JPH11505611A

JPH11505611A - アミリン放出の抑制

Info

Publication number: JPH11505611A
Application number: JP8533796A
Authority: JP
Inventors: デュンモレ，サイモン，ジョン; ダベンポート，ミシェル; カウトーン，ミカエル，アンソニー
Original assignee: ユニヴァーシティオブバッキンガム
Priority date: 1995-05-12
Filing date: 1996-05-11
Publication date: 1999-05-21
Also published as: EP0829011A1; CA2220106A1; AU694360B2; NZ308105A; US20010006790A1; US5763200A; US6774109B2; DK0829011T3; WO1996035950A1; ATE223045T1; DE69623280D1; DE69623280T2; US20040146951A1; AU5764596A; MX9708740A; EP0829011B1; PT829011E; ES2180769T3

Abstract

(57)【要約】化合物のソマトスタチンタイプ−５レセプター（ＳＳＴＲ−５）への結合能及びアミリン放出の抑制能を測定する方法。当該方法は、ＳＳＴＲ−５を含む、調製物、細胞調製物または膜調製物のいずれか、を得；該調製物、化合物、及びＳＳＴＲ−５リガンドをインキュベートし、この際、リガンド及び化合物の少なくとも一方は検出できるように標識され；化合物のＳＳＴＲ−５への結合に関するリガンドとの競合能を測定し；化合物がＳＳＴＲ−５に結合できると決定される際に及びそのように決定される際にのみ、膵臓細胞を得；アミリン放出刺激物質が膵臓細胞からのアミリンの放出を誘導する条件下で、化合物、膵臓細胞、及びアミリン放出刺激物質をインキュベートし；さらに化合物のアミリン放出の抑制能を測定することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】アミリン放出の抑制発明の背景カルシトニン遺伝子関連タンパク質（クーパー(Cooper)、エンドクリンレビュー(Endocrine Review)、１５：１６３（１９９４年）を参照）と構造が関連する３７アミノ酸ポリペプチドである、アミリンは、まず、合成され、パッケージングされ、ランゲルハンス島のβ−細胞から分泌される。ランゲルハンス島に加えて、アミリン様免疫反応活性が、肺、胃腸管、及び神経系でも検出された。ミヤザトエム(MiyazatoM.)ら、バイオクバイオフィレスコム(Bioch．Biop h．Res．Comm.)、１８１：２９３（１９９１年）；チャンス(Chance)ら、ブレインレス(Brain Res.)、５３９：３５２（１９９１年）；マルダー(Mulder)ら、ガストロエンテロロジー(Gastroenterology)、１０７：７１２（１９９４年）を参照のこと。血液における異常に高濃度のアミリンの存在、即ち、高アミリン血症(hyperam ylinemia)が、膵臓癌の患者（パーマート(Permert)ら、エヌエングルジェーメド(N．Engl．J．Med.)、３３０：３１３（１９９４年）を参照）、肥満患者（ヒュアング(Huang)ら、ハイパーテンション(hypertension)、１９（Ｓｕｐｐ．Ｉ）：１０１（１９９２年）を参照）、および前糖尿病患者（エリックソンジェー(Erickson J.)、ダイアベトロジア(Diabetologia)、３５：２９１（１９９２年）を参照）において発見された。高アミリン血症状態は、糖尿病およびアミロイド形成の双方と関連があった（デコニング(Dekoning)ら、プロックナショルアカデサイユーエスエー(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)、９１：８４６７（１９９４年）を参照）。アミロイドの形成は、β島細胞の破壊、さらには膵臓の機能不全を引き起こす（ジョンソン(Johnson)ら、ラブインヴェスト(Lab．Invest.)、６６：５２２（１９９２年）及びロレンツォ(Lorenzo)ら、ネーチャー(Nature)、３６８：７５６（１９９４年）を参照）。天然のソマトスタチンは、１４−アミノ酸イソ型（ソマトスタチン−１４）及び２８−アミノ酸イソ型（ソマトスタチン−２８）から構成される（ライヒリン (Reichlin)、ニューイングジェーメディシン(New Eng．J．Medicine)、３０９（２４）：１４９５（１９８３年）を参照）。５個の別のソマトスタチンレセプターが同定されその特性が明らかにされた（ホイアー(Hoyer)ら、ノイニン −シュミーデベルグスアークファーマコル(Naunyn-Schmiedeberg's Arch．P harmacol.)、３５０：４４１（１９９４年）を参照）。ソマトスタチンは、ホルモン放出、例えば、成長ホルモン、グルカゴン、インスリン、アミリン、及び神経伝達物質放出、の修飾などの様々な効果を有する。これらの効果によっては、特定のソマトスタチンレセプターへの結合に関連するものもあった。例えば、成長ホルモンの抑制はソマトスタチンタイプ−２レセプター（「ＳＳＴＲ−２」）によるものであった（レイナー(Raynor)ら、モレキュラーファーマコル(Molec ular Pharmacol.)、４３：８３８（１９９３年）及びロイド(Lloyd)ら、アムジェーフィジオル(Am．J．Physiol.)、２６８：Ｇ１０２（１９９５年）を参照）。天然のソマトスタチンの半減期は短いため、様々なソマトスタチン類似体が、例えば、先端巨大症の処置を目的として、開発された（レイナー(Raynor)ら、モレキュラーファーマコル(Molecular Pharmacol.)、４３：８３８（１９９３年）を参照）。発明の要約本発明は、ソマトスタチンタイプ−５レセプター（「ＳＳＴＲ−５」）に選択的なリガンドが膵臓細胞からのアミリンの放出を有効に抑制するという発見に基づくものである。本発明の概念は、化合物のソマトスタチンタイプ−５レセプターへの結合能及びアミリンを分泌する膵臓細胞からのアミリン放出の抑制能を測定する方法に関するものである。該方法は、（ｉ）ＳＳＴＲ−５を含む調製物、細胞調製物または膜調製物のいずれか、を得る；（ｉｉ）該調製物、化合物、及びＳＳＴＲ−５リガンドをインキュベートし、この際、リガンド及び化合物の少なくとも一方は検出できるように標識される(detectably Iabeled)；（ｉｉｉ）化合物のＳＳＴＲ−５への結合に関するリガンドとの競合能を測定する；（ｉｖ）化合物がＳＳＴＲ−５に結合できると決定される際に及びそのように決定される際にのみ、アミリンを分泌する膵臓細胞（例えば、ラットまたはマウス等の齧歯動物由来の無傷の膵臓の細胞、β細胞等のランゲルハンス島細胞、またはアミリノーマ細胞(a mylinoma cell)）を得る；（ｖ）アミリン放出刺激物質が膵臓細胞からのアミリンの放出を誘導する条件下で、化合物、膵臓細胞、及びアミリン放出刺激物質（例えば、グルコースまたはＤ−グリセルアルデヒド）をインキュベートする；及び（ｖｉ）化合物のアミリン放出の抑制能を測定する段階からなる。