JP2002531421A - ニコチン中毒の治療及び予防のためのハプテン−キャリア複合体 - Google Patents

ニコチン中毒の治療及び予防のためのハプテン−キャリア複合体

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Abstract

(57)【要約】 新規なハプテン-キャリア複合体は、インビボでニコチンに特異的に結合する抗体の産生を誘導する能力がある。これらの複合体は、免疫原性のキャリアタンパク質に複合化したニコチンハプテンを含む。この新規な複合体は、もともと(S)-(-)状態にあるニコチンのキラリティーを保存しており、さらに安定性が良好である。この複合体は、ニコチン中毒を予防したり治療したりするのに用いられる能動免疫のためのワクチンを処方するのに有用である。このニコチンハプテン-キャリア複合体に応答して生じる抗体は、受動免疫に用いられる。これらの抗体はニコチン中毒の予防及び治療のために投与される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明はニコチン中毒の治療及び予防に関する。特に本発明は、抗体の生産を
誘導する能力のある新規のハプテン-キャリア複合体に関する。このような抗体
はニコチンに特異的に結合する能力がある。さらに本発明は、薬学的に許容され
る製剤でニコチン-キャリア複合体を投与することによる、ニコチン中毒の予防
または治療を構想している。また本発明は、ニコチン中毒の予防及び治療を行う
ためのハプテン-キャリア複合体に応答して生じる抗体の使用も企図している。
【０００２】発明の背景 紙巻タバコ、葉巻、及びパイプの喫煙は米国及び世界中で広まっている問題で
ある。有煙タバコも無煙タバコも、既知の中毒性物質のニコチンが多い。ニコチ
ンはタバコ植物から誘導されるアルカロイドであって、それが喫煙の精神活性と
中毒作用の原因である。ニコチンは一重結合によって一体に結合した二個の環、
即ち芳香族の6員環(ピリジン)と脂肪族の5員環(ピロリジン)とから構成されてい
る。ピロリジンはN-メチル化されていて、その2位炭素からピリジンの3位炭素に
結合している。したがって2位の炭素はキラルであり、二個の環を結合する一重
結合の周りで事実上自由に回転する。2位の炭素の絶対的な配置はSであると立証
されている。しがたって天然のニコチンの配置は(S)-(-)-ニコチンである。
【０００３】 ニコチンの利用は、紙巻タバコ、葉巻、パイプ及び無煙タバコがたやすく入手
できるため広範に広まっている。米国保健社会福祉省（U.S. Department of Hea
lth and Human Services）によると紙巻タバコの喫煙は、米国内の予防可能な死
の単独首位の原因である。MacGinnisら、J. Am. Med. Assoc., 270, 2207-2211
(1993)も参照のこと。間接的に煙に暴露されることにより、喘息の悪化を含む健
康への深刻な悪影響があることが報告されている。
【０００４】 ニコチンの中毒性が周知であっても、紙巻タバコの喫煙は普及している。血液
中のニコチンレベルのピークは約25〜50ナノグラム／mlであり、紙巻タバコを喫
煙して10〜15分以内に達する。ヒトでは紙巻タバコを喫煙することによって肺か
ら心臓に急速にニコチンが送達されるため、静脈内のニコチン濃度よりも10倍も
高い濃度に動脈内では至る(Henningfield (1993) Drug Alcohol Depend. 33: 23
-29参照)。これによって結果的に、高濃度の動脈内のニコチンが脳に急速に送達
される。一旦ニコチンが血液-脳関門を通過すると、呼吸、心拍数の維持、記憶
、覚醒及び筋肉動作に関与する神経伝達物質のアセチルコリンにより通常は活性
化されるコリン作動性受容体にニコチンが結合することを示唆している。ニコチ
ンがこれらの受容体に結合すると、ドーパミンのような他の神経伝達物質の放出
を誘起することによって正常な脳機能に影響が与えられる場合がある。ドーパミ
ンは、脳の情緒、やる気、及び喜びの感情に関連する領域で見られる。ニコチン
に対する、またはニコチンの他の取り込みに対するタバコ常用者の中毒に応答す
る神経伝達物質、特にドーパミンの放出である。
【０００５】 健康に対する喫煙の悪影響が深刻であるため、喫煙者はやめようとすることが
よくある。しかしながらニコチンの中毒性の特性と紙巻タバコの入手容易性のた
め、ニコチンに対する持続的な依存性とやめようとする人の失敗率の高さとが増
大する。離脱症状は不快で、喫煙によって開放される。
【０００６】 ニコチン中毒に対しては多くの治療法が開発されているが、大部分は効果的で
ない。二つの最も一般的な治療法は、ニコチンの経皮貼着剤とニコチン入りのチ
ューインガムが残っている。これらの治療法は「ニコチン置換法」(NRT)と言わ
れ、利用者が喫煙から以前に受け入れたニコチンの量を置き換え、ニコチンから
利用者を引き離すように作用する。しかしながらある程度の引き戻しがこのタイ
プの治療法には見られる。特に、血流へのニコチンの透過性が低く、そのため喫
煙の要求が大きくなる。このような口のヒリヒリ感、顎の苦痛、むかつきなどの
問題はニコチンチューインガムの使用と関連していた。皮膚の刺激、睡眠障害、
及びいらいら感などの問題はニコチンの経皮貼着剤の使用と関連していた。
【０００７】 したがってニコチン中毒を治療する別の方法が必要とされている。文献はこの
必要性を認識していて、ニコチン中毒を治療するための方法を提供しようとする
試みがいくつかあった。その方法の一つは、ニコチンに応答して生じる抗体の投
与を含むものである。しかしながらハプテンといわれる低分子量の物質は、宿主
動物において免疫応答を誘発できないことがわかっている。ニコチンも例外では
なく、小さな分子であるため免疫原性はない。ハプテンに対する抗体応答性を誘
導するために、それは通常キャリアタンパク質に共有結合しており、その複合体
はハプテンを認識する抗体の生産を誘導できる。
【０００８】 例えばコチニン4'-カルボン酸はキーホール・リンペット・ヘモシアニン(KLH)
に共有結合している場合、ニコチン代謝物のコチニンに対する抗体を生じさせる
ために用いられた。これらの抗体は、生理液中のコチニンの存在を検出するため
に用いられた。Bjerkeら、J. Immunol. Methods, 96, 239-246 (1987)参照。
【０００９】 他のニコチン抗体は、カストロら(Castroら)(Eur. J. Biochem., 104, 331-34
