CZ289370B6 - Peptid, jeho pouľití a farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Jedn se o cyklick peptidy-analogy somatostatinu, v nich jsou N- koncov a C- koncov zbytky aminokyselinov²ch °et zc v z ny disulfidov²mi vazbami. D le jsou pops ny r zn aplikace peptidu, pou it peptidu pro v²robu l iva pro inhibov n uvoln n inzulinu v subjektu, farmaceutick² prost°edek a pou it peptidu pro v²robu diagnostick ho prost°edku pro zobrazen bun k.\

Description

Protože přírodní somatostatin používaný pro léčení různých chorob (např. akromegalie) je dosti nestabilní, byly vyvinuty umělé analogy somatostatinu. Somatostatin vyvolává rozmanité účinky včetně modulace uvolňování různých hormonů či neurotransmiterů. Některé tyto účinky jsou vázány na přítomnost specifických receptorů somatostatinu. Snahou je vždy získat analog s co největší selektivitou pro specifický subtyp receptorů odpovědný za požadovanou biologickou odpověď, aby se snížily interakce vedoucí k vedlejším účinkům.

Dosavadní stav techniky

Přírodní somatostatin se skládá jak z izoformy o 14 aminokyselinách (somatostatin - 14), tak z izoformy o 18 aminokyselinách (somatostatin - 18). Heiman, et al., Neuroendocrinology, 45:429-436 (1987). Z důvodu krátkého poločasu rozpadu přírodního somatostatinu, např. pro léčení akromegalie. Raynor, et al., Molecular Pharmacol. 43:838 (1993).

Bylo identifikováno a charakterizováno pět význačných receptorů somatostatinu. Hoyer, et al., Naunyn - Schmiedeberg's Asch. Pharmacol., 350:441 (1994). Somatostatin vyvolává rozmanité účinky včetně modulace uvolňování hormonů byly vyvinuty různé somatostatinové analogy, např. růstového hormonu, glukagonu, inzulínu, anylinu a též uvolňování neurotransmitérů.

Některé tyto efekty jsou spojeny s jeho vazbou na specifické receptory somatostatinu. Například inhibice růstového hormonu je přisuzována receptorů somatostatinu typu-2 („SSTR-2“) (Raynor, et al., Molecular Pharmacol. 43:838 (1993); Lloyd, et al., Am. J. Physiol. 268:G102 (1995)), zatímco inhibice inzulínu je přisuzována somatostatinovému receptorů typu -5 („SSTR-5“) (Coy, et al. 197:366-371 (1993)).

Dává se přednost analogu, který je selektivní pro specifický subtyp receptorů somatostatinu odpovědný za požadovanou biologickou odpověď, čímž se sníží interakce jiných subtypů receptorů, které by mohly vést k nežádoucím vedlejším účinkům.

Podstata vynálezu

Vynález se týká peptidů vyjádřených následujícím sumárním vzorcem:

Ri

Ai-A2-A3-A4-D-Trp-Lys-A7-Ag-A9-R3 (I),

R₂ ve kterém

Ai je D- nebo L- izomer kyseliny merkaptopropionové,

A₂ je Asn, Gin, Ala, kyselina 2-aminoheptanová, Val, Leu, izoleucin, norleucin, norvalin nebo kyselina 2-aminomáselná, Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X je fluor, chlor, jod, OH, OCH₃,

CH₃, nebo NO2, pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichloro-Phe, Tyr-I, nebo Fs-Phe, neboje vynecháno,

A₃ je Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X je fluor, chlor, jod, OH, OCH₃, CH₃, nebo NO₂, pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichloro-Phe, Tyr-I, nebo F₅-Phe,

A₄ je His nebo Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X je fluor, chlor, jod, OH, OCH₃, CH₃, nebo NO₂, pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichloro-Phe, Tyr-I, nebo F₅-Phe;

A₇ je Thr, Ser, Ala, kyselina 2-aminoheptanová, Val, Leu, izoleucin, norleucin, norvalin, nebo kyselina 2-aminomáselná;