「ＳＳＴＲ−５リガンド」は、ＳＳＴＲ−５に結合する化合物を意味し、例えば、ソマトスタチン−１４、ソマトスタチン−２８、ソマトスタチン−１４若しくはソマトスタチン−２８の類似体（［Ｔｙｒ¹¹］−ソマトスタチン−１４等）、またはＳＳＴＲ−５に対して生じる抗体が挙げられる。リガンドまたは試験化合物のいずれかを放射性同位元素または非放射性（例えば、蛍光性、化学発光性、若しくはビオチン化）分子で標識されてもよい。好ましくは、［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］−ソマトスタチン− １４を標識されたＳＳＴＲ−５リガンドとして用いて、上記方法を実施する。標識されたリガンドの他の例としては、¹²⁵Ｉ−ＬＴＴ−ソマトスタチン−２８（パテル(Patel)ら、エンドクリノル(Endocrinol.)、１３５（６）：２８１４（１９９４年）を参照）および¹²⁵Ｉ−ＣＧＰ２３９９６（レイナー(Raynor)ら、モルファーム(Mol．Pharm.)、４４：３８５〜３９２（１９９３年）を参照）が挙げられる。上記方法を実施するにあたって使用される膵臓細胞の例としては、齧歯動物やヒトの膵島細胞（例えば、β及びδ細胞）および膵臓腫瘍細胞（例えば、アミリノーマ細胞(amylinoma cell)）が挙げられる。膵臓細胞は、インビトロあるいはインビボのいずれでインキュベートされてもよい。インビトロシステムの例としては、単離されたラットの膵臓、ラットのβ−細胞系ＲＩＮｍ５ｆ、及びハムスターのβ−細胞系ＨＩＴ−Ｔ１５が挙げられる。インビボシステムの例としては、スプラグ−ダウレイ(Sprague-Dawley)またはツッカー(Zucker)脂肪ラットを試験ソマトスタチン類似体のアミリン抑制活性を試験するための動物モデルとして使用できる。アミリン放出刺激物質、例えば、１６．７ｍＭグルコース、は、動物に注射されてもよい。次に、試験ソマトスタチン類似体は、様々な濃度で動物に注射される。血液サンプルを動物から採取し、試験ソマトスタチン類似体の注射前後に存在するアミリンの量はラジオイムノアッセイによって測定できる。「アミリン放出刺激物質」は、膵臓細胞中に貯蔵されるアミリンの放出を刺激する化合物を意味する。アミリン放出刺激物質の例としては、グルコース、Ｄ− グリセルアルデヒド、またはＬ−アルギニンが挙げられる。上記方法は、患者の膵臓由来のアミリンの放出を抑制できる新規な化合物をスクリーニングするために使用できる。効率を促進するために、本方法をスクリーニングプロジェクトで使用する際には、２以上の試験化合物を単一のサンプルとして一緒に使用してもよく、必要であれば、その後、分けて再試験してもよい。本発明の他の概念は、高アミリン血症にかかっている、あるいはかかりやすい被験者（例えば、哺乳動物などの温血動物、例えば、ヒト）の膵臓由来のアミリンの放出を抑制することによって高アミリン血症を処置する（即ち、予防するまたは改善する）方法に関するものである。上記方法は、被験者に、高アミリン血症を処置するのに、即ち、膵臓細胞からのアミリンの放出を抑制することによって血流におけるアミリンレベルを低減するのに有効な量のＳＳＴＲ−５アゴニストを（例えば、非経口で、静脈内に、皮下に、経皮で、粘膜内に、または持続放出性配合物の移植を介して）投与することからなる。「ＳＳＴＲ−５アゴニスト」または、請求の範囲における、「ソマトスタチンタイプ−５レセプターアゴニスト」は、（ｉ）ＳＳＴＲ−２に対してよりＳＳＴＲ−５に対してより選択性が高い、即ち、ＳＳＴＲ−５に関するＫ_iがＳＳＴＲ −２に比べて低い（下記実施例で記載されるレセプター結合アッセイの一によって測定される際に）；および（ｉｉ）アミリン放出刺激物質によって誘導される膵臓細胞からのアミリンの放出を抑制する（下記実施例で記載される機能アッセイの一によって測定される際に）化合物を意味する。ＳＳＴＲ−５アゴニスト及びこれらの選択工程の例は、以下の「発明の説明」の欄に記載する。上記治療方法は、膵臓癌、前糖尿病症状、または非インスリン依存型糖尿病にかかっている被験者を処置するのに使用できる。有効量は、処置される状態、選択される投与経路、及び使用される化合物の特異的な活性によって変化し、最終的には、主治医または獣医によって決定される。ＳＳＴＲ−５アゴニストを純粋なあるいは実質的に純粋な化合物として投与することも可能であるが、薬剤配合物または調製物として存在することが好ましい。ヒト及び動物に対して、本発明において使用される配合物は、以下のＳＳＴＲ −５アゴニストのいずれか、および一以上の製薬上許容できる担体や必要であれば他の治療成分からなる。担体は、配合物の活性成分と適合し（及び好ましくは、ペプチドを安定化でき）、処置される被験者に有害でないという意味で「許容できる」ものでなければならない。配合物は、単位服用量形態で簡便に存在していてもよく、また、薬学の分野において既知の方法によって調製されてもよい。すべての方法は、活性成分を一以上の補助成分を構成する担体と合わせる段階を含む。通常、錠剤または粉末用の配合物は、活性成分を超微粒子状の固体担体と均一にかつ均質にブレンドした後、錠剤の場合には必要であれば、生成物を望ましい形状及び大きさに形成することによって調製される。一方、静脈内または皮下投与に適した配合物は、簡便には、活性成分の滅菌水溶液からなる。好ましくは、溶液は、処置される被験者の血液と等張である。このような配合物は、固体の活性成分を水に溶解して水溶液を得、さらにこの溶液を滅菌することによって簡単に調製される。この配合物は、１回の投与用の(uni t-dose)あるいは複数回の投与用の(multi-dose)容器、例えば、密閉されたアンプルまたはバイアル中に含ませてもよい。持続放出性配合物の非経口移植による薬剤のデリバリーは当該分野において既知である。例えば、米国特許番号３７７３９１９号、米国特許番号４７６７６２８号；及びＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／００１４８号を参照。治療または予防、例えば、高アミリン血症に関連する病気または疾患の処置に使用されるＳＳＴＲ−５アゴニスト、このような病気または疾患の処置を目的とする薬剤の製造へのＳＳＴＲ−５アゴニストの使用もまた、本発明の概念に含まれる。本発明はさらに、本発明の方法によって同定される新規なＳＳＴＲ−５アゴニストおよびＳＳＴＲ−５アゴニストを含む薬剤組成物に関するものである。