0 (1980))によって調製された。カストロらは、ニコチンの6位でリンカーを介し
て複合化させたキャリアタンパク質を持つ、ウシ血清アルブミン(BSA)に複合化
させたニコチンハプテンを調製した。カストロらは別のBSAのニコチン複合体を
調製し、抗体を生じさせるため哺乳動物に注入した。別の刊行物、Castroら、Bi
ochem. Biophys. Res. Commun. 67, 583-589 (1975)では二種のニコチン-アルブ
ミン複合体、即ちN-サクシニル-6-アミノ-(±)-ニコチン-BSAと6-(σ-アミノカ
プラミド)-(±)-ニコチン-BSAとを開示している。この1975年の刊行物において
はまた、カストロらはニコチンキャリア複合体である6-(σ-アミノカプラミド)-
(±)-ニコチン-BSAに対する抗体を用い、それによって血液と尿に含まれるニコ
チンのレベルを検出した。Res. Commun Chem. Path. Pharm. 51, 393-404 (1986
)参照。
【００１０】 スバインら(Swainら)(WO 98/14216)は、ハプテンがニコチンの1,2,4,5,6また
は1'位で複合化しているニコチンキャリア複合体を開示している。ヒエダら(Hie
da)は、キーホール・リンペット・ヘモシアニンに結合させた6-(カルボキシメチ
ルウレイド)-(±)-ニコチンを用いて動物を免疫して、ニコチンに特異的な抗体
を産生させたことを示した。J. Pharm. and Exper. Thera. 283, 1076-1081 (19
97)。ランゴーンら(Langoneら)は、Biochemistry, 12, 5025-5030に参照される
ようにハプテン誘導体のO-サクシニル-3'-ヒドロキシメチル-ニコチンを調製し
、ラジオイムノアッセイ法でこのハプテン-キャリア複合体に対する抗体を用い
た。Methods in Enzymology, 84, 628-635 (1982)参照。ランゴーン（Langone）
によって合成された複合体は加水分解されやすい。さらにアバドら(Abadら)はAn
al. Chem., 65, 3227-3231 (1993)において、3'-(ヒドロキシメチル)ニコチンヘ
ミサクシネートをウシ血清アルブミンに複合化させ、ELISAアッセイ法において
紙巻きタバコの濃縮煙におけるニコチン含量を測定できるよう、ニコチンに対す
る抗体を生産することについて記載している。
【００１１】 したがって従来技術は、ニコチンハプテンのキラル中心を保存していて、かつ
ニコチンエピトープの性質を保存する様式でキャリアにそのハプテンを結合させ
る安定なニコチン-キャリア複合体を開示していない。さらにこの技術は、その
ような複合体を用いることによってニコチン中毒を予防する方法及び治療する方
法について開示も示唆もしていない。シーマン(Seeman)はHeterocycles, 22, 16
5-193 (1984)において、配座の解析及びニコチンの化学反応性の研究の結果を開
示している。
【００１２】発明の概要 ニコチン中毒を治療するためのより効果的な方法に対する要求に応じて本発明
の一目的は、安定で天然の(S)-(-)配座をとったニコチンを含み、ニコチンエピ
トープの性質とニコチン分子の二個の環の相対的な方向とを保存するニコチン-
キャリア結合を用いた新規なニコチン-キャリア複合体を提供することである。
ニコチンの二つの環とそれらの相対的な方向が、溶液中でニコチンの抗体に認識
されるために必須であると考えられている。このような複合体は、ニコチンに特
異的に結合できる抗体を産生させるのを刺激する能力がある。本発明の複合体を
用いて本発明者らは、哺乳動物における血清中のニコチンレベルを高めるととも
に脳のニコチンレベルを減少させた。さらに本発明の複合体を用いて本発明者ら
は、ニコチンが誘導する血圧の変化及び運動の影響も抑制した。
【００１３】 本発明の別の目的では、ニコチンに対する中毒性を示す患者に本発明の複合体
を投与することにより、その患者で抗-ニコチン抗体を生じさせてニコチン中毒
を治療する方法を提供する。こうしてその患者が喫煙する(または噛みタバコを
飲む)場合、これらの製品からのニコチンが血液中で抗-ニコチン抗体と結合して
ニコチンが血液-脳関門を通過するのを抑制し、したがってニコチン-中毒の原因
となるニコチンが誘導する脳内化学物質の変化を減少させる。これに関して、ニ
コチン-キャリア複合体が天然のニコチン分子を認識できる抗体の生産を誘導す
ることが重要である。上記に記載したように本発明の新規なニコチン-キャリア
複合体は、天然に発生するニコチンのキラリティーとエピトープを保存している
。
【００１４】 ニコチン複合体および該複合体に応答して産生される抗体が、哺乳動物によっ
て摂取されたニコチンの効果をどのようにして阻害するかに関する任意の理論に
本発明者らは拘束されるものではない。ニコチンが血液脳関門を通過するのを阻
止することに加えてこの抗体は、簡単な立体妨害によりニコチンが末梢神経系の
他の受容体に結合するのも阻止できる。
【００１５】 これらの目的は、次の化学式のハプテン-キャリア複合体を提供することによ
って達成できる：
【化３】 この式中、mは1〜2500であり、nは0〜12であり、yは1〜12であり、XはNH-CO、CO
-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、及びS-Sからなる群より選
択され、YはNH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、及び
S-Sからなる群より選択され、且つ-(CH2)n-X-(CH2)y-Y-部分は3'、4'または5'位
に結合している。このハプテン-キャリア複合体の好ましい態様ではmが11〜17で
あり、nが1であり、yが2であり、XがNH-COであり、YがCO-NHであって、キャリア
タンパク質がエキソプロテインAであり、且つ-(CH2)n-X-(CH2)y-Y-部分が3'位に
結合している。ハプテン-キャリア複合体の別の好ましい態様では、mが11〜17で
あり、nが1であり、yが2であり、XがNH-COであり、YがCO-NHであって、キャリア
タンパク質がエキソプロテインAであり、且つ前記-(CH2)n-X-(CH2)y-Y-部分が4'
位に結合している。ハプテン-キャリア複合体のさらに好ましい態様では、mが11
〜17であり、nが1であり、yが2であり、XがNH-COであり、YがCO-NHであって、キ
