JPH07508287A - 免疫応答を変調する方法および薬剤，並びにその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫応答を変調する方法および薬剤、並びにその使用発明の技術分野 本発明は一般に免疫学の分野に関するものであり、更に詳しくは、宿主免疫能力 の増強並びに疾患状態の予防および治療用のワクチンの調製および投与を含む種 々の抗原に対する免疫応答の変調に関する。

発明の背景 一般に、抗原は、例えば、マクロファージおよびＢ細胞（これらはＡＰＣ表面に 存在する主要組織適合遺伝子複合体分子（ＭＩＩＣ）と協力して作用する）を含 む抗原提示細胞（ＡＰＣ）により免疫系に“提示”される。通常、天然抗原およ び免疫原として供給される分子は、八ＰＣにより摂取され、部分消化され、その 結果、もとの抗原の小片が、その後、１ｌｌＩＩｃ分子と関係してその細胞表面 で発現されると考えられる。

また、Ｔリンパ球は、Ｂリンパ球と対照的に、可溶性抗原と比較的相互作用し得 ないことが現在理解されている。典型的に、Ｔリンパ球は、抗原が処理され、次 いで上記のようにＩＪＩｃ分子と関係してＡＰＣの細胞表面で発現されることを 必要とする。こうして、Ｔ細胞、そして更に特別に、所謂“Ｔ細胞レセプター” は、処理抗原と一つ以上のＭｌｌ（Ｃ分子を含む二分子リガンドの形態で抗原を 認識できる。

また、ＴＩＪンパ球は、Ｂリンパ球と対照的に、可溶性抗原と比較的相互作用し 得ないことが現在理解されている。典型的に、Ｔリンパ球は、抗原が処理され、 次いで上記のようにＭｉｌＣ分子と関係してＡＰＣの細胞表面で発現されること を必要とする。こうして、Ｔ細胞、そして更に特別に、所謂“Ｔ細胞レセプター ”は、処理抗原と一つ以上の朋Ｃ分子を含む二分子リガンドの形態で抗原を認識 できる。

異種タンパク質および内在性タンパク質の両方を含むタンパク質の多くのエピト ープは、認識される間に、免疫系により比較的認識されないか、またはわずかに 弱く認識されるかにつき、その他の更に活性なエピトープの反応性によりこうし て支配される。それ故、これらのエピトープは抗体またはその他の免疫応答を殆 ど誘発しないか、または全く誘発しないことが明らかであり、またせいぜい弱い 応答のみを誘発し得る。それ故、例えば、これらのタンパク質エピトープに対し て抗体を産生ずることは困難であり、または不可能であった。対照的に、成る場 合に、先のエピトープの排除（または部分排除）に対し格別強い免疫応答を誘発 するエピトープが、“免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ　）”と称し得 る。本明細書に記載された発明は、抗原に対してその他の点で正常な免疫応答を 変調するために抗原およびエピトープを修飾する異なる方法を使用する。

本発明は、免疫系によるエピトープの免疫認識を変更する方法に関する。これは 内在性分子または外来分子（免疫原）を必要とし、そしてその抗原性を変え、ま たはそれに対する免疫応答を変えることを伴うことがあり、これは免疫原により 提示される（修飾されていない）天然産の内在性分子または外米分子に対する免 疫応答を無制限に変調することを含む。関係する分子を変性することにより、修 飾されていない形態の分子に対し免疫応答を生じ得る。例えば、変性エピトープ は、免疫系が完全に応答しない分子に存在し得る。同様に、エピトープは実質的 に認識されない場合があり、または別の抗原分子に対し不活性なエピトープであ る場合がある。同様に、このようなエピトープは、そうしないと、通常の条件下 で免疫系によりごくわずかに認識され、また応答される場合がある。また、この ようなエピトープは、同じ免疫原分子のその他のエピトープが免疫応答を誘発し ない程強く免疫系により認識される場合がある。

本明細書に記載された発明は、一般に、分子の修飾およびこのような正常な抗原 機構の変調に関する。特に、こうして、本発明は、一実施態様において、抗原を アドバンスト（ａｄｖａｎｃｅｄ　）グリコジル化最終生成物（ＡＧＥ）または ＡＧＥを生成する化合物で処理することにより抗原の抗原性または免疫原性を変 更することに関する。エピトープの抗原性の正の調節および負の調節の両方を得 ることができることが意図されている。例えば、エピトープを認識されるように し、または認識可能にすることにより、抗体が産生されて抗原を認識し、それに 結合し得る。増強される抗原性および別の弱いか、または有効ではないエピトー プに対し抗体を産生ずる能力は、例えば、ヒトを含む動物のワクチン投与だけで なく、その他の使用の中でも、エピトープおよび抗原を結合し、同定し、特性決 定し、また沈殿させるための試薬として使用し得る抗体の産生に大きな実用性が ある。

また、本発明は、例えば、別の“劣位個体（ｓｕｂｏｒｄｉｎａｔｅ）”エピト ープに対する免疫応答を可能にするための、免疫優性エピトープに対する免疫応 答の有効な抑制を意図している。抗原性を変調するこの付加的な能力は、例えば 、ヒトを含む動物を免疫し、そしてまた別のサイレントエピトープまたは弱い抗 原性のエピトープに対し反応性である抗体を産生ずるのに有益であり得る。また 、このような抗体は、中でも、生体内および試験管内のエピトープおよび抗原を 結合し、同定し、特性決定し、また沈殿させるのに有益である。

それ故、本発明の一つの目的は、現在まで認識されていなかったエピトープを特 性決定することである。

本発明の別の目的は、ポリペプチドの抗原性を変更し、そして変更された抗原性 を利用してこのようなポリペプチドの特性決定を助けることである。

本発明の別の目的は、従来同定されていなかったエピトープを活性化する方法を 提供することである。これらの目的およびその他の目的は、本明細書の教示から 当業者に明らかであろう。

発明の要約 抗原に対する免疫応答を変更する方法が開示される。第一の実施態様において、 抗原は、変更された免疫応答を誘発するのに充分な量で抗原に対しＡＧＥを生成 するような方法で、ＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物と反応させられる。

更に詳しくは、抗原は、抗原性が所望される分子のエピトープ領域で抗原に対し ＡＧＥを生成するような方法で反応させられる。この領域でその分子に存在する ＡＧＨの適当なレベルで、そこに存在するＡＧＥを含む分子領域は、ＡＧＥ修飾 領域により提示される天然産エピトープに対する通常不十分または皆無の免疫応 答が増強される意味で“活性化”される。

本発明の第二の好ましい実施態様において、特別な分子領域のＡＧＥ修飾は、そ の分子の一部の抗体認識を抑制するのに使用される。典型的には、抗体認識を誘 発するのに必要なレベルより若干高いＡＧＥ反応または蓄積のレベルで、ＡＧＢ とその分子の反応は、ＡＧＥを有する部位により提示される天然産エピトープの 認識を抑制する。また、ＡＧＥを生成でき、またはＡＧＢと会合できるエピトー プがアドバンストグリコジル化のインヒビター、例えば、アミノグアニジンまた はその類縁体と反応させられてＡＧＨの生成およびその結果としての免疫優性の 発生を抑制し得る。これらの方法において、免疫優性エピトープの抑制は、別の 免疫学的にサイレントまたは劣性のエピトープが免疫系により認識され、応答さ れることを可能にし得る。

上記のタンパク質中のアドバンストグリコジル化最終生成物の生成のインヒビタ ーが米国特許第４．７５８．５８３号明細書に広く示されており、その開示が参 考として本明細書に含まれる。これらの化合物として、初期グリコジル化生成物 のカルボニル部分と反応する化合物が挙げられる。このようなアドバンストグリ コジル化インヒビターの代表は、アミノグアニジン、リシンおよびα−ヒドラジ ノヒスチジンである。

これらの特定の化合物の他に、アドバンストグリコジル化を抑制できるその他の 薬剤またはタンパク質が同様に同定されており、また脂質のアドバンストグリコ ジル化を同様に抑制するのに利用できる。これらの薬剤が、ウルリッチ（Ｕｌｒ ｉ−ｃｈ）らの米国特許第４．９０８．４４６号、同第４．９８３．６０４号、 同第５．１４０．０４８号、同第５、１７５．１９２号、同第５．１１４．９４ ３号、同第５．１３７．９１６号、同第５．１３０．３３７号、同第５、１００ ．９１９号および同第５．１０６．８７７号に示されており、これらの開示が同 様に参考として本明細書に含まれる。

従って、このような化合物として、例えば、下記の一般式を有する種々のヒドラ ジン誘導体、およびそれらの医薬上杵される酸付加塩が挙げられる。

Ｒ９ 訃 Ｒ−Ｎ−ＮＨ２ 式中、Ｒは式 Ｒ１ の基であり、かつ Ｒ３は水素または１〜６個の炭素原子の低級アルキル基、ヒドロキシエチル基で あり、またはＲ７と一緒になって２〜４個の炭素原子の低級アルキレンブリッジ であってもよく：Ｒ７は水素または１〜６個の炭素原子の低級アルキル基であり 、またはＲ，もしくはＲ３と一緒になって２〜４個の炭素原子の低級アルキレン ブリッジ、アミノ基、ヒドロキシ基、または式％式％ （式中、ｎは２〜７の整数であり、かつＲ６およびＲ１は独立に１〜６個の炭素 原子の低級アルキル基であり、または−緒になって１〜２個のへテロ原子を含む シクロアルキル環または複素環の一部を形成し、そのへテロ原子の少な（とも一 つは窒素であり、また前記へテロ原子のうちの第二のへテロ原子は窒素、酸素、 および硫黄からなる群から選ばれ、但し、その複素環の前記へテロ原子のうちの 第二のへテロ原子が窒素であり、かつピペラジン環を形成することを条件とし、 それは必要によりピペラジン環の第一の窒素上のその化合物の一部と同じである 置換基により置換されていてもよ（り のアミノアルキレン基であり、Ｒ１は水素、１〜６個の炭素原子の低級アルキル 基であり、またはＲ７もしくはＲ４と一緒になって２〜４個の炭素原子の低級ア ルキレンブリッジであり、Ｒ４は水素、１〜６個の炭素原子の低級アルキル基で あり、またはＲ１と一緒になって２〜４個の炭素原子の低級アルキレンブリッジ 、またはアミン基であり、Ｒ３は水素、または１〜６個の炭素原子の低級アルキ ル基であり：但し、Ｒ，、Ｒ，、Ｒｓ　、Ｒ４またはＲ９の少なくとも一つは水 素以外であることを条件とし、またはＲはアシルまたは１０個までの炭素原子の 低級アルキルスルホニル基であり、かつＲ３は水素である。

それ故、本明細書で同定される場合に、“アドバンストグリコジル化のインヒビ ター”という用語は、アミノグアニジン、リシンおよびα−ヒドラジノヒスチジ ンの如き化合物と、上記のように一般に表され、またその他の関連特許出願およ び米国特許第４．９８３．６０４号に続いて発行され、それに関連する特許に含 まれているようなその他の薬剤の両方を包含することが意図されている。

本発明の別の好ましい実施態様は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびこのような細 胞の表面に存在する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を使用する。抗原は、 ＡＧＥまたは上記のようにＡＧＥを生成する化合物と最初に反応させられる。次 いでこのＡＧＥ修飾生成物は、抗原の処理がエピトープを認識可能にするのに有 効となるまで、細胞表面に存在するＭＩＩＣを有するだけでなくＡＧＥ、抗原ま たはＡＧＥ−抗原生成物のレセプターを有するＡＰＣと合わされる。次いで、処 理され、露出された抗原が、八ＰＣと関係してエピトープまたはＡＧＥ修飾エピ トープを認識する免疫系のその他の成分と反応するのに利用可能である。

また、本明細書に記載された発明は、好ましくは、本明細書に記載された方法に より、または本明細書に記載されたようにして修飾された免疫原に応答して産生 された抗体を含み、前記抗体として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体 およびキメラ抗体だけでなく、このような抗体を産生ずる細胞の不死の株、例え ば、関係するその分子およびＡＧＥ−分子を認識するモノクローナル抗体を産生 ずるハイブリドーマが挙げられる。

また、本発明は、細胞免疫系成分、例えば、このようなＡＧＥ修飾抗原または免 疫原に応答して産生されたＴリンパ球、ＡＧＥ修飾抗原、抗体または細胞免疫系 成分を含む医薬組成物および種々の使用方法を含む。

本発明の好ましい局面において、免疫原は複数のエピトープを含む。ＡＧＥまた はＡＧＥを生成する化合物が、その分子の少なくとも一種のエピトープと反応さ せられる。

本発明の別の好ましい局面において、免疫原とＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化 合物との反応は、免疫原の免疫原性を増大し、またその一部の免疫原性を比較的 増大する。これは、応答されるエピトープとのＡＧＥ反応、またはＡＧＥもしく はＡＧＥを生成する化合物とエピトープ付近の抗原の領域、即ち、エピトープ領 域、または抗原の別の部分においてはエピトープから所定の距離にある領域との 反応によるものであり得る。