A₈ je Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X je fluor, chlor, jod, OH, OCH₃, CH₃, nebo NO₂, pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichloro-Phe, Tyr-I, nebo Fs-Phe,

A9 je D- nebo L-izomer Cys;

přičemž každý Rj a R₂ je, nezávisle, H, Ci_i₂ alkyl, C7-20 fenylalkyl, Cn_₂o naftylalkyl, Ci_i₂ hydroxyalkyl, C7-20 hydroxyfenylalkyl, Cu_2o hydroxynaftylalkyl nebo COEi, kde Ei je C1-12 alkyl, C7-20 fenylalkyl, Cn-20 naftylalkyl, C1-12 hydroxyalkyl, C7-20 hydroxyfenylalkyl nebo Cn-20 hydroxynaftylalkyl a R₃ je NH₂ nebo NH-Y-CH2.Z, kde Y je Ci_₁₂ přímý či rozvětvený dvojvazný alkyl a Zje H, OH, CO₂H nebo CONH₂, a disulfidovými můstky vázané postranní řetězce zbytků A[ a A₉ za tvorby cyklického peptidu. V jednom vyjádření obě skupiny A₃ a Ag nezávisle jsou Phe, p-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCH₃, nebo NO₂), o-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCH₃, CH₃ nebo NO₂), pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichloro-Phe, Tyr (I), nebo F-Phe, A₄ je His, Phe, p-X-Phe (kde X⁵ je halogen, OH, OCH₃, CH₃ nebo NO₂), pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichloro-Phe, Tyr (I) nebo Fs-Phe, A₂ je Asn, Gin, Ala, H-amino-izobutanová kyselina, Val, Leu, izoleucin, norleucin, norvalin, alfa-aminomáselná kyselina, Phe, p-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCH₃, CH₃ nebo NO₂), o-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCH₃, CH₃ nebo NO₂), pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichloro-Phe, Tyr (I), F₅-Phe nebo je vynechán, a A7 je Thr, Ser, Ala, H-amino-izobutanová kyselina, Val, Leu, izoleucin, norleucin, norvalin nebo alfa-aminomáselná kyselina.

V následujícím vyjádření A9 je Cys, každá A₃ a A_g nezávisle je Phe, každá p-X-Phe (kde X je halogen, OH, nebo CH₃), Tyr (I) nebo Trp, A₄ je His, Phe, p-X-Phe (kde X je halogen, OH nebo CH₃), Tyr (I) nebo Trp, A₂je Asn, Gin neboje vynechán a A₇ je Thr nebo Ser.

V posledním vyjádření A₂ je Asn neboje vynechán, A₃ je Phe, A4 je Phe, His, p-X-Phe (kde X je halogen, OH nebo CH₃) a každý z R] a R₂ nezávisle H a R₃ je NH₂.

Níže jsou uvedeny příklady peptidů tohoto vynálezu, které lze vyjádřit výše uvedeným vzorcem:

H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Analog I), H2-c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH₂ (Analog II), H₂-c [Cys-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH₂, H₂-c[D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH₂, H₂-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Lys]-NH2, H₂-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Lys]-NH2, H₂-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2 (Analog IV), H2-c[D-Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Gys]-NH2, H₂-c[Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2 (Analog III), H₂-c[D-Cys-Phe-T rp-D-T rp-Ly s-Ser-Phe-Cys]-NH₂, H2-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2,

-2CZ 289370 B6

H2-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH₂, H₂-c[Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Analog VIII), H₂-c[D-Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H₂-c [Cys-Phe-Tyr(I)-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH₂, H₂-c[D-Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H₂-c[Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Analog V), H₂-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH₂, H₂-c [Cys-Asn-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Thr-Phe-CysJ-NPL, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[l>-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH₂, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH₂, H₂-c[Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H₂-c [Cys-Asn-Phe-His-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH₂, H₂-c[D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH₂, H2-c[Cys-Asn-Phe-Tyr(I}-I>-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH₂, H2-c[E>-Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H₂-c [Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH₂, H2-c[I>-Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Analog VI), H2-c[Cys-Phe-beta-naftylalanin-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Analog VII), H2-c[Cys-Phe-Cpa-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Analog IX), H2-c[kyselina merkaptopropionová-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Analog X), H₂-c[Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Cys]-NH2 (Analog XI), H₂-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Tyr-Cys]-NH2 (Analog XII), H2-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Analog XIII).