ＳＳＴＲ−２に対してよりＳＳＴＲ−５に対する方がより選択的であるリガンドを高アミリン血症を処置するのに使用することにより、望ましくない副作用を最小限にできる。本発明の他の態様及び利点は、以下の様々な実施態様の図面及び詳細な説明からおよび請求の範囲から明らかであろう。図面の簡単な説明まず、図面を以下に簡単に説明する。図１は、グルコースにより誘導されるアミリンの分泌に関するソマトスタチン −１４の効果を示すグラフである。図２は、グルコースにより誘導されるアミリンの分泌に関するソマトスタチン類似体の効果を示すグラフである。図３は、グルコースにより誘導されるアミリンの分泌に関する他のソマトスタチン類似体の効果を示すグラフである。発明の説明本発明の治療方法を実施するにあたって使用できるＳＳＴＲ−５アゴニストは、ＳＳＴＲ−２に対してよりＳＳＴＲ−５に対する方がより選択的であるソマトスタチンレセプターリガンドである。特定のレセプターに対するＳＳＴＲ−５アゴニストの選択性は、ＳＳＴＲ−５及びＳＳＴＲ−２に関する各結合阻害定数（Ｋ_i’ｓ）が測定されるレセプター結合アッセイによって測定される。アミリンの放出を抑制できるＳＳＴＲ−５アゴニストは、（ｉ）ヒトのＳＳＴＲ−２でトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて測定される際の、ヒトのＳＳＴＲ−２に関するＫ_iよりも低い、ヒトのＳＳＴＲ−５でトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて測定される際の、ヒトのＳＳＴＲ−５に関するＫ_i、または（ｉｉ）ＡＲ４２Ｊラット膵腺房の腫瘍細胞を用いて測定される際の、ラットのＳＳＴＲ−２に関するＫ_iよりも低い、ラットの嗅球細胞を用いて測定される際の、ラットのＳＳＴＲ−５に関するＫ_iのいずれかを有する上記化合物である。ここで述べられた４種の結合アッセイは以下の実施例において詳細に説明する。好ましいＳＳＴＲ−５アゴニストは、ＳＳＴＲ−２に対するよりＳＳＴＲ−５に対する方が少なくとも３倍選択性が高い；言い換えると、ヒトのシステムまたはラットのシステムにおいて、ＳＳＴＲ−５に関するＫ_iに対するＳＳＴＲ−２に関するＫ_iの割合が３以上（例えば、３〜１０，０００、例えば、３〜１，０００、特に、３〜１００、より特に３〜６０）である。より好ましいＳＳＴＲ−５アゴニストは、ＳＳＴＲ−２に対する選択性に比べて１０倍以上のＳＳＴＲ−５に対する選択性を有する。好ましくは、上記ＳＳＴＲ−５アゴニストは、直鎖状のペプチド、例えば、オクタペプチド等のオリゴペプチドである。このような直鎖状のペプチドの例としては、以下に制限されるものではないが、以下の一般式に含まれるものが挙げられる：ただし、Ａ¹は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、 β−Ｎａｌ、β−Ｐａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、２，４−ジクロロ−Ｐｈｅ、ペンタフルオロ−Ｐｈｅ、ｐ−Ｘ−Ｐｈｅ、またはｏ−Ｘ−Ｐｈｅ［但し、ＸはＣＨ₃ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃若しくはＮＯ₂である］のＤ−またはＬ−異性体であり；Ａ²は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｌｅ、Ｐｈｅ、β−Ｎａｌ、ピリジル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、２，４−ジクロロ−Ｐｈｅ、ペンタフルオロ−Ｐｈｅ、ｏ−Ｘ−Ｐｈｅ、またはｐ−Ｘ−Ｐｈｅ［但し、ＸはＣＨ₃、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃若しくはＮＯ₂である］であり；Ａ³は、ピリジル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、β−Ｎａｌ、２，４−ジクロロ− Ｐｈｅ、ペンタフルオロ−Ｐｈｅ、ｏ−Ｘ−Ｐｈｅ、またはｐ−Ｘ−Ｐｈｅ［但し、ＸはＣＨ₃、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃若しくはＮＯ₂である］であり；Ａ⁶は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｂｕ、またはＳｅｒであり；Ａ⁷は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｌｅ、Ｐｈｅ、β−Ｎａｌ、ピリジル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、２，４−ジクロロ−Ｐｈｅ、ペンタフルオロ−Ｐｈｅ、ｏ−Ｘ−Ｐｈｅ、またはｐ−Ｘ−Ｐｈｅ［但し、ＸはＣＨ₃、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃若しくはＮＯ₂である］であり；Ａ⁸は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、 β −Ｎａｌ、ピリジル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、２，４−ジクロロ−Ｐｈｅ、ペンタフルオロ−Ｐｈｅ、ｐ−Ｘ−Ｐｈｅ、またはｏ−Ｘ−Ｐｈｅ［但し、ＸはＣＨ₃、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃若しくはＮＯ₂である］のＤ−またはＬ−異性体であり；Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ独立して、Ｈ、低級アシル（例えば、Ｃ₇アシルまで）または低級アルキル（例えば、Ｃ₁からＣ₆のアルキル）であり；Ｒ₃は、ＯＨまたはＮＨ₂であり：この際、Ａ¹及びＡ⁸の少なくとも一およびＡ²及びＡ⁷の一方は芳香族アミノ酸でなければならず；およびＡ¹、Ａ²、Ａ⁷及びＡ⁸はすべてが芳香族アミノ酸にはならない。本発明の治療方法に使用される直鎖状のＳＳＴＲ−５アゴニストの例としては、下記が挙げられる： H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH₂ (BIM-23052); H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-OH (類似体I); H-D-Phe-p-クロロ-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH₂; H-D-Phe-p-NO₂-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂; H-D-Nal-p-クロロ-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂; H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂; H-D-Phe-p-クロロ-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂; H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-β-Nal-NH₂;及び H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-D-Phe-NH₂。