本発明の別の好ましい局面は、抗原のエピトープの抗原性を低下することを伴い 、またはその一部の相対的抗原性を低下する。これは、応答されるエピトープと のＡＧＥ反応、またはＡＧＥもしくはＡＧＥを生成する化合物とエピトープ付近 の抗原の領域、即ち、エピトープ領域、または抗原の別の部分においてはエピト ープから所定の距離にある領域との反応によるものであり得る。こうして、抗原 とＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物との反応は、その分子の一部、成る場合 には、有利にその抗原の更に別のエピトープの認識を低下するのに利用し得る。

図面の簡単な説明 本発明が、図面に関連して詳細に本明細書で説明される。

図中、ＩＮ＋は、異なるインキュベーションプロトコルによる細胞に関する基質 濃度の関数としてのチミジンとり込みを示す三つのグラフである。

図２は、基質が３７℃で１６時間にわたって１％のトリプシンでブレインキュベ ートされる場合の基質濃度（ＡＧＥ−ＲＮａｓｅまたは対照ＲＮａｓｅ）　（μ ｇ／ｍｌ）の関数としてのチミジンとり込み（ＣＰＭ）のグラフである。

図３は、マウスを初回免疫してＴ細胞を活性化するのに使用された基質濃度（Ａ ＧＥ−ＲＮａｓｅまたは対照ＲＮａｓｅ）の関数としてのチミジンとり込み（Ｃ ＰＭ　ｘ　１０００）のグラフである。対照ＲＮａｓｅを使用してＴ細胞を初回 免疫するのに必要な投薬量よりもｌＯ倍少ないＡＧＥ−ＲＮａｓｅ投薬量を使用 してＴ細胞を初回免疫した。

図４は、ＡＧＥ−ＲＮａｓｅおよび対照ＲＮａｓｅを使用して抗体を産生する競 合ＥＬＩＳＡにより生じたデータのグラフ表示である。

図５は、抗原につきＡＧＨの存在により影響される細胞介在性（Ｔ細胞）免疫を 示すデータのグラフ表示である。

図６は、抗体ｎｏ、１１．３のエピトープスキャンである。

図７は、抗体５．８のエピトープスキャンであり、そして図８は、抗体ｎｏ、　 Ｉｌ、　３および５．８の活性の比較である。

詳細な説明 下記の略号力体明細書に使用され、また特に明記されない限り下記の意味を有す る。

“免疫原”という用語は、免疫応答を誘発しようと努めて個体に投与し得るあら ゆる物質、例えば、分子、細胞、ウィルスまたはこのような分子、細胞もしくは ウィルスの７ラグメントを表す。免疫原は免疫系またはそのＡＧＥ修飾形態のそ の成分により認識可能であることが好ましく、またその分子は非修飾形態のＡＧ Ｅ−抗原に対して産生された抗体により認識可能である。

こうして、　“免疫原”という用語は、例えば、“初回免疫”によるように抗体 または細胞免疫系成分を産生ずるのに投与またはそれ以外に使用され、または投 与またはそれ以外に使用し得るこのような物質を単に表す。

“免疫原”に関して使用される場合に、”分子”という用語は、特に明記されな い限り、ＡＧＥ修飾されていない形態の抗原の分子または分子フラグメントを表 す。

同様に、細胞、ウィルスまたはこれらのフラグメントを表すのに使用される場合 に、免疫原は細胞、ウィルスまたはこれらのフラグメントであってもよく、これ らはＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物と反応または処理されてそれに対する 免疫応答を変更し得る。それ故、“免疫原”という用語は、抗原物質、例えば、 細胞、ウィルス、細胞成分およびウィルス成分、抗原化合物、および異種タンパ ク質を含むだけでなく、本明細書に記載された処理により抗原性にされる種を含 む。

ここに使用される好ましい免疫原として、タンパク質およびタンパク質フラグメ ントが挙げられる。

“免疫原”という用語は、免疫応答を誘発する物質、例えば、分子を表す。こう して、それは免疫系により接触されるあらゆる分子を表すことができ、タンパク 質、核酸、等が挙げられるが、これらに限定されない。夫々の抗原は典型的には 一種以上のエピトープを含む。これらの抗原分子は還元糖との反応を行ってＡＧ Ｅを生成し得る。しかしながら、これらの化合物はＡＧＥと直接、または二官能 もしくは多官能カップリング試薬の存在下で反応させることができ、化学的に連 結されて、その分子へのＡＧＥの結合を生じることができる。

本明細書で意図され、かつ／または記載された抗原またはそのエピトープは、本 発明による処理後に正常な、実質的に免疫適格性の宿主への注射またはその他の 暴露の際に免疫応答またはその他の免疫反応を誘発するものであることが好まし い。

それ故、本発明は、前記のように、免疫系によるその認識および免疫系との相当 する反応性がＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物との反応の不在下で実際に皆 無であるように最小であり、またはマスクされるエピトープを有する抗原に及ぶ ものである。同様に、本発明の好ましい局面は、ＡＧＥまたはＡＧＥ生成化合物 との反応の不在下でさえもその分子に存在するエピトープを認識するこれらの抗 体を考慮する。関係する分子とＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物との反応は 、その分子のエピトープを抗体により認識可能にすることが最も好ましく、その 後、これらの抗体はＡＧＥ修飾されていない形態の分子のエピトープを認識し得 る。

“ＡＧＥ−”という用語は、それが表すタンパク質またはその他の化合物のアド バンストグリコジル化最終生成物を表す。これらの化合物は、関係する分子を一 種以上のＡＧＥまたはＡＧＨの生成をもたらす方法でＡＧＥを生成する化合物（ 制限がないが、還元糖を含む）と反応させることにより生成し得る。ＡＧＨの“ ファミリー”は、全く安定である幾つかの貝と不安定または反応性であるその他 の員とを有する。こうして、ＡＧＥ−タンパク質はまた安定、不安定または反応 性であり得る。内在性タンパク質に関して使用される場合、このようなＡＧＥ− 分子は典型的には生体内で非酵素的に生成される。また、このような化合物は、 例えば、還元糖と適当な化合物、例えば、タンパク質または核酸の混合物をイン キュベートすることにより、または試験管内のその他の方法、例えば、生物巨大 分子へのＡＧＥおよびＡＧＥモデルの化学カップリングにより試験管内で生成し 得る。

“タンパク質”という用語は、合成により生成されたポリペプチドおよび天然産 ポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント並びにこれらの誘導体を表し、これ らは試験管内または生体内で非酵素的にアトパンストグリコリル化反応を受け得 る。限定のためではな（、便宜上、以下の記載は“タンパク質”という用語を使 用するが、これらの教示はまた非酵素的アドバンストグリコジル化を受けるその 他の化合物にも当てはまる。オリゴヌクレオチドおよびアミン含有脂質だけでな く、その他のＡＧＥ反応性生物分子が非限定的な例として挙げられる。それ故、 本明細書に含まれる教示は、タンパク質またはそのフラグメントに限定されない 。

“還元糖”という用語は、フェーリング試薬またはトリンス試薬を還元するあら ゆる単糖または多糖を表す。非限定的な例として、はぼ全ての単糖および殆どの 三糖が還元糖である。蔗糖が格別の例外である。好ましい還元糖として、グルコ ース、グルコース−６−ホスフェート（０６Ｐ）　、フラクトースおよびリボー スが挙げられる。還元糖は一部アミン基と反応して、イミン形態のシッフ塩基中 間体を生成することが知られている。続いて、これらの化合物はアマトリ転位を 受け、こうしてαアミノカルボニル部分を生成し得る。イミンを更に安定な二級 アミンまたは二置換アミンに変換するこの転位は、糖とタンパク質を更に永久的 に結合する。これらの二級アミンは更に反応して、ＡＧＥと称される化合物のク ラスを生成し得る。ＡＧＥは最終的に分子内架橋または分子間架橋を形成または 生じ得る。

ＡＧＥ生成および架橋は、側鎖アミノ基の利用可能性のために、高いリジン含量 を有するタンパク質において特に顕著である。

タンパク質が還元糖に暴露される場合、これらの糖は酵素触媒作用に依存しない 機構によりタンパク質と化学反応し得る。最終的に、一連の複雑な転位および更 なる反応により、これらの糖修飾タンパク質はアドバンストグリコジル化最終生 成物即ちＡＧＥ−タンパク質になる。これらの化合物は生体内で絶えず生成する が、ＡＧＥ浄化機構がまた作用することが明らかである。例えば、マクロファー ジおよびその他の細胞が、これらの内在ｆＶＧＥ−修飾タンパク質のとり込みお よび分解に関与する。ＡＧＥ−修飾タンパク質の浄化は、マクロファージおよび その他の細胞で発現された別個のレセプター、所謂ＡＧＥ−レセプターにより生 じ得る。本発明により作用性であると考えられる機構の中で、抗原におけるＡＧ Ｅの存在が抗原をマクロファージのＡＧＥレセプターに対し標的とすることを助 け、それによりプロセシングにつき更に有効な抗原とり込みをもたらし得る。加 えて、ＡＧＥ−修飾タンパク質は酵素的タンパク質分解およびＣｎＢｒ消化に対 し更に抵抗性であることが示されたので、タンパク質分解に対するこの増大され た抵抗性は、抗原性を変調する方法でペプチトフラグメンテーンヨンを変化し得 る。

“免疫適格性”、　“正常な免疫系”、等の用ｊｔ１は、化合物が本明細書に記 載されたＡＧＥ−修飾を受けずに投与される場合に、関係する抗原により正常な 哺乳類宿主中で誘発し得る免疫応答を表す。免疫原は単に修飾されていない形態 で宿主に投与でき、そして正常な免疫応答が評価される。こうして、当業界で認 められている方法を使用して、この調節が無用の実験に頼らないで容易に確かめ られる。

“抗体”という用語は、特定のエピトープを認識し、またはそれらに結合する免 疫グロブリンを表し、これらは完全な抗体を含むだけでなく、そのフラグメント 、例えば、Ｆａｂ　、　Ｆ（ａｂ’　）またはＦ（ａｂ’　）ｚを含む。こうし て、その用語は、中でも、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびキメ ラ抗体を含み、最後に記載されたものは米国特許第４．８１６．３９７号および 同第４．８１６．５６７号明細書に詳しく記載されており、これらの特許が参考 として本明細書に含まれる。こうして、抗体“製剤”はこのような抗体またはそ のフラグメントを含み、これらは、その製剤中の個々の免疫グロブリン分子の少 なくとも一部が抗原を認識する（即ち、それに結合する）場合に抗原と反応性で ある。それ故、抗体製剤は、抗原への個々の免疫グロブリン分子の結合が普通に 使用される方法により検出できない場合に抗原と“非反応性”と称される。

抗体は、それがエピトープに結合する場合にエピトープを“認識する”と言われ る。それ故、“認識”はエピトープとの抗体結合反応を伴い、これは典型的な結 合機構および結合方法を含み得る。こうして、“結合”は普通の意味で使用され 、化学結合の形成を必要としない。

“エピトープ”という用語は、抗体またはその他の免疫系成分により認識され、 または認識可能である抗原または免疫原の一つ以上の部分を同定するのに使用さ れる。本明細書で使用される“エピトープ領域”は、三次元空間を考慮して、エ ピトープおよびエピトープの付近の周囲の領域を表す。それ故、これは抗原の三 次構造および四次構造を考慮し得る。ＡＧＥ反応がエピトープ領域中で起こる場 合、エピトープは免疫系により更に容易に認識されるようになり、また低下され た免疫系認識が、本明細書に詳しく記載されるように得られ得る。

“プロセシングおよび“提示”は、抗原がとり込まれ、変性され、免疫系に利用 可能にされる機構を表す。また、提示は、適当な場合には、■ＩＣとの複合体形 成（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）または結合を含む。成る場合には、プロセシン グは、ＡＰＣによる抗原のとり込みおよび部分タンパク質分解だけでなく、ＭＩ ＩＣに関係したＡＰＣ表面における露出を伴う。

°“反応゛および“複合体”並びにその誘導体という用語は、一般の意味で使用 され、また特別な反応機構または反応順序を必要とするものと見なされるべきで はない。

“リボヌクレアーゼ”（ＲＮａｓｅ）はウシ由来酵素を表す。ＲＮａｓｅは還元 糖と反応し、それにより同時インキュヘーション後にアドバンストグリコジル化 最終生成物を生成することが知られている。ＲＮａｓｅは、還元糖とのそのかな りの反応性のために、またそれがかなりの架橋を受けることから、試料タンパク 質として使用される。

略号“ＢＳ、Ａ”はラン血清アルブミンを表す。

略号“ＭＨＣ”は、中でも、抗原提示細胞の表面に通常多少の程度で存在する一 連の化合物である主要組織適合遺伝子複合体を表す。■ＩＣは抗原提示細胞およ び／または前記細胞に結合された抗原および／またはこれらの■（Ｃを認識し、 これらと反応するように細胞免疫系成分、例えば、Ｔリンパ球に“シグナル”を 送るように作用する。“シグナル”という用語は一般的な意味で使用されて、順 Ｃと関係したＴ細胞とＡＰＣを有する処理抗原との反応の開始を表す。このよう なものとして、“シグナル”は、抗原を抗体、抗体製剤または細胞免疫系成分に より認識させるこれらの成分間のあらゆる反応を伴い得る。