S výjimkou N-konců aminokyseliny, všechny zde publikované zkratky aminokyselin (např. Ala nebo A₂) znamenají strukturu -NH-CH-(R)-CO- kde R je postranní řetězec aminokyseliny (např. CH₃ pro Ala). Pro N-konec aminokyseliny znamená zkratka =N-CH(CH₂SH)-COjestliže se jedná o D- nebo L-izomer Cys nebo =C(-CH₂-SH)-CO- jedná-li se o D- nebo L-izomer kyselina merkaptopropionová, kde R je postranní řetězec aminokyseliny.

Tyr(I) znamená jodovaný tyrosinový zbytek (např. 3-I-Tyr, 5-I-Tyr, 3,5-I-Tyr), kde jód může být ve formě radioaktivního izotopu, např. I, I¹²⁷ nebo I¹³¹. Alifatická aminokyselina je alfa-aminokyselina s jedním nebo dvěma postranními řetězci, které jsou (nezávisle) hydrouhlíkaté, např. rovný nebo rozvětvený řetězec s 1 - 6 uhlíky.

Jedná se např. o tyto alifatické aminokyseliny: Ala, H-aminoizobutanová kyselina, Val, Leu, izoleucin, norleucin, norvalin nebo alfa-aminomáselná kyselina.

Aromatická aminokyselina je alfa-aminokyselina, jejíž postranní řetězec má neutrální (např. ne kyselý nebo zásaditý) aromatický substituent, např. substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl, naftyl nebo aromatickou heterocyklickou skupinu (např. pyridyl nebo indolyl). Jedná se např. o tyto aromatické aminokyseliny: Phe, p-X-Phe (kde X je halogen (např. F, Cl nebo I), OH, OCH₃, CH₃ nebo NO₂), o-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCH₃, CH₃ nebo NO₂), pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichloro-Phe, Tyr(I), F₅-Phe. Kde aminokyselinový zbytek je opticky aktivní, blíže nespecifikovaný L-izomer.

Hydroxyalkyl, hydroxyfenylalkyl a hydroxynaftylalkyl, uvedené v obecném vzorci výše, mohou též obsahovat 1 - 4 hydroxy substituenty a COEi znamenají -C=O.Ei.

-3CZ 289370 B6

Příkladem -C=O.Ei jsou p-hydroxyfenylpropionyl (např. -C=O.CH₂-CH₂-C6H4-OH) a fenylpropionyl, ale i jiné.

Stanovením nebyly prokázány disulfidové můstky mezi thiolovou skupinou na postranním řetězci zbytku Ai (např. kyselina merkaptopropionová, D-kyselina merkaptopropionová, Cys nebo D-Cys) a thiolovou skupinou na postranním řetězci zbytku Ag (např. kyselina merkaptopropionová, D-kyselina merkaptopropionová, Cys nebo D-Cys). Zkoumaný peptid je zde též vyjádřen jiným vzorcem, např. H2-C[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, s dvěma disulfidicky vázanými zbytky (např, Cys) umístěnými v hranaté závorce následující ve vzorci po C“ „V .

Zkoumané peptidy mohou být použity k inhibici uvolňování inzulínu u savců (zvířat i lidí).

Peptidy jsou tedy užitečné při léčbě za takových fyziologických podmínek, při nichž je potřebná inhibice uvolňování inzulínu např. diabetes II. typu. Ty ze zkoumaných peptidů obsahujících v molekule Tyr (I) zbytek, k rozpoznání buněk obsahujících somatostatinové receptory (např. SSTR-5). Takovéto peptidy mohou být použity buď in vivo k detekci buněk, jež mají somatostatinové receptory (např. nádorové buňky) nebo in vitro jako radioligand při stanovení vazeb receptorů somatostatinu.

