDa y la otra de aproximadamente 66 kDa. Cuando sólo se teñía la fracción de membrana plasmática, estaba presente una única banda de aproximadamente 66 kDa. Por tanto, los estudios de Western blot confirman los resultados de inmunoEM de que el receptor CCK-B/gastrina está presente en las células tumorales de adenocarcinoma, aunque los estudios de inmunoEM no distinguen entre las isoformas del receptor CCK-B/gastrina. Los datos indican que los presentes inmunógenos provocan la formación de anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina que pueden reconocer y unirse a varias isoformas del receptor, lo que podría ser ventajoso para el tratamiento de estos tumores.
Ejemplo 7
Se inyectaron células de adenocarcinoma C170HM2 por vía intraperitoneal en ratones atímicos y se dejó que los tumores crecieran en el hígado. Los ratones control recibieron una infusión de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y los ratones de experimentación recibieron una infusión de anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina. En el Grupo 1, a cada ratón se le administró diariamente una infusión con 0,5 mg de anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina de conejo generados contra el péptido 1 (anti-péptido 1 de conejo, Rbt@GRP1). En el Grupo 2, cada ratón recibió diariamente 0,5 mg de anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina de conejo generados contra el péptido 4 (anti-péptido 4 de conejo, Rbt@GRP4). Se estudiaron los ratones durante un periodo de 40 días tras la infusión de anticuerpos, se sacrificaron y los tumores se extrajeron para su estudio. Se evaluó el peso, el tamaño y el área de la sección transversal de los tumores mediante técnicas habituales. Los resultados se muestran en las figuras 9 y 10.
Tal como se observa en las figuras 9 y 10, la implantación de la línea celular cancerígena C170HM2 de adenocarcinoma colorrectal en ratones sin tratamiento da como resultado el rápido crecimiento de grandes masas tumorales, tal como se determinó por el peso del tumor, o por el tamaño del tumor, y el área de la sección transversal de los tumores. Sin embargo, la infusión de los animales con los anticuerpos anti-péptido 1 de conejo o anti-péptido 4 de conejo da como resultado una notable disminución en el número de animales que tiene algún tumor detectable, así como en el peso y el tamaño de los tumores en animales que los tienen cuando se comparó con el control. El mismo efecto puede observarse para los anticuerpos anti-péptido 1 cuando se calcula el peso medio del tumor, el tamaño medio del tumor o el número medio de tumores. Estos datos se muestran en las figuras 11, 12 y 13.
Se obtiene una mayor compresión de la distribución dentro de la población calculando las medianas de los números, pesos y tamaños de los tumores. Los resultados se muestran en las figuras 14, 15 y 16. Tal como se observa en estas figuras, el inmunógeno anti-péptido 1 de conejo fue sistemáticamente más eficaz que el anti-péptido 4 de conejo en la inhibición del crecimiento tumoral.
Ejemplo 8
Se generó una carga tumoral mayor en ratones atímicos usando la línea celular C170HM2 de cáncer de colon mediante un método tal como se describe en el ejemplo 7, pero con un inóculo celular inicial mayor. C170HM2 es un modelo de xenoinjerto invasor del hígado. Los ratones control y de experimentación también se trataron como se describe en el ejemplo 7.
Cuarenta días tras la infusión del anticuerpo, los ratones se sacrificaron y los tumores hepáticos se extrajeron y se estudiaron. Las figuras 17, 18 y 19 muestran los resultados de estos experimentos. La figura 17 muestra el número medio y su mediana de los tumores hepáticos de los animales control y los tratados con anticuerpo anti-receptor CCK-B/gastrina. Los datos muestran que los anticuerpos de conejo anti-receptor CCK-B/gastrina ("Conejo@GRP") son eficaces en la inhibición del crecimiento de los tumores metastásicos en el hígado. Hay una disminución estadísticamente significativa en el número medio de tumores hepáticos en los hígados de los ratones en los que se usó anti-péptido 1 de conejo (prueba de la t de Student), p = 0,0084 y en la mediana del número de tumores hepáticos, p = 0,0016 (Mann Whitney) cuando se comparó con los controles. Los ratones tratados con anticuerpos anti-péptido 4 también muestran una disminución en el número medio de tumores hepáticos; sin embargo, no hubo diferencia en el número medio de tumores hepáticos en estos últimos animales cuando se comparó con los controles.
La figura 18 muestra que los anticuerpos anti-péptido 1 y anti-péptido 4 también pueden reducir la media y la mediana de los pesos tumorales de las metástasis hepáticas cuando se compara con los animales control. Los datos en la figura 19 muestran que los ratones tratados con anti-receptor CCK-B/gastrina también tenían una disminución significativa en la media y la mediana del área de la sección transversal de los tumores hepáticos cuando se compara con los animales control.