略号“ＦＦＩ”は、合成モデルＡＧＥである２−（２−フロイル）−４（５）　 −（２−フラニル）−１Ｈ−イミダゾールを表す。その化合物は、参考として含 まれる米国特許第４．６６５．１９２号（１９８７年５月１２８に発行）に記載 されたような化学合成により製造し得る。

本発明の一実施態様において、還元糖と一種以上のエピトープを有するタンパク 質とを非酵素的に反応させてＡＧＥ−タンパク質を生成することは、抗原が還元 糖との先の反応の不在下でＡＰＣに利用可能にされてＡＧＥ−抗原を生成する場 合に観察し得る抗原提示の内因性レベルを越えて抗原の提示を増進する。

本発明を特別な機構に限定するものではないが、所定の免疫原の抗原性のＡＧＥ 変更に関する幾つかの説明が考えられる。ＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物 は、抗原のコンホメーションまたは構造を変えて、それに異なる全体配置（これ は異なるエピトープを免疫系に露出する）をとらせることができる。

また、ＡＧＥの存在はＡＧＢ−抗原のとり込みを増進して、更に多くの抗原をＡ ＰＣによる提示に利用可能にし得る。

別のレベルでは、抗原におけるＡＧＨの存在は、ＡＩ’Ｃ細胞表面におけるＭＩ ＩＣの背景内で抗原の提示を変え得る。抗原は提示前に部分消化し得るので、Ａ ＧＩＥがタンパク質フラグメンテーションの程度またはパターンを変更して、抗 原フラグメントの異なるパターンを細胞表面で発現させることがまた可能である 。同様に、ＡＧＥは■ＩＣと相互作用し、こうして抗原を変更された方法で露出 させ、またエピトープを異なって認識させ得る。これらの機構のこれらの可能な 説明のいずれが一つまたはあらゆる組み合わせが適用し得る。しかしながら、本 発明はこの可能性に限定されるものではなく、全く異なる機構が適用可能である 場合がある。

その分子をＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物と合わせ、そしてこのＡＧＥ修 飾分子を免疫原として使用することにより、“変更された免疫応答”を得ること ができる。これは、例えば、免疫原か従来認識されていなかったエピトープに特 異性である抗体を産生ずるのに使用し得ることを意味する。更に、変更された免 疫応答は非抗体免疫系成分、例えば、Ｔリンパ球を伴うことがあり、これらは従 来提示または認識されていなかったエピトープを認識し得る。それ故、　“変更 された免疫応答”は主として本明細書に記載されたように処理された抗原の従来 認識されていなかったエピトープに関する。

本発明の好ましい実施態様は、免疫原としてＡＧＥ修飾抗原を使用して、同じエ ピトープまたは異なるエピトープ（これは、前記分子がＡＧＥまたはＡＧＥを生 成する化合物と前もって反応させられていない場合でさえもその分子に存在する ）をまた認識する抗体を産生じ、または前記抗原をそれらの抗体と反応させよう とするものである。それ故、本発明のこの局面において、所謂、変更された免疫 応答は、そうしないと試験管内または生体内で生成または観察されない抗体の産 生を伴う。例えば、免疫原はＡＧＥでインキュベートされ、次いで哺乳類に接種 するのに使用されて新たに認識可能なエピトープに対し抗体を産生じ、抗血清ま たはワクチン製剤、等を生産し得る。

同様に、抗体分子は開裂されて抗体フラグメントを生成でき、これらは試験管内 で組換えられて抗原の新たに認識可能なエピトープを認識または結合するキメラ 抗体を生成し得る。それ故、“変更された免疫応答”は通常のアレルギー反応、 またはその程度もしくは重度の増大または低下に限定されない。

本発明の別の好ましい実施態様は、認識可能である有効な抗原またはエピトープ への非抗原性の分子またはエピトープの変換を伴う。これは、抗原と反応し、ま たはそれに付着したＡＧＥを含む抗原を産生ずる試験管内または生体内の変換に より達成し得る。抗原はＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物と合わされて抗原 に対し変更された免疫応答を誘発し得る。

本発明の更に別の好ましい実施態様は、弱い抗原性である分子に関する。この好 ましい局面において、弱い抗原性の分子がＡＧＥと反応させられ、もしくはそれ に結合され、或いはＡＧＥを生成する化合物と反応さぜられて、その分子の抗原 性を増大し、またその一種以上のエピトープの認識を高める。同様に、これは試 験管内または生体内で行われて、その分子を増大された抗原性を有する化合物に 変換し得る。

本発明の別の好ましい実施態様は、そうしないと抗原性の分子のそうしないと弱 い抗原性または非抗原性のエピトープに対する抗原性の変調を伴う。このような 場合、ＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物とその分子の反応は、そうしないと “看過される”エピトープに対する増強された免疫応答をもたらす。本発明のこ の局面において、その分子は試験管内または生体内でＡＧＥまたはＡＧＵＥを生 成する化合物と反応させられて、そうしないと通常の条件下で免疫系により認識 されない一種以−Ｆのエピトープを明らかにし得る。このように、通常認識され ないエピトープが抗体産生、認識またはその他の免疫応答を誘発し得る。

本発明の別の好ましい実施態様において、その分子のエピトープの免疫優性が変 更される。一種より多いエピトープを含む成る種の抗原は、一種以上の他のエピ トープに対する一種のエピトープの優性に基いて特徴的な免疫応答を有する。

本発明のこの局面は、ＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物を一種以上の劣位個 体エピトープと試験管内または生体内で反応させてその認識を増進するが、また はＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物を、この優性エピトープの認識を抑制す るのに有効な歌でその分子の免疫優性エピトープと試験管内または生体内で反応 させることにより一種以上の劣位個体エピトープの認識を増進する。これは一種 以上のその他のサイレントエピトープまたは劣性エピトープを発現させる。

優性エピトープの認識を抑制するために、前記エピトープに対するＡＧＥ反応の レベルは、劣性エピトープまたはサイレントエピトープを認識させるのに必要な ＡＧＥ反応のレベルより若干高（でもよい。このＡＧＥ反応のレベルは、その他 のエピトープよりも有利にその特別なエピトープの反応性を抑制するのに有効で あるレベルである。優性エピトープを抑制するのに必要なレベルは、認識シグナ ルの相対的な強さ、導入される抗原の濃度およびその他の因子の関数である。再 度、その調節レベルの決定は当業者に無用の実験を必要としない。

前記のように、エピトープの反応性または免疫優性は、アドバンストグリコシル 化最終生成物の生成のインヒビターの投与により変調またはダウンレギュレーシ ョンし得る。それ故、アミングアニジンおよび先に！１丁シ＜説明された化合物 の如きインヒビターはＡＧＨの生成を阻止することができ、そうすることにより 、免疫優性の発生および成る種の自己免疫で体験し得るその結果としての反応性 を阻止し得る。それ故、本発明はこのような目的のためのアドバンストグリコジ ル化のインヒビターの使用に及ぶ。

本発明の更に別の好ましい実施態様において、抗原分子はＡＧＥまたはＡＧＥを 生成する化合物とのその反応性を増進するように修飾し得る。一つのこのような アプローチは抗原分子へのりシンまたはその他のＡＧＥ−反応性化合物の添加を 伴う。

このようなその他の化合物として、その他のαアミノ酸、例えば、アルギニン、 ヒスチジンおよびアミノ基だけでなくその他のＡＧＥ反応性部分を含むその他の 化合物が挙げられる。上記のように、このリジン修飾は、ＡＧＥと合わされ、反 応させられるエピトープに対して行われて、その分子を抗原性にし、かつ抗原の 認識を促進し得る。同様に、この修飾は弱い抗原性の分子を用いて行われて、抗 原に対して更に大きな免疫応答を生じることができ、または劣性エピトープもし くは非認識性エピトープを用いて行われて、その他の通常優性のエピトープより もその認識を高めることができる。それ故、本発明のこの好ましい実施態様にお いて、その分子の抗原性はその分子にＡＧＥと反応でき、またはＡＧＥを生成で きる部分を導入することにより変更される。

導入される部分はりシン基であることが好ましく、これはエピトープまたはエピ トープ領域に導入される。しかしながら、リシン基はエピトープ領域以外の分子 の一部に含まれていてもよく、その免疫原のその特別な部分の免疫系認識を増大 もしくは低下でき、或いはそのエピトープの認識に対し効果を有することができ る。

本発明の別の好ましい実施態様において、リシンはエピトープ、エピトープ領域 中またはその分子中のいずれかのエピトープ領域の外部のポリペプチド中でその 他のアミノ酸を置換している。

本発明の別の好ましい局面において、リジンは分子鎖の末端に結合し得る。

本発明の別の好ましい局面において、抗原がポリペプチドである場合、リジンは その池のアミノ酸を置換しないでポリペプチド鎖に挿入し得る。再度、これはエ ピトープ、エピトープ領域中またはエピトープ領域の外部で試みられてもよく、 またリシンをコートする適当な遺伝子配列を所望の位置で関係するポリペプチド をコートする配列に付加し、その配列を発現ベクターに挿入し、そのベクターを 宿主に移入し、そして付加されたりシンを有するポリペプチドを宿主に発現させ ることにより達成し得る。

上記のりシン修飾は、優性エピトープにつき、免疫系によるその認識を増大また は低下するのに有効な量で行い得る。これは、その他のエピトープよりもその免 疫優性を増大または低下するために、またはその分子中のその他の通常認識され ない部位を抗体により認識可能にするために行い得る。

また、ポリペプチドのりシン修飾は化学的に行われてもよいが、好ましい方法は 組換え技術を使用して関係する分子の発現をコートする遺伝子配列を変更する。

このような遺伝子操作されたタンパク質が発現される場合、一つ以上のりシン基 はコートされた一つ以上の位置で分子中に含まれていてもよく、これは、勿論、 ポリペプチドへのりシン分子の挿入のためのコドンの付加、そのリジン分子をポ リペプチドの末端にグラフトまたは付加すること、または関係する分子の最終的 な発現の際にそのＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子中の−っ以上のコＦ：／を置換 して成るタンパク質アミノ酸をリシンで順に置換することを伴い得る。

関係する分子の突然変異タンパク質の発現をコードする発現ベクターが調製でき 、このベクターは、宿主細胞が突然変異タンパク質を発現させられるように、宿 主細胞に移入し得る。突然変異タンパク質は、突然変異タンパク質の一次配列中 のそうしないと存在しないリシン残基の発現のためのコドンで置換され、または そのコドンを挿入した、もとのアミノ酸配列、またはその部分を含んでいてもよ い。好適なりシン含有部分として、リシン単独およびリシンを含むポリペプチド フラグメントが挙げられる。

非紹換え手段を使用して一つ以上のりシン分子またはりシン含有フラグメントを ポリペプチドに挿入するために、酵素かりシン分子をポリペプチド主鎖に挿入も しくは結合するのに使用されてもよく、またはりシンもしくはりシン含有基をポ リペプチドにグラフトするのに使用されてもよい。同様に、化学試薬が上記の分 子にリシン含有フラグメントをグラフトまたは挿入するのに使用し得る。それ故 、抗原分子は、ポリペプチドをコードする配列を含む宿主発現ベクターからその 分子を発現することにより生成されたポリペプチドであってもよい。コード配列 がリジンのコドンを含むように修飾される場合、ポリペプチドは所望の位置、例 えば、エピトープ、エピトープ領域またはその他の場所でリシンで発現し得る。

リジンを分子的に挿入し、もしくはそれ以外にリシンをタンパク質と反応させ、 またはりシンを含む修飾ポリペプチド（突然変異タンパク質）の発現をコードす ることにより、ポリペプチドの一部アミノ基またはその池のＡＧＥ反応性部分の 数が増加でき、こうしてＡＧＥ生成のためのポリペプチドの反応性を増大し得る 。これらの方法はりシン基を一次配列中に入れ、こうしてＡＧＥをあらゆる所望 の部位に配置することを可能にし、こうしてエピトープの抗原性を免疫優性エピ トープの付近または関係するエピトープ以外の部位でその分子中のいずれかで変 調する。

適当な反応性基または部位を含み、かつＡＧＥまたは還元糖と反応するりシン以 外の化合物がまた反応性を変えるのに使用し得る。これらの化合物はそれ以外に タンパク質を変性または失活しないことが好ましい。

ここに含まれる抗原性を増強する別の好ましい方法として、抗原提示細胞（ＡＰ Ｃ）の使用が挙げられる。抗原提示細胞、内在性■Ｃ分子（これらは幾つかの異 なる形態で前記抗原提示細胞の膜に存在する）、およびＡＰＣの表面にあるレセ プター分子が使用し得る。本発明のこの実施態様において、本発明はタンパク質 とＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物との間で生じた生体内または試験管内で 誘導された反応生成物を使用し得る。

この実施態様は、例えば、ポリペプチド分子、ＡＧＢまたは反応生成物（これは ＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物とＡＧＢ−反応性化合物の間で試験管内ま たは生体内で生成し得る）を認識し、それらに結合するＡＰＣレセプタータンパ ク質を利用し得る。

