MXPA99010424A - Compocisiones inmunogenicas al receptor cck-b/gastrina y metodos para el tratamiento de tumores - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a inmunogenes, composiciones inmunogénicas y a un método para el tratamiento de tumores que dependen de la gastrina. Los inmunogenes comprenden un péptido a partir del receptor CCK-B/gastrina conjugado a un espaciador y a un portador inmunogénico. Los inmunogenes son capaces de inducir anticuerpos in vivo los cuales se enlazan al receptor CCK-B/gastrina en las células tumorales, con ello, se previene que las hormonas peptídicas que estimulan el crecimiento se enlacen a los receptores, e inhiban el crecimiento celular del tumor. Los inmunogenes también comprenden anticuerpos contra el receptor CCK-B/gastrina para inmunización pasiva. La invención también se refiere a métodos de diagnóstico para la detección de tumores que dependen de la gastrina in vivo o a partir de una biopsia de tejido usando los anticuerpos de la invención.

Description

COMPOSICIONES INMUNOGENICAS AL RECEPTOR DE CCK- B/GASTRINA Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona gastrina se enlaza al receptor gastrina/colequistocinina (CCK)-B con alta afinidad vía sus aminoácidos 5 carboxi-ter inales . El receptor CCK-B/gastrina es una proteína de la membrana citoplásmica que se acopla vía una proteína G a las vías de transducción de señal intracelular que a su vez controlan la expresión de varios genes. La gastriaa es una hormona peptídica que se presenta en dos formas, la tetratriacontagastrina (G34) y heptadecagastrina (G17), y se sintetiza y se secreta por células especializadas. Las células G, que están localizadas en el antrum del estómago. La hormona se secreta en la sangre circulante y se enlaza específicamente a las células en el estómago, a saber, las células parietales y similares a la enterocromafina (ECL) , que directa o indirectamente afecta la secreción del ácido estomacal. Históricamente, las hormonas de gastrina se han REF.: 32011 asociado con la estimulación de la secreción del ácido gástrico (Edkins, J. S. 1905). (Las citas completas para las referencias citadas aquí se proporcionan en la sección de referencias que precede a las reivindicaciones) . En años recientes, se ha acumulado referencia de que la gastrina puede actuar como un factor trófico dentro del tracto gastrointestinal (Johnson, L. 1997) y que puede promover el crecimiento de cánceres gastrointestinales (Watson et al, 1989, Dickinson, C. J. 1995), así como cánceres no gastrointestinales que incluyen carcinoma de células pequeñas del pulmón (Rehfeld, et al. 1989) . En el proceso post-traduccional de la gastrina, es la forma carboxi-amidada "madura" la que se enlaza al receptor de gast rina/CCK-B vía el carboxi terminal (Kopin et al. 1992) . Se ha mostrado que varios tipos de tumores, por ejemplo, adenocarcinomas colorectal, del estómago, pancreático y hepatocelular poseen los receptores de CCK-B/gastrina en sus membranas plasmáticas y que responden a la gastrina con una proliferación celular potente (Rehfeld, J. F. 1972, Upp et al. 1989 y Watson et al. 1993). Además, más recientemente se ha descubierto que muchas de estas células cancerosa también secretan gastrina y así efectúan una vía proliferativa autónoma (Van- Solinge et al. 1993, Nemeth et al. 1993 y Seva et al. 1994). El receptor CCK-B/gastrina pertenece a la familia de los receptores que se acoplan a la proteína G con siete dominios de transmembrana con igual afinidad para ambos la CCK y la gastrina (Solí et al. 1984). Este receptor se llamó un receptor B tipo CCK sabido a que se encontró predominantemente en el cerebro (Wank et al. 1992). Se encontró subsecuentemente que el receptor era idéntico al receptor periférico de CCK/gastrina en las células ECL y parietales del estómago (Nakata et al. 1992). Este receptor se ha caracterizado bien en un número de tejidos normales (Fourmy et al. 1984, Grider et al. 1990) y tumorales (Singh et al. 1990, Watson et al. 1993), y estudiado extensivamente usando la línea celular de adenocarcinoma pancreático de rata AR42J (Scemama et al. 1987). Se ha clonado y secuenciado el ADNc del receptor CCK-B/gastrina de AR42J, y más del 90% homólogo en la secuencia de ADN al receptor de CCK-B/gastrina en rata y cerebro de humano, y más del 84% homólogo en la secuencia al ADNc del receptor de CCK-B/gastrina en las células parietales caninas (Wank, S.A. 1995), demostrando una homología de secuencia alta aún entre especies. Las hormonas peptídicas G17 y G34 se enlazan al receptor de CCK-B/gastrina en la membrana celular de células normales. Sin embargo, se ha encontrado que G17 y no G34, estimulan el crecimiento de las células de cáncer dependiente de la gastrina. La G17 asociada con el suero, en particular, tiene el potencial de estimular el crecimiento de tumores colorectales en una manera endocrina, mediada por los receptores de CCK-B/gastrina (Watson et al. 1993) en las células del tumor. Parece que la gastrina-17 está particularmente implicada en la estimulación del crecimiento de los adenocarcinomas colorectales debido a una afinidad incrementada posible para el receptor CCK-B/gastrina en las células tumorales, sobre otras especies de hormona gastrina (Rehfeld 1972 y 1993) . Se encontró que los receptores CCK-B/gastrina se expresan en una forma de alta afinidad en el 56.7% de los tumores colorectales primarios humanos (Upp et al. 1989). Se ha postulado que el circuito potencial de autocrina puede también existir debido a la producción endógena de los péptidos de gastrina precursores por tales tumores (Van-Solinge et al. 1993 y Nemeth et al. 1993). El complejo resultante G17 ligando/receptor estimula el crecimiento celular por medio de mensageros secundarios para regular la función celular (Ulrich et al. 1990). La unión de G17 al receptor CCK-B/gastrina lleva a la activación del rompimiento del fosfatidil inositol, la activación de la proteína cinasa C con un incremento resultante en la concentración de iones de calcio intracelulares, así como la inducción de los genes c-fos y c-jun vía la proteína cinasa activada con mitógeno, que se ha implicado en la regulación de la proliferación celular (Tadisco et al. 1995). Adicionalmente, el enlace de la gastrina al receptor CCK-B/gastrina se ha asociado con el incremento subsecuente en la fosforilación por una tirosina cinasa, ppl25FADK (cinasa de adhesión focal), la cual también puede tener un papel en la transmisión de las señales mitogénicas (Tanaguchi et al. 1994). Un número de antagonistas del receptor de CCK-B/gastrina de alta afinidad se han evaluado terapéuticamente tanto i n vi tro como in vi vo en un número de cánceres gastrointestinales experimentales. Por ejemplo, proglumida, un derivado del ácido glutámico (Seva et al. 1990; Harrison et al. 1990 y Watson et al. 1991a), Benzotript, un derivado de N-acilo del triptófano, L-365,260, un derivado de Aspercillin (Bock et al. 1989) y CI-988 una molécula que imita la secuencia de pentapéptido C-terminal de CCK (Hughes et al. 1990) han mostrado que neutralizan efectivamente los efectos de la gastrina exógena en el crecimiento del tumor gastrointestinal tanto in vi vo como in vi tro (Watson et al. y Romani et al. 1994). Sin embargo, estos antagonistas tienen severos efectos colaterales tóxicos y carecen de especificidad puesto que bloquean la acción de todos los ligandos potenciales del receptor tal como G34 y CCK en las células normales. Recientemente, los antagonistas del receptor CCKB/gastrina altamente selectivos y potentes tal como YM022 (Yuki et al. 1997) y YF476 (Takinami et al. 1997) también se han descrito. La Proglumida y Benzotript se han valorado ampliamente en los estudios pre-clínicos . El principal problema con estos compuestos es su falta de potencia, con relativamente altas concentraciones requeridas para desplazar el G17 (Watson et al. 1992a; Watson et al. 1992b). A pesar de esto, la proglumida y el benzitript inhibieron la proliferación basal y estimulada con gastrina de un número de lineas celulares (Seva et al. 1990; Watson et al. 1991a). Además, la proglumida incrementó la supervivencia del ratón con xenoinjerto que lleva el tumor del colon del ratón sensible a la gastrina, MC26 a 39 días en los animales tratados de 25 días en los animales de control. Debido a la baja especificidad de esta clase de agentes antagonistas de gastrina para el receptor de gastrina/CCKB, la inhibición del crecimiento del tumor puede no ser efectivamente controlada con antagonistas de gastrina. Además, los receptores celulares que reconocen y se enlazan a las gastrinas no se enlazan a todos los inhibidores probados (Seva et al. 1994). Así, si la inhibición completa de la gastrina que se enlaza al receptor no ocurre en la cascada de crecimiento autocrina, entonces los antagonistas de gastrina pueden ser incapaces de bloquear este mecanismo de promoción del crecimiento del tumor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones inmunogénicas y métodos inmunológicos para el tratamiento de tumores dependientes de la gastrina. El método comprende la inmunización activa o pasiva de un paciente con un inmunógeno de receptor anti-CCK-B/gastrina o anticuerpos receptores de anti-CCK-B/gastrina . Los anticuerpos producidos por los inmunógenos son específicos contra el receptor CCK-B/gastrina en las células tumorales y bloquean los efectos que promueven el crecimiento de la gastrina en los receptores. Los anticuerpos evitan que las hormonas peptídicas se enlacen a los receptores de CCK-B/gastrina en las células de tumor dependiente de la gastrina, así, el crecimiento del tumor se detiene. Además, sorprendentemente, los anticuerpos específicos al extremo NH2 terminal del receptor, luego de enlazarse al receptor, se internalizan y se translocan rápidamente en el citoplasma y en el núcleo de las células tumorales. Así, la internalización ocurre tan tempranamente como 10 segundos después de exponer las células al anticuerpo. Esta internalización rápida del complejo anticuerpo/receptor a su vez causa que las células tumorales afectadas sufran apoptosis o suicidio. Los inmunógenos de la invención comprenden péptidos naturales o sintéticos derivados del receptor de CCK-B/gastrina humana, como la porción inmunomímica del inmunógeno. Los inmunógenos también pueden comprender una secuencia peptídica separadora unida a un extremo del péptido inmunomímico. El inmunógeno también se pude conjugar a un portador de proteína, tal como el toxoide de difteria, el toxoide del tétano la albúmina del suero de bovino y similares. En una modalidad, el método de inmunización contra el receptor de CCK-B/gastrina comprende inmunización activa, en donde un paciente se inmuniza con un inmunógeno de la invención. El inmunógeno estimula la producción de anticuerpos contra el receptor de CCK-B/gastrina en las células tumorales . Los anticuerpos producidos por los inmunógenos del receptor de anti-CCK-B/gastrina se enlazan a los receptores de CCK-B/gastrina en la células tumorales y evitan efectivamente el enlace de las hormonas del péptido a los receptores, por lo que inhiben la vía estimulatoria del crecimiento de la autocrina de la división de células tumorales y finalmente el crecimiento del tumor. En otra modalidad de la invención, el método de tratamiento comprende inmunización pasiva, por lo que los anticuerpos contra el receptor de CCK-B/gastrina se administran a un paciente en una concentración suficiente para enlazar a los receptores de CCK-B/gastrina de las células tumorales, y los anticuerpos bloquean el enlace de las hormonas del péptido al receptor. La prevención del enlace de las hormonas a su receptor inhibe el sendero o vía que estimula el crecimiento de las células tumorales, por lo que inhiben así el crecimiento de los tumores dependientes de las hormonas. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, los anticuerpos para la terapia humana pueden ser quiméricos, humanizados o anticuerpos monoclonales humanos que se pueden producir por métodos bien conocidos en la técnica. Además, los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina se pueden conjugar adicionalmente a las moléculas citotóxicas tales como toxina de cólera, o a moléculas radioactivas marcadas con un radionúclido, tales como 125I y 131I, para mejorar la destrucción de las células. La invención también proporciona un método para diagnosticar un tumor que responde a la gastrina, que comprende la detección inmunoquímica de los tumores dependientes de la gastrina (que contienen CCK-B/gastrina) a partir de una biopsia de tejido utilizando los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina específicos de la invención se pueden marcar con un sistema de detección utilizando compuestos tales como biotina, peroxidasa de rábano y fluoresceína para detectar los receptores de CCK-B/gastrina en el tejido tumoral utilizando procedimientos inmunoquímicos estándar. La invención también proporciona un método para diagnosticar un tumor dependiente de la gastrina, que comprende la detección in vi vo de los tumores dependientes de la gastrina (que contienen receptores de CCK-B/gastrina), utilizando los anticuerpos de los receptores anti-CCK-B/gastrina. El método comprende, administrar a una paciente que posee un tumor colorectal, una dosis efectiva de anticuerpos de los receptores anti-CCK-B/gastrina vía una inyección intravenosa y formar imágenes o detectar células tumorales que tienen anticuerpos de receptores anti-CCK-B/gastrina enlazados a sus membranas celulares mediante procedimiento de exploración escintigráficos normales. En este aspecto de la invención, los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina. En este aspecto de la invención, los anticuerpos de los receptores anti-CCK-B/gastrina deberán ser etiquetados con un radionúclido tal como ^Indio, 90Itrio y 131I.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y IB ilustran vistas esquemáticas del receptor CCK-B/gastrina y sus dominios transmembrana 7. La figura 2 muestra datos de los ensayos ELISA con anticuerpo generados en conejos inmunizados con un inmunógeno contra el péptido 1 del receptor CCK-B/gastrina. La figura 3 muestra los datos de los ensayos ELISA con anticuerpos generados en conejos inmunizados con un inmunógeno contra el péptido 4 del receptor CCK-B/gastrina. La figura 4 es una gráfica que muestra los datos obtenidos de una inhibición ELISA usada para valorar la especificidad de los anticuerpos purificados por afinidad generados contra el inmunógeno GRP1-DT. La figura 5 es una gráfica de barras que muestra los datos en la inhibición del enlace del 125I-G17 humano a las células AR4-2J por los inhibidores peptídicos. La figura 6 es una gráfica de barras de la distribución celular de las células tumorales AR4-2J etiquetadas con inmunooro.