必要であれば、一以上の化学部分、例えば、糖誘導体、モノ−若しくはポリ− ヒドロキシＣ_2-12アルキル基、モノ−若しくはポリ−ヒドロキシＣ_2-12アシル基、またはピペラジン誘導体、を、ＳＳＴＲ−５に、例えば、Ｎ−末端アミノ酸に結合させてもよい（ＰＣＴ出願番号ＷＯ８８／０２７５６号、欧州特許出願番号０３２９２９５号、及びＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０８８７５号を参照）。Ｎ−末端が化学的に置換されたＳＳＴＲ−５アゴニストの例としては、以下がある：特記しない限り、本明細書中に記載されるすべてのアミノ酸配列式に関して、各アミノ酸残基、例えば、Ａ¹またはＬｙｓ、は、ＨＮ−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯ−の構造（但し、Ｒは側鎖である）を表わすことを留意すべきである。アミノ酸残基間の線は、２個のアミノ酸を結合するペプチド結合を表わす。また、アミノ酸残基が光学活性を有する際には、Ｄ−体と特記していない限り、Ｌ−体の立体配置を意味するものとする。一般的でない略称である、β−Ｎａｌ、β−Ｐａｌ、Ｎｌｅ、及びＡｂｕは、それぞれ、３−（β−ナフチル）アラニン、３−（β−ピリジル）アラニン、ノルロイシン、及びα−アミノ酪酸を表わす。さらに詳細に述べなくとも、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明を十分利用できると考えられる。特記しない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的及び科学的な用語は本発明が属する分野における通常の知識を有するものによって一般的に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書中に記載される方法及び材料と類似のあるいは同様の方法及び材料は、本発明の実施または試験において使用できる。本明細書中で述べられるすべての公報、特許出願、特許、及び他の引用文献は、参考のために引用される。さらに、材料、方法、及び実施例は詳細に述べるのみであり、本発明を制限するものではない。ソマトスタチンレセプターリガンドの合成短いアミノ酸配列の合成はペプチド分野において良く確立されている。例えば、上記構造を有する、ＢＩＭ−２３０５２の合成は、欧州特許出願番号０３９５４１７Ａ１号の実施例Ｉに記載されるプロトコルに従うことによって達成できる。Ｎ−末端が置換されたソマトスタチン類似体の合成は、例えば、ＷＯ８８／０２７５６号、欧州特許出願番号０３２９２９５号、及びＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０８８７５号に記載されるプロトコルに従うことによって達成できる。類似体Ｉ及びＩＩ等のＳＳＴＲ−５アゴニストは同様にして合成できる。放射線標識されたソマトスタチンレセプターリガンドの合成放射線標識されたソマトスタチンレセプターリガンドの合成は、良く報告されており、当該分野における通常の知識を有するものの能力内である（例えば、チェルニック(Czermick)ら、ジェーバイオルケム(J．Biol．Chem.)、２５８：５５２５（１９８３年）を参照）。例えば、ＳＳＴＲ−２の放射リガンド、シクロ（Ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ［Ｉ¹²⁵］−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ）または［Ｉ¹²⁵−Ｔｙｒ］ＭＫ−６７８、を下記の方法で合成した：非ヨウ素化環状ヘキサペプチドをまず米国特許番号４３１０５１８号に記載の方法に従って合成した。次に、このヘキサペプチドをクロラミン−Ｔ法を用いてヨウ素化した。より詳しくは、５０ｎＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４、５０μ ｌ）、ＭＫ−６７８の溶液（リン酸塩緩衝液において１ｍＭ、１０μｌ）、及びＮａ¹²⁵Ｉ（約１０μｌのＨ₂Ｏにおいて１ｍＣｉ）をポリプロピレン管に添加した。反応を、新たに調製したクロラミン−Ｔ溶液（Ｈ₂Ｏにおいて１ｍｇ／ｍｌ；１０μｌ）を添加することによって開始した。この混合物を３０秒間撹拌した後、リン酸塩緩衝液におけるシステイン溶液（２ｍｇ／ｍｌ；１００μｌ）を加えて反応を終了させた。材料をＨＰＬＣによって精製した。目的とする生成物を含む画分を、３０分間で２０〜５０％のグラジエントで２１４ｎｍのＵＶ検出によって同定し、貯め、１０％エタノールで希釈し、さらに−２０℃で貯蔵した。別の放射線標識されるソマトスタチンレセプターリガンド［Ｉ¹²⁵−Ｔｙｒ¹¹ ］ソマトスタチン−１４は、同様の方法に従って調製できる。［Ｉ¹²⁵−Ｔｙｒ¹ ¹ ］ソマトスタチン−１４はまた市販される。ソマトスタチンレセプター結合アッセイ（１）ラットのＳＳＴＲ−２結合アッセイ未精製膜(crude membrane)を、１５秒間、セッティング６で、ポリトロンホモゲナイザー(POLYTRON homogenizer)（ブリンクマンインストラメンツ(Brinkma nn Instruments)、ウェストバリー(Westbury)、ニューヨーク，米国）で２０ｍｌの氷冷した５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（緩衝液Ａ）中でＡＲ４２Ｊ細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィレ，メリーランド(Rockville，Maryland)，米国；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１９９２）を均質化することによって調製した。さらに緩衝液Ａを添加して最終容積を４０ｍｌとし、ホモジネートを、０〜４℃で１０分間、ソルヴァルＳＳ−３４ローター(Sorval SS-34 rotor)（デュポン(DuPont)、ニュータウン，コネチカット(Newtoun，Connecticut)，米国）で３９，０００ｇで遠心した。得られた上清をデカンテーションして捨てた。ペレットを氷冷した緩衝液Ａ中に再度均質化し、希釈し、前記と同様にして遠心した。