ＡＰＣによりとり込まれた抗原は非特異的機構により生じることができ、続いて 細胞表面でＭＩＩＣと混在して抗原の露出が生じ得る。プロセシングが、抗原と ＡＰＣの表面の初期の相互作用を増進することにより著しく増大し得る。例えば 、ＩｇＧまたはＣ３ｂによる抗原のオプソニン作用が抗原プロセシングおよび提 示をかなり増進し得る。抗原を処理するこの高められた能力は、成る場合には抗 原の増大された内在化により生じ得る。抗原は、オプソニン作用を受けた抗原複 合体とＦｃレセプター、補体レセプターとの相互作用により更に有効に内在化で き、または抗原は抗原特異的表面レセプター免疫グロブリンに結合される。

抗原がＡＰＣにより一旦内在化されると、部分タンパク質分解がプレリソソーム の（ｐｒｅｌｙｓｏｚｏｍａｌ　）エンドソーム中で起こり、そして抗原の処理 ペプチドフラグメント力＜Ｉ＋Ｏ（Ｃ分子と混在されるようになる。しかしなが ら、抗原の部分タンパク質分解はそのペプチドフラグメントへの適当な囲Ｃおよ びＴ細胞の結合を生じるために必須であり得るが、抗原の過度の分解は最終的な 免疫応答に有害であることがわかった。特定の抗原のプロセシングに必須ではな いタンパク質分解の抑制はプロセシングおよび提示を増進することが示され、こ れは、不適なタンパク質分解による干渉が実際に抗原提示を増進することを示唆 する。

これらの二つの方法、即ち、ＡＰＣの表面への抗原のターゲツティング、および 非必須の抗原タンパク質分解による干渉が、抗原プロセシングおよび提示を増進 するのにここに使用し得る。例えば、抗原をＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合 物で処理し、次いでＡＧＥ−抗原をＡＰＣと合わせることにより、異なるフラグ メンテーションおよび提示のパターンが生じｉ）る。同様に、抗原をＡＧＥ反応 の前に断片化することにより、フラグメンテーションおよび提示のパターンが変 更可能である。

従来認識されていなかったエピトープの認識または提示を促進するために、タン パク質分子が還元糖と反応させられてＡＧＥ−タンパク質反応生成物（ＡＧＥ− タンパク質）を生成し得る。

ＡＧＥおよびＡＧＥを生成することが知られている化合物が充分に反応しなくて 所望のレベルの増進された抗原提示を１７えない場合、その分子とＡＧＥまたは ＡＧＢを生成する化合物の反応性を高めるのに有効な量のりシンを使用してその 特別な分子を修飾し得る。上記のりシンは、ＡＧＥを特性決定されるべき分子の 一部で生成または結合させるのに比較的低いレベルでその分子の特別な部分に誘 導し得る。

また、リシンおよびＡＧＥ反応工程はその分子の異なる部分を活性化するのに高 いレベルでその分子の一部に誘導でき、こうして優性エピトープを抑制し、その 他のエピトープを認識させる。

また、ＡＧＥ−タンパク質またはそのフラグメントは、結合が生じるまで細胞表 面にＭＩＩＣを有するＡＰＣと合わされてもよい。

高いＡＧ８レベルでは、優性エピトープにおける、またはエピトープの抗体また はＴ細胞認識を低下または干渉するポリペプチドの位置におけるＡＧＥの存在は 、その優性をその他のエピトープにシフトし得る。これは分布の変化率（％）ま たはエピトープに対する直接効果の関数であり得る。

ＡＰＣ内の生物学的プロセスは、ＡＧＥ−タンパク質の結合を定性または定量す ることを可能にするように調節し得る。例えば、インキュベーションの時間およ び温度が、ＡＰＣによる完全な内在化、ＡＧＥとタンパク質の完全な結合、等の パラメーターを得るように調節し得る。ＡＰＣおよびＡＧＥ−タンパク質を合わ せて適当な期間、例えば、約１時間にわたって適当な温度、例えば、４℃に保つ ことにより、ＡＰＣ細胞表面へのＡＧＥ−タンパク質の結合が定量化し得る。何 となれば、内在化が有効に減少または抑制し得るからである。また、ＡＰＣ／Ａ ＧＥ−タンパク質インキュベーション温度および／または期間を増大することに より、例えば、約１時間にわたって約３７℃まで」二昇させることにより、内在 化が評価し得る。

また、そのタンパク質のこの部分を有効に“停止”し、そして特別な医学の症状 または疾患、例えば、癌、自己免疫疾患、等と関連し得るサイレントエピトープ を活性化するエピトープに存在するＡＧＥの相対量を測定することができる。反 応性エピトープに存在するＡＧＨのレベルを測定し、次いでサイレントエピトー プの抗体認識を評価することができる。抗体がサイレントエピトープを認識し始 める時、優性エピトープに存在するＡＧＨのレベルおよび位置が測定でき、こう してＡＧＨの存在または抗原性の変調を関係する疾患または症状と相関付けるこ とができる。

本明細書に記載される方法は、評価すべきそのタンパク質をＡＧＥまたはＡＧＥ を生成する化合物との反応の前に開裂性化合物、例えば、酵素で処理することに よりタンパク質フラグメンテーンヨンを適当に処置することができる。

本発明によれば、通常の分子生物学、微生物学、クローニング技術および組換え ＤＮＡ技術が利用でき、これらは当業者のレベル内にある。このような技術が文 献に充分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、”Ｍｏ１ｅｃ−ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　（＋９８２）；　”ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ： 　Ａ　Ｐｒａｃ狽奄モ≠戟@Ａｐ− ｐｒｏａｃｈ、　”　１巻および１１巻（Ｄ、　Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ編集、＋９ ８５）；　”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈ■刀| ｉｓ″（１＋Ｌ　Ｊ、　Ｇａｉ　を編集、１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”（Ｂ、Ｂ、ｔｌａｍｅ刀@＆Ｓ、Ｊ。

Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８５）；　”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　 Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−（Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ＆Ｓ、Ｊ、P１ｇ− ｇ１ｎｓ編集、１．９８４）；“Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕｌ　ｔｕｒｅ− （Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８６）；“Ｉａｎｏａ| ｉｌｉｚｅｄ　ｃｅｌｌｓ　Ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ”（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、 　１９８６）；　Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ≠戟@Ｇｕｉ− ｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　（１９８４）を参照のこ と。これらの教示が参考として本明細書に含まれる。

ここに使用される抗体は、典型的には、上記のようにして認識可能にされ、増強 または抑制される抗原のエピトープを認識する抗体である。この型のＡＧＢと反 応した抗原を、例えば、高度免疫法プロトコルにより哺乳類に注射することによ り、エピトープに対する変調された抗体応答を得ることができる。

ここに有益である抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラ 抗体であってもよく、また産生されて所望のエピトープを認識でき、そして種々 の診断用途、治療用途および研究用途に使用し得る。例えば、抗体が発現ライブ ラリーをスクリーニングするのに使用さねて評価されるエピトープを有する夕ン パク質をコードする遺伝子を最終的に得ることができる。更に、提示された抗原 を認識する抗体が無傷の動物に使用または測定されて、タンパク質が果たす生物 学的役割を更に良く解明でき、または免疫応答または免疫記憶の状態を更に有効 に評価し得る。

抗原のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびキメラ抗体は、公知の技 術、例えば、高度免疫法プロトコル、または、例えば、融合マウス牌臓リンパ球 およびミエローマ細胞を使用するハイブリドーマ技術により調製し得る。また、 不死の抗体産生細胞系を、融合以外の技術、例えば、癌遺伝子ＤＮＡによるリン パ球の直接形質転換、またはエプスタイン・バールウィルスによる形質転換によ りつくることができる。同様に、キメラ抗体分子が、適当なトランスフェクショ ンおよびハイブリドーマプロトコルを使用して産生じ得る。

ここに使用される一つの好ましい抗体は、修飾ポリペプチドのコード配列を含む 宿主発現ヘクターから発現される修飾形態のポリペプチドを認識する抗体である 。その配列は、例えば、上記のような置換型または挿入型の付加によるように、 へＧＢ反応性部分を含むように簡単に修飾し得る。特に好ましい抗体は、エピト ープに付加された一つ以上のりシン基を有するポリペプチドを認識する。

別の好ましい抗体は、エピトープ領域、例えば、エピトープの外部に付加された 一つ以」二のリンン基を有するポリペプチドを認識する。

別の好ましい抗体は、エピトープ領域の外部、例えば、別のエピトープまたはそ うしないと免疫系により認識されない領域にあるポリペプチドに付加されたりン ン基を有する上記のポリペプチドを認識する。

本明細書の教示により提供された結合パートナ−・フォアーアンヂゲン（ｆｏｒ ａ−ｎｔｉｇｅｎｓ）として使用し得る一Ｆ−記の抗体に関して、修飾抗原を認 識する抗体（例えば、Ａｂｔ）が第二抗体（Ａｂ、）を使用して評価し得る。こ の方法はイディオタイプとして知られている抗体特性を利用する。夫々の抗体は 、抗原に特異的である特有の領域を含む。この領域がイディオタイプと称される 。抗体それ自体は抗原決定基を含む。抗体のイディオタイプは、その分子に特異 な抗原決定基である。生物を抗体で免疫することにより、イディオタイプを認識 する抗体を含む、それらを認識する抗抗体が産生じ得る。他の抗体のイディオタ イプを認識する抗体が抗イデイオタイプ抗体と称される。幾つかの抗イデイオタ イプ抗体は、その抗体が認識するもとの抗原を模擬し、その抗原の“内部イメー グを有すると言われる。

それ故、抗イデイオタイプ抗体Ａｂ、の特性は、それがＡｂ、と反応することで ある。抗イデイオタイプ抗体を産生ずる一つの方法は、異なる補乳類種中でＡｂ ｔおよびＡｂ、を産生することを伴う。例えば、Ａｂ、はウサギ抗体を抗原とし て使用してヤギ中で産生じ得る。それ故、Ａｂｔはヤギ中で産生された抗ウサギ 抗体である。

Ａｂ、がＡｂ、を認識する場合、Ａｂ、はエピトープと同じ特性を有し得る。

修飾抗原がリガンドとして使用される場合、成る抗イデイオタイプ抗体がそのリ ガンドのレセプターに結合し得る。この文脈におけるレセプターは、結合部位ま たは結合分子を意味する。研究者らは、インスリン、アンギオテンシンＩＩ、ア デノシン■、β−アドレナリン、およびラット脳ニコチンのレセプターおよびオ ピエートレセプターに結合する抗イデイオタイプを含む、これらの幾つかを同定 した。

この現象を利用して、その他のりガントが抗イデイオタイプ抗体を使用して単離 し得る。抗イデイオタイプは、もとの抗原に結合する分子をスクリーニングす′ るのに使用し得る。それ故、この技術を使用してサイレントエピトープに結合す るその他のりガントを同定でき、またはポリペプチドに結合し、こうしてアゴニ スト、アンタゴニスト等として作用する分子をスクリーニングすることができる 。

また、本発明は、本明細書に記載されたようにしてＡＧＥ−修飾形態として産生 され、使用される免疫原を含む。こうして、好ましい免疫原は、少なくとも一つ のエピトープと、その分子中のエピトープ、エピトープ領域またはいずれかの場 所と反応または共有結合された少なくとも一つのＡＧＥとを有するＡＧＥ−修飾 タンパク質である。免疫原は、前ＥＡＧＥの存在、それとの反応またはそれへの 結合のために変更された抗原性を有する。その免疫原は、ＡＧＥ修飾形態または 非修飾形態のタンパク質を認識する抗体の産生を誘発する。

特に好ましい免疫原は、免疫応答が所望されるエピトープ領域と反応または共有 結合された少なくとも一つのＡＧＥを有する抗原分子である。

その他の特に好ましい免疫原は、エピトープ領域以外の部位と反応または共有結 合された少なくとも一つのＡＧＥを有する抗原である。それ故、その他の好まし い免疫原は、多数のエピトープ領域と、少な（とも一つのこのようなエピトープ 領域と反応または共有結合されたＡＧＥとを有する抗原分子である。前記免疫原 は、ＡＧＥ修飾形態または非修飾形態の抗原分子を認識する抗体の産生を誘発し 得る。

こうして、本発明の免疫原複合体および組み合わせは、それに反応または結合し たＡＧＥと、ＡＧＥを有するエピトープ、または免疫原中のいずれかの場所のＡ ＧＨの存在または反応により活性化されたエピトープを認識する抗体とを更に含 む。

それ故、複合体および組み合わせは、本明細書に記載された抗体を含む。

一つのこのような組み合わせは、ＡＰＣ、ＡＧＥ−タンパク質反応生成物および 免疫原にＦＴ在し、ＡＧＥ反応後に認識可能であるエピトープの抗体を含む。

別のこのような組み合わせは、ＡＰＣ、ＡＧＥ−タンパク質反応生成物およびそ のタンパク質に存在するエピトープの抗体を含み、前記抗体はＡＧＥ−抗原投与 に応答して産生され、更にＡＧＩＥまたはＡＧＥを生成する化合物の存在または それらとの反応がなくてもエピトープを認識する。