La figura 7 es una fotografía de un análisis de manchado Western de los extractos de proteína de las membranas nucleares de las células de adenocarcinomas utilizando anticuerpos generados contra el Péptido 1. La figura 8 es una fotografía de un análisis de manchado Western de los extractos de proteínas de las membranas extranuclear y plasmática de las células de adenocarcinoma utilizando anticuerpos generados contra el péptido 1. La figura 9 es una gráfica que ilustra el peso del tumor C170HM2 de los animales de control y los animales tratados con el receptor anti-CCK-B/gastrina . La figura 10 es una gráfica que ilustra el área de sección transversal de los tumores C170HM2 de los animales de control y los animales tratados con el receptor anti-CCK-B/gastrina. La figura 11 es una gráfica de barras que muestra los pesos de tumor C170H 2 medios de los animales de control y los animales tratados con el receptor anti-CCK-B/gastrina. La figura 12 es una gráfica de barras que muestra el área de sección transversal media de los tumores C170HM2 de los animales de control y los animales tratados con anti-CCK-B/gastrina. La figura 13 es una gráfica de barras que muestra el número medio de los tumores C170HM2 en los animales de control y tratados con anti-CCK-B/gastrina. La figura 14 es una gráfica de barras que muestra el peso medio del tumor C170HM2 de la metástasis del hígado, de los animales de control y tratados con el receptor anti-CCK-B/gastrina. La figura 15 es una gráfica de barras que muestra el área de sección transversal media de los tumores C170HM2 de los animales de control y tratados con el receptor anti-CCK-B/gastrina. La figura 16 es una gráfica de barras que muestra el número medio de tumores C170HM.2 en los animales de control y tratados con el receptor anti-CCK-B/gastrina. La figura 17 es una gráfica de barras que muestra el número medio y mediano de tumores C170HM2 del hígado en los animales de control y tratados con el receptor anti-CCK-B/gastrina. La figura 18 es una gráfica de barras que muestra el peso medio y mediano de tumores C170HM2 del hígado en los animales de control y tratados con el receptor anti-CCK-B/gastrina.

La figura 19 es una gráfica de barras que muestra los valores medio y mediano para el área de sección transversal de la metástasis del tumor C170HM2 del hígado en los animales de control y tratados con el receptor anti-CCK-B/gastrina. La figura 20 muestra una gráfica que muestra las concentraciones de los anticuerpos radioetiquetados con 125I en los xenoinjertos del tumor del hígado C170HM2 de los ratones desnudos de control (suero de conejo normal) y tratados con anti-GRP1. La figura 21 muestra una gráfica de barras que muestra el número medio de tumores del hígado C170HM2 por hígado de los xenoinjertos de los ratones desnudos de control y tratados con anti-GRPl. La figura 22 muestra una gráfica de barras que muestra el peso medio del tumor del hígado C170HM2 de los xenoinjertos de hígado de los ratones desnudos de control y tratados con anti-GRPl. La figura 23 muestra los manchados Western de las proteínas del xenoinjerto del tumor del hígado C170HM2 de los ratones desnudos de control y tratados con anti-GRPl. La figura 24 es una fotografía de una sección histológica . tomada con un microscopio ligero que muestra una sección manchada con hematoxilina/eosina de un xenoinjerto de hígado C170HM2 de un ratón de control. La figura 25 es una fotografía de una sección histológica tomada con un microscopio ligero que muestra una sección manchada con hematoxilina/eosina de un xenoinjerto de hígado C170HM2 de un ratón tratado con anticuerpos anti-GRPl.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos de la invención están dirigidos al tratamiento de los tumores dependientes de la hormona gastrina en animales, que incluyen los humanos, y comprenden administrar al paciente un inmunógeno del receptor anti-CCK-B/gastrina, que produce anticuerpos en el paciente inmunizado que se enlaza al receptor CCK-B/gastrina en las células tumorales, para evitar el enlace de la hormona al receptor para inhibir los efectos de promoción del crecimiento de la hormona. Más importantemente, desde un punto de vista clínico, el complejo receptor/anti-GRPl se internaliza rápidamente, atraviesa el citoplasma y entra al núcleo. Esto aparentemente provoca que las células tumorales afectadas cometan suicidio (apoptosis). Los inmunógenos comprenden péptidos naturales o sintéticos del receptor humano CCK-B/gastrina que actúan como inmunomímicos . En particular, se han desarrollado dos péptidos sintéticos como inmunomímícos . Estos péptidos, desarrollados de la secuencia de aminoácidos del receptor CCK-B/gastrina, son inmunogénicos y con reacción cruzada con el receptor endógeno CCK-B/gastrina de las células tumorales tanto in vi vo como in vi tro . El péptido 1 consiste de 5 a 21 aminoácidos de la secuencia del receptor CCK-B/gastrina: KLNRSVQGTGPGPGASL (péptido 1, SEC ID NO : 1 ) en el listado de secuencias) . El péptido 1 constituye el extremo amino terminal del receptor y está localizado en la superficie extracelular de la membrana celular (ver figura 1) . En otra modalidad, el inmunógeno comprende el Péptido 4, que consiste de la siguiente secuencia de aminoácidos del receptor CCK-B/gastrina: GPGAHRALSGAPISF (Péptido 4, SEC ID NO: 2 en el listado de secuencias) Péptido 4 es parte del cuarto dominio extracelular del receptor y está también en el lado externo de la membrana del plasma (ver figura 1) .