ャリアタンパク質がエキソプロテインAであり、且つ-(CH2)n-X-(CH2)y-Y-が5'位
に結合している。さらに好ましい態様においてmは1〜20及び1〜200からなる群よ
り選択される。
【００１６】 上記の目的は、次の化学式(III)のハプテン-キャリア複合体を提供することに
よっても達成できる：
【化４】 この式中、nは0〜12であり、jは1〜1000であり、kは1〜20であり、且つEはアミ
ノ酸-含有マトリックスである。好ましい態様においてそのマトリックスはポリ-
L-グルタミン酸である。
【００１７】 この目的は、化学式(I)のハプテン-キャリア複合体に応答して産生される抗体
を提供することによっても達成できる。さらに別の態様においてこの抗体は機能
的断片である。好ましい態様では、その抗体はモノクローナル抗体である。本発
明のさらに別の態様ではその抗体はポリクローナル抗体である。
【００１８】 この目的は、化学式(III)のハプテン-キャリア複合体に応答して産生される抗
体を提供することによっても達成できる。付加的な態様においてこの抗体は機能
的断片である。好ましい態様において、その抗体はモノクローナル抗体である。
本発明のさらに別の態様ではその抗体はポリクローナル抗体である。
【００１９】 この目的は、ニコチン中毒の治療を必要としている患者において、化学式(I)
または(III)のハプテン-キャリア複合体の治療的に有効な量を投与することを含
む、ニコチン中毒を治療または予防する方法を提供することによって達成できる
。またはこの目的は、ニコチン中毒の治療を必要としている患者において、化学
式(I)または(III)のハプテン-キャリア複合体に応答して生じた抗体の治療的に
有効な量を投与することを含む、ニコチン中毒を治療または予防する方法を提供
することによって達成できる。
【００２０】 さらにこの目的は、化学式(I)または化学式(III)のハプテンキャリア複合体を
含むワクチン組成物を提供することによって達成できる。そのうえこのワクチン
は、ニコチン中毒を治療するためのさらに別の治療用化合物をさらに含んでいて
もよい。
【００２１】 またこの目的は、化学式(I)または(III)のハプテン-キャリア複合体を用いて
宿主哺乳動物を免疫することを含む、抗体を生産する方法を提供することによっ
ても達成できる。好ましい態様において、生産された抗体はモノクローナル抗体
である。別の態様ではその抗体はポリクローナル抗体である。
【００２２】 さらなる目的は、化学式(I)または化学式(III)のハプテン-キャリア複合体に
応答して生じる抗体を含む、試料中のニコチンの存在を検出するためのキットを
提供することによって達成できる。
【００２３】 これらの目的及び当業者に明かな他の目的は、詳細な説明として下記に記載さ
れた発明及び添付の特許請求の範囲によって達成された。
【００２４】 好ましい態様の詳細な説明 本発明は、ニコチンに対する中毒を治療するためのニコチンハプテン-キャリ
ア複合体を提供する。このニコチンハプテン-キャリア複合体は化学式(I)で表さ
れる：
【化５】 この式中、mは1〜2500であり、nは0〜12であり、yは1〜12であり、XはNH-CO、CO
-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、及びS-Sからなる群より選
択され、YはNH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、及び
S-Sからなる群より選択され、キャリアタンパク質は任意の適当な免疫原性のタ
ンパク質またはポリペプチドである。好ましくはキャリアタンパク質はT-細胞の
エピトープを含んでいてもよく、且つ-(CH2)n-X-(CH2)y-Y-部分はニコチン分子
の3'、4'または5'位に結合している。
【００２５】 化学式(I)においてmは好ましくは1〜200である。別の好ましい態様ではmは1〜
20である。特に好ましい態様ではmは11〜17である。別の好ましい態様ではXはNH
-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、及びCO-NH-NH-COからなる群より
選択される。
【００２６】 mが1以上である場合、括弧内の部分はキャリアタンパク質の付着部の異なるポ
イントにm回付着する。例えばm＝2である場合、化学式(I)は次のようになると考
えられる。
【化６】
【００２７】 抗体はニコチン自体に応答して形成できないため、本発明の発明者らは、ニコ
チンの3'、4'または5'位で誘導されるニコチンハプテンを開発した。この部分が
キャリアタンパク質に結合することでハプテンキャリア複合体が得られ、それが
適当な宿主哺乳動物に注入されるとニコチン部分に対する抗体を生じさせる。こ
れに関連して、哺乳動物に投与された場合に抗体の生産を誘導できるハプテンキ
ャリア複合体を含む薬学的組成物であるためには、キャリアタンパク質が免疫原
性でなくてはならない。好ましくはそれはT-細胞-エピトープを含むと考えられ
る。したがってキャリアタンパク質がニコチンハプテンに複合化して続いて哺乳
動物に投与されると、該哺乳動物はニコチンハプテンに応答して抗体を産生、即
ち「生成」する。
【００２８】 ハプテン及び誘導 本発明で用いられる「ハプテン」という用語は、それ自体では免疫応答を誘発
する能力はないが、キャリア分子に一旦結合すると免疫応答を誘発できる低分子
量の有機化合物を意味する。好ましい態様においてこのハプテンはリンカーを介
してキャリアに結合する。本発明のハプテンはニコチン誘導体である。このニコ
チンハプテンは反応性の官能基を含んでいて、それにキャリアが直接結合しても
よいし、リンカーを介して、マトリックスを介して、またはリンカーとマトリッ
クスとを介して結合してもよい。好ましくはニコチンハプテンは、アミド結合ま
たはジスルフィド結合を介してキャリアタンパク質に結合する。アミド及びジス
ルフィド結合は、望ましい安定性を備えている。本発明のハプテン-キャリア複
合体はワクチンとして用いられると考えられるため、ワクチンの保存寿命を延長
させるためにその複合体が安定であることが重要である。
【００２９】 本発明の好ましい態様ではこのニコチンハプテンは次の化学式(II)によって表
される：
【化７】 この式中、nは0〜12であり、ZはNH2、COOH、CHOまたはSHであり、且つ-(CH2)n-Z
は3'、4'または5'位に結合できる。Z部分はキャリアに直接的かまたはリンカー