抗原提示細胞が関与する場合、その抗原提示細胞および抗原＝ＡＧＥ反応生成物 が、前記抗原−ＡＧＥ反応生成物を実質的に内在化しないで抗原−ＡＧＥ反応生 成物をＡＰＣの表面に結合させるのに有効である条件下で同時インキュベートし 得る。

同様に、ＡＰＣおよび抗原−ＡＧＥ反応生成物は、前記抗原−ＡＧＥ反応生成物 をＡＰＣにより内在化されるようにするのに有効である条件下で合わせることが できる。

また、上記の本発明の局面は、ＡＧＥまたはＡＧＥを生成する化合物と反応した 分子および前記抗原フラグメンテーション方法を使用し得る。例えば、免疫原が 細胞、ウィルスまたはポリペプチドである場合、抗原分子がＡＧＥまたはＡＧＥ を生成する化合物と反応させられ、次いでＡＰＣと合わせる前に断片化し得る。

また、フラグメンテーションは抗原の提示を変更でき、その結果、異なるエピト ープが認識し得ることが意図されている。

抗原はＡＧＥ化合物による処理の前に断片化され、次いで提示し得る。これは、 フラグメンテーションパターンの別の変更を得る。

更に、抗原およびＡＧＥ化合物が合わされ、そして抗原−ＡＧＥ反応生成物がＡ ＰＣにより断片化され、その後、露出または提示し得る。これ力便に第三のフラ グメンテーションパターンを得る。それ故、フラグメンテーションパターンは本 明細書に記載されたＡＧＥ処理方法によりかなり影響され得ることが意図されて いる。何となれば、提示および露出後に、異なるフラグメンテーションパターン が夫々の場合に認められるからである。全てのこのような修飾が本発明内に含ま れる。

更に、エピトープを認識可能にする方法は、ＡＧＥ　、抗原または抗原−ＡＧＥ 反応生成物のいずれかのとり込みのための細胞手段を伴い得る。これはエピトー プを免疫系により認識可能にするのに有益であり、しかもエピトープがＡＰＣお よび抗原−ＡＧＥ反応生成物を合わせる前に免疫系により実質的に認識されない 場合に特に好ましい。

ＡＰＣ処理が望まれる場合に、ここに使用するのに好ましいＡＰＣとしてマクロ ファージ細胞が挙げられ、マウス腹膜マクロファージ細胞が最も好ましい。

また、本発明は、これらの薬剤の診断用途および治療用途を意図している。それ 故、ＡＧＥ−タンパク質またはその抗体が種々のこれらの方法に使用するために 調製し得る。

これらの薬剤のいずれかは、適当に標識されていてもよ（、また標識されていな くてもよい。典型的には、標識成分は抗体であるが、ＡＧＥ　、抗原、ＭＨＣま たはＡＰＣを同様に標識することか可能である。

こうして、レセプターと提示された抗原を認識する結合パートナ−の両方が、こ こに記載された種々の技術に関して使用される。例えば、標識されていてもよく 、また標識されていな（でもよいＡＧＨのレセプターまたはその他のりガントを 使用して、ラジオイムノアッセイが行い得る。標識は、例えば、放射能付加、ホ ウ水素化ナトリウムによる還元または放射性ヨウ素化により行い得る。

最も普通に使用される標識は放射性同位元素、抗原、紫外線に暴露された時に蛍 光を発する薬品、等である。

適当な放射性同位元素は、３１１、＋４ｃ　、　３２ｐ　、　２３ｐ　、　！５ ３　、　”ＣＬ　”Ｃｒ、Ｓ？Ｃｏ、５ｓＣｏ、Ｓｉｐ、　９０ｙ、＋２５（、 ＩＨＩ、および＋８６Ｒｅからなる群から選ばれてもよい。

上記の放射性同位元素の一種により与えられるような放射性標識が使用される場 合には、現在知られている利用可能なカウント操作が使用し得る。

標識が酵素である場合、検出は現在使用されている当業界で知られている比色技 術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、検温技術、電流滴定技術またはガス計量 技術のいずれかにより行い得る。酵素が、橋かけ分子、例えば、カルボジイミド 、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、等との反応によりアドバンストグリ コジル化最終生成物、それらの結合パートナ−またはキャリヤー分子に接合し得 る。また、本発明の好ましい実施態様において、酵素それ自体が前記のような糖 との反応によりアドバンストグリコジル化最終生成物に修飾し得る。

これらの操作に使用し得る多くの酵素が知られており、使用し得る。好ましい酵 素はベルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β− Ｄ−ガラクトンダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ベルオキシダー セ、ヘキソキナーゼ＋ＧＰＤａｓｅ、　ＲＮＡａｓｅ、グルコースオキシダーゼ ＋アルカリ性ホスファターゼ、ＮＡＤ酸化還元酵素士ルシフェラーゼ、ホスホフ ラクトキナーゼ＋ホスホエノールビルベートカルボキシラーゼ、アスパルテート アミノトランスフェラーセ＋ホスホエノールビルベートデ力ルボキンラーゼ、お よびアルカリ性ホスファターゼである。米国特許第３．６５４．０９０号、同第 ３．８．８５０．７５２号、および同第４．０１６．０４３号明細書が、別の標 識物質および標識方法のそれらの開示につき例として参考にされる。

幾つかの蛍光物質が知られており、標識として使用し得る。これらとして、例え ば、フルオレセイン、ローダミンおよびオーラミンが挙げられる。特別な検出物 質は、ヤギ中で調製され、イソチオシアネートによりフルオレセインと接合され た抗ウサギ抗体である。

イムノアッセイにおいて、ＡＧＥ−抗原反応生成物の調節量の結合パートナ−が 調製され、必要により、例えば、酵素、発光する化合物および／または放射性同 位元素で標識され、次いで哺乳類から採取された組織または液体試料に導入され て、例えば、その中に存在する抗原の量を測定し得る。標識物質またはそれの一 種以上の結合パートナ−が試料と反応する機会を有した後、得られる複合体が既 知技術により試験でき、これは付着された標識の性質に応じて変化する。このよ うにして、　ＡＧＥレセプター、Ｍｌ（Ｃの活性および効果、またはその抗体に より認識されたエピトープが評価し得る。

夫々の場合、アドバンストグリコノル化最終生成物が一種以上の結合パートナ− と複合体を形成し、−員が検出可能なラベルで標識し得る。複合体が生成したと いう事実および、所望により、その量が、本明細書に記載された検出方法により 測定し得る。

ここに含まれる一つの好ましい診断方法は、哺乳類から採取された試料中の１９ ２６球のレベル、機能または活性の測定を伴う。ＡＧＥ−処理免疫原がＡＰＣで インキュベートされ、その後、哺乳類から採取された１９２６球が添加される。

哺乳類から採取された１９２６球のレベル、機能または活性が、その後、標準と 比較し得る。

一つの好ましい実施態様において、ＡＰＣが固体担体に結合し得る。

別の好ましい実施態様において、免疫原−ＡＧＥ反応生成物が、ＡＰＣと免疫原 −ＡＧＥ反応生成物の結合を生じるのに有効である温度でＡＰＣと合わされる。

これは、ＡＰＣによる実質的な内在化を許さないで達成し得る。このようにして 、面心ＰＣへの抗原結合が評価し得る。また、温度を上昇することにより、ＡＧ Ｅ−抗原のＡＰＣ内在化およびその後の細胞代謝プロセスが評価し得る。

治療処置方法および診断方法が、本明細書に記載された種々の成分および方法の いずれかまたは全部を使用して行い得る。例えば、癌または感染症の診断または 治療に関して、単離されたタンパク質が腫瘍、異常細胞または感染生物から得ら れ、そしてこのタンパク質がその精製形態で、またはＡＧＥ−誘導体として抗原 として使用し得る。このタンパク質またはＡＧＥ−タンパク質の抗体が、本明細 書に開示された増進された抗原提示方法を使用して誘発され、そして所望により 、腫瘍、異常細胞、バクテリアタンパク質またはウィルスタンパク質につき従来 知られていないエピトープまたは有効ではないエピトープを同定、特性決定、結 合、抑制または失活するのに使用し得る。この情報は、順に、このような病気を 治療する薬剤、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、等を開発するのに有益で ある。

同様に、上記の抗体は、特に、腫瘍、自己免疫疾患および感染症の治療における 直接の診断または治療上の実用性を有するように産生じ得る。

本明細書に記載されたＡＧＥ−修飾抗原に好ましい用途は、このような治療を要 する哺乳類患者を免疫するのに使用し得るワクチンの形態である。このような患 者に有効量の免疫原を投与することにより、抗体が特別な免疫原に対し産生でき 、これらは疾患を治療し、またその発生または広がりを防止するのに有効である 。

同様に、本明細書に記載された発明はまたこのような治療を要する哺乳類患者へ の抗体の投与を含む。この治療方法において、患者は、病因物質を認識する有効 量の、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および／またはキメラ 抗体を投与される。例えば、腫瘍または腫瘍タイプから得られたタンパク質のサ イレントエピトープまたは劣性エピトープに対し産生された抗体が哺乳類患者に 投与され、こうして腫瘍の非修飾形態または修飾形態のエピトープを認識する抗 体を得ることができる。こうして、免疫系が疾患を治療するために補充またはそ れ以外に使用し得る。

抗原を認識し、かつ本発明により提示されたエピトープを特性決定するのに使用 される好ましい非細胞成分は、本明細書に記載された方法によらないと通常誘発 されない抗原に対し産生された抗体を含む。また、上記のように、最も好ましい 抗体はＡＧＥ−修飾抗原に対し産生されるが、非修飾分子を認識しない。

上記の一般的な操作力似下の実施例で説明される。本明細書に開示された全ての プロトコルは、本明細書に示された方法により活性化されたエピトープの定性測 定および定量測定に適用し得る。

実施例１ 特定のＴ細胞ハイブリトーマに対するマクロファージによる抗原の提示がＡＧＥ −修飾により増進される マクロファージ＋抗原　→　３７°ＣＸ１時間　→　１％のパラホルムアルデヒ ド中で固定　→　抗原特異的Ｔ細胞ハイブリトーマを添加し、２４時間インキュ ベート−ＩＬ−２産生を測定することにより分析されるＴ細胞刺激万牌 １ン抗原　クルコース修飾抗原（ＲＮａｓｅおよびヘモグロビン）を、０．５Ｍ のグルコースまたはグルコース−６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）を含む０．１Ｍの リン酸緩衝液中で４日間または８日間インキュベートすることにより調製した。

対照抗原を同じ時間の長さにわたってリン酸緩衝液単独中でインキュベートした 。次いでタンパク質を１％食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に対し徹底的に透析し 、タンパク質濃度をブラッドフォード法またはタンパク質の公表された吸光率を 使用することにより測定した。

２）マウス・全ての実験をジャクノン研究所からのＣＢＡ／Ｊ（）１２Ｋ）を用 いて行った。

３）Ｔ細胞ハイブリドーマ刺激アッセイ　そのアッセイ系はグルコース修飾抗原 または未修飾抗原を抗原特異的Ｔ細胞ハイブリドーマに提示するマクロファージ の能力を調べた。腹膜マクロファージを３　Ｘ　１０’のリステリア・モンサイ トゲネス・バクテリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　ｂａｃ ｔｅｒｉａ）による感染の７〜２１日後にＣＢＡ／Ｊマウスから得た。マクロフ ァージを９６ウエルプレートに付着した後、ウェルを洗浄し、種々の濃度の抗原 を添加した。次いで細胞を３７℃で１時間放置し、続いてそれらを１％のパラホ ルムアルデヒド中で固定した。

次いで抗原特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞を、固定したマクロファージ単層に 添加し、インキュベーションを２４時間行った。Ｔ細胞刺激を、Ｔ細胞／イブリ トーマによるＩＬ−２の放出を定量することにより分析した。この定量をＩＬ− ２依存性ＣＴＬＬ−２細胞系による′Ｈ−チミジンとり込みにより測定した。

抗原および抗原特異的Ｔ細胞ハイブリトーマを生存マクロファージに添加する付 加的な実証を行った。インキュベーションを２４時間行い、続いて上記のＩＬ− ２産生を測定することにより刺激を分析した。結果を図１に示す。結果は、実施 例２で得られたＴ細胞活性化の増進と近似した。

墾 図１は、グルコースまたはＧ６ＰによるＲＮａｓｅおよびヘモグロビンの修飾が 、未修飾抗原（中央のパネル）と比較された場合に抗原提示の約１０倍の増進（ 上のパネル）をもたらしたことを示す。この提示の増進は、抗原がグルコースま たはグルコース−６−ホスフェートのいずれでインキュベートされようとも同様 であり、また８日射４Ｂ＋＝わたるグルコースによる抗原のインキュベーション は効力を実質的に増大しなかった。

対照的に、タンパク質リゾチームはグルコースまたはグルコース−６−ホスフェ ートによるインキュベーション後に増進された提示を示さなかった。ニブシロン グルコースが、例えば、リシン残基のＥ−ニブシロンアミノ基に非酵素的に付加 されるので、リボヌクレアーゼおよびヘモグロビンにつき１０個および１２個と 比較してリゾチーム中のわずかに３個のりシン残基の存在が一部の説明を与え得 る。