Los inmunógenos pueden también comprender una extensión o péptido espaciador adecuado para proyectar el péptido inmunomímico lejos del portador de proteína y mejorar su capacidad para enlazarse a los receptores linfocíticos . Unas secuencias peptídicas espaciadoras son adecuadas a la secuencia de aminoácidos SSPPPPC (espaciador Serina(Ser), SEC ID N0:3, en el Listado de Secuencias). Sin embargo, otros péptidos espaciadores podrán también, ser adecuados. Los péptidos inmunomímicos, con o sin el espaciador, son entonces conjugados a un portador de proteína, tal como toxoides de Difteria, vía un residuo de cisteína al extremo carboxiterminal . Los péptidos espaciadores no están relacionados inmunológicamente a los péptidos derivados del receptor de CCK-B/gastrina y por lo tanto, deberá mejorar, pero no determinar, la inmunogenecidad específica de los péptidos derivados del receptor. La presencia y densidad de los receptores de CCK-B/gastrina en las células tumorales en un paciente, puede ser determinada al hacer reaccionar anticuerpos anti-receptor etiquetados con una muestra obtenida a partir de una muestra de biopsia del tumor. Los anticuerpos anti-receptores pueden ser etiquetados con ya sea un indicador radioactivo, o tinte o una etiqueta fluorescente. Además, la sensibilidad de las células tumorales a la gastrina puede ser evaluada in vi vo a partir de una muestra de biopsia del tumor del paciente usando técnicas estándares. Los pacientes que tienen tumores con muestras de biopsias positivas para el ensayo de anticuerpo del receptor CCK-B/gastrina son candidatos típicos para el tratamiento mediante los métodos de la invención. Un rango de dosificación efectiva a partir de 0.001 hasta 2 mg de la composición inmunogénica se administra a un paciente para el tratamiento del cáncer gastrointestinal. La dosificación efectiva de la composición imunogénica deberá ser capaz de incitar una respuesta inmune en un paciente que consiste de niveles efectivos tituladores de anticuerpos contra el receptor de CCK-B/gastrina 1-3 meses después de la inmunización. Después de la inmunización de un paciente, la efectividad de los inmunogenes es monitoreada mediante procedimientos clínicos estándares, tales como ultrasonido e imágenes de resonancia magnética (MRI), para detectar la presencia y tamaño de los tumores. Los niveles tituladores del anticuerpo contra el receptor, pueden también ser monitoreados a partir de una muestra de sangre tomada del paciente. Las inmunizaciones de inyecciones de refuerzo deberán darse como se requiera para mantener un titulador de anticuerpo efectivo. El tratamiento efectivo de los cánceres que dependen de la gastrina, tal como estómago, hígado, adenocarcinomas pancreático y colorectal, de conformidad con esta invención, podrán resultar en la inhibición del crecimiento del tumor y una disminución en el tamaño del tumor. Los anticuerpos salientes por los inmunogenes del receptor anti-CCK-B/gastrina de la presente invención, pueden tener efectos antitróficos contra los tumores que dependen de la gastrina mediante tres mecanismos potenciales: (i) inhibición de la gastrina que se enlaza a su receptor, (ii) degradación o disrupción o rompimiento de la vía de transducción de la señal de la proliferación de células tumorales; y (iii) inducción de la apoptosis (o células suicidas) en las células donde los complejos receptor/anticuerpo están incorporados y migran hacia el núcleo. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos del receptor anto-CCK-B/gastrina son administrados a un paciente que posee un tumor que responde al receptor CCK-B/gastrina. Los anticuerpos se enlazan específicamente a los receptores CCK-B/gastrina en las células tumorales. El enlace de los anticuerpos a los receptores previene el enlace de la gastrina a su ligando en las membranas de las células y, por lo tanto, la señal de crecimiento de las células tumorales dependientes de la gastrina, se inhibe, y se interrumpe el crecimiento del tumor. Los anticuerpos son preferiblemente anticuerpos quiméricos o humanizados, o fragmentos de los mismos, los cuales se enlazan efectivamente a un receptor objetivo y pueden ser producidos mediante técnicas estándares, tales como aquellas descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,023,077, 5,468,494, 5,607,676, 5,609,870, 5,688,506 y 5,662,702. Estos anticuerpos producidos de manera exógena, pueden también ser empleados para matar células tumorales que portan el receptor CCK-B/gastrina en sus membranas plasmáticas en virtud de su inhibición del crecimiento de las células tumorales o la liberación de una substancia tóxica en la célula tumoral. Los anticuerpos anti-CCK-B/gastrina preferidos para terapia, son aquellos reactivos con dominios extracelulares 1 y 4 de la proteína del receptor mostrada en la FIG.l como GRP-1 y GRP-4, respectivamente. De manera particular, son preferidos los anticuerpos que reconocen específicamente y enlazan secuencias de aminoácidos de la proteína del receptor correspondiente a los Péptidos 1 y 4. La inhibición del crecimiento del tumor en este método de inmunización es también monitoreada mediante la obtención de imágenes por ultrasonido y MRI y se administran inmunizaciones repetidas como se requiera por el paciente. La efectividad de los anticuerpos en la inhibición del crecimiento celular y muerte de las células tumorales puede mejorarse mediante la conjugación de las moléculas citotóxicas a los anticuerpos anti-CCK-B/gastrina. Las moléculas citotóxicas pueden ser toxinas, por ejemplo, toxina del cólera, ricina, a-amanitina, o moléculas radioactivas etiquetadas, por ejemplo con 125? o 131I, o agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, citosina arabinosida o 5-fluorouridina . Además de los anticuerpos radioetiquetados con 125I y 131I, los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina pueden también ser etiquetados con radionúclidos tales como ?nIndio y 90Itrio. En este aspecto de la invención, los anticuerpos son empleados para la detección y diagnóstico in vi vo de los tumores que poseen el receptor CCK-B/gastrina, mediante la administración de estos anticuerpos al paciente, y la detección de enlaces de anticuerpos en las células tumorales que contienen el receptor de CCK-B/gastrina. Después se deja que los anticuerpos anti-CCK-B/gastrina radioetiquetados alcancen al tumor, aproximadamente 1-2 horas después de la inyección, en el radioactivo, las "manchas calientes" son reflejadas usando procedimientos escintigráficos estándares como se describe previamente (Harrison's Principies of Infernal Medicine, Isselbacher, et al. 13th Ed. 1994) . Las composiciones en las cuales los inmunogenes son administrados para el tratamiento de los tumores que dependen de la gastrina en pacientes, pueden ser en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación sólidas, semi- sólidas y líquidas, tales como polvos, soluciones líquidas, suspensiones, supositorios y soluciones inyectables e ingeribles. La forma preferible dependerá del modo pensado de adminsitración y de las aplicaciones terapéuticas. Las composiciones comprenden los presentes inmunogenes y componentes farmacéuticamente aceptables adecuados, y pueden • incluir otros agentes medicinales, portadores, adyuvantes, excipientes, etc. Los adyuvantes adecuados pueden incluir dipéptidos nor-muramil (nor-MDP, Península Labs., CA) , y aceites tales como Montanide ISA 703 (Seppic, Inc., París, Francia), los cuales pueden ser mezclados usando procedimientos estándares. Preferiblemente, las composiciones son en la forma de dosis unitarias. La cantidad del compuesto activo administrada para inmunización o como un medicamento a la vez, o durante un periodo de tiempo, dependerá del sujeto a ser tratado, la manera y forma de administración, y del juicio del especialista que lo trata. Los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina de la invención, para inmunización pasiva son administrados preferiblemente a un paciente de manera intravenosa, usando un portador farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina, por ejemplo, salina de fosfato amortiguada.