Tyto zkoumané peptidy mohou být dodávány ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Příklady takových solí (nikoli však vyčerpávající) představují soli tvořené s organickými kyselinami (např. octová, mléčná, maleinová, citrónová, maleová, askorbová, šťavelová, benzoová, methansulfonová, toluensulfonová nebo kyselina pamoová („pamoic acid“), s anorganickými kyselinami (např. kyselina chlorovodíková, kyselina sírová nebo kyselina fosforečná), s polymerickými kyselinami (např. kyselina tříslová, karboxymethylcelulóza, polymléčná, polyglykolová) nebo kopolymery polylakto-glykolových kyselin.

Léčebně účinné množství zkoumaného peptidů a farmaceuticky přijatelný nosič (např. uhličitan hořečnatý, laktóza nebo fosfolipid, s nímž léčebná složka může tvořit micelu) spolu tvoří léčebnou směs (např. pilulky, tablety, kapsle nebo kapalina) pro podávání (např. orální, intravenózní, transdermální, pulmonámí, vaginální, subkutánní, nazální, iontoforetické nebo intratracheální) pacientům v případě potřeby peptidů.

Pilulky, tablety či kapsle mohou být potaženy substancí chránící směs před rozkladem žaludečními kyselinami nebo enzymy tenkého střeva v žaludku pacienta po dobu pasáže nenatrávené léčebné směsi do tenkého střeva. Léčebná směs může být dodávána též v biologicky odbouratelné nebo neodbouratelné formě podporující uvolnění přípravku pro subkutánní a intramuskulámí podávání. Viz např. US patenty 3 773 919 a 4 767 628 a PCT přihláška WO 94/00 148.

Lze též zajistit nepřetržité podávání léčebné směsi použitím implantovatelné nebo vnější pumpy (např. INSUSAID™ pump). Peptid by měl být podáván přednostně před spaním.

Dávkování tohoto peptidů při léčení výše uvedených chorob a disbalancí se mění v závislosti na způsobu podávání, věku a tělesné hmotnosti pacienta a též podmínkách léčení. Přesné dávkování určí vždy ošetřující, případně veterinární lékař. Takovéto množství peptidů určené ošetřujícím či veterinárním lékařem je zde uváděno jako „léčebně účinné množství“.

Uvažujeme-li v rozsahu tohoto výzkumu, je peptid, vyjádřený výše uvedeným obecným vzorcem, vhodný jak při léčení chorob a disbalancí spojených s potřebou inhibice uvolňování inzulínu, např., diabetes II. typu, tak i pro detekci somatostatinových receptorů, např. radioimaginováním „radioimaging“.

Ostatní znaky a výhody tohoto vynálezu jsou zřejmé z podrobného popisu a patentových nároků.

-4CZ 289370 B6

Syntéza a použití analogů somatostatinu, které jsou předmětem tohoto výzkumu, jsou velmi dobře zvládnutelné odborníkem znalým v boru na běžné úrovni. Není-li definováno jinak, všechny zde uvedené technické a vědecké termíny mají stejný význam jako je běžně užíván v oblasti oboru tohoto výzkumu. Zmíněné publikace, přihlášky patentů, patenty a jiná osvědčení jsou začleněny v odkazech.

Je samozřejmé, že odborník znalý v oblasti tohoto výzkumu může vycházet ze zde uvedených postupů a využít současného stavu výzkumu v plném rozsahu. Následující specifické příklady by měly být chápány pouze jako ilustrativní, žádným způsobem nelimitující možnosti dalšího výzkumu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Syntéza analogů somatostatinu

Syntéza krátkých peptidů je dobře odzkoušena na příslušných pracovištích zabývajících se peptidy. Viz např. Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., 2d ed. 1984). Níže bude uvedena syntéza Analogu I. Ostatní výše uvedené zkoumané peptidy lze připravit obdobným způsobem odborníkem znalým v oboru.

1,1 g, 0,5 mmol benzylhydrylamin-polystyrenové pryskyřice (Advanced Chem Těch, lne., Lousville KY) ve formě chloridu bylo umístěno do reakční nádoby (advanced Chem Těch ACT 200 peptide synthesizer) naprogramovaného na dávkování následujících reagencií či rozpouštědel: (a) methylen chlorid; (b) 33% kys. trifluoroctová v methylenchloridu (2krát po dobu 1 a 25 minut každý); (c) methylenchlorid; (d) ethanol; (e) methylenchlorid; a (f) 10% triethylamin chloroformu.