実施例２ 未修飾抗原によらずに、ＡＧＥ−抗原およびＦＦｌ−抗原による抗原パルス化マ クロフマクロファージ＋抗原　→　４°ＣＸ１時間　−ＨＢＳＳで洗浄　→　３ ７℃で１時間の加温　→　１％のパラホルムアルデヒド中で固定　→　Ｔ細胞ハ イブリドーマを２４時間にわたって添加　→　実施例１のようにして刺激につき 分析方体 ｌ）抗原・グルコース修ｆｆ１ｐＲＮａｓｅおよび対照ＲＮａｓｅを実施例Ｉに 記載されたようにして調製した。加えて、モデルＡＧＥ　、　ＦＦＩをＲＮａｓ ｅに化学結合させ、これを抗原として使用した。

２）抗原パルス化マクロファージ　上記の抗原を４°Ｃで１時間にわたってマク ロファージ細胞（実施例１のようにして得られた）でインキュベートした。ノ１ ンクス平衡塩溶液（ＩＩＢｓｓ）で洗浄して未結合のＲＮａｓｅを除去し、細胞 を３７℃で１時間温めた。次いでマクロファージを１％のパラホルムアルデヒド で固定し、続いてＲＮａｓｅ特異的Ｔ細胞バイブ１月・−マを固定マクロファー ジ単層に添加した。ハイブリドーマの刺激を実施例１に記載されたようにして分 析した。結果を下記の表Ｉに示す。

墾 これらの条件下で、未修飾リボヌクレアーゼはりボヌクレアーゼ特異的Ｔ細胞ハ イブリドーマを刺激できなかった。著しく対照的に、下記の表Ｉに示されるよう に、グルコースまたはグルコース−６−ホスフェートでインキュベートされたり ボヌクレアーゼはＴ細胞ハイブリトーマを活性化することができた。また、ＦＦ ｌ−リボヌクレアーゼを抗原として使用した場合に刺激が生じた。これらの条件 下で刺激するグルコース−修飾リボヌクレアーゼおよびＦＦｌ−リボヌクレアー ゼの両方の能力は、それらがマクロファージ細胞表面に結合できることを示唆す る。

４°Ｃで、リガンドのレセブクー結合が起こるが、細胞が代謝上不活性であるの で、内在化は起こらない。洗浄は遊離抗原の全てを除去するので、細胞表面に結 合される抗原のみが、内在化、プロセシング、およびマクロファージが３７℃に 一旦温められた場合の提示に利用可能である。マクロファージ細胞に結合しない 対照りボヌクレアーゼはこれらの条件下で提示されない。何となれば、それは４ ℃で未結合形態のみでγｒ在し、それ故、洗浄により完全に除去されるからであ る。

表■ 対照ＲＮａｓｅ 実験１　（ｃｐｍ）　４２３　２５３　９３　１９０実験２　１５６７　１６０ 　１３７　１４０１日　Ｄ−グルコース Ｒへａｓｅ 実験１　２４７　１２０　１．１６７　１６７実験２　３８．９４７　＋５．４ ８０　２．９９３　２２０実験１　２１．１７３　７８３　１６０　９３実験２ 　５．５９３　１．、＋０７　１８７　１１７ＦＦＩ−ＲＮａｓｅ 実験１　４９．２５０　１３０　１００　１３０実施例３ マクロファージ　→　４°Ｃで３０分間競合物１（ＡＧＥまたは対照ヘモグロビ ン）でブレインキュベート　→　ＡＧＥ−抗原を添加し、４℃で更に６０分間イ ンキュベート−洗浄　→　実施例２のような残りのアッセイ方法 １）抗原　ＡＧＥ＝抗原はＲＮａｓｅまたはヘモグロビンからなり、これを０． ５ＭのＤ−グルコース中で４日間インキュベートし、実施例１に記載したように して処理した。

２）競合抑制アッセイ：　ＲＮａｓｅ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマへの提示につ きＡＧＥ−リボヌクレアーゼと競合するＡＧＥ−ヘモグロビンの能力を分析した 。付着マクロファージを４℃で３０分間にわたってＡＧＥまたは対照へモグロビ ンでプレインキユベートシ、続いてＡＧＥ−リボヌクレアーゼを添加した。４℃ で更に１時間インキュベートした後、未結合の抗原を洗浄して除いた。マクロフ ァージを固定し、次いで実施例２のようにして分析した。４１′Ｉ果を下記の表 １１に示す。

結果 表１１に示されるように、ＡＧＥ−ヘモグロビンは提示につきＡＧＥ−リボヌク レアーゼと競合するが、対照へモグロビンは競合しない。抗原プロセシングにつ き競合する不適なＡＧＥ−タンパク質の能力は、ＡＧＥ−リボヌクレアーゼの増 進された提示がＡＧＥレセプターを介してＡＧＥ−修飾抗原に特異的に結合する マクロファージの能力によることを示唆する。ＡＧＥ−修飾抗原のみが提示され ると考えられる。何となれば、マクロファージによる抗原の結合が抗原プロセシ ングに必要とされるからである。

表ＩＸ Ｄ−グルコースＲＮａｓｅ　０　２８．５４７同」二　ＡＧＥ−ヘモグロビン （１００μｇ／ｍｌ）　６，５５３ 同上　ＡＧＥ−ヘモグロビン （３１μｇ／ｍｌ）　２７，４６７ 同上　対照ヘモグロビン （１００μｇ／ｍｌ）　２２，９４０ 同１ユ　対照ヘモグロビン （３１μｇ／ｍｌ）　３１．６３７ 予備固定されたマクロファージ　→　トリプシン処理されたりボヌクレアーゼ＋ リボヌクレアーゼ特異的ハイブリドーマ　−２４時間インキ、ベートし、／Ｘイ ブリトーマ刺激につき分析 方法 １）抗原　グルコース１１飾りホヌクレアーゼまたは未修飾リボヌクレアーゼの トリプシンフラグメントを、適当な抗原を緩衝剤入りの１％のトリプシン製剤で ３７００で１６時間インキュベートすることにより生成した。

２）バイ１１月・−マ刺激アンセイ　トリプシン消化製剤、ＡＧＥ−修飾りボヌ クレアーゼまたは対照りボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ特異的Ｔ細胞ｌ ＼イブ１ノトーマを、予備固定されたマクロファージ単層に添加した。インキュ ベーションを２４時間行い、続いてハイブリドーマ刺激を先に記載されたように して分析した。

結果 図２に示された結果は、ＡＧＥ−ＲＮａｓｅの試験管内の酵素的加水分解が増進 された抗原提示と関連していることを実証する。これらの実験条件下で、マクロ ファージによる抗原の内在化およびプロセシングの必要性が回避される。何とな れば、抗原のプロセシングは試験管内でトリプシンを用いて行われるからである 。生成されるトリプシンフラグメントは、マクロファージ細胞表面でクラスＩＩ ＭＩ（Ｃ分子と直接会合し得る。

本発明を特別な機構に限定しないが、二つの可能な説明が上記の結果を説明する のに考えられる。第一に、リボヌクレアーゼのＡＧＥ−修飾がタンパク質分解に 対する部分的な抵抗性を与え、それにより、自ｃＪＩｃに結合できる更に適当な ペプチドフラグメントの生成を可能にすることが可能である。これは、抗原提示 に非必須のプロテアーゼが抑制される場合に見られる生存マクロファージにおけ る増強された抗原提示に類似し得る。第二に、リボヌクレアーゼのへＧＢ修飾は 、ＡＧＢ−ペプチドがＭＨＣに結合するための増大された安定性を与える。増進 された提示が■（Ｃ分子との増大された会合により生じるか否かを実証するため に、リボヌクレアーゼ特異的ハイブリドーマにより認識されるコア合成ペプチド を合成した。

抗原のへＧＥ修飾がタンパク質加水分解に対する安定性を与えるか否かを調べる ために、抗原を徹底的に分解することが知られているプロテアーゼに対し保護す るＡＧＥ修飾の可能性を調べることができる。ＡＧＥ修飾はこのようなプロテア ーゼに対し安定性を与える場合、ＡＧＥ抗原は未修飾抗原よりもこのようなプロ テアーゼによる長いインキュベーションに耐えることができるとともに、依然と してその刺激特性を保持し得る。

実施例５ 早期生成物ではなく、後期グリコリル化生成物が増進された提示の原因である方 法 ｌ）抗原　グルコース修飾リボヌクレアーゼおよびＦＦｌ−リボヌクレアーゼを 実施例２に記載されたようにして調製した。ＲＮａｓｅおよびグルコースのアマ トリ生成物をホウ水素化ナトリウムで還元して相当するアルコールを生成した。

２）Ｔ細胞やり激アッセイを実施例２のようにして行った。Ｔ細胞刺激アッセイ の結果を下記の表ＩＩ＋に示す。

結果 表ＩＩＩは、ホウ水素化ナトリウムによるグリコリル化抗原の還元がグルコース 修飾抗原の増進された提示に影響しないことを示す。還元は早期グリコジル化生 成物を排除するが、ＡＧＥ生成物に影響しないので、これらの結果は、提示の増 強が後の最終生成物の生成によるものであることを示唆する。加えて、合成モデ ルＡＧＥであるＦＦＩが提示を増強することができることは、抗原提示の増進に おける更なるアドバンスト生成物の役割を支持する。

対照ＲＮａｓｅ　１，５６７　１８０　＋３７　１４０Ｄ−グルコースＲＮａｓ ｅ （４日）　３８．９４７　＋５．４８０　２．９９３　２２０還元Ｄ−クルコー ス ＲＮａｓｅ　４７．１４３　１９．６０３　３．０４３　５６０Ｇ６Ｐ　ＲＮａ ｓｅ （４日）　５，５９３　１．０７０　１８７　＋１７還元Ｇ６Ｐ、’ＲＮａｓｅ 　３．１００　５５７　１７０　１１ＯＦＦＩ−ＲＮａｓｅ　４９，２５０　１ ３０　１００　１２０実施例６ 抗原の過剰修飾（ｏｖｅｒ−ｍｏｄｉｆ　１ｃａｔｉｏｎ）が減少された提示の 増進をもたらす。

方法。

り抗原　０．５Ｍのグルコースおよびグルコース−６−ホスフェートによるイン キュベーションを６週間に延長した以外は、ＡＧＥ−リボヌクレアーゼを実施例 １のようにして調製した。加えて、リボヌクレアーゼを、０．０１Ｍから０．５ Ｍまでの範囲の種々の濃度のＤ−グルコースおよびグルコース−６−ホスフェー トで４日間インキュベートした。

２）Ｔ細胞ハイブリドーマ刺激を実施例２に記載された方法により行った。結果 を下記の表ＩＶに示す。

結果 ６週間にわたる０．５Ｍのグルコースまたはグルコース−６−ホスフェートによ るリボヌクレアーゼのインキュベーションは、同じ条件下でわずかに４日間イン キュベートされたりボヌクレアーゼと比較した場合に抗原提示の増進をもたらさ なかった（表Ｉｖを参照のこと、結果が異なる実験から得られる）。

その他に、グルコース−６−ホスフェートで１５週間にわたってインキュベート されたりボヌクレアーゼは、同じ時間の長さにわたってＤ−グルコースでインキ ュベートされた抗原よりも小さな抗原提示の増進を示した。

表ＩＶ 抗原濃度　１００　３１　１．０　３．１対照ＲＮａｓｅ　（６週間）６３０７ 　１６３　１．０　１９０対照ＲＮａｓｅ　（４日間）　１５６７　１８０　１ ３７　１４０Ｄ−グルコース／ＲＮａｓｅ　（６週間）３９０３７　３４６０７ 　４４６０　９７Ｄ−グルコースＲＮａｓｅ　（４日間）３８９４７　１５４８ ０　２９９３　２２０６６Ｐ／’ＲＮａｓｅ　（６週間）　３２０４１　１９３ 　１５０　１１０Ｇ６Ｐ／ＲＮａｓｅ　（４日間）　２１１７３　７８３　＋６ ０　９３抗原をインキュベートするグルコースの最適濃度を同定するために、Ｒ Ｎａｓｅを種々の濃度のＤ−グルコースまたはグルコース−６−ホスフェートで ４日間インキュベートした。提示の増進に最適のＤ−グルコースおよびグルコー ス−６−ホスフェートの濃度は０．Ｏ１〜０．１Ｍであった（結果につき表Ｖを 参照のこと）。このデータは、抗原の少しのＡＧＥ−修飾のみが最適の結果を得 るのに必要であるとし）う更なる証拠を与える。最後に、先の実施例と対照的に 、グルコース−６−ホスフェートは抗原提示を増強する点でＤ−グルコースより 劣っていた。