を介して結合できる。このキャリア-ハプテン複合体は、患者または動物の体内
に導入されると抗体の産生を誘導すると考えられる。
【００３０】 特に好ましい態様において、ニコチンハプテンは次の化学式(3'-アミノメチル
ニコチン)である。
【化８】
【００３１】 1.直接的複合体 「直接的複合体」を作成するためには、一個のニコチンハプテンをリンカーを
用いて、またはリンカーを用いないでキャリアに直接的に結合させる。例えば一
個のニコチンハプテンは、キャリアの持つそれぞれ利用可能なアミノ基に結合で
きる。ホモ二官能基性のクロスリンカーまたはヘテロ二官能基性のクロスリンカ
ーを用いてキャリアタンパク質にハプテンを直接的に複合化する一般的な方法は
、例えばG. T. HermansonによってBioconjugate Techniques, Academic Press (
1996)において、またDickとBeurretによってConjugate Vaccines. Contribu. Mi
crobiol. Immunol., Karger, Basal (1989) vol. 10, 48-114において記載され
ている。二官能基性のクロスリンカーを用いて直接的に複合化する場合、タンパ
ク質に対するハプテンのモル比は、特殊な複合化化学があるためタンパク質上の
利用可能な官能基の数によって制限を受ける。例えばリジン部分をn数所有する
キャリアタンパク質を用いると、リンカーのカルボキシル基と反応するのに利用
できる一級アミン(末端アミノ基を含む)は立体的にn＋1個であると考えられる。
このようにこの直接的複合化法を利用するとその生成物は、形成されたn＋1個の
アミド結合を持つ、即ち最大n＋1個のハプテンが結合されると限定される。
【００３２】 当業者は、ニコチンハプテンをキャリアタンパク質に複合化させるために用い
られる反応体の濃度とキャリアタンパク質の特性に依存して、キャリアに対する
ハプテンの比率が変化しうることを認識していると思われる。またニコチン-キ
ャリア複合体の得られる調製物の範囲で、それぞれ個々の複合体のハプテン／キ
ャリアの比率は変化しうる。例えばエキソプロテインAは、理論的にはハプテン
と複合化するのに利用できる15個のアミンを持っている。しかしながら本発明者
らは、3'アミノメチルサクシニル-ニコチンがこのタンパク質に複合化する場合
、一個の複合体調製物において11〜17個の範囲のニコチンハプテンがそれぞれエ
キソプロテインAキャリアに結合されていると決定した。この範囲は、ガス濾過
クロマトグラフィーを用い、260nmでのUV吸収の増加を測定することにより実験
的に決定した。ニコチンハプテンがキャリア上の非-アミン部分に結合できるた
め、17個のニコチンがいくつかのキャリアに結合していた。ハプテンが結合でき
る非-アミン部分の例には-SH及び-OH部分が挙げられるが、これらに限定するわ
けではない。しかしながらこれらの副反応の発生率は低い。
【００３３】 2.マトリックス複合体 直接的複合化を利用してキャリアに結合できるハプテンの数の制限を回避する
ために、アミノ酸「マトリックス」を用いることができる。「マトリックス」と
いう用語は、アミノ酸、ペプチド、ジペプチド、またはオリゴマーのポリペプチ
ドやポリマーのポリペプチドを含むポリペプチドを意味する。マトリックスはま
た、線状または分枝状のポリペプチドであってもよい。マトリックスを形成する
ために利用できるアミノ酸の例には、アスパラギン酸、リジン、システイン、及
びL-グルタミン酸が含まれるが、これらに限定するわけではない。このようなマ
トリックス材料は、ポリ-L-グルタミン酸のようなポリペプチドに配合するとよ
い。システインのようなアミノ酸を用いる場合、チオール基を保護することでハ
プテンがアミノ酸のカルボキシル基に結合することが可能になる。当業者は、保
護基の種類、及びアミノ酸官能基に保護基を結合する手段について熟知している
。論文についてはGreen、有機化学における保護基（PROTECTIVE GROUPS IN ORGA
NIC CHEMISTRY）、John Wiley & Sons, New York, 1991を参照のこと。
【００３４】 ふさわしいマトリックスは適当な官能基を持っていて、二個またはそれ以上の
ハプテンをロードしている。従って本発明の別の好ましい態様では、ニコチン-
置換されたマトリックスはキャリアタンパク質に複合化し、そのハプテン-キャ
リア複合体におけるキャリア分子に対するハプテンの比率を増加させる。このマ
トリックスは二つの役割を果たしており、一番目は多数のハプテンの支持体とし
ての役割であって、また二番目はクロスリンカーとしての役割である。キャリア
タンパク質に複合化させたニコチン置換のマトリックスは次の化学式(III)によ
って表される：
【化９】 この式中nは0〜12であり、jは1〜1000であり、kは1〜20であり、Eはハプテンが
結合できるアミノ酸含有マトリックスであり、キャリアタンパク質はT-細胞エピ
トープを含む任意の適当なタンパク質またはポリペプチドである。アミノ酸含有
マトリックスEは、アミノ酸、ペプチド、ジペプチド、またはポリマーのポリペ
プチドだけでなくオリゴマーのポリペプチドを含むポリペプチドでありうる。こ
のマトリックスは一個または複数のアミノ酸を含み、それにはアスパラギン酸、
リジン、システイン、及びポリ-L-グルタミン酸が含まれるが、これらに限定す
るわけではない。好ましい態様ではjは1〜200であり、別の好ましい態様ではjは
1〜4である。
【００３５】 マトリックス-キャリア複合体は、多重結合の「格子体」を形成する能力があ
る。このような格子体は下記の図で表される。「格子体」という用語は共有結合
した複合体を示すために用いられ、それには多数のマトリックス、ハプテン、リ
ンカー及びキャリアタンパク質が含まれ、その全ては共に共有結合している。ニ
コチン-置換されたマトリックスがキャリアと複合化するのに利用可能な多数の
ニコチン部分を含んでいるため、多数のキャリアを含む格子体、及び多数のニコ
チン-置換されたマトリックスが形成できる。このような格子体の部分の簡単な
表示は次のように表される。
【化１０】
【００３６】 当業者は、本発明に係る格子体は化学式(III)のハプテンキャリア複合体を含
むことを認識していると思われる。
【００３７】 マトリックスを用いるこの複合化法は、タンパク質が持つ複合化に利用できる
官能基の数にかかわらず、タンパク質に対するハプテンのモル比について自由度