EJEMPLO 1 Preparación de los Conjugados GRP1-DT y GRP4-DT Los péptidos del receptor CCK-B/gastrina son preparados mediante la síntesis estándar peptídica en estado sólido. Para elaborar los inmunogenes capaces de inducir una respuesta inmune específica, se sintetizaron cada uno de los Péptidos 1 y 4 que contienen la secuencia espadadora SSPPPC (SEC ID N0.:3 en el Listado de Secuencias) a su termino carboxi. Estos péptidos son subsecuentemente conjugados a grupos amino presentes en el portador, toxoide de Difteria ("DT"), vía la cisteína del residuo de aminoácido del péptido terminal del espaciador, utilizando un agente enlazador heterobifuncional que contiene un éster de succinimidilo a un extremo y maleimida al otro extremo del agente enlazador ya sea por el Método A o Método B como se describe anteriormente. Método A: Como se describe previamente en la Patente Norteamericana No. 5,023,077, el enlace del Péptido 1 o 4 anterior y el portador está abarcado como sigue. Se disuelve el péptido seco en 0. ÍM de amortiguador de fosfato de sodio, pH 8.0, con treinta partes de exceso molar de ditiotreitol ("DTT"). La solución se agitó bajo una atmósfera de gas de nitrógeno saturado por cuatro horas. El péptido que contiene la cisteína reducida se separó de los otros componentes mediante cromatografía sobre una columna Sephadex G10 equilibrada con ácido acético 0.2M. El péptido se liofilizó y se almacenó bajo vacío hasta su uso. El portador se activó mediante tratamiento con el agente de enlace heterobifuncional por ejemplo, éster N-hidrosuccinimida del ácido maleimidocapróico-Epsilon, ("EMCS"), en porciones suficientes para realizar la activación de aproximadamente 25 grupos de aminoácidos libres por peso molecular 105 del portador. En el ejemplo específico de toxoide de difteria, este se suma a la adición de 6.18 mg de EMCS (pureza 75) para cada 20 mg de toxoide de difteria . La activación de toxoide de difteria se abarcó por la disolución de cada 20 mg de alícuota de toxoide de difteria en 1 mi de amortiguador de fosfato de sodio 0.2M, pH 6.45. Las alícuotas de 6.18 mg EMCS se disolvieron en 0.2 mi de Dimetil Formamida ("DMF") . Bajo condiciones de obscuridad, el EMCS se agregó en forma de gotas en cantidades de 50 microlitros ("µl") al DT con agitaciones. Después de 2 horas de incubación en la obscuridad, la mezcla se cromatografió en una columna Sephadex G50 equilibrada con amortiguador de Citrato de Sodio 0.1M, pH 6.9, que contiene 0.1 mM de EDTA. Las fracciones que contienen toxoide de difteria activada con EMCS se concentraron sobre una membrana de ultrafiltración PM 10 bajo condiciones de obscuridad. El contenido de proteína del concentrado se determinó por cualquiera de los métodos Lowry o Bradford. El contenido EMCS del portador se determinó por la incubación del portador activado con HC1-císteína, seguido por la reacción con 10 mM de Reactivo Ellman 5, 5' -ditio-bis (2-ácído nitrobenzoico) 10 mM. La diferencia de densidad óptica entre un tubo liso que contiene HCl-cisteína y el tubo de muestra que contiene HCl-cisteína y el portador, se trasladó en el contenido del grupo EMCS mediante el uso del coeficiente de extinción molar de 13.6xl03 por ácido 5-tio-2-nitrobenzoico a 412 nm. El contenido de cisteína reducido (-SH) del péptido también se determinó utilizando el Reactivo Ellman. Aproximadamente 1 mg del péptido se disolvió en 1 mi de agua saturada con gas de nitrógeno y 0.1 mi de alícuota de esta solución se hizo reaccionar con el Reactivo Ellman. Utilizando el coeficiente de extinción molar de ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (13.6xl03, se calculó la cisteína libre SH). Una cantidad suficiente del péptido que contiene -SH libre que reacciona con cada uno de los 25 grupos EMCS activados en el portador, se disolvió en 0.1 M de amortiguador de Citrato de Sodio, pH 6.0, que contiene 0.1 mM de EDTA, y se agregan en forma de gota al portador activado como EMCS bajo condiciones de obscuridad. Después de que se ha agregado toda la solución al portador, la mezcla se incuba durante la noche en la obscuridad bajo una atmósfera de gas de nitrógeno saturado con agua. El conjugado el péptido enlazado al portador vía EMCS se separa de otros componentes de la mezcla mediante cromatografía sobre una columna Sephadex G50 equilibrado con bicarbonato de amonio 0.2 M. El conjugado eluido en el volumen vacío de la columna se liofilizó y se almacenó desecado a 20°C hasta su uso. El conjugado resultante puede ser caracterizado por el contenido del péptido mediante un número de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica incluyendo incremento en peso, análisis de aminoácidos, etc. Los conjugados de los Péptidos 1 y 4 con separadores y toxoide de difteria producidos por este método son determinados por tener una proporción de péptido/portador efectiva de 5-35 moles de péptido por 100 KD MW de portador y todos se consideraron adecuados como inmunogenes para la inmunización de los animales de ensayo. Preferiblemente, el rango de péptido de 10-30 moles por 100 KD MW de DT produce una respuesta inmune efectiva . Método B: En un método preferido, los conjugados comprenden GRP1 acoplados a DT y péptidos GRP4 acoplados a DT, se prepararon a temperatura ambiente como sigue. Se disolvió DT purificado (400 mg) en 20 mi de 0.5M de amortiguador fosfato, pH 6.6, saturado con gas de nitrógeno para dar una solución DT de 20 mg/ml. La solución DT se colocó en una botella de vidrio de ámbar obscuro de 60 mi (que sirve como un recipiente de reacción y reservorio de filtración). El Reactivo de acoplamiento EMCS (123.6 mg) se disolvió en 2.0 mi de dimetilformamida. La solución EMCS se agregó en forma de gotas a la solución durante un periodo de 15 minutos con agitaciones continuas. La botella se tapó, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 1 hora 45 minutos adicionales, para formar DT(M-DT) activado. El M-DT se purificó entonces mediante diafiltración usando un Sistema de Ultrafiltración de Canal Delgado A icon Modelo TCF10 por operación manual I-113G con una membrana de ultrafiltración diaflujo XM50. El M- DT se lavó dos veces contra volúmenes de 420 mi de amortiguador fosfato, concentrándolo a 20 mi cada vez, después se lavo nuevamente contra 420 mi de 0.1 M de amortiguador de citrato de sodio, pH 6.0, que contiene 0. ÍM de EDTA, y se concentró la solución hacia abajo a 20 mi. Para elaborar el conjugado GRP1-DT, se colocaron 2.02 mi de solución M-DT (que contiene 22.3 mg de M-DT) en un recipiente de vidrio de ámbar obscuro de 10 mi, después 13 mg del péptido GRP1 se disolvieron en el amortiguador de citrato para dar 40 mg/ml del péptido y se agregó en forma de gotas a la solución M-DT con agitaciones. Para elaborar el conjugado GRP4-DT, se colocaron 2.21 mi de la solución M-DT (que contiene 24.2 mg de M-DT) en un recipiente de vidrio ámbar obscuro de 10 mi, después se disolvieron 13 mg del péptido GRP en el citrato amortiguador para dar 40 mg/ml del péptido y se agregaron en forma de gotas a la solución M-DT con agitaciones . Las reacciones se dejaron proceder durante la noche en la obscuridad. Cada conjugado se removió de los matraces de reacción y se dialízaron de manera separada en entubados de diálisis de corte de 12,000-14,000 MW contra 5 cambios de 500 mi de una solución de bicarbonato de amonio 0.1M. Cada conjugado se liofilizó. Los conjugados entonces se analizaron mediante análisis de aminoácido y sus péptidos a DT, las proporciones de substitución se determinaron por ser 21.8 péptidos por 105 MW de DT para GRPl-DT y 21.2 péptidos por 105 MW de DT para GRP4-DT. Los conjugados de los péptidos 1 y 4 con espaciadores y DT producidos por este método tienen una proporción de péptido/portador efectiva de 5-35 moles de péptido por 100 kd MW del portador y todos son considerados adecuados como inmunogenes. Un rango de proporción preferido para producir una respuesta inmune efectiva es de 10-25 moles de péptido por 100 KD MW de DT.

Preparación de Inmunogenes Los presentes inmunogenes que contienen ya sea al Péptido 1 o al Péptido 4 con espaciadores conjugados a DT como se describe anteriormente, se usaron para inmunizar conejos. Los inmunogenes se prepararon como sigue: El conjugado se disolvió en salina de fosfato de sodio amortiguado 0.15M, pH 7.3 a una concentración de 3.79 mg/ml. La solución del conjugado se agregó al Adyuvante Montanide ISA (703) (Seppic, Inc.) a una proporción de 30:70 (p:p) de la solución del conjugado a Montanide ISA 703, después la mezcla se homogeneizó usando un Homogenizador Silverson por 3 minutos a 8,000 RPM para formar una emulsión que contiene 1 mg/ml del conjugado.

Inmunización de la Colección de Muestra Los conejos se inyectaron intravascularmente con 0.1 mi de inmunógeno que consiste de 0.1 mg del conjugado ya sea GRPl-DT, o GRP4-DT. A cada conejo se le dieron inyecciones de inmunogen a las 0 y 4 semanas. Se colectó la sangre de cada conejo a las 6 y 8 semanas del experimento. Se preparó suero a partir de cada muestra se sangre, y se almacenó a -20°C hasta su utilización en ensayos para determinar la presencia de anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina.