Neutralizovaná pryskyřice byla míchána po dobu 1 h s Bo-S-4—methylbenzyl-Cys a diizopropyl-karbodiimidem (oba 1,5 mmol) v methylenchloridu a vzniklá aminokyselinová pryskyřice byla cyklována na reaktoru (koloně) výše uvedeným promývacím programem dle kroků (a) až (f). Následující aminokyseliny (1,5 mmol) byly pak postupně párovány stejným způsobem: BocPhe, Boc-O-benzyl-Thr, Boc-N-benzyloxykarbonyl-Lys, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Phe, a Boc-S-methylbenzyl-Cys. Po promytí a usušení byla takto připravená pryskyřice zvážena a usušena (1,6 g).

Pryskyřice (1,6 g; 0,5 mmol) byla pak smíchána sanisolem (5 ml), dithiothreitolem (100 mg) a anhydridem kyseliny fluorovodíkové (35 ml) při 0 °C a směs byla míchána po dobu 45 minut. Přebytek kyseliny fluorovodíkové byl rychle odpařen v proudu suchého dusíku a volný peptid byl vysrážen a promyt etherem. Surový peptid byl pak rozpuštěn v 500 ml 90% kyseliny octové, ke které byl přidán koncentrovaný roztok I₂/MeOH až do stabilního hnědého zbarvení. Přebytek I₂ byl odstraněn přidáním kyseliny askorbové a roztok byl odpařen na malý objem, který byl nanesen na kolonu (2,5 x 90 cm) s náplní SEPHADEX™ G-25, který byl eluován 50% AcOH.

Funkce obsahující hlavní složku byly detekovány UV absorpcí a chromatografií na tenké vrstvě, byly sbírány, odpařeny na malý objem a naneseny na kolonu (1,5 x 70 cm) VYDAC™ oktadecylsilan křemíku (10 - 15 Tm). Tato kolona byla eluována lineárním gradientem od 80 % A a 20 % B do 40 % A a 60 % B, kde A je 0,1% kys. trifluoroctová (TFA) ve vodě a B je 79,9 % acetonitril, 20 % vody a 0,1 % TFA. Frakce byly detekovány chromatografií na tenké vrstvě (tle) a analytickou vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (hplc) a jímány odděleně za účelem dosažení maximální čistoty. Opakovanou lyofilizací z vodného roztoku bylo získáno 95 mg produktu ve formě bílého chmýřovitého prášku.

-5CZ 289370 B6

U takto získaného homogenního produktu byla provedena analýza aminokyselin kyselého hydrolyzátu a směsi cyklického oktapeptidu fixovaného na matrici pomocí techniky MALDIMS (matriční laserová desorpční hmotová spektrometrie).

(mol. hmotnost vypočtená, 1077, mol. hmotnost nalezená 1080)

Dalším příkladem je syntéza analogu V.

0,7 g, 0,25 mmol benzylhydrylamin polystyrénové pryskyřice (Advanced Chem Těch, lne.) ve formě hydrochloridu bylo umístěno do reakční nádoby fy Advanced Chem Těch ACT 200 peptide synthesizer programované na dávkování následujících reagencií/rozpouštědla: (a) methylenchlorid, (b) 33% kys. trifluoroctová v methylenchloridu (2krát po dobu 1 a 25 min. každá); (c) methylenchlorid, (d) ethanol, (e) methylenchlorid, (f) 10% triethylamin v chloroformu.

Neutralizovaná pryskyřice byla míchána s Boc-S-methylfenyl-Cys a diizopropylkarbodiimidem (1,5 mmol oba) v methylenchloridu po dobu 1 h a vzniklá aminokyselinová pryskyřice byla pak cyklována postupně kroky (a) až (g) dle výše uvedeného promývacího programu. Následující aminokyseliny (1,5 mmol) byly postupně párovány stejným způsobem jako výše. Boc-Phe, BocO-benzyl Thr, Boc-N-benzyloxykarbonyl-Lys, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Phe, Boc-Phe, Boc-Asn a Boc-S-methyl-benzyl-Cys. Po promytí a usušení bylo získáno 1,2 g pryskyřice.