表Ｖ 対照 リボヌクレアーゼ　１．５６７　９８　４０　６１Ｄ−グルコ−スＯ，ＯＩＭ　 ５３．６７７４３．８８３２７．５００１４．０３７０．０５Ｍ　、１８，０９ ０３５，６１７１４．７１３　４．０８７０、ＩＯＭ　４１．６６０２０，５５ ７　６．６２７　＋、４９００、２５Ｍ　伺、５３０２８．８５７　４．６８７ 　１３７０．５０Ｍ　３８，９４７１５．４８０　２．９９３　２２０グルコー ス−０，０１Ｍ　４３，７９０　＋６．０２７　８，１２０　１．１２７６−Ｐ 　Ｏ，０５Ｍ　３３．０８７　９．３５７　４，６８３　１，１４７０、　ＩＯ Ｍ　５６．３９０２６．７９７　ｔｏ、　４６７　３．１８３０．２５Ｍ　５０ ．６００　７．２９３　＋、２８３　２１３０．５０Ｍ　５，５９３　１．０７ ０　１６７　１１７実施例７ ＡＧＥ−抗ハＴ１がリンパ節′Ｆ細胞の増進された初回免疫と関連する処 １）Ｔ細胞増殖アッセイ　ＡＧＥ−リボヌクレアーゼまたは対照りボヌクレアー ゼによるＢａ１ｂ／Ｃマウスの初回免疫を、尾底部に完全フロインドアジュバン ト（“ＣＦＡ”）中の種々の濃度の抗原を注射することにより行った。初回免疫 の８日後に、鼠径リンパ節および大動脈周囲のリンパ節の単細胞懸濁液を生成し た。単細胞懸濁液からの２　ｘ　１０５の細胞をリボヌクレアーゼと一緒にマイ クロタイタ・ウェルに添加した。Ｔ細胞の初回免疫を、塗布の２〜５日後に３１ １−チミジンとり込みを測定することにより分析した（生体内で初回免疫された Ｔ細胞は試験管内で増殖し、それ故、３Ｈ−チミジンをとり込む）。

２）ＡＧＥ−リボヌクレアーゼは０．５ＭのＤ−グルコースで４８間インキュベ ートされ、前記のようにして処理されたりボヌクレアーゼからなっていた。

精米 図３に示されるように、対照りボヌクレアーゼで初回免疫するのに必要とされた 投薬量よりも１０倍少ない投薬量を使用して、マウスを初回免疫するのに成功し た。マウスを初回免疫するのに必要とされたＡＧＥ−リボヌクレアーゼの最小投 薬量は約０．１Ｈｇから約１．０Ｈｇまでであり、一方、対照ＲＮａｓｅで注射 されたマウスは最大応答を誘発するのに１０〜１００Ｈｇを必要とした。このデ ータは、ＡＧＥ−抗原が月４照抗原と比較した場合に生体内でＴ細胞を活性化す るのに更に有効であることを実証することにより、試験管内の知見を確認し、拡 張する。

タンパク質の免疫原性を増大するＡＧＥ−修飾の例として、リボヌクレアーゼ（ ＲＮａｓｅ）をＡＧＥにより修飾しくＡＧＥ−ＲＮａｓｃ）　、ウサギに注射し て抗体の産生を生じた。ＲＮａｓｅ（２５ｍｇ／ｍｌ　）を０．２ＭのＮａＰＯ ４緩衝液（ｐＨ７，４）中のＩＭのグルコースで９０日間インキュベートするこ とにより調製した。

図４は、得られた抗血清による競合ＥＬＩＳＡを示す。このアッセイにつき、天 然ＲＮａｓｅを９６ウエル・マイクロタイタ・プレートに固定化した。特定量の 抗ＡＧＥ−ＲＮａｓｅ抗血清を添加しく５０　μｍ　、最終希釈１／２０，００ ０）　、続いてＡＧＢ−ＲＮａｓｅまたは未修飾ＲＮａｓｅ（変性されたもの） の希釈液を添加した。示されるように、ＡＧＥ−ＲＮａｓｅは固定化天然ＲＮａ ｓｅへの抗血清の結合につき天然ＲＮａｓｅよりも更に有効な競合物質であった 。これは固定化天然ＲＮａｓｅと添加されたリガンド（天然ＲＮａｓｅまたはＡ ＧＥ−ＲＮａｓｅ　）の間の競合アッセイであるので、抗体＝ＡＧＥ相互作用は この系において作用しない。この実験は、ＡＧＥ修飾がＲＮａｓｅの構造（エピ トープ）の変化を生じ、それを固定化天然ＲＮａｓｅと抗血清の相互作用につき 天然ＲＮａｓｅよりも良好な競合物質にすることを示す。

ＥＬＩＳＡ方内 ９６ウエル・マイクロタイタ・プレート（ヌンク・イムノプレート（Ｎｕｎｃ　 ｍｕローｏｐｉａｔｅ）　、ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎ ｄ、　ＮＹ））を、夫々のウェルにＰｌｕｓに溶解したＡＧＥ−ＢＳＡ　ｌｏｇ ／ｍｌの溶液０．１ｍｌを添加し、室温で２時間インキュベートすることにより ＡＧＥ−ＢＳＡで被覆した。ウェルを、ＰＢＳ　、０１０５％のトウイーン（Ｔ ｗｅｅｎ　）２０、およびＩｍＭのＮａＮ５（ＰＢＳ　ｔ・ウィーン）を含む溶 液０．１５ｍ１で３回洗浄し、ウェルを２％のヤギ血清、０．１％のＢＳＡ　、 およびＩ請のＮａＮを含むＰＢＳの溶液０．１ｍｌで１時間インキュベートする ことによりブロックした。ＰＢＳ−トウイーンで洗浄した後、競合抗原５０μｌ を添加し、続いて抗血清（最終希釈、ｌ／１００００　）５０μｌを添加した。

プレートを室温で３時間インキュベートした。次いで壁部をＰＢＳ−トウイーン で洗浄し、比色基質としてパラ−ニトロフェニルホスフェートを使用してアルカ リ性ホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧで展開した。

実施例９ 特定の主要組織適合ハブロタイブと関係して提示されたタンパク質／ペプチド抗 原に特異的なレセプターを有するＴ細胞ハイブリドーマを試験管内でモデル系に おいて研究した。２２Ｄ、ｌｌと称される一つのこのようなＴ細胞ハイブリドー マは、このタンパク質がＩ−Ｅ　”ハブロタイブを有する抗原提示細胞により提 示される場合にハト・シトクロムＣを認識する。このように刺激されたＴ細胞は 、インターロイキン−２を分泌することにより応答する。次いでこの応答が、な らし培地（これは分泌されたインターロイキン−２を含む）をインターロイキン −２増殖依存性細胞系（ＣＴＬｌ、）に添加し、通常の方法により旧チミジンと り込みを測定することにより測定し得る。

この実施例に関して、シトクロムＣを２種の糖：　０．２Ｍのグルコース、４日 および１４日並びに０．２Ｍのグルコース−６−ホスフェート（更に反応性）、 ４日および１４０インキユベートすることによりＡＧＢにより修飾した。次第に 増加する量の天然シトクロムＣおよびＡＧＥ−修飾シトクロムＣを０．１ｍｌの 培地中で２４時間にわたって５　Ｘ　１０’のＴ細胞（２２［１，１１）でイン キュベートした。この時間の終了時に、培地５０７１１を除去し、ウェル当たり ５　ｘ　１０”のＣＴＩ、Ｌ細胞を含む培地２００μｌに添加した。これらを２ ４時間培養し、次いでウェル当たりｌμＣｉの”Ｈ−チミジンでパルス化し、ｃ ｐｍ測定のために１２時間後に回収した。

図５は、４日間のグルコースによるインキュベーションがＴ細胞に対し刺激効果 （特に高濃度の抗原で）を有し、これが１４日で減少する（更に多くのＡＧＥが 生成する時）ことを示す。グルコース−６−ホスフェート（ＧａＰ）（これはグ ルコースよりも迅速にＡＧＥを生成する）は４日で抑制効果を有する。その抑制 は１４０で増大する。

これらのデータは、細胞介在性免疫応答アッセイ系において、ＡＧＥが抗原とＴ 細胞の反応性に影響することを示す。タンパク質に対する低レベルのＡＧＥ−修 飾で、この効果は刺激性であり得る。高レベルのへＧＥ−修飾で、この効果は抑 制性である。

実施例１０ ここに提示されたＴ細胞の抗原性の試験中に、Ｔ細胞が生体内でへ〇Ｂ−修飾タ ンパク質の発生および存在に応答して果たし得る役割を更に大いに考慮した。以 下のコメントおよび知見が、この研究から生じた発見を反映する。

組織マクロファージがＡＧＢ修飾タンパク質を除去し、ＡＧＥ−レセプター系を 介して組織腫瘍調節サイトカインを分泌する。この系は、特有のＮ末端配列を有 する２種のタンパク質（６０ｋＤおよび９０ｋＤ）からなる。組織回復の重要な 関与体であるリンパ球がまた組織ＡＧＥと相互作用すると推論して、本発明者ら はヒトおよびラットのＴリンパ球につき同様のＡＧＥ結合部位の発現につき研究 した。

静止Ｔ細胞は７．８　Ｘ　１０−＠ＭのＫｄでＡＧＥ−リガンドを結合し、一方 、４８時間にわたる００１％のＰＩ（Ａによる刺激後に、特異的結合が５．８　 Ｘ　１０−”ＭのＫｄに増加する。ラットＴ細胞の免疫組織化学染色およびＦＡ Ｃ３分析は、静止ＣＤ５＋Ｔ細胞の３８，２％かｐ６０を発現し、一方、Ｐ）Ｉ Ａによる刺激後に、発現がＴ細胞の８９．４％に増加することを示した。同様に 、ラットＣＤＩ　＋　Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に関するｐ６０の発現は静止 時に夫々３４．５％および５８゜５％であり、刺激後に、夫々の場合に９１．９ ％および８６．４％に増加した。少数のＴ細胞がＰｌ（Ａ刺激に最小に応答して ｐ９０八〇Ｅ−レセプターを発現した。ＡＧＥ−ヒト血清アルブミン（ＡＧＢ− Ｈ５ＡＸＯ，１−１０／μｇ／ｍｌ）へのＰＨＡ刺激Ｔ細胞の露出は、顕著な投 薬量依存性ＩＦＮγｍＲＮＡ発現および成熟タンパク質分泌をもたらし、一方、 このような応答は未修飾ＩＳＡへの応答において認められなかった。データは、 マクロファージと協力してＴ細胞が、直接の抗増殖性作用を与えると知られてい るＴ細胞ＡＧＥ−レセプター介在性ＩＦＮγ産生により正常組織ターンオーバー の調節に寄与し、こうしてサイトカイン効果を相殺し得ることを示唆する。この バランスは、糖尿病組織中のように、損傷をもたらす過度のＡＧＥ蓄積により相 殺し得る。それ故、Ｔ細胞の刺激または活性化を含む、ＡＧＥを認識し、変調し 、かつ／または除去する方法が含まれる。

実施例１１ どのエピトープが、成る場合には天然ＲＮａｓｅに対し産生され、またその他の 場合にはＡＧＥ−ＲＮａｓｅに対し産生された抗血清により認識されるのかを測 定する目的でポリペプチドＲＮａｓｅを分析した。この実験を行って、別種の優 性エピトープに対する免疫認識および応答が抑制でき、また別種のサイレントエ ピトープまたは劣性エピトープに対する免疫認識および応答がポリペプチドをＡ ＧＥを生成する化合物で処理することにより増進し得ることを確かめた。ウシＲ Ｎａｓｅに相当するポリペプチド配列を決定しく１２４の残基）、エピトープ地 図作成および分析に使用しｔこ。

休作 ウシＲＮａｓｅのアミノ酸配列に相当し、フラグメント当たりＩＯのアミノ酸を 含む広範囲にわたる一連のポリペプチドフラグメントを、連続フラグメントが８ のアミノ酸によりオーバーラツプするように、（二つのアミノ酸をずらして）合 成した。それ故、ペプチド番号ｌはウシＲＮａｓｅ配列のアミノ酸番号１−１０ を含んでいた。ペプチド番号２はアミノ酸番号３〜Ｉ２を含んでいｌこ。以下、 同様。５８のペプチドを、このようにしてつくった。

Ｎ末端アセチル化を受けた全てのペプチドを分子スペーサーアームに結合し、そ して夫々のペプチドフラグメントに対し抗ＲＮａｓｅ抗体および抗（ＡＧＥ−Ｒ Ｎａｓｅ　）抗体を使用して別々のＥＬＩＳＡを行う目的で、８ｘ１２のマイク ロタイタ・プレート・７オーマントに保持されたピンに共有結合させた。

ＥＬＩＳＡアンセイ ２種の試験抗血清を使用して、即ち、最初にＲＮａｓｅの抗体（抗血清１１．３ と称される）を用い、そして次にＡＧＥ−ＲＮａｓｅの抗体（抗血清５．８と称 される）を用いて典型的な固相ＥＬＩＳＡ操作を使用した。試験抗体製剤を“ス ー／ぐ−カクテル”（卵白アルブミン１０．０ｇおよびウシ血清アルブミンｔｏ 、　Ｏｇを食塩加リン酸緩衝液に溶解し、トウィーン２０を添加する）中１／１ ０．０００に希釈し、そして結合した一次抗体または試験抗体を検出するのに利 用できる二次抗体製剤（ダコパッツ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）からのブタ抗ウサギ Ｉｇ　ＨＲＰ接合体）をまたスーパーカクテル中で１１５００に希釈した。ペプ チドＰＬＡＱおよびＧＬＡＱを夫々陽性対照および陰性対照として使用した（以 下に使用した記号は、本明細書に参考として含まれるＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｉ、 　２４３：３５５２−３５５９（＋９６９　）に記載されたアミノ酸の１文字表 示に基いている）。