Ensayo Inm nosorbente Ligado a la Enzima (ELISA) Se usó ELISA en fase sólida para seleccionar la reacción o entre la reacción de antisuero alcanzada contra el Péptido 1 y Péptido 4 de cada conejo inmunizado. El ELISA se realizó mediante placas de 96 pozos que contienen poliestireno ( IMMULON II, Dynatech) con 25 µl/pozo de 10 µg/ml del Péptido 1 enlazado a la albúmina de suero de bovino (BSA) ("GRP1-BSA" ) , o Péptido 4 ligado al antígeno BSA ("GRP4-BSA") en 0.1M de amortiguador Glicina-HCl, a pH 9.5.- Las placas se incubaron durante la noche a 4°C, y se lavaron subsecuentemente en amortiguador. El antisuero obtenido a partir de los conejos inmunizados se diluyó serialmente a un rango de 10-1 a 10-8 en amortiguador hemaglitinación BSA-, FTA al 1%, a pH 7.2. Veinticinco µl del antisuero de ensayo por pozo se incubaron en cada péptido de ensayo por 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavaron completamente con amortiguador para remover cualquier anticuerpo libre. Cada pozo se trató con 25 µl de IgG (H+L) anti-conejo de macho bioteñido diluido con 1:100 en amortiguador de dilución BSA-FTA al 1% por 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado de las placas para remover el reactivo de anti-conejo libre, cada pozo se incubó por 1 hora a temperatura ambiente, con 25 µl de conjugado de fosfatasa avidin-alcalina diluida 1:100 en amortiguador BSA-FTA. Las placas se lavaron completamente para remover el reactivo de fosfatasa avidin-alcalina libre, y se incubaron con 25 µl de 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato ("PNPP") en amortiguador de dietanolamina al 10% que contiene 0.01% de MgCl2*6H20, a pH 9.8. Las placas se dejaron desarrollar hasta la absorbencia de la reacción hasta alcanzar una longitud de onda de 490 nm con una densidad óptica entre 0.8 a 1.5. Para ensayar la especificidad del antisuero producido por los conejos, los conejos se inmunizaron con DT y para el ensayo de ELISA, las placas se cubrieron con DT como antígeno para determinar la reactividad del antisuero producido contra el portador. La Figura 2 muestra los resultados de ELISA usando el Péptido 1/GRP1 y la Figura 3 muestra los resultados ELISA usando el Péptido 4/GRP4 como el antígeno. Como se observa en la Figura 2, los resultados de ELISA, muestran que los conejos inmunizados con el conjugado DT del espaciador del Péptido 1 producen elevados tituladores de anticuerpos los cuales enlazan específicamente al Péptido 1, como se indica por el anticuerpo que enlaza al Péptido 1 aún a altas diluciones (1:100,000) del antisuero. De manera similar, la Figura 3 muestra que los conejos inmunizados con el conjugado DT espaciador del Péptido 4 produce elevados tituladores de los anticuerpos anti-Péptido 4. Como se observa en las Figuras 2 y 3, los conejos inmunizados contra cada péptido producen anticuerpos los cuales enlazan específicamente a cada péptido a concentraciones de antisueros pequeñas. Los datos indican que los anticuerpos anti-Péptido 1 y anti-Péptido 4 tienen una gran capacidad para enlazar a los Péptidos 1 y 4 del receptor CCK-B/gastrina. Los datos también muestran que la inmunización de los conejos con los presentes conjugados incitan o producen respuestas inmunes potentes contra el Péptido 1 y Péptido 4, respectivamente. Además, los conejos inmunizados con cualquiera de los conjugados del Péptido 1 o Péptido 4 aparecen y se comportan de manera normal y no presentan algún síntoma de enfermedad o patologías durante los experimentos.

EJEMPLO 2 Se realizaron los siguientes experimentos para establecer la especificidad de los anticuerpos alcanzados en los conejos contra el péptido GRPl-DT que contiene el espaciador Ser descrito en el Ejemplo 1 usando el Método B. Se condujeron una serie de ensayos para valorar la especificidad de los anticuerpos de conejos inducidos mediante inmunización con GRP-1DT y la afinidad purificada mediante inmunoadsopción sobre una columna de Sefarosa de GRPl-Ser. Se usó la inhibición ELISA para valorar la especificidad de la afinidad de los anticuerpos purificados por el Péptido GRPl-Ser. Los ensayos se corrieron como sigue: el conjugado GRPl-Ser-BSA se cubrió en placas de 96 pozos (Inmulon U inferior) mediante incubación durante la noche, de 50 µl de una solución 2 µg/ml del conjugado en amortiguador de glicina (0.1M, pH= 9.5), a 4°C. La afinidad anti-GRPI Ab purificada (a una concentración final de 10 ng/ml) se combinó con varios inhibidores (en series de diluciones a 1:10) y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. Los inhibidores incluyen GRP1-Ser, GRP1 EPT, Ser, espaciador 17 (1-9) -Ser de la gastrina humana (hG17 ( 9 ) -Ser ) , GRP1 EPT + Ser, y amortiguador (no inhibidor). El amortiguador de incubación consiste de PBS + 0.5% BSA + 0.05% Tween 20 + 0.2% de NaN3. Las etapas subsecuentes usan el mismo amortiguador sin BSA. Las placas de 96 pozos se lavaron libres de GRPl-Ser-BSA libre, y se agregaron las mezclas de Ab + inhibidor (50 µl/pozo) . Después de 1 hora, las placas se lavaron y se agregó el conjugado (Zymed) de fosfatasa alcalina Ig (H+L) anti-conejo macho (dilución 1:2000). Después de 1 hora de incubación, las placas se lavaron para remover el reactivo libre, y se agregó 50 µl/pozo de la solución (1 mg/ml) del substrato pNPP (Sigma) en el substrato amortiguador (PBS + 0.1 mg/ml MgCl2 + dietanolamina al 10% + 0.02% NaN3). Después de 60 minutos de incubación, se midió la absorbencia en un lector MRX (Dynatech Laboratories). Las muestras se corrieron en duplicado, y los medios se calcularon para cada concentración. El enlace anterior (establecido con afinidad de anticuerpos anti-GnRH de conejo purificados) se restó o substrajo de todos los valores, y el % de inhibición relativo no agregado al inhibidor (anti-GRPI Ab + amortiguador) se calculó para cada inhibidor ensayado: % de Inhibición = ( 1 0 0 ) ( I -Ano inhibido~Ain ibido ) /Ano inhibido ) donde A = absorbencia. Los resultados están mostrados en la Figura 4. La Figura 4 representa el por ciento de inhibición del enlace del anticuerpo como una función de la concentración del inhibidor. Como se puede ver en la figura, el anticuerpo inhibe completamente al péptido GRPl-Ser se enlaza al GRPl-Ser-BSA. Se alcanza aproximadamente el 60% de inhibición con el péptido GRPI EPT, el cual no contiene la secuencia espadadora Ser, y mediante una mezcla equimolar de GRPI EPT más espaciador Ser. La carencia de estos péptidos para producir la completa inhibición, sugiere que una proporción de los anticuerpos son específicos para un epítope o unos epítopes que comprenden elementos de ambas secuencias espadadoras GRP1 y Ser. No se obtiene inhibición mediante cualquiera de las mismas secuencias espadadoras Ser o mediante un péptido no relacionado que lleva el espaciador Ser (" hG17 ( 9 ) -Ser" , que consiste de los nueve residuos amino-terminales de hG17 seguidos por el espaciador Ser) . Estos resultados de ELISA demuestran que la preparación de la afinidad de los anticuerpos purificados es específica para el péptido GRPl-Ser, y que el 60% de la actividad enlazante se dirige contra el componente epítope receptor de la gastrina del péptido.

EJEMPLO 3 Las células tumorales AR42J (Colección Europea de Cultivos Celulares Animales, Portón Down, UK) se derivan de un adenocarcinoma pancreático de rata y son conocidos por tener bien caracterizados a los receptores de CCK-B/gastrina. Así, se ensayaron las células AR42J para confirmar la expresión del receptor de CCK-B/gastrina y la especificidad del receptor para hG17 mediante inhibición del radioligando . Las células AR42J se cultivaron a 37°C con C02 al 7% en RPMI 1640 (Sigma) completo, suplementado con FCS al 10% (Gemini Bioproducts ) , 2 mM de glutamina (JHR Biosciences ) , 1 mM de piruvato de sodio (JRH B) y 50 µg/ml de gentamicina (Gemini Bioproductos ) . Las células se cosecharon en matraces T de 175 cm2 (Falcon Plastics) con PBS que contiene 0.25% de EDTA, después se lavaron dos veces con PBS (sin EDTA) mediante centrifugación (400 x g por 10 minutos) . Las células se mantuvieron a 0-4°C para todas las manipulaciones. Se preparó una sola suspensión celular en amortiguador, y la concentración celular se ajustó a 106 células/ml. Se agregaron a tubos de cultivos de 12X75 cm, las alícuotas de 1 mi de la suspensión celular, después, las células se centrifugaron y se descargaron los sobrenadantes. Las células se suspendieron nuevamente en PBS (0.1 ml/tubo) que contiene G17 (hG17) humano, la hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) , o sin péptido. Las concentraciones del péptido fueron de 1.0 ng/ml, 100 ng/ml y 10 µg/ml. Una alícuota de 0.1 mi de 125I-hG17 (NEN), que contiene aproximadamente 26,300 CPM (actividad específica, 2200 Ci/mmol), se agregó a cada tubo. Los tubos se sometieron a yórtices, después se incubaron por 15 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS, después se contaron en un contador ? (Wallac). Las muestras se corrieron por duplicado. Los cuénteos anteriores se substrajeron o restaron, después el % de inhibición del enlace 125I-hG17 para cada inhibidor se calculó usando la ecuación: % de Inhibición = ( 100 ) ( 1- ( ( CPMno ?nh?b? o-CPMlnhlbldo ) /CPMno inhibido ) • Los resultados de los ensayos de inhibición del enlace de radioligandos están mostrados en la Figura 5, los cuales presentan las medias (+ SE) de los valores individuales. Como se puede ver en la figura, el enlace de 125IhG17 a las células AR42J se inhibió por hG17. El grado de inhibición disminuye con la cantidad de inhibidor agregada, a 32% de inhibición a 1 µg hG17 por tubo, la concentración del péptido ensayado se eleva. De manera inversa, el GnRH no produce inhibición a las dos concentraciones elevadas ensayadas (el 6% de inhibición obtenido con 100 pg GbRH se consideró por no ser específico) , que indica que la inhibición por hG17 fue específica para la gastrina. Estos resultados confirman la expresión de la superficie celular del receptor gastrina mediante las células tumorales AR42J.