Peptidová pryskyřice byla podrobena HF štěpení a I₂ cyklizaci stejným způsobem jako je uvedeno výše. Výtěžek výše uvedené purifikace na koloně byl 21 mg cyklického nonapeptidu, který byl dále homogenizován na hplc a tle. Dále byla provedena analýza aminokyselin kyselého hydrolyzátu a vzorku směsi cyklického nonapeptidu fixovaného na nosiči technikou MALDI MS.

(mol. hmotnost vypočtená 1192; mol. hmotnost nalezená 1192).

Syntéza analogů somatostatinu jodovaných na tyrosinovém zbytku (např. chloramin-T metodou) je velmi dobře dokumentována a snadno proveditelná odborníkem s běžnými znalostmi v oboru. Viz např. Czemick, et al., J. Biol. Chem. 258:5525 (1993) a EP 389 180 Bl.

Příklad 2. Stanovení vazeb receptorů somatostatinu

a) Stanovení vazeb lidského SSTR-2: CHO-K1 (vaječníky, čínský křeček) buňky byly získány od Američan Type Cultare Collection (ATCC) (Rockville, MD) (ATCC No. CCL61) a byly transfekovány s lidskou SSTR-2 cDNA, metodou popsanou v Yamada, et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:251-255 (1992), též dostupné u ATCC (ATCC No. 79046), použitím standardních technik známých z molekulární biologie. Viz např. Patel, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 198:605 (1994). Surové membrány byly připraveny homogenizací lidským SSTR-2 transfekovaným s CHO-Ki buňkami v 20 ml ledově chladném 50 nM Tris-HCl (pufr A) na POLYTRON™ homogenizátoru (Brinkmann Instrumente, Westbury, NY) při nastavení 6, po dobu 15 s. Přidávaný pufr byl doplněn do konečného objemu 40 ml a homogenát byl odstředěn na odstředivce SORVAL™ SS-34 rotor (Du Pont, Newtoron, CT) při 39 000 g po dobu 10 min. při 0 až 4 °C.

Supematant byl odstraněn. Sediment (pelety) byl znova smíchán s ledově chladným pufrem A, zředěn a odstředěn stejným způsobem.

Takto získaný sediment byl resuspendován v 10 mM Tris HC1 a uchováván v mrazáku pro stanovení vazby receptorů somatostatinu.

-6CZ 289370 B6

Jednotlivé podíly z membránové preparace byly inkubovány 90 min. při 25 °C s 0,5 nM [¹²⁵I—Tyr] MK-678 (2 000 Ci/mmol; c[N-methyl-Ala-Tyr (I^,25)-D-Trp-Lys-Val-Phe]) v 50 mM HPES (pH 7,4) obsahujícím různé koncentrace testovaného peptidu (např. 10^-11 až 10“⁶ M), 10 mg/ml hovězího sérového albuminu (frakce V, Sigma Chemical Co., St. Louis MO), MgCb (5 mM), Trasylol (200 KlCl/ml), bacitracin (0,02 mg/ml) a fenylmethyl-sulfonyl fluorid (0,02 mg/ml). Vždy do konečného objemu 0,3 ml. Inkubace byly ukončeny rychlou vakuovou filtrací přes GF/C filtry (předem promyté 0,3 % polyethyleniminem po dobu 30 minut) za použití filtrační trubice (Brandel, Gaithusburg, MD).

Každá trubice i filtr byly pak promyty třikrát 5 ml alikvotního množství ledově chladného pufru A.

Specifická vazba byla definována jako rozdíl všech vazeb [T¹²⁵I/Tzr]MK-678 a vazeb stanovených v přítomnosti 200 nM somatostatinu-14.