Los datos para el anti-péptido 1 indican que los anticuerpos anti-receptor CCK-B/gastrina de la invención son eficaces en el control de la diseminación y el crecimiento del cáncer de colon dependiente de gastrina en el hígado, que constituye el sitio principal de diseminación metastásica de este cáncer.
Ejemplo 9
Estos estudios se llevaron a cabo para confirmar la inmunorreactividad de GRP1 en las células C170HM2. El objetivo del estudio fue evaluar la localización tumoral del antisuero obtenido contra GRP1 y determinar su efecto terapéutico sobre el crecimiento de las células C170HM2 dentro del hígado de ratones atímicos. Las células C170HM2 se inyectaron por vía intraperitoneal en ratones atímicos, tal como se describió anteriormente en el ejemplo 7. El antisuero de GRP1 se obtuvo en conejos. El antisuero se radiomarcó con ^{125}I y se administró a ratones atímicos con xenoinjertos de C170HM2 establecidos mediante una inyección en la vena de la cola. Los ratones control recibieron suero de conejo normal radiomarcado con ^{125}I. Los ratones se sacrificaron en puntos de tiempo crecientes tras la inyección de una dosis única de anticuerpos marcados con ^{125}I. La radiactividad se midió como cuentas por minuto y por gramo (CPM/g) de tejido y se calculó la razón de hígado / tumor hepático.
La figura 20 es un gráfico que muestra los anticuerpos anti-GRP1 de conejo radiomarcados unidos a los tumores hepáticos frente al control. Tal como se observa en la figura, se unen más anticuerpos anti-GRP1 de conejo al tejido tumoral hepático cuando se compara con los controles. La figura 20 también muestra la razón de tumor hepático / hígado en el eje y con el tiempo creciente en el eje x para el suero de conejo normal radiomarcado y el antisuero GRP1. El suero de conejo normal logró una razón de 1 desde el día 1, que permaneció constante hasta el día 5. Esto indica que el nivel de radiomarcador en el tumor hepático y en el hígado normal fue igual. La razón para el antisuero de GRP1 acumulado se aproximó exponencialmente a 2 en el día 5. Esto indica que el antisuero GPR1 radiomarcado se localiza específicamente dentro de los tumores hepáticos C170HM2.
Ejemplo 10 Efecto terapéutico del antisuero de GRP1 sobre xenoinjertos de C170HM2
Los xenoinjertos de tumor C170HM2 se iniciaron mediante inyecciones por vía intraperitoneal de células. Se usaron tres inóculos celulares diferentes para generar 3 niveles de carga tumoral. El antisuero de GRP1 se administró pasivamente mediante inyección en la vena de la cola diariamente desde el día 0. El tratamiento terminó el día 40.
Efecto del antisuero de GRP1 sobre la "tasa de formación" de tumores
El parámetro inicial evaluado fue el número medio de tumores dentro del hígado, lo que se muestra en la figura 21. Los controles tratados con antisuero de conejo normal se agruparon en inóculos celulares crecientes. Tal como se observa en la figura 21, en los grupos control el número medio de tumores por hígado estaba entre 1 y 3. En el grupo tratado con antisuero de GRP1, el número medio de tumores por hígado fue inferior a 1 para los tres inóculos celulares, lo que fue significativo para los 3 experimentos (un inóculo, n = 18, p = 0,003; 2 inóculos, n = 12, p = 0,0001 y 3 inóculos, n = 20, p = 0,0068, análisis de Mann-Whitney).
Efecto del antisuero de GRP1 sobre el peso del tumor de los tumores establecidos
La figura 22 muestra el peso medio del tumor para los controles tratados con suero de conejo normal en el panel izquierdo, para los 3 inóculos celulares crecientes. La figura también muestra el peso medio del tumor de ratones atímicos tras el tratamiento con antisuero de GRP1, el peso medio del hígado se redujo en un 60% con los 3 inóculos celulares, lo que fue significativo para los 3 experimentos (un inóculo, p = 0,0016; 2 inóculos, p = 0,0084 y 3 inóculos, p = 0,0001, análisis de Mann-Whitney).
Inmunorreactividad de GRP1 en xenoinjertos de C170HM2 determinada por Western blotting
Se prepararon proteínas de membrana extranuclear de xenoinjertos de C170HM2 de 2/3 experimentos. Éstas se analizaron por Western blotting usando el antisuero de GRP1. La figura 23 es una fotografía del Western blot que muestra, en los xenoinjertos tratados con suero de conejo normal, 2 bandas inmunorreactivas que estaban presentes a 74 y 50 kDa, mostrando la primera banda la inmunorreactividad más fuente. En los xenoinjertos tratados con antisuero de GRP1 hay 2 bandas inmunorreactivas junto con una banda intermedia, no observada en los xenoinjertos control ni en las células que se hicieron crecer in vitro. Una banda de 50 kDa muestra la inmunorreactividad más fuerte. Esto indica que en los xenoinjertos tratados con el antisuero de GRP1 puede estar presente una mayor proporción de receptores CCK-B/gastrina como forma internalizada.