と調節を提供する。このことは、特定のキャリアタンパク質を用いた場合、また
複合体の高い免疫原性を達成するために適切な比を得る必要がある場合に特に有
用である。マトリックスを用いる場合には利用する必要はないが、そのようなリ
ンカーを用いるとよい。この態様でリンカーを用いるためには、ニコチン置換さ
れたマトリックスを活性なリンカー化合物と反応させる。例えば、ADH、即ちア
ジピン酸ジヒドラジドがマトリックス複合体とのリンカーとして利用できる。
【００３８】 キャリアタンパク質 一旦ニコチンハプテンが調製されたら、それを、ニコチンキャリア複合体に対
する抗体を生じさせるべく用いられるキャリアタンパク質に複合化させる。本発
明のニコチンキャリア複合体で用いられるキャリアタンパク質は化学式(I)及び(
III)における次の記号で表され、任意の適当な免疫原性のタンパク質またはポリ
ペプチドを包含している。
【化１１】 「免疫原性」分子とは免疫応答を誘導する能力のある分子である。好ましくはキ
ャリアタンパク質は、T-細胞エピトープを含む。また分枝したペプチドであるMA
P、即ち多価-抗原性ペプチドも、「キャリアタンパク質」の表示に包含される。
MAPを用いることによって、多数の分岐したアミノ酸残基があるため、ハプテン
の密度と結合価が最大になる。MAPを形成するのに利用できるアミノ酸の例には
リジンが挙げられるが、これに限定するわけではない。
【００３９】 本発明のキャリアタンパク質は、患者のT細胞を刺激する能力のある少なくと
も一つのT細胞エピトープを備えた分子を含み、それは続いてB細胞を誘導するこ
とで完全なハプテン-キャリア複合体分子に対する抗体を産生する。記載されて
いる本発明で用いられるような「エピトープ」という用語には、抗体分子と特異
的に相互作用するために応答できる抗原が持つ任意の決定基が含まれる。エピト
ープの決定基は通常、アミノ酸や糖の側鎖のような分子の化学的に活性な表面配
置からなり、特殊な電荷特性はもちろん、特殊な三次元構造の特徴も備えている
。免疫原性の性質を備えるためには、タンパク質またはポリペプチドはT-細胞を
刺激する能力を持つ必要があると考えられている。しかしながらT-細胞のエピト
ープを欠如するキャリアタンパク質も免疫原性を持つことがありうる。
【００４０】 免疫原性の応答を強く誘導することがわかっているキャリアタンパク質を選択
することによって、種々の患者の集団が本発明のハプテン-キャリア複合体によ
って治療することが可能になる。キャリアタンパク質は、ワクチンに対する免疫
応答を強く誘導できるように充分に異質でなくてならない。通常用いられるキャ
リアタンパク質は好ましくは、共有結合で結合したハプテンに免疫原性を付与す
ることができる大きな分子である。特に好ましいキャリアタンパク質は、本質的
に高い免疫原性を持つタンパク質である。したがって、免疫原性の程度が高く、
かつハプテンに対する抗体産生を最大にできるキャリアタンパク質が非常に望ま
しい。
【００４１】 ウシ血清アルブミン(BSA)もキーホール・リンペット・ヘモシアニン(KLH)も、
動物を用いた実験で複合体ワクチンを開発する際にキャリアとして一般的に用い
られてきた。しかしながらこれらのタンパク質はヒトに利用するにはふさわしく
ないと考えられる。治療用複合体ワクチンの調製で用いられてきたタンパク質と
しては、多くの病原性の細菌の毒素やそれらのトキソイドが挙げられるがこれら
に限定されるわけではない。例としては、ジフテリアおよび破傷風毒素ならびに
医学的に許容される相当するトキソイドが含まれる。他の候補も交差反応物質(C
RM)といわれる細菌の毒素と抗原原性が類似したタンパク質である。
【００４２】 ニコチン複合体の薬学的組成物を調製する場合には、組換えシュードモナス・
アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）のエキソプロテインA(rEPA)がその
構造及び生物学的作用について十分に特徴が明らかにされているため、それをキ
ャリアタンパク質として用いることができる。さらにこの組換えタンパク質は、
米国国立衛生研究所（National Institute of Health）及び本発明の発明者らに
よってスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のカプセル
化多糖複合体ワクチンとしてヒトにうまくまた安全に利用されてきた。Fattonら
、Infect Immun. 61 1023-1032 (1993)。このタンパク質は、天然の外毒素の内
因性の酵素活性が553位のアミノ酸の欠失により減じられるために、適当なタン
パク質キャリアとして同定されてきた。結果的にrEPAは、天然の外毒素A(ETA)と
同じ免疫学的プロフィールを呈するが、天然のETAの肝臓毒性の特徴は持ってい
ない。この適用で用いられるように「エキソプロテインA」とは、変形した非肝
臓毒性のETAを指す。このようなエキソプロテインAの一例は、553位にアミノ酸
の欠失がある。
【００４３】 ハプテンのキャリアタンパク質への複合化 ハプテンのような小さな分子にキャリアが結合、即ち複合化するのを容易化す
るために利用できる非常にたくさんの官能基がある。これらには、カルボン酸類
、無水物類、混成無水物類、アシルハライド類、アシルアジド類、アルキルハラ
イド類、N-マレイミド類、イミノエステル類、イソシアネート類、アミン類、チ
オール類、及びイソチオシアネート類、並びに他の当業者に既知の部分のような
機能的な部分が含まれる。これらの部分は、タンパク質分子の反応基と共有結合
を形成できる。用いた機能的部分に応じて反応基は、反応して結果的にアミド、
アミン、チオエーテル、アミジンウレアまたはチオウレア結合を形成する、キャ
リアタンパク質または修飾したキャリアタンパク質分子上に存在するリジン残基
のεアミノ基またはチオール基であってもよい。当業者は、他の適当な活性基及
び複合化法も利用できることを認識していると思われる。例えば、Wong、タンパ
ク質結合およびクロスリンクの化学（Chemistry of Protein Conjugation and C
ross-Linking）、CRC Press, Inc. (1991)参照。また、Hermanson、バイオ複合
化技術（BIOCONJUGATE TECHNIQUES）、Academic Press: 1996、ならびにDickお
よびBeurret、複合化ワクチン（Conjugate Vaccines.）、Cintrubu. Microbiol.