Dále byly stanovovány tyto testované peptidy: somatostatin-14, somatostatin-28, Analog I, Analog Π, Analog III, Analog IV a Analog V. Struktury Analogů I - V jsou uvedeny výše. Hodnoty K_; u testovaných peptidů byly vypočteny dle následujícího vzorce:

Kc = IC₅o/[l + (LC/LEC)], kde IC₅₀ je koncentrace testovaného peptidu potřebného kinhibici 50 procent specificky vázaného radioligandu [^l25I-Tyr]MK-678; LC je koncentrace radioligandu (0,05 nM) a LEC je rovnovážná disociační konstanta radioligandu (0,155 nM).

Hodnoty K, vypočtené pro testované peptidy jsou uvedeny ve sloupci pod hlavičkou „SSTR-,, v tabulce I.

b) Stanovení vazeb lidského SSTR-5:

CHO-K1 buňky byly transfekovány s lidskou SSTR-5 cDNA metodou popsanou v Yamada, et al., Biochem Bioptys. Res. Commun., 195-844 (1993) použitím standardních technik známých z molekulární biologie. Viz např. Patel, et al., Biochem. Bioptys. Res. Comm. 198:605 (1994). Surové membrány byly připraveny homogenizací SSTR-5 transfekovaného s CHO-K1 křeččími buňkami v 20 ml ledově chladné 50 mM Tris-HCl na POLYTRON™ homogenizátoru (nastavení 6, 15 sekund). Pufr byl doplněn do konečného objemu 40 ml a homogenát byl odstředěn na přístroji SORVAL™ SS-34 rotor při 39 000 g po dobu 10 min. při 0 až 4 °C.

Vzniklý supematant byl odstraněn. Získaný sediment byl resuspendován v ledově chladném pufru, zředěn a odstředěn stejným způsobem jako výše.

Finální sediment byl resuspendován v 10 mM Tris HC1 a uchováván v mrazáku pro stanovení vazeb receptorů somatostatinu.

Jednotlivé podíly z membránové preparace byly inkubovány po dobu 30 minut při 30 °C s 0,05 nM [ ^2ÍI-Tyrⁿ] somatostatin-14 (2 000 Ci/mmol; Amersham Corp., Aclinghton Heights, IC) v 50 mM HEPES (pH 7,4) obsahujícím různé koncentrace testovaného peptidu (např. 10’¹ až ÍO^M), 10 mg/ml hovězího sérového albuminu (frakce V), MgCl₂ (5mM), Trasylol (200 KlCl/ml), bacitracin (0,02 mg/ml) a fenylmethylsulfonyl fluorid (0,02 mg/ml). Konečné objemy jednotlivých stanovení byly 0,3 ml.

Inkubace byly ukončeny rychlou filtrací přes GF/C filtry (předem promyté v 0,3% polyethyleniminu po dobu 30 min.) s použitím Brandelovy filtrační aparatury. Každá trubice i filtr byly potom 3 krát promyty 5ml podíly ledově chladného pufru.

-7CZ 289370 B6

Specifická vazba byla definována jako rozdíl všech vazeb [^I25I-Tyr^H] somatostatin-14 a vazeb stanovených v přítomnosti 1 000 nM ligandu BIM-23052(H₂-D-Phe-Phe-Phe-^D-Trp-LysThr-Phe-Thr-NH₂) pro receptor somatostatinu typ -5.

Hodnoty Ki testovaných peptidů byly vypočteny podle následujícího vzorce: IC₅o/[l + (LC/LEC)], kde IC₅₀ je koncentrace testovaného peptidů potřebná k inhibici 50 % specifických vazeb na radioligandu [¹²⁵I-Tyr^H] somatostatin-14, LC je koncentrace radioligandu (0,05 nM) a LEC je rovnovážná disociační konstanta radioligandu (0,16 nM).

Vypočtené hodnoty K, testovaných peptidů jsou uvedeny ve sloupci pod hlavičkou „SSTR-5“ v tabulce 1.

V tabulce I jsou též uvedeny poměry Kj pro lidský SSTR-2 a K; pro lidský SSTR-5. Zkoumané peptidy (např. Analogy I-V) mají tyto poměry neočekávaně vyšší než 1 a tudíž jsou selektivnější pro SSTR-5 než pro SSTR-2.