EJEMPLO 4 En enlace de los anticuerpos específicos GRPl-Ser a las células AR42J se valoró por inmunofluorescencia . Las células AR42J crecieron como en los Ejemplos previos y se cosecharon con raspados celulares a partir de matraces T de 175 cm2 y se lavaron dos veces con amortiguador (PBS con NaN3 al 0.02%) por centrifugación (400 x g por 7 minutos). Las células se mantuvieron a 0-4°C para todas las manipulaciones. Se preparó una sola suspensión celular en amortiguador, y la concentración celular se ajustó a células 106/ml. La suspensión celular se agregó a tubos microfugos de 1.5 mi (1 ml/tubo) . Las células se formaron en pelotillas mediante centrifugación y se aspiraron los sobrenadantes. Las células se suspendieron nuevamente en amortiguador (0.1 ml/tubo) que contiene los inhibidores péptidicos (1.0 mg/ml). Los inhibidores incluyen GRPl-Ser, GnRH, hG17(9)-Ser y amortiguador (no inhibidor). Se agregaron los anticuerpos que incluyen al anti-GRPl-Ser (100 µg/ml) de conejo, y afinidad anti-DT (control negativo, 100 µg/ml) de conejo purificada, antisuero (control positivo, dilución 1:100, inactivado por calor) anti-AR42J de ratón, o suero normal de ratón, a los tubos apropiados y se mezclaron los contenidos. Las células se incubaron por 1 hora, con mezclado ocasional. Las células se lavaron entonces tres veces con amortiguador, y se agregó por tubo 0.1 mi de IgG (Anticuerpos Incorporados) anti-conejo macho etiquetados con fluoresceina (1:50 diluido). Las células que se trataron con suero de ratón se desarrollaron con reactivo (Zymed) IgG anti-ratón con fluoresceina. Las células se suspendieron nuevamente al someterlas a vórtices, después se incubaron por 1 hora. Las células se lavaron nuevamente tres veces, después se suspendieron nuevamente en glicerol:PBS (1:1, V:V) , 50 µL/TUBO. Él incremento de humedad se preparó con los contenidos de cada tubo, y las células se examinaron usando un microscopio fluorescente Laborlux 12 (Leitz). La fluorescencia se registró en una escala de O a 4 , con 0 representando la fluorescencia anterior (obtenida con el suero normal de ratón) y 4 representando la fluorescencia máxima (obtenida con el antisuero de control positivo anti-AR42J de ratón) . Los resultados de los ensayos de inmunofluorescencia están presentados en la Tabla 1. Como se puede ver en la Tabla, las células AR42J tratadas con anticuerpos anti-GRPl-Ser en la ausencia de inhibidores péptidos, no producen teñido fluorescente, que demuestra que el teñido observado con los anticuerpos anti-GRPl-Ser no son una consecuencia del enlace no específico de la superficie celular por la inmunoglobulina de conejo. Sin embargo, el enlace se muestra por ser específico para el péptido GRPl-Ser. Además del enlace GRPl-Ser completamente inhibido, se consideran péptidos no relacionados, que incluyen hG17(9)-Ser y GnRH, carentes para inhibir. Como el epitope GRP1 comprende los residuos 5-21 del receptor de gastrina, se concluye que los anticuerpos anti-GRPl son específicos para el receptor de la gastrina expresado mediante las células AR42J.

Tabla 1 EJEMPLO 5 Las células AR42J, pasaje no. 16-18, se cultivaron en un medio RPMI-1640 que contiene FCS al 10% y 2 mM de glutamina. Todas las células se mantuvieron a 37°C en C02 al 5% en aire a 100% de humedad, crecieron a 80% de confluencia en matraces T75 (Falcon, London, UK) y se pasaron después a un tratamiento de EDTA al 0.02% para traer células adherentes en la suspensión. Las células se incubaron por 10, 30 segundos, 30 minutos y 1 hora con un anticuerpo (aGR) receptor anti-CCK-B/gastrina generado en conejos con un inmunogen receptor del Péptido I CCK-B/gastrina de la invención como se describe en el Ejemplo 1, el cual ha sido purificado por cromatografía de afinidad en una columna preparada con el Péptido 1. Las células se fijaron en glutaraldehido al 1% por una hora y se prepararon por estudios de microscopía del inmunoelectrón (Inmunol EM) usando técnicas estándares. Las suspensiones celulares se centrifugaron dos veces a 2000 rpm por 2 minutos y después las pelotillas celulares se suspendieron nuevamente en salina de fosfato amortiguada (PBS) . La pelotilla celular se infiltró con resina plástica LRwhite. Las secciones ultradelgadas de 70-90 nm en espesor, se cortaron y colocaron en rejillas de níquel cubiertas con Pioloformo. Las rejillas se colocaron en el suero de macho normal (Dako, High Wycombre, Uk) en albúmina de suero bovino al 0.1% (BSA) (Sigma, Poole, Dorset) y se incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos. Las rejillas se enjuagaron en PBS y después se incubaron con un anticuerpo secundario, anticuerpo (oroetiquetado) anti-conejo macho conjugado con biotina, diluido 1:50 en BSA al 1%, por 1 hora a temperatura ambiente. Se realizaron los experimentos de control sin anticuerpos secundarios. Después del lavado final con PBS, las rejillas se tiñeron en un contador en acetato de uranilo acuoso saturado por 3 minutos y citrato de plomo Reynold por 3 minutos. Se contaron las partículas doradas en la membrana celular en el citoplasma, en la membrana nuclear y dentro del núcleo. Se contaron veinticinco células/rejillas por un observador independiente. Para los controles de las células AR42J se expusieron a anticuerpo por menos de 1 segundo, y se usaron las células del hígado las cuales están exentas o libres del receptor CCK-B/gastrina. Las células AR42J expuestas a IgG normal también se usaron como controles para la determinación del enlace no específico de los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina. Los resultados de estos experimentos están mostrados en la Tabla 2 y Figura 6.

Tabla 2 Distribución de las Partículas Inmunooro del receptor CCK-B/gastrina Dentro de las Células AR42J (media + SEM por 25 células, repeticiones n=5) Como se demuestra en la Tabla 2 Figura 6, las partículas de anticuerpos inmunooros unidas al receptor de CCK-B/gastrina se localizan en la membrana plasmática, citoplasma, membrana nuclear y matriz nuclear de las células de adenocarcinoma, además, se demuestra que el - complejo anticuerpo/receptor está incorporado por las células. Como se observa en la Tabla 2, los estudios de inmunoEM que usan un antisuero dirigido contra el extremo amino-terminal del receptor CCK-B/gastrina muestra que después de una hora de incubación, la distribución del anticuerpo del receptor de CCK-B/gastrina etiquetado con inmunooro se incorpora rápidamente como el 12% del complejo receptor del anticuerpo asociado con la membrana celular, 36.6% está dentro del citoplasma, 7.9% está en la membrana nuclear, y muy sorprendentemente, 43.5% está dentro del núcleo celular. Las áreas intensas de inmunoreactividad del receptor CCK-B/gastrina dentro del núcleo se encuentran en la cromatina, la cual puede sugerir sitios de enlaces específicos para la regulación del ADN. Estos estudios de microscopía del electrón con anti-inmunoglobulina conjugada a las bolillas o pelotillas doradas (inmunooro) revelan que un cambio extremadamente rápido del complejo receptor/antireceptor ocurre en las células tumorales; tan pronto como 10 segundos después de la exposición a los anticuerpos, los complejos son detectables en los núcleos celulares como se observa en la Figura 6.