Immunol., Karger, Bassal (1989) vol. 10, 48-114も参照のこと。
【００４４】 線状のリンカー部分は、ハプテンをキャリアタンパク質に複合化させるには、
環状または分枝したリンカーよりも好ましい。好ましいリンカーはサクシニル部
分である。しかしながらリンカーは、線状部分はもちろん、環状構造であっても
よい。別の例のリンカーはADHである。
【００４５】 しがたって本発明のニコチンハプテン-キャリア複合体は、T細胞を刺激する能
力があってT細胞の増殖を誘導し、かつ特定のB細胞を活性化するメディエーター
を放出して免疫原性のハプテン-キャリア複合体に応答する抗体の生産を刺激で
きるハプテンキャリア複合体を得るために、一種または複数のハプテンをキャリ
アタンパク質と反応させることによって調製される。ハプテンキャリア複合体に
応答して生じるある種の抗体は、ハプテン-キャリア複合体のハプテン部分に特
異的であると考えられる。本発明は、ニコチン中毒を治療する際に用いられるハ
プテンとキャリアタンパク質とのさまざまな適当な組合せの使用を企図している
。
【００４６】 モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体 モノクローナル抗体を作成する方法は当技術分野で周知である。モノクローナ
ル抗体は、ニコチンハプテン-キャリア複合体を含む組成物をマウスに注入する
段階、続いて血清の試料を除去することによって抗体産生の存在を証明する段階
、B-リンパ球を入手するために脾臓を除去する段階、B-リンパ球を骨髄腫細胞と
融合してハイブリドーマを形成する段階、該ハイブリドーマをクローニングする
段階、ハプテン-キャリア複合体に対する抗体を生産する陽性クローンを選択す
る段階、抗原に対する抗体を生産するクローンを培養する段階、及びハイブリド
ーマ培養物から抗体を単離する段階により得られる。
【００４７】 モノクローナル抗体は、種々の充分に確立された方法によってハイブリドーマ
培養物から単離して精製できる。このような単離法には、プロテインAセファロ
ースを用いる親和性クロマトグラフィー、サイズ-排除クロマトグラフィー、及
びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Coliganの2.7.1〜2.7.12
頁及び2.9.1〜2.9.3頁参照。また、Bainesら、「イムノグロブリンG（IgG）の精
製（Purification of Immunoglobulin G (IgG)）」METHODS IN MOKECULAR BIOLO
GY, VOL. 10, 79〜104頁 (The Humana Press, Inc. 1992)も参照のこと。
【００４８】 またポリクローナル抗体を調製する方法も当技術分野で周知である。ポリクロ
ーナル抗体は当技術分野で標準的な方法によって調製される。ポリクローナル抗
体を調製するためには、動物に免疫原性の物質を注入し、注入した免疫原の非常
に多くのエピトープに対して誘導される抗体の混合物を含む抗体が富化した血清
を集める。抗体を産生させるのに適切な宿主の哺乳動物には、限定するわけでは
ないがヒト、ラット、マウス、ウサギ及びヤギが含まれる。
【００４９】 本発明によると、機能的な抗体断片も利用できる。この断片は、ペプシンまた
はパパインのような酵素を用いた消化及び／または化学的還元によるジスルフィ
ド結合の開裂を含む方法によって作成される。または本発明に含まれる抗体断片
は、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）、マルチプル・ペ
プチド・システムズ社（Multiple Peptide Systems）及び他社によって市販され
ている合成装置のような自動化ペプチド合成装置を用いて合成できるし、またそ
れらは当技術分野で周知の方法を用いて手作業で合成することも可能である。Ge
ysenら、J. Immunol. Methods 102: 259 (1978)参照。本発明に係るモノクロー
ナル抗体の重鎖及び軽鎖にある可変領域のアミノ酸配列の直接決定は、簡便な方
法を用いて行うことができる。
【００５０】 本発明に係る断片はFv断片であることができる。抗体のFv断片は、抗体の重鎖
の可変領域(Vh)と抗体の軽鎖の可変領域(Vl)から形成されている。抗体のタンパ
ク質分解によって、VhとVl領域が非-共有結合したままであり、抗原結合能を保
持している二重鎖のFv断片を生産できる。またFv断片は、重鎖と軽鎖の可変領域
がペプチドリンカーによって接続されている一本鎖の組換え抗体分子も含んでい
る。Skerraら、 Science, 240, 1038-41 (1988)参照。また本発明に係る抗体断
片は、無傷の抗体のFc断片を欠如したFab、Fab'、F(ab)2、及びF(ab')2も含んで
いる。
【００５１】 治療方法 ニコチンは血液脳関門を通過した後で多くの重要な効果を発揮するため、本発
明はニコチンが血液脳関門を通過するのを阻止する治療方法を含む。特定すると
、患者にニコチンハプテン-キャリア複合体を投与することによって、患者の血
流中にニコチンに対する抗体を生じさせることができる。または、治療を行うべ
き患者の身体の外部で、即ち適切な宿主哺乳動物において生じさせた抗-ニコチ
ン抗体を患者に投与することもできる。患者が喫煙するのであれば、該患者の血
液中のニコチンは循環する抗-ニコチン抗体に結合されてニコチンが脳に到達す
るのを抑制する。したがってその抗体は、脳内に生じたニコチンの肉体的及び精
神的作用を抑制できる。喫煙者はこれらの作用の減少または中断を実感できるた
め、彼／彼女は喫煙の欲望を喪失すると考えられる。患者が無煙タバコを常用し
ている場合も、本発明のニコチンハプテン-キャリア複合体を用いて免疫した後
で同じ治療効果が期待される。さらに本発明の複合体及び抗体は、末梢神経系を
刺激するニコチンの能力に影響を及ぼすことでその作用を発揮できる。