Tabulka 1

SLOŽKA	SSTR-2	SSTR-5	SSTR-2/SSTR-5
Somatostatin-14	0,187	0,883	0,212
Somatostatin-28	0,242	0,383	0,632
Analog I	15,1	0,376	40,2
Analog II	13,0	2,63	4,94
Analog III	14,7	1,21	12,1
Analog IV	19,3	0,928	20,8
Analog V	129	2,43	53,1
Analog VI	6,19	0,34	18,2
Analog VII	8,07	4,145	1,94
Analog VIII	4,78	0,27	17,7
Analog IX	6,205	4,77	1,30
Analog X	15,0	0,744	20,1
Analog XI	34,83	28,04	1,24
Analog XII	59,20	5,78	10,2
Analog ΧΠΙ	32,32	2,01	16,1

Samozřejmě, že tento detailní popis vynálezu je pouze ilustrativní, nikoli limitující rozsah dalšího výzkumu, který je definován v přiložených patentových nárocích. Ostatní aspekty, výhody a modifikace vyplývají též z nároků.

Claims (6)

1. Peptid obecného vzorce I:

Ri

A i - A2“ A3-A4-D-Trp-Lys-A7-Ag-A9-R3 ve kterém

Ai je D- nebo L- izomer kyseliny merkaptopropionové;

A₂ je Asn, Gin, Ala, kyselina 2-aminoheptanová, Val, Leu, izoleucin, norleucin, norvalin, nebo kyselina 2-aminomáselná, Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X je fluor, chlor, jod, OH, OCH₃, CH₃, nebo NO₂, pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichlor-Phe, Tyr-I, nebo Fs-Phe, nebo je vynecháno;

A3 je Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde Y je fluor, chlor, jod, OH, OCH3, CH₃, nebo NO₂, pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichlor-Phe, Tyr-I, nebo Fs-Phe;

A4 je His nebo Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X je fluor, chlor, jod, OH, OCH₃, CH₃, nebo NO₂, pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichlor-Phe, Tyr-I, nebo Fs-Phe;

A₇ je Thr, Ser, Ala, kyselina 2-aminoheptanová, Val, Leu, izoleucin, norleucin, norvalin, nebo kyselina 2-aminomáselná;

A_g je Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X je fluor, chlor, jod, OH, OCH₃, CH₃, nebo NO₂, pyridyl-Ala, Trp, beta-naftylalanin, 2,4-dichlor-Phe, Tyr-I, nebo Fs-Phe;

A9 je D- nebo L-izomer Cys;

přičemž každý Ri a R₂ je, nezávisle, H, Ci__I2 alkyl, C₇_₂₀ fenylalkyl, Cn-20 naftylalkyl, Ci_i₂ hydroxyalkyl, C₇_₂o hydroxyfenylalkyl, Cn_₂₀ hydroxynaftylalkyl nebo COEi, kde Ei je Ci__i2 alkyl, C₇_₂o fenylalkyl, Cn_₂₀ naftylalkyl, Ci__i2 hydroxyalkyl, C₇_₂₀ hydroxyfenylalkyl nebo Cn_₂₀ hydroxynaftylalkyl a R₃ je NH₂ nebo NH-Y-CH₂.Z, kde Y je C_t_i₂ přímý či rozvětvený dvojvazný alkyl a Zje H, OH, CO₂H nebo CONH₂, a disulfldovými můstky vázané postranní řetězce zbytků A] a A9 za tvorby cyklického peptidu.

2. Použití peptidu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro inhibování uvolnění inzulínu v subjektu.

3. Použití peptidu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení cukrovky typu II v subjektu.

4. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství peptidu podle nároku 1 a farmaceutický přijatelný nosič.

-9CZ 289370 B6

5. Použití peptidů podle nároku 1 pro výrobu diagnostického prostředku pro zobrazení buněk in vivo, kde uvedené buňky obsahují somatostatinové receptory.

5

6. Použití peptidů podle nároku 1 pro výrobu diagnostického prostředku pro zobrazení buněk in vitro, kde uvedené buňky obsahují somatostatinové receptory.

Konec dokumentu