EJEMPLO 6 Las líneas celulares de adenocarcinoma, llamadas AR42J, HCT116, C170HM2, LoVo, ST16 y MGLVA1 , se hicieron crecer in vi tro y se cosecharon como se describe en el Ejemplo 3. Las células de los matraces 30 x T-75 se suspendieron en 5 mi de amortiguador de homogenización (1 mM de hidrógeno carbonato de sodio, 2 mM de cloruro de magnesio, 1 nM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 40 mM de cloruro de sodio, 10 µl de leupeptina, 1 µM de pepstatina, 5 nM de EDTA [Sigma]). La homogenización se realizó por 5 rupturas de 5 segundos de duración en un homogenizador . Para las membranas extranucleares, el tejido de desecho se formó en una pelotilla mediante centrifugación a 500g, 7 minutos a 4 ° C . La pelotilla se descargó y el sobrenadante se centrifugó a 500 g, 4°C para remover los desechos adicionales. El sobrenadante se recentrifugó a 48,000 g, 1 hora, 4°C. La pelotilla que contiene la preparación de la membrana extranuclear se suspendió en una solución de Tris/NP-40 (0.1M TRIZMA, 0.5% NONIDET P40 [Sigma Chemical]). Para las preparaciones de la membrana nuclear, después de la homogenización en un segundo del amortiguador de homogenización (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.1% TRITÓN 100, 0.32 M de sucrosa, 3mM MgCl2, 2 mM EGTA, 0.1 mM de tetraclorhidrato de espermina, 2 mM de PMSF, 10 mM de . clorhidrato de bezomidina, 3 mM de EGTA clorhidrato de aminoacetonitrilo [Sigma]), el tejido de desecho se formó en pelotilla mediante centrifugación a 400 g, por 10 minutos a 4°C. La pelotilla se resuspendió en sucrosa al 55% (0.2 M) en agua HPLC. Esta mezcla se revolvió a 60,000 g por 1 hora a 4°C. La pelotilla se lavó con NONIDET P40 al 0.4% en un amortiguador de homogenización sin TRITÓN 100. La pelotilla se revolvió a 700 g por 15 minutos a 4 ° C y se suspendió nuevamente en un amortiguador de homogenización sin TRITÓN 100. El contenido de proteína se determinó por el método de Lowry (usando un equipo Pierce) . Las muestras que contienen 10-15 µg de proteína se cargaron en un gradiente de Tris/glicina al 8-16% electroforesis con gel de poliacrilamida PAGE) (Sistemas Novex R y D) en amortiguador de Tris/glicina y se corrieron por 90 minutos a 125 volts constantes, 36 mA. El gel se fijó en ácido glacial acético al 10% por 1 hora y las muestras se mancharon en la membrana de nitrocelulosa . Las membranas se incubaron en BSA al 1% por 1 hora, seguidos por la incubación con antisuero GRP1 (con y sin preabsorpción ) por 1 hora. Se detectaron los enlaces de anticuerpos mediante el método del complejo de avidina : bitoina-peroxidasa usando diamino-bezideno como el subtrato. El resultado del análisis del manchado Western que usa el antisuero de conejo alcanzado contra el Péptido 1 (antisuero anti-GRP1 de conejo) está mostrado en la Figura 7 y Figura 8. Como se muestra en la Figura 7, el rango marca el peso molecular de 116, 66, 45 y 29 kDa. El manchado muestra una banda inmunoreactiva anti-Péptido 1 prominente localizada a aproximadamente 43 kDa en todos las células de adenocarcinomas estudiadas, es decir, HCT116, C170HM2, LoVo, ST16 y MGLVA1, excepto uno (AP5LV) . Esta proteína corresponde a la forma truncada del receptor CCK-B/gastrina. Algunas líneas celulares (HCT 116 y C170HM2) muestran al menos otras 3 bandas, que varía en peso molecular entre 60 y 100 kDa. Los datos indican que los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina pueden reconocer y enlazarse a varias isoformas del receptor CCK-B/gastrina en las células tumorales . La Figura 8 muestra un manchado Western de membrana plasmática y extranuclear (ENM) de células de adenocarcinoma C170HM2 y HCT116. Como se muestra en la Figura 8, las líneas celulares de adenocarcinoma ensayadas para los receptores de CCK-B/gastrina ENM, demuestran la existencia de dos bandas teñidas fuertemente: una de aproximadamente 43 kDa y la otra a aproximadamente 66 kDa. Cuando solamente se tiñó la fracción de la membrana plasmática, se presento una sola banda a aproximadamente 66 kDa. Así, los estudios del manchado Western confirman en los resultados de inmunoEM que el receptor CCK-B/gastrina está presente en las células tumorales de adenocarcinoma, a pesar de que los estudios de inmunoEM no distinguen entre las isoformas del receptor de CCK-B/gastrina. El dato indica que los inmunogenes presentes provocan anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina, los cuales pueden reconocer y enlazar varias isoformas del receptor, las cuales podrán ser ventajosas para el tratamiento de estos tumores.

EJEMPLO 7 Las células de adenocarcinoma C170HM2 que se inyectaron intraperitonealmente en tumores y ratones desnudos se dejaron crecer en el hígado. El ratón de control recibió una infusión de solución salina de fosfato amortiguador (PBS) y el ratón experimental recibió una infusión de un anticuerpo del receptor anti-CCK-B/gastrina. En el Grupo I, cada ratón se sometió a infusión diariamente con 0.5 mg de anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina de conejo generados contra el Péptido 1 ( anti-péptido 1 de conejo, RbtSGRPl). En el grupo 2, cada ratón recibió diariamente 0.5 mg de anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina de conejo, generados contra el Péptido 4 (anti-péptido 1 de conejo, RbtTGRPl) . El ratón se estudió por un periodo de 40 días después de la infusión del anticuerpo, se sacrificó y los tumores se removieron para su estudio. Se valoraron el peso, tamaño y área de sección transversal mediante técnicas estándares. Los resultados están mostrados en las Figuras 9 y 10. Como se observa en las Figuras 9 y 10, el implante de la línea celular de adenocarcinoma colorectal C170HM2 en ratones sin tratamiento, resultó en el rápido crecimiento de masas tumorales grandes, como se determina por el peso tumoral, o tamaño del tumor, y el área de sección transversal del tumor en los tumores. Sin embargo, la infusión de los animales con los anticuerpos anti-Péptido 1 de ratón o anti-Péptido 4 de ratón, resulta en una disminución marcada en el número de animales que tienen algún tumor detectable, así también como en el peso y tamaño de los tumores en animales que los tienen cuando se comparan al control. El mismo efecto se puede observar cuando se calcula el peso del tumor medio, el tamaño del tumor medio, o el número del tumor medio. Estos datos están mostrados en las Figuras 11, 12 y 13. Además, se mejora la penetración en la distribución dentro de la población por el cálculo de las medianas de los números de tumores, peso y tamaño • de los tumores. Los resultados están mostrados en las Figuras 14, 15 y 16. Como se observa en estas figuras, el inmunogen anti-péptido 1 de conejo fue consistentemente más efectivo que el anti-Péptido 4 de conejo en la inhibición del crecimiento del tumor. Sin embargo, ambos anticuerpo, anti-Péptido 1 y anti-Péptido 4 de conejo, presentan potente actividad inhibitoria del tumor con la comparada con el tratamiento de control.

EJEMPLO 8 Se generó un tumor de gran peso en el ratón desnudo usando la línea celular de cáncer de colon C170HM2 mediante el método como se describe en el Ejemplo 7, pero con un inoculo celular inicial elevado. La línea celular C170HM2 es un modelo xenografo invasor del hígado. Los ratones de control y experimentales se trataron también como se describe en el Ejemplo 7. Cuarenta días después de la infusión del anticuerpo, los ratones se sacrificaron y los tumores del hígado se removieron y estudiaron. Las Figuras 17, 18 y 19, muestran los resultados de estos experimentos. La Figura 17 muestra la media y la mediana en el número de tumores del hígado de los animales de control y tratados con el anticuerpo del receptor anti-CCK-B/gastrina. El dato muestra que los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina de conejo (" RabbitSGRP" ) son efectivos en la inhibición del crecimiento de los tumores metastáticos en el hígado. Hay una disminución estadísticamente significante en los números principales de tumores en el hígado en los hígados de los ratones que usan el anti-Peptido 1 de conejo (ensayo de T de Student), p= 0.0084 en la mediana del número de tumores del hígado, p = 0.0016 (Mann Whitney) cuando se comparan con los controles. Los ratones tratados con anticuerpos anti-Péptido 4 también muestran una disminución en la media del número del tumor del hígado, sin embargo, no hay una diferencia en la media del número del tumor del hígado en estos animales cuando son comparados con los controles . La figura 18 muestra que los anticuerpos anti-Péptidos 1 y anti-Péptidos 4 también son capaces de reducir los pesos de tumores medios y medianos de la metástasis del hígado cuando se comparan con los animales de control. El dato en la Figura 19 muestra que el ratón tratado con el receptor anti-CCK-B/gastrina tiene también una disminución significante en el área transversal mediana y principal de los tumores del hígado cuando se comparan con los animales de control. Los datos indican que los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina son efectivos en el control de la expansión y crecimiento de un cáncer de colon dependiente de la gastrina en el hígado, el cual constituye el mayor sitio de la expansión metastática de este cáncer.