Análisis histológico de xenoinjertos de C170HM2
La figura 24 muestra una vista microscópica de un xenoinjerto de C170HM2 que invade un hígado de un ratón atímico. El tumor está compuesto generalmente por un centro necrótico con un borde de avance viable que aplasta a los hepatocitos cuando invade el hígado. Se midió el grado de apoptosis en el borde de avance viable de los tumores C170HM2 mediante el método túnel, visualizándose las células positivas mediante hibridación in situ. La figura 25 muestra que las células apoptóticas estaban presentes en las células tumorales viables, en los xenoinjertos tratados con antisuero de GRP1, pero no en los tumores tratados con suero de conejo normal.
Los datos muestran que el antisuero obtenido contra el epítopo del extremo amino terminal del receptor CCK-B/ gastrina se localiza selectivamente dentro de los tumores C170HM2 invasores del hígado. La neutralización del epítopo de GRP1 indujo un efecto significativo tanto sobre la "tasa de formación" de tumores como en la carga tumoral bruta de los tumores que se establecieron. Este efecto inhibidor de tumores puede deberse a (a) un efecto citostático general inducido por bloqueo del receptor CCK-B/gastrina y/o (b) un efecto indirecto de dirigir un anticuerpo al núcleo de la célula, dando como resultado posiblemente la apoptosis.
Bibliografía
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(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Michaeli, Dov
\hskip3.9cm
Caplin, Martyn E. 
\hskip3.9cm
Watson, Susan A. 
\hskip3.9cm
Grimes, Stephen 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones inmunogénicas para el receptor CCK-B/gastrina y métodos para el tratamiento de tumores
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Dimitrios T. Drivas, White & Case
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1155 Avenue of the Americas
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NY
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 10036-2787
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.30.
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO / AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Drivas, Dimitrios T.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 32.218
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: 1102865-0032
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE COMUNICACIONES TELEFÓNICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (212) 819-8200
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: (212) 354-8113
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no pertinente
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Leu Asn Arg Ser Val Gln Gly Thr Gly Pro Gly Pro Gly}
\sac{Ala Ser Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no pertinente
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Gly Ala His Arg Ala Leu Ser Gly Ala Pro Ile Ser}
\sac{Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no pertinente
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys}

Claims (16)

1. Inmunógeno que comprende un péptido activo que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 conjugada con un transportador inmunogénico.
2. Inmunógeno según la reivindicación 1, que comprende además una secuencia peptídica espaciadora, que separa el péptido activo del transportador.
3. Inmunógeno según la reivindicación 2, en el que el péptido espaciador tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
4. Inmunógeno según cualquier reivindicación anterior, en el que el transportador es el toxoide diftérico, el toxoide tetánico o la albúmina sérica bovina.
5. Inmunógeno según cualquier reivindicación anterior, para su uso en el tratamiento de un estado maligno producido por el crecimiento celular maligno dependiente de gastrina.
6. Uso de un inmunógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un agente para el tratamiento de un estado maligno producido por el crecimiento celular maligno dependiente de gastrina.
7. Anticuerpo contra un inmunógeno según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que reconoce y se une al receptor CCK-B/gastrina.
8. Anticuerpo según la reivindicación 7, en forma quimérica, monoclonal o humanizada.
9. Anticuerpo según la reivindicación 7 u 8, conjugado con una molécula citotóxica o radiactiva.
10. Anticuerpo según la reivindicación 9, en el que la molécula citotóxica es la toxina colérica o la molécula radiactiva se marca con ^{125}I o ^{131}I.
11. Anticuerpo según la reivindicación 7, 8, 9 ó 10 para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de gastrina.
12. Método para detectar un tumor que responde a gastrina que contiene receptores CCK-B/gastrina, que comprende exponer un anticuerpo según la reivindicación 7 a células aisladas de una muestra de biopsia de tumor y detectar el receptor CCK-B/gastrina unido al anticuerpo.
13. Anticuerpo según la reivindicación 7, para su uso in vivo en la obtención de imágenes de un tumor colorrectal dependiente de gastrina en un paciente.
14. Anticuerpo según la reivindicación 13, radiomarcado con ^{111}Indio o ^{90}Itrio.
15. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 7, 8, 9 ó 10, en la preparación de un agente para el tratamiento de un tumor dependiente de gastrina.
16. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 7, en la preparación de un agente para la obtención de imágenes de un tumor colorrectal dependiente de gastrina en un paciente.
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