最終的なペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ中に再懸濁し、レセプター結合アッセイ用に氷上に維持した。膜調製物のアリコートを、様々な濃度の試験ペプチド（例えば、１０^-11〜１０^-6Ｍ）、１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（フラクションＶ）（シグマケミカルシーオー(Sigma Chemical Co.)、セントルイス，ミズーリ(St．Louis， Missouri)，米国）、ＭｇＣｌ₂（５ｍＭ）、トラジロール（２００ＫＩＵ／ｍｌ）、バシトラシン（０．０２ｍｇ／ｍｌ）、及びフェニルメチルスルホニルフッ化物（０．０２ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）における０．０５ｎＭ［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ］ＭＫ−６７８（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と共に２５℃で９０分間インキュベートした。最終的なアッセイ容積は０．３ｍｌであった。インキュベーションを、瀘過マニホルド(filtration manifold)（ブランデル(Brandel)，ガイザースブルグ，メリーランド(Gaithersburg，Maryla nd)，米国）を用いたＧＦ／Ｃフィルター（予め０．３％ポリエチレンイミン中に３０分間浸漬した）によるラピッドフィルトレーション(rapid filtration)によって終了させた。次に、各チューブ及びフィルターを氷冷した緩衝液Ａの５ｍｌのアリコートで３回洗浄した。特異的な結合を、［全結合［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ］ＭＫ−６７８結合ソマトスタチン−１４］から［２００ｎＭソマトスタチン−１４の存在下で結合した値］を引いた値として定義した。以下のソマトスタチン類似体をアッセイした：ソマトスタチン−１４、類似体Ｉ（上記構造）、類似体ＩＩ（上記構造）、ＢＩＭ−２３０５２（上記構造）、ＢＩＭ−２３０１４（Ｈ−Ｄ−β−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−ＮＨ₂；ランレオタイド(LANREOTIDE)またはソマツライン(SOMATULINE)）、及びＳＭＳ２０１−９９５（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−トレオニノル(Threoninol) ；サンドスタチン(SANDOSTATIN)またはオクトレオタイド(OCTREOTIDE)）。これらの試験ソマトスタチン類似体に関するＫ_i値を下記式を用いて算出した：Ｋ_i＝ＩＣ₅₀／［１＋（ＬＣ／ＬＥＣ）］ただし、ＩＣ₅₀放射リガンド［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ］ＭＫ−６７８の特異的な結合の５０％を阻害するのに必要な試験化合物の濃度であり、ＬＣは放射リガンドの濃度（０．０５ｎＭ）であり、およびＬＥＣは放射リガンドの平衡解離定数（０．１５５ｎＭ）である。試験ペプチドについて算出されたＫ_i値を、表１の見出しが「ＳＳＴＲ−２」の下のカラムに示す。（２）ラットのＳＳＴＲ−５結合アッセイ未精製膜(crude membrane)を、ポリトロンホモゲナイザー(POLYTRON homogeni zer)（セッティング６、１５秒間）で２０ｍｌの氷冷した５０ｍＭトリス−ＨＣｌ中でラットの嗅球細胞（ジヴィック−ミラーラボラトリーインコーポレイテッド(Zivic-Miller Laboratory,Inc.)，ゼレノプル，ペンシルバニア(Zelleno ple, Pennsylvania)，米国）の均質化によって調製した。緩衝液を添加して最終容積を４０ｍｌとし、ホモジネートを、０〜４℃で１０分間、ソルヴァルＳＳ− ３４ローター(Sorval SS-34 rotor)で３９，０００ｇで遠心した。得られた上清をデカンテーションして捨てた。ペレットを氷冷した緩衝液中に再度均質化し、希釈し、前記と同様にして遠心した。最終的なペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ中に再懸濁し、レセプター結合アッセイ用に氷上に維持した。膜調製物のアリコートを、様々な濃度の試験ペプチド（例えば、１０^-11〜１０^-6Ｍ）、１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（フラクションＶ）（シグマケミカルシーオー(Sigma Chemical Ｃo.)、セントルイス，ミズーリ(St．Louis ，Missouri)，米国）、ＭｇＣｌ₂（５ｍＭ）、トラジロール（２００ＫＩＵ／ｍｌ）、バシトラシン（０．０２ｍｇ／ｍｌ）、及びフェニルメチルスルホニルフッ化物（０．０２ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）における０．０５ｎＭ［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ソマトスタチン−１４（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；アマシャムコーポレイション(Amersham Corp.)，アーリントンハイツ，イリノイ(Arlington Heights，Illinois)，米国）と共に３０℃で３０分間インキュベートした。最終的なアッセイ容積は０．３ｍｌであった。インキュベーションを、ブランデル瀘過マニホルド(Brandel filtration manifold)を用いたＧＦ／Ｃフィルター（予め０．３％ポリエチレンイミン中に３０分間浸漬した）によるラピッドフィルトレーション(rapid filtration)によって終了させた。次に、各チューブ及びフィルターを氷冷した緩衝液の５ｍｌのアリコートで３回洗浄した。特異的な結合を、［全結合［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ソマトスタチン− １４］から［１０００ｎＭＢＩＭ−２３０５２の存在下で結合した値］引いた値として定義した。試験ソマトスタチン−１４及びその類似体に関するＫ_i値を下記式を用いて算出した：Ｋ_i＝ＩＣ₅₀／［１＋（ＬＣ／ＬＥＣ）］ただし、ＩＣ₅₀は放射リガンド［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ソマトスタチン−１４の特異的な結合の５０％を阻害するのに必要な試験化合物の濃度であり、ＬＣは放射リガンドの濃度（０．０５ｎＭ）であり、およびＬＥＣは放射リガンドの平衡解離定数（０．