EJEMPLO 9 Estos estudios se realizaron para confirmar la inmunoreactividad GRP1 en las células C170HM2. El ámbito del estudio fue para evaluar la localización del antisuero alcanzado contra el GRP1 y para determinar su efecto terapéutico en el crecimiento de las células C170HM2 dentro del hígado de ratones desnudos. Las células C170HM2 se inyectaron int raperitonealmente en ratones desnudos como se describe en el Ejemplo 7 anterior. Se alcanzó el antisuero GRP1 en conejos. El antisuero se redioetiquetó con 125I y se administró a. -TLos ratones desnudos con xenografías establecidas C170HM2 mediante una inyección en la vena posterior. Los ratones de control recibieron suero de conejo normal 1251 radioetiquetado. Los ratones se terminaron en puntos de tiempo incrementados después de la inyección de una sola dosis de anticuerpos 125I. Se midió la radioactividad como cuenteo por minuto por gramo de tejido (CPM/g) y se calculó la proporción del tumor hígado/hígado. La Figura 20 es una gráfica la cual muestra los anticuerpos anti-GRPl de conejo radioetiquetados enlazados a los tumores del hígado contra los de control. Como se observa en la figura, se enlazan más anticuerpos anti-GRPl de conejo a los tejidos del tumor cuando se comparan a los controles. La Figura 20 también muestra la proporción del tumor del hígado/hígado en el eje y con tiempo incrementado en el eje x por ambos suero de conejo normal radioetiquetado y antisuero GRP1. El suero de conejo normal alcanzó una proporción de 1 desde el día 1 el cual permaneció constante hasta el día 5. Esto indica que el nivel de la radioetiqueta en el tumor del hígado y el hígado normal fue igual. La proporción para el antisuero GRP1 acumulada exponencialmente se aproximó de 2 hasta el día 5. Esto indica que el antisuero GRP1 radioetiquetado se localiza específicamente dentro de los tumores del hígado C170H2M2 EJEMPLO 10 Efecto terapéutico de antisuero GRP1 en xenografos C170HM2 Se inició el xenografo del tumor C170HM2 por inyecciones celulares intraperitoneales. Se usaron tres diferentes inóculos celulares para generar 3 niveles de tumores grandes. El antisuero GRP1 se administró pasivamente por la inyección de la vena posterior diariamente desde el día 0. Se terminó la terapia en el día 40.

Efecto del antisuero GRP1 en "proporción obtenida" del tumor El parámetro inicial evaluado fue el número de tumor medio dentro del hígado el cual está mostrado en la Figura 21. Los controles tratados con antisuero de conejo normal están agrupados en el incremento del inoculo celular. Como se observa en la Figura 21, en los grupos de control, el número de tumor medio por hígado fue entre 1 y 3. En el grupo tratado con antisuero GRP1 el número de tumor medio por hígado fue menor que 1 para los tres inóculos celulares, los cuales fueron significantes para todos los 3 experimentos (inoculo uno 8, p=0.003; inoculo 2, n=12, p=0.0001 e inoculo 3, n=20, p=0.0068, análisis Mann Whitney) .

Efecto del antisuero GRP1 en el peso del tumor de tumores establecidos .

La Figura 22 muestra el peso del tumor medio para los controles tratados de suero de conejo normal en el panel izquierdo para el incremento de los 3 inóculos celulares. La figura también muestra que el peso del tumor medio del ratón desnudo después del tratamiento con el antisuero GRP1, al peso del hígado principal se redujo de 60% dentro de todos los 3 inóculos celulares, los cuales fueron significantes para todos los 3 experimentos (inoculo uno 8, p=0.0016; inoculo 2, p=0.0084 e inoculo 3, p=0.0001, análisis Mann Whitney) .

Inmunoreact±vidad GRPl en xenografos C170HM2 como la determinada por el Manchado Western Las proteínas de la membrana extra-nuclear se prepararon a partir de los xenografos C170HM2 de 2/3 de experimentos. Estos se analizaron por el manchado Western usando el antisuero GRPl. La Figura 23 es una fotografía del manchado Western mostrando las bandas inmuno-reactivas del xenografo 2 tratado con suero de conejo normal presentadas a 74 y 50 kDa, con la banda formadora que muestra la inmunoreactividad más potente. En los xenografos tratados con antisuero GRP1, hay 2 bandas inmunoreactivas junto con una banda intermedia, que no se observan en los xenografos de control o células que crecen in vi tro . Una banda de 50 kDa muestra la inmunoreactividad más potente. Esto indica que en los xenografos tratados con antisueros GRP1, puede estar presente una porción mayor de los receptores CCK-B/gastrina como una forma interna.

Análisis histológico de los xenógrafos C170HM2 La Figura 24 muestra una vista microscópica de un xenógrafo C170HM2 que invade el hígado de un ratón desnudo. El tumor está compuesto de manera general de un centro necrótico con un borde conductor viable el cual aprieta a los hepatocitos en cuanto invaden al hígado. El grado de apoptosis se midió en el borde portador viable de los tumores C170HM2 mediante el método del Túnel con las células positivas visualizadas mediante hibridación in si tu . La Figura 25 muestra que las células apoptóticas están presentes en las células tumorales viables en los xenógrafos tratados con anti-suero GRP1, pero no en los tumores tratados con suero de conejo normal. El dato muestra que el antisuero alcanzado contra el epitope aminoterminal del receptor de CCK-B/gastrina se localiza selectivamente dentro de los tumores C170HM2 invasores del hígado. La neutralización del epitope GPR1 induce un efecto significante en ambos tumores "proporción obtenida" y el volumen del tumor grande de los tumores que se establecieron. Este efecto inhibitorio del tumor puede ser debido a (a) un efecto citostático general inducido por el bloqueo del receptor de CCK-B/gastrina y/o (b) un efecto indirecto de un anticuerpo objetivo al núcleo de la célula, posiblemente que resulta en una apoptosis.

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Claims (25)

REI INDICACIONES

1. Un inmunogen caracterizado porque comprende un péptido del receptor CCK-B/gastrina conjugado a un portador inmunogénico .

2. El inmunogen de la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene la secuencia de aminoácido KLNRSVQGTGPGPGASL (SEC ID NO: 1 en el Listado de Secuencias) o GPGAHRALSGAPISF (SEC ID NO : 2 en el Listado de Secuencias ) .

3. El inmunogen de la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque, además, comprende una secuencia peptídica espaciadora.

4. El inmunogen de la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia peptídica espaciadora es SSPPPPC (SEC ID N0:3 en el Listado de Secuencias ) .

5. El inmunogen de la reivindicación 1 , caracterizado porque el portador inmunogénico se selecciona a partir del grupo que consiste de toxoide de Difteria, toxoide de tétano y albúmina de suero bovino .

6. Un método para tratar una condición maligna causada por el crecimiento de células malignas que dependen de la gastrina, caracterizado porque comprende administrar a un animal en necesidad de tal tratamiento, de una cantidad efectiva de un inmunogen del receptor anti-CCK-B/gastrina.

7. El método de la reivindicación 6, caracterizado porque el inmunogen comprende un péptido del receptor CCK-B/gastrina.

8. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque el péptido tiene la secuencia de aminoácido KLNRSVQGTGPGPGASL (SEC ID NO: 1 en el Listado de Secuencias) o GPGAHRALSGAPISF (SEC ID NO : 2 en el Listado de Secuencias) .

9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el inmunogen además, comprende una secuencia peptídica espaciadora.

10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia peptídica espaciadora es SSPPPPC (SEC ID NO : 3 en el Listado de Secuencias ) .

11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque, demás, comprende un portador inmunogénico seleccionado del grupo que consiste de toxoide de difteria, toxoide de tétano y albúmina de suero bovino.

12. Un método para el tratamiento de un tumor dependiente de la gastrina, caracterizado porque comprende administrar a un animal en necesidad de tal tratamiento, de una cantidad efectiva de anticuerpos anti-CCK-B/gastrina el cual reconoce y se enlaza a los receptores de CCK-B/gastrina en las células tumorales.

13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque los anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste de anticuerpos quiméricos, monoclonales y humanizados.

14. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina reconocen y se enlazan a la secuencia de aminoácido KLNRSVQGTGPGPGASL (SEC ID NO: 1 en el Listado de Secuencias) o GPGAHRALSGAPISF (SEC ID NO : 2 en el Listado de Secuencias) del receptor.

15. El método de la reivindicación 12 o 14, caracterizado porque los anticuerpos además, están conjugados a una molécula citotóxica.

16. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula citotóxica es una toxina o una molécula radioactiva.

17. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque la toxina es la toxina del cólera.

18. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque la molécula radioactiva está etiquetada con 125I o 131I .

19. Un método para detectar un tumor que responde a la gastrina que contiene los receptores CCK-B/gastrina, caracterizado porque comprende exponer un anticuerpo del receptor anti-gastrina a células aisladas a partir de una muestra de biopsia del tumor, y, detectar el receptor CCK-B/gastrina en la muestra.

20. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo del receptor anti-gastrina es específico para un péptido amino-terminal del receptor CCK-B/gastrina.

21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el péptido que está en la región amino-terminal del receptor CCK-B/gastrina comprende residuos de aminoácidos 5-21.

22. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende un inmunogen del receptor anti-CCK-B/gastrina.

23. La composición de la reivindicación 22, caracterizada porque el inmunogen comprende un péptido del receptor CCK-B/gastrina.

24. Un método para diagnosticar un tumor dependiente de la gastrina, caracterizado porque comprende administrar anticuerpos del receptor CCK-B/gastrina radioetiquetados a un paciente que posee un tumor colorectar y la formación de imágenes del tumor mediante exploración escintigráfica

25. El método de la reivindicación 25, caracterizado porque los anticuerpos del receptor anti-CCK-B/gastrina están radioetiquetados con llxIndio o 90Itrio