免疫原としてのウシＲＮａｓｅによる高度免疫プロトコルを使用して試験抗体１ １．．３をウサギ中に産生じ、免疫原としてＡＧＥ−ＲＮａｓｅを使用する高度 免疫プロトコルを使用して試験抗体５．８をウサギ中に産生じた。夫々の試験抗 体を５８のペプチドフラグメントと反応させ、夫々のペプチドに対する夫々の抗 体の反応性を分析した。

結果を図６および図７に図示する。個々の試験結果の比較を図８に図示する。

魂胆 抗体１１．３は、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）においてＧＬＡＱ　（陰性）対 照ペプチドにつき約、１００（０００，４）の比較的高いバックグラウンドレベ ルを示した。ペプチド番号、配列およびＥＬＩＳＡ　ＯＤを下記の表Ｖｌに示す 。下線を施した配列は陽性ＥＬＩＳＡシグナルを示す夫々の連続ペプチドに共通 であり、これらは抗血清、即ち、機能性抗原エピトープにより認識される配列の 最良の推測に相当する。

５４　ＣＡＹＫＴＴＯＡＮＫ　０．６０１５５　ＹＫＴｒＯＡ？ＪＫＨ１０，４ ５５５６ＴＴＯＡＮＫＨＩＩＶ　＋、　１２８抗体５．８は、イムノアンセイ（ ＥＬＩＳＡ）においてＧＬＡＱ　Ｃ陰性）対照ペプチドにつき約１００（ＯＤ　 ０．０９６）の比較的低いバックグラウンドレベルを示した。ペプチド番号、配 列およσＥＬＩＳＡ　ＯＤを下記の表Ｖｌ＋に示す。下線を施した配列は陽性Ｅ ＬＩＳＡシグナルを示す夫々の連続ペプチドに共通であり、これらは抗血清、即 ち、機能性抗原エピトープにより認識される配列の最良の推測に相当する。

表Ｖｌｌ ペプチド番号　配列　０Ｄ ３９　ＣＫＮＧＱＴＮＣＹＱ　Ｏ，＋２５図６および７に示されるように、ペプ チドフラグメントに対する抗血清の特異性および反ＬＬ、性の多数の相違か認め られ。これらは免疫１京にお＋７るＡＧＥの存在（または不在）を原因としてい る。非反応性であり、かつ天然ＲＮａｓｅが免疫原として供給される時に抗体応 答を誘発しない幾つかのエピトープに対する免疫応答を変調し、そしてＡＧＥ− ＲＮａｓｅが免疫原として利用できる時に天然エピトープの異なるスペクトルに 対し抗体を産生した。例えば、ペプチド番号２７で、ＲＮａｓｅに対し産生され た抗体は１．００１のＯＤを示し、これは反応性のバックグラウンドレベルの約 ３〜４倍である。対照的に、ＡＧＥ−ＲＮａｓｅ抗体は０．０２のＯＤを示し、 これはバッククララントＯＤよりも約５倍低く、これはＲＮａｓｅとＡＧＥの反 応後のこの特別なエピ１−−−プの抑制を実証する。逆に、ペプチド２９〜３１ により表されるＡＧＥ−ＲＮａｓｅに対し産生された抗体は、非修飾形態のＲＮ ａｓｅに対し産生された抗体により実質的に認識されなかったエピトープを認識 する。

本発明は、その精神または必須の特徴から逸脱しないで、別の形態で具体化でき 、また別の方法で実施し得る。それ故、この開示は全ての点で例示であり、限定 ではないと考えられるべきであり、本発明の範囲は請求の範囲により示され、ま た均等の意味および範囲内にある全ての変化はその中に包含されることが意図さ れている。

ヘモグロビ：／　Ｊｆ　（ｕ　ｇ　／　ｍ　Ｉ　ｌｎαＪＲＥＩ Ｆｉｇｕｒｅ　２ １１Ｇ／ｌ、化 Ｆ１ｇｕｒθ３ υ９ 冒 ・　／　ノ　・ ・　０ ／／　・ ・　０ ／　Ｍ　１１７　。

ＬＩＪｄり 国際調査報告 、、、−、−、、＾、、、（、、、、、、ＰＣＴ／ＵＳ９３１０４６２４−−− −＾＠＊に、、締＾Ｈ・　ＰＣＴ／ＵＳ　９３ノ０４６２４フロントページの続 き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｑ　１１０４　６ ８０７−４Ｂ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　７０５５−２Ｊ３３１５３１　Ａ　７０５５−２Ｊ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ 、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、 　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ。

ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ ＦＩ （７２）発明者　ブカラ　リチャード　ジェイアメリカ合衆国　ニューヨーク州 　１００２１ニユーヨーク　イースト　シックスティサード　ストリート５０３ 　アパートメント　３３−０ （７２）発明者　スコルニク　ニドワード　ワイアメリカ合衆国　ニューヨーク 州　１００２４ニユーヨーク　ウェスト　エイティナインス　ストリート　２０ １

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原を抗原に対し変更された免疫応答を誘発するのに充分な量のアドバンス トグリコシル化最終生成物またはアドバンストグリコシル化最終生成物を生成す る化合物と反応させることを特徴とする抗原に対し変更された免疫応答を誘発す る方法。
2. ２．その反応か抗原のエピトープ領域の抗原性を増大する請求の範囲第１項に記 載の方法。
3. ３．その反応が抗原のエピトープ領域の抗原性を低下する請求の範囲第１項に記 載の方法。
4. ４．抗原に対しＡＧＥ　を生成するように反応できる部分を含むように抗原の抗 原性を変更することを更に含む請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．抗原に対しＡＧＥ　を生成するように反応できる部分かリシン、アルギニン 、ヒスチジンおよびシステインからなる群から選ばれた少なくとも一員である請 求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．発現後のポリペプチド中に請求の範囲節５項に記載の群から選ばれた少なく とも一員を含むように、ポリペプチドをコードする発現配列を修飾し、修飾ポリ ペプチドを発現し、そして 修飾ポリペプチドを前記ポリペプチドに対し変更された免疫応答を誘発するのに 有効な量のＡＧＥ　またはＡＧＥ　を生成する化合物と反応させることを特徴と するポリペプチドに対する免疫応答を変更する方法。
7. ７．抗原分子のエピトープを認識する抗体であって、前記抗原分子が抗原の抗原 性を変更するのに有効な量のアドバンストグリコシル化最終生成物またはアドバ ンストグリコシル化最終生成物を生成する化合物と反応させられており、前記エ ピトープがこのような反応の不在下で抗体により認識できないことを特徴とする 抗体。
8. ８．ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラ抗体である請求の範 囲第７項に記載の抗体。
9. ９．少なくとも一つのエピトープを有し、かつ抗原分子に反応または共有結合さ れたアドバンストグリコシル化最終生成物を有する抗原分子を含む免疫原であっ て、 前記免疫原が前記アドバンストグリコシル化最終生成物への反応または結合後に 変更された抗原性を有することを特徴とする免疫原。
10. １０．抗原のエピトープ（そのエピトープは通常の条件下で免疫応答を実質的に 誘発しない）を免疫系により認識可能にする方法であって、抗原分子をＡＧＥ　 またはＡＧＥ　を生成する化合物と反応させて抗原−ＡＧＢ反応生成物を生成し 、そして 抗原−ＡＧＥ反応生成物を、細胞表面にＭＨＣ　を有する抗原提示細胞と合わせ ることを特徴とする抗原のエピトープを免疫系により認識可能にする方法。
11. １１．（ａ）細胞表面に主要組織適合遺伝子複合体を有する抗原提示細胞と、（ ｂ）抗原提示細胞のＭＨＣ　に関係して提示されたエピトープを含み、かつエピ トープまたはエピトープ以外の部位に結合または反応したＡＧＥ　またはＡＧＢ 　を生成する化合物を有する抗原 とを含むことを特徴とする抗原提示複合体。
12. １２．抗原に結合されたＡＧＥ　反応生成物を含む免疫源であって、前記抗原− ＡＧＢ反応生成物が請求の範囲第７項または第８項に記載の抗体により認識され るエピトープを有することを特徴とする免疫原。
13. １３．エピトープが抗原提示細胞、ＭＨＣ　および前記抗原−ＡＧＥ反応生成物 の反応後に認識可能である請求の範囲第１２項に記載の免疫原。
14. １４．哺乳類から採取された試料中のＴリンパ球のレベル、機能または活性の測 定方法であって、 （ａ）分子およびＡＧＥ　またはＡＧＥ　を生成する化合物と前記分子の反応生 成物から選ばれた抗原で抗原提示細胞をインキュベートし、（ｂ）前記抗原提示 細胞および抗原を前記哺乳類から採取されたＴリンパ球と合わせ、そして （ｃ）前記Ｔリンパ球のレベル、機能または活性を標準と比較することを特徴と する測定方法。
15. １５．ＡＧＥ−修飾抗原を認識するＴリンパ球の産生方法であって、哺乳類にＴ リンパ球初回免疫有効量の前記ＡＧＥ−修飾抗原を投与し、そして前記初回免疫 されたＴリンパ球を回収することを特徴とするＴリンパ球の産生方法。
16. １６．医薬上許される担体と組み合わせて、抗原の抗原性を変更するのに有効な 量のアドバンストグリコシル化最終生成物またはアドバンストグリコシル化最終 生成物を生成する化合物で処理された抗原分子を含む免疫原を含むことを特徴と する医薬組成物。
17. １７．医薬上許される担体と組み合わせて、請求の範囲第７項に記載の抗体を含 むことを特徴とする医薬組成物。
18. １８．請求の範囲第１５項に記載のＡＧＥ−修飾抗原を認識するように初回免疫 されているＴリンパ球を含むことを特徴とする生物学的組成物。
19. １９．感染症、自己免疫疾患または癌の治療または予防を要する哺乳類患者の感 染症、自己免疫疾患または癌の治療または予防方法であって、抗原に対する免疫 応答を変更するのに有効な量のアドバンストグリコシル化最終生成物またはアド バンストグリコシル化最終生成物を生成する化合物と反応した抗原分子を含む有 効量の免疫原を前記患者に投与し、前記免疫原を前記感染症、自己免疫疾患また は癌を治療または予防するのに有効な量で投与することを特徴とする治療または 予防方法。
20. ２０．感染症、自己免疫疾患または癌の治療または予防を要する哺乳類患者の感 染症、自己免疫疾患または癌の治療または予防方法であって、抗原に対する免疫 応答を変更するのに有効な量のアドバンストグリコシル化最終生成物またはアド バンストグリコシル化最終生成物を生成する化合物と反応した抗原を認識する有 効量の抗体を前記患者に投与し、前記抗体を前記感染症、自己免疫疾患または癌 を治療または予防するのに有効な量で投与することを特徴とする治療または予防 方法。
21. ２１．感染症、自己免疫疾患または癌の治療または予防を要する哺乳類患者の感 染症、自己免疫疾患または癌の治療または予防方法であって、前記患者に有効量 の抗原を認識するように産生されたＴリンパ球または前記抗原を認識する抗体を 投与し、 前記抗原を、抗原に対する免疫応答を変更するのに有効な量のアドバンストグリ コシル化最終生成物またはアドバンストグリコシル化最終生成物を生成する化合 物と反応させ、 前記Ｔリンパ球を、前記感染症、自己免疫疾患または癌を治療または予防するの に有効な量で投与することを特徴とする治療または予防方法。
22. ２２．変更された免疫原性を示す免疫原の調製方法であって、抗原に前記の変更 された免疫原性を示させるのに有効である量のアドバンストグリコシル化最終生 成物またはアドバンストグリコシル化最終生成物を生成する化合物と抗原とを合 わせることを特徴とする免疫原の調製方法。
23. ２３．腫瘍の治療を要する哺乳類の腫瘍の治療方法であって、マクロファージお よび／またはＴリンパ球を腫瘍調節サイトカインを分泌させるのに充分な量のＡ ＧＥ−修飾タンパク質を哺乳類に投与することを特徴とする哺乳類の腫瘍の治療 方法。
24. ２４．ＡＧＥ−リガンドヘのＴリンパ球の特異的結合を増大する化合物で処理し た有効量のＴリンパ球を前記哺乳類に投与することを更に含む請求の範囲第２３ 項に記載の方法。
25. ２５．Ｔリンパ球を、腫瘍増殖を変調するのに充分な量のＩＦＮ　を分泌するの に充分な量で投与する請求の範囲第２３項に記載の方法。
26. ２６．哺乳類中に存在するアドバンストグリコシル化最終生成物を除去するため の哺乳類の治療方法であって、Ｔリンパ球をＡＧＥ−リガンドヘの前記Ｔリンパ 球の結合能を高める化合物と合わせ、そしてＴリンパ球を前記哺乳類に投与する ことを特徴とする治療方法。