１６ｎＭ）である。試験ソマトスタチン類似体に関するＫ_i値（ｎＭ）を、表１の見出しが「ＳＳＴＲ− ５」の下のカラムに示す。表１はまた、ラットのＳＳＴＲ−５に関するＫ_iに対するラットのＳＳＴＲ− ２に関するＫ_iの各割合をも示す。これより、１より大きな割合を有する上記ソマトスタチン類似体（例えば、ＢＩＭ−２３０５２、類似体Ｉ及び類似体ＩＩ）は、ラットのＳＳＴＲ−２に対してよりラットのＳＳＴＲ−５に対する方がより選択的である。（３）ヒトのＳＳＴＲ−２結合アッセイヒトのＳＳＴＲ−２ｃＤＮＡクローンは、報告されており（ヤマダ(Yamada) ら、プロックナショルアカデサイユーエスエー(Proc．Natl．Acad. Sci ．USA)、８９：２５１〜２５５（１９９２年）を参照）、ＡＴＣＣから利用できる（ＡＴＣＣ番号７９０４６）。ヒトのＳＳＴＲ−２レセプターの全コーディング領域を含む１．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、制限酵素による消化によって単離されており、ニューイングランドバイラブス(New England Bio labs)（ビバリー，マサチューセッツ(Beverly，Massachusetts)，米国）から利用できる。このｃＤＮＡ断片を、標準的な分子生物学的な技術を用いて、哺乳動物の発現ベクターである、ｐＣＭＶ（ラッセル(Russell)ら、ジェーバイオルケム(J．Biol.Chem.)、２６４：８２２２〜８２２９（１９８９年）を参照）中に挿入し、発現プラスミド、ｐＣＭＶ−ヒトＳＳＴＲ−２を得た。他の哺乳動物の発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ（インヴィトロゲン(Invit rogen)，サンドレシイ，カルフォルニア(Sandlesy，California)，米国）が挙げられる。例えば、マニアティス(Maniatis)ら、モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) ，１９８２年を参照。この発現プラスミドを適当な細菌宿主である、大腸菌ＨＢ１０１(E．coli HB101)（ストラタジーン(Stratagene)，ラジョラ，カルフォルニア(La Jolla，Califomia)，米国）に導入し、トランスフェクション用の、プラスミドＤＮＡを塩化セシウムグラジエントで調製した。ＣＨＯ−Ｋ１（卵巣、チャイニーズハムスター）細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Typr Culture Collection)、ロックヴィレ，メリーランド(Rockville，Maryland)，米国（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）から得た。この細胞を成長させ、標準的な組織培養条件下で１０％ウシ胎児血清を添加したハムのＦ１２培地（ギブコビーアールエル(Gibco BRL)、グランドアイランド，ニューヨーク(Grand Island，New York)，米国）中で維持した。トランスフェクションを目的として、細胞を１×１０⁶／６０ｃｍ²の密度でプレート（バクスターサイエンティフィックプロダクツ(Baxter Scientific P roducts)，マクガウパーク，イリノイ(McGaw Park，Illinois)，米国）に播種した。ＤＮＡ介在トランスフェクション(DNA mediated transfection)を、リン酸カルシウム共沈法（オウスベル(Ausubel)ら、キャレントプロトコルズインモレキュラーバイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)，ジョンウィリーアンドサンズ(John Wiley ＆ Sons)，１９８７年を参照）を用いて行った。プラスミドｐＲＳＶ−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ；ＡＴＣＣ番号３７１９８号）を、１／１０の発現プラスミドの濃度で選択マーカーとして含ませた。トランスフェクションされたＤＮＡを安定して保持しているＣＨＯ−Ｋ１クローン細胞系を、１０％ウシ胎児血清及び０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（シグマケミカルシーオー(Sigma Chemical Co.)、セントルイス，ミズーリ(St．Louis，Missouri)，米国）を含むハムのＦ１２培地で生育させることにより選択した。この細胞を、分析のために同様の培地でリングクローニングして(ring-clone)拡張した(expand) 。ヒトのＳＳＴＲ−２レセプターの発現は、細胞から調製された全ＲＮＡのノーザンブロッティング分析（サムブルック(Sambrook)ら、モレキュラークローニング−アラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning-A Laboratory Manual )，第２版，コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harb or Laboratory)，コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)，ニューヨーク，１９８９年を参照）によって及びリガンドとして［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹ ］ソマトスタチン−１４を用いたレセプター結合によって検出した。ヒトのＳＳＴＲ−２レセプターを発現するトランスフェクションされた細胞系を培養物においてクローニングにより拡張し(clonally expand)、上記ラットのＳＳＴＲ−２結合プロトコルに使用した。試験ソマトスタチン類似体に関するＫ_iを表２に列挙する（ＬＣは０．０５ｎＭであり、ＬＥＣは０．１５ｎＭである）。（４）ヒトのＳＳＴＲ−５結合アッセイヒトのＳＳＴＲ−５ｃＤＮＡクローンは文献に記載されている（パネッタ(P anetta)ら、モルファーマコル(Mol．Pharmacol.)，４５：４１７〜４２７（１９９４年）；オー’キャロル(O'Carroll)ら、モルファーマコル(Mol．Pharmac ol.)，４６：２１９〜２９８（１９９４年）;およびヤマダ(Yamada)ら、バイオケムバイオフィズレスコミュン(Biochem．Biophys．Res．Commun.)，１９５：８４４（１９９３年）、この際、図１はヒトのＳＳＴＲ−５のＤＮＡ配列を示すを参照）。