【００５２】 上記に記載したように、本発明の新規なニコチン-キャリア複合体はニコチン
分子のもともとのキラリティーと構造を保存している。特定するとこれらの複合
体のニコチン部分は、(S)-(-)型の立体配置をとっている。したがってこのよう
な複合体に応答して生産される抗体はもともとのニコチンの形態に特異的であっ
て、喫煙から吸入されたり無煙タバコから吸収されるニコチンに特異的に結合す
る場合、またこの吸い込んだニコチンの作用を阻害する場合に最も効果的である
と考えられる。さらに本発明の複合体は化学的に安定であり、安定性は保存寿命
の長いワクチンを製造するのに重要である。
【００５３】 本発明のワクチン組成物は、中毒の治療に有用な化合物または他の治療法と組
み合わせて利用するとよい。これには、限定するわけではないがZyban及びProza
cのような抗-抑制薬などの化合物の投与が含まれる。
【００５４】 1.ニコチンハプテン-キャリア複合体の投与 本発明の複合体は、ニコチン中毒を治療したり予防したりするのに適切である
。ニコチン中毒を治療するためには、本発明のニコチン-キャリア複合体がニコ
チン中毒に罹っている患者に投与される。ニコチン中毒を予防するためには、ニ
コチン中毒に進行する危険性のある10代の若者のような患者が本発明に係る複合
体で処置される。この複合体を患者に直接投与することは、「能動免疫」と言わ
れる。
【００５５】 本発明のワクチン組成物は、免疫応答を誘発するのに充分な量の少なくとも一
種のニコチンハプテン-キャリア複合体を含んでいる。ニコチンハプテンキャリ
ア複合体は、続いて起こるニコチンの取り込みに対して活動できる充分な濃度で
インビボに残存する能力がある。
【００５６】 本発明のニコチンハプテンキャリア複合体を用いて最初のワクチン接種を行う
と、ニコチンに特異的な抗体を高い力価で生じる。ニコチン中毒の治療を必要と
している患者に投与される複合体の治療的に有効な量は、当業者により容易に決
定される。適切な用量範囲は1〜1000μg／用量である。外来抗原に対する抗体を
生じさせるためには、一般的に一週間から数週間かかる。患者の血液中の抗体の
生産は、ELISA、ラジオイムノアッセイ法、及びウエスタンブロッティング分析
のような当業者に周知の技術を用いてモニターできる。また治療効果も、血圧の
ようなニコチンの種々の肉体的作用を評価することによってモニターできる。
【００５７】 下記に詳細に説明したように本発明のニコチンハプテン-キャリア複合体は、
患者に容易に投与できる組成物を提供するように処理することができる。投与の
好ましい態様は、鼻腔内、気管内、経口、経皮、経粘膜、皮下注入及び静脈内注
入が含まれるが、これらに限定されるわけではない。当業者は、最初の注入を行
った後に複合体の一回または複数回の「追加抗原刺激」という続いての投与を行
うとよいことを認識していると思われる。このような追加抗原刺激は、本発明の
ニコチンハプテン-キャリア複合体に対する抗体の産生を増加させると考えられ
る。
【００５８】 本発明のワクチン組成物は、少なくとも一つのアジュバントを含むとよい。本
発明で用いられるアジュバントは、キャリアタンパク質の効果が阻害されないよ
うに選択される。本発明で用いられるアジュバントはヒトに生理的に許容される
アジュバントであり、それらには、ミョウバン、QS-21、サポニン及びMPLA(モノ
ホスホリルリピドA)が含まれるがこれらに限定するわけではない。
【００５９】 本発明のワクチン組成物は、一種または複数種の薬学的に許容される賦形剤を
任意で含むことができる。本発明で有用な賦形剤としては滅菌水、食塩水のよう
な塩溶液、燐酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルコール、アラビアガム、植物
油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、マンニトール、
炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、粘性パラフィン、脂肪酸エステル、ヒド
ロキシメチルセルロース及び緩衝液が挙げられる。当然のことながら当業者に既
知の別の賦形剤も本発明において有用である。
【００６０】 本発明のハプテン-キャリア複合体は、ニコチン中毒を治療したり予防したり
することが必要な患者に投与するために薬学的組成物に組み入れられる。ハプテ
ン-キャリア複合体を含む組成物が注入用に利用されるべきときは、薬学的に許
容されるpHで水性の塩溶液中にハプテン-キャリア複合体を溶解することが好ま
しい。しかしながら、ハプテン-キャリア複合体の注入用懸濁液を使用すること
も可能である。通常の薬学的に許容される賦形剤を利用するだけでなく、この組
成物には純度を保証したり、生物学的利用性を高めたり及び／または透過性を増
したりする任意の成分が含まれうる。
【００６１】 さらにこのワクチン組成物には、分散媒、被膜、ミクロスフェア、リポソーム
、マイクロカプセル、脂質、界面活性剤、潤滑剤、保存剤及び安定化剤といった
少なくとも一つの補助剤を任意で含ませることも可能である。当然のことながら
当業者に既知の任意の別の補助剤も本発明において有用である。また本発明のワ
クチン組成物の効果を助けて補強するように作用する何らかの薬剤も本明細書に
おいて有用である。
【００６２】 本発明の薬学的組成物は滅菌性であり、保存、分散、及び使用に耐えられるよ
うに充分に安定である。さらにこの組成物は、微生物の感染、及び微生物の増殖
からその組成物が保護されるように、追加の成分を含んでいてもよい。この組成
物は、投与する直前に薬学的に許容される希釈剤によって再生できる凍結乾燥し
た粉末の形態として製造されていると好ましい。滅菌性の注入可能な溶液を調製
する方法は当業者には周知であり、それには真空乾燥、凍結-乾燥、及び回転式