開始コドン（３０〜５０番目の残基）のすぐ先に位置する(prece ding)、センス５’−オリゴヌクレオチドプライマー、および停止コドン（１１８０〜１２００番目の残基）のすぐ先に位置する(preceding)、アンチセンス３ ’−オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、レセプターの全長のコーディング配列を有する１１７０塩基対の断片を標準的な逆転写ＰＣＲ（ヤマダ(Yamada)ら、バイオケムバイオフィズレスコミュン(Biochem．Biophys．Res．Commun.)，１９５：８４４（１９９３年）、この際、図１はヒトのＳＳＴＲ−５のＤＮＡ配列を示す；およびイニス(Innis)ら、ＰＣＲプロトコルズ，アガイドツーメソッズアンドアプリケーションズ(PCR Protocols，A Guide to Methods and Appli cations)，アカデミックプレス(Academic Press)，１９９０年を参照）によって得た。ｃＤＮＡ断片の同一性を、シークェナーゼキット(Sequenase kit)（ユナイテッドステーツバイオケミカルズ(United States Biochemicals)、アーリントンハイツ，イリノイ(Arlington Heights，Illiois)，米国）によるジデオキシ−鎖終止法(dideoxy-chain termination method)（サンガー(Sanger)ら、プロックナショルアカデサイユーエスエー(Proc．Natl．Acad．Sci．US A)、７４：５４６３（１９７７年）を参照）を用いたＤＮＡ配列決定によって確認した。ヒトのＳＳＴＲ−５ｃＤＮＡ断片を、哺乳動物の発現ベクター、ｐＣＭＶ中に挿入し、平滑末端連結（例えば、マニアティス(Maniatis)ら、モレキュラークローニング−アラボラトリーマニュアル(Molecular Clonig-A Laboratory Manual)，コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbo r Laboratory)，コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)，ニューヨーク，１９８２年を参照）によって発現プラスミドｐＣＭＶ−ヒトＳＳＴＲ−５を得た。この発現プラスミドを実施例３に記載されるのと同様にしてＣＨＯ−Ｋ１細胞中にトランスフェクションし、クローン細胞系を、ノーザンブロッティング分析及び［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ソマトスタチン−１４を用いたリガンド結合によって選択し、ヒトのＳＳＴＲ−５レセプターの発現に関する特性を明らかにした。細胞系、ＣＨＯ−Ｋ１Ｍは、ヒトのＳＳＴＲ−５を発現することが示された。安定してトランスフェクションされた細胞系由来の膜を上記ラットのＳＳＴＲ−５結合プロトコルで使用した。試験ソマトスタチン類似体に関するＫ_i値（ｎＭ）を表２に列挙する（ＬＣは０．０５ｎＭであり、ＬＥＣは０．１８ｎＭである）。ラットの膵臓細胞を用いたアミリン放出抑制アッセイスプラグ−ダウレイ(Sprague-Dawley)ラット（オス、２００〜３００ｇ）（ハーラン−オラク(Harlan-Olac)、バイセスター，オクソン(Bicester，Oxon)，英国）をペントバルビトンナトリウム(sodium pentobarbitone)で麻酔をかけた（６０ｍｇ／ｋｇ）。ラットの膵臓を、デュンモレ(Dunmore)ら、ジェーエンドクリノル(J．Endocrinol.)、９２：１５〜２０（１９８２年）に従来報告されたのと同様にして単離した。この膵臓を、３％デキストランＴ４０（ファルマシア (Pharmacia)、ミルトンヘインズ，ブックス(Milton Heynes，Bucks)，英国）及び１％高純度ウシ血清アルブミン（シグマ(Sigma)、プール，ドーセット(Pool e，Dorset)，英国）を含む修飾クレブス-リンガー重炭酸塩緩衝液で、デュンモレ(Dunmore)ら、ジェーエンドクリノル(J．Endocrinol.)、１３７：３７５〜３８１（１９９３年）に記載されるのと同様にして、潅流した。始めの５分間で安定化させた後、単離された膵臓を以下の組成の緩衝液で４．５〜５．０ｍｌ／分の速度で経時的に１０分間の間隔で灌流した：１）緩衝液１：５．６ｍＭグルコースを含むクレブス -リンガー重炭酸塩緩衝液（基準となるアミリンの分泌を試験するため）；２）緩衝液２：１６．７ｍＭグルコースを含むクレブス-リンガー重炭酸塩緩衝液（高グルコースで刺激された分泌を試験するため）；３）緩衝液３：１０ｎＭの試験化合物の存在下で１６．７ｍＭグルコースを含むクレブス-リンガー重炭酸塩緩衝液（高グルコースで刺激されたアミリンの分泌に関する試験化合物の活性を試験するため）；および４）緩衝液２：１６．７ｍＭグルコースを含むクレブス -リンガー重炭酸塩緩衝液（試験化合物の活性の可逆性を評価するために高グルコースで刺激されたアミリンの分泌を再試験するため）。灌流液の画分を４００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン（ベイヤー(Bayer)、ヘイワーズヒース，ダブリュースセックス(Hayward's Heath，W．Sussex)，英国）の存在下で１分毎に水上で収集した。画分をアッセイを行うまで−２０℃で貯蔵した。収集した灌流液を３×１．５ｍｌのアリコートに分け、デュンモレ(Dun more)ら、ジェーエンドクリノル(J. Endocrinol.)、１３７：３７５（１９９３年）に記載されるのと同様にして、ラジオイムノアッセイによってアミリンに関して検定した。アミリンは、ペニンシュララボラトリーズリミテッド(Pen insula Laboratories Ltd.)（セントヘレンズ，マーセイサイド(St．Helens， Merseyside)，英国）によって供給される試薬を用いて検定した。これらの試薬としては、¹²⁵Ｉで標識されたアミリン、ウサギの抗ラットアミリン抗体、及びラットのアミリンが挙げられる。結合したアミリンを、ヤギの抗ウサギ第２抗体がカップリングしたセルロース（サック−カル(Sac-Cal)，アイディエス(IDS)，ボルドン，タインアンドウェアー(Boldon，Tyne and Wear)，英国）を用いて沈殿させた。ソマトスタチン−１４、ＢＩＭ−２３０１４、及びＢＩＭ−２３０５２を、上記アッセイにおいて試験化合物として使用した。アッセイの結果を図１〜３に示す。すべての場合において、単離されたラットの膵臓を１６．７ｍＭグルコースで灌流することにより、アミリンの分泌がかなり向上した。ＳＳＴＲ−５に対して高い親和性を有する、ソマトスタチン−１４は、１０ｎＭでグルコースにより誘導されるアミリンの分泌を抑制した（図１）。ＳＳＴＲ−５に対して低い親和性を有する、ソマトスタチン類似体であるＢＩＭ−２３０１４は、同濃度では何等効果を有さなかった（図２）。全く反対に、ＳＳＴＲ−５に対して高い親和性を及びＳＳＴＲ−２に対しては低い親和性を有する、ＢＩＭ−２３０５２は、同濃度でグルコースにより刺激されるアミリンの分泌を７８％抑制した（図３）。上記アッセイはまた、メスのツッカー(Zucker)脂肪ラット（ハーラン−オラク(H arlan-Olac)、バイセスター，オクソン(Bicester，Oxon)，英国）から単離されたラットの膵臓を用いても実施できる。ＲＩＮｍ５ｆ細胞を用いたアミリン放出抑制アッセイラットのβ−細胞系であるＲＩＮｍ５ｆ細胞の確立及び培養は既に報告されている（ガツダー(Gazdar)ら、プロックナショルアカデサイユーエスエー (Proc．Natl．Acad．Sci．USA)、７７：３５１９（１９８０年）；およびプラズ (Praz)ら、バイオケムジェー(Biochem．J.)、２１０：３４５（１９８３年）を参照）。インビトロのアミリンの放出抑制アッセイでは、１９〜２１継代の、ＲＩＮｍ５ｆ細胞を使用する。この細胞（ザナショナルインスティテュートオブヘルス(the National Institute of Health)，ベセスダ，メリーランド (Bethesda，Maryland)，米国から市販）を、２％ウシ胎児血清及び２ｍＭのグルタミンを添加したＲＰＩＭ−１６４０中で標準的な組織培養条件下で維持する。アミリンの放出の評価を目的として、細胞を、２４穴プレート（バクスターサイエンティフィックプロダクツ(Baxter Scientific Products)，マクガウパーク，イリノイ(McGaw Park，Illinois)，米国）に３×１０⁵細胞／ウェルで播種する。３７℃で３６〜４８時間培養した後、培地を除去し、３０分間でｐＨ７．４で、５００μｌの２ｍＭグルコース、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（シグマＡ −４３７８、シグマケミカルシーオー(Sigma Chemical Co.)、セントルイス，ミズーリ(St．Louis，Missouri)，米国）を含むクレブス-リンガー緩衝液で置換する（ムーア(Moore)ら、バイオケムバイオフィズレスコミュン(Bioche m．Biophys．Res．Commun.)，１７９：１（１９９３年）を参照）。この期間終了時に、緩衝液を、試験化合物の存在下であるいは不存在下で、１５ｍＭＤ− グリセルアルデヒドまたは５０ｍＭＤＬ−グリセルアルデヒド（シグマケミカルシーオー(Sigma Chemical Co.)、セントルイス，ミズーリ(St．Louis，Mi ssouri)，米国）のいずれかを含む１ｍｌの新たな緩衝液と置換する。３７℃で２時間インキュベートした後、緩衝液を回収し、７００ｒｐｍで５分間遠心し、前記（デュンモレ(Dunmore)ら、ジェーエンドクリノル(J．Endocrinol.)、１３７：３７５（１９９３年）を参照）したのと同様にしてアミリン含量を検定する。他の実施熊様前記説明により、本発明の特定の実施態様が制限された。しかしながら、変更及び修飾が本発明にはなされて、本発明の利点の一部またはすべてが達成されることは明らかであろう。このような実施態様もまた以下の請求の範囲の概念に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者カウトーン，ミカエル，アンソニーイギリス国，バッキンガムエムケー18 １エージー，ハンターストリート，ユニヴァーシティオブバッキンガム

Claims

【特許請求の範囲】１．以下よりなる、化合物のソマトスタチンタイプ−５レセプターへの結合能及びアミリンを分泌する膵臓細胞からのアミリン放出の抑制能を測定する方法：ソマトスタチンタイプ−５レセプターを含む調製物を得る；該調製物、化合物、及びソマトスタチンタイプ−５レセプターリガンドをインキュベートし、この際、該リガンド及び該化合物の少なくとも一方は検出できるように標識される；該化合物のソマトスタチンタイプ−５レセプターへの結合に関する該リガンドとの競合能を測定する；測定された化合物がソマトスタチンタイプ−５レセプターに結合できる際に及びそのように結合できる際にのみ、アミリンを分泌する膵臓細胞を得る；アミリン放出刺激物質が膵臓細胞からのアミリンの放出を誘導する条件下で、化合物、膵臓細胞、及びアミリン放出刺激物質をインキュベートする；および化合物のアミリン放出の抑制能を測定する。２．該調製物が細胞調製物である、請求の範囲第１項に記載の方法。３．該調製物が膜調製物である、請求の範囲第１項に記載の方法。４．該調製物が齧歯動物の嗅球由来である、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。５．該調製物がヒトのソマトスタチンタイプ−５レセプターでトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞由来である、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。６．該膵臓細胞がランゲルハンス島細胞またはアミリノーマ細胞またはＲＩＮｍ５ｆ細胞である、請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法。７．該ランゲルハンス島細胞がβ−細胞である、請求の範囲第６項に記載の方法。８．該膵臓細胞が単離された齧歯動物の膵臓の細胞である、請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の方法。９．該リガンドが検出できるように標識される、請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載の方法。１０．高アミリン血症を治療することを目的とする薬剤の製造へのソマトスタチンタイプ−５レセプターアゴニストの使用。１１．ソマトスタチンタイプ−２レセプターに対するよりもソマトスタチンタイプ−５レセプターに対する方が少なくとも３倍選択性が高いソマトスタチンタイプ−５アゴニストの請求の範囲第１０項に記載の使用。１２．ソマトスタチンタイプ−２レセプターに対するよりもソマトスタチンタイプ−５レセプターに対する方が少なくとも１０倍選択性が高いソマトスタチンタイプ−５アゴニストの請求の範囲第１０項に記載の使用。１３．有効量のソマトスタチンタイプ−５レセプターアゴニストを被験者に投与することからなる、被験者の高アミリン血症の処置方法。１４．ソマトスタチンタイプ−２レセプターに対するよりもソマトスタチンタイプ−５レセプターに対する方が少なくとも３倍選択性が高いアゴニストを該ソマトスタチンタイプ−５アゴニストとして使用する、請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．ソマトスタチンタイプ−２レセプターに対するよりもソマトスタチンタイプ−５レセプターに対する方が少なくとも１０倍選択性が高いアゴニストを該ソマトスタチンタイプ−５アゴニストとして使用する、請求の範囲第１３項に記載の方法。