脱水乾燥が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これらの方法で、
混合前に導入された任意の追加の賦形剤を伴う活性な成分からなる粉末が得られ
る。
【００６３】 2.ニコチン-キャリア複合体に応答して産生された抗体の投与 受動免疫では、本発明のニコチンハプテン-キャリア複合体に応答して生じた
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の投与、即ちそれらの抗体への暴
露が含まれる。このような抗体は動物またはヒトで生じさせることが可能である
。本発明のニコチン複合体に応答して生じた抗体は、ニコチンに対する中毒を予
防するために投与することができる。例えばこのような抗体は、10代の若者のよ
うなニコチンに対する中毒に進行する危険があると思われる人に投与することが
できる。また抗体は、ニコチンに対する中毒になっている患者を治療するために
も適切である。上述したように、抗体は血液中のニコチンに結合して血液脳関門
をニコチンが通過するのを阻止すると考えられる。本発明のハプテン-キャリア
複合体の投与によって生じた抗体は、約150kDaから約1,000kDaの範囲の分子量を
有する。
【００６４】 ニコチン中毒の治療を必要としている患者に投与される本発明の治療用抗体の
治療的に有効な量は、当業者によって容易に決定される。適切な用量範囲は1〜1
000μg／投薬である。
【００６５】 本発明の治療用組成物は少なくとも、本発明のニコチン-キャリア複合体に応
答して産生された抗体を含む。本発明のこれらの組成物は、一種または複数種の
薬学的に許容される賦形剤を任意で含むことができる。本発明で有用な賦形剤に
は、滅菌水、食塩水のような塩溶液、燐酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルコ
ール、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、
ゼラチン、マンニトール、炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、粘性パラフィ
ン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース及び緩衝液が挙げられる。当
然のことながら当業者に既知の任意の別の賦形剤も本発明において有用である。
【００６６】 本発明の抗体は、ニコチン中毒を治療したり予防したりすることが必要な患者
に投与するために薬学的組成物に組み入れられる。抗体を含む組成物が注入用に
利用されるべきときは、薬学的に許容されるpHで水性の塩溶液中に抗体をおくこ
とが好ましい。しかしながら、抗体の注入用懸濁液を利用することも可能である
。通常の薬学的に許容される賦形剤だけでなく、この組成物には純度を保証した
り、生物学的利用性を高めたり及び／または透過性を増したりする任意の成分が
含まれうる。
【００６７】 本発明の抗体を含む薬学的組成物は滅菌性であり、保存、分散、及び使用に耐
えられるように充分に安定である。さらにこの組成物は、微生物の感染、及び微
生物の増殖からその組成物が保護されるように、追加の成分を含んでいてもよい
。滅菌性の注入可能な溶液を調製する方法は当業者には周知であり、それには真
空乾燥、凍結-乾燥、及び回転式脱水乾燥が挙げられるが、これらに限定される
わけではない。これらの方法で、混合前に導入された任意の追加の賦形剤を伴う
活性な成分からなる粉末が得られる。
【００６８】 本発明の抗体を含むキット 本発明の抗体はまた、試料中のニコチンレベルを検出して測量するために用い
ることのできるキットを調製する場合にも役立つ。本発明に係るキットは、適当
な容器に入れた本発明に係るニコチン-特異性抗体を含んでいる。ラジオイムノ
アッセイ法を行うためにはそのキットは、標識をつけたニコチンも含んでいると
よい。試料中のニコチンは、標識をつけたニコチンを抗体に結合させ、続いて抗
体由来の標識をつけたニコチンをテストすべき試料と競合させることによって検
出される。またELISAキットも本発明に係る抗体を含んでいる。ELISAでは、既知
量のニコチンを用いた抗体結合の阻害とニコチンを含むことが疑われる試料を用
いた阻害との比較が含まれると考えられる。これにより、既知のニコチン濃度の
標準的な阻害曲線と試料を比較することによって、試料中の未知のニコチンを測
定することが可能となる。別のタイプのELISAでは、ニコチンを含むことが疑わ
れる試料を、ニコチンに結合する物質で被覆したミクロタイタープレートととも
にインキュベートする。本発明の抗体を加え、酵素-結合した抗-抗体性の抗体を
そのプレートに添加するとよい。基質を添加することにより、プレートに結合す
るニコチンの量を定量できる。
【００６９】 以下の実施例は、本発明の調製法及び使用をさらに例示するためにのみ提示さ
れている。本発明の範囲は以下の実施例に制限されるものではない。
【００７０】実施例1-誘導されたニコチンハプテン(3'位が置換されている)の合成 ハプテンを合成するための出発物質は、商業的な供給元から入手可能なtrans-
4'-カルボキシ(-)-コチニンである。CushmanおよびCastagnoli, Jr. (1972) J.
Org. Chem. 37 (8): 1268-1271に記載されている方法を変形して、その酸のメチ
ルエステル化を行い、続いてそのエステルを還元することによって、アルコール
であるtrans-3'-ヒドロキシメチル-(-)-ニコチンが得られる。このアルコールを
続いてスルホン化し、そのスルホン酸を、最終的にアミンに還元されるアジド基
と置換する。
【００７１】 4gのtrans-4'-カルボキシ-(-)-コチニンを乾燥メタノールに2Nの硫酸を入れた
溶液50mLに溶解し、室温で一晩攪拌する。得られた懸濁液をワットマン（Whatma
n）No.1濾過紙を通して濾過し、100mLの炭酸水素ナトリウム飽和溶液にゆっくり
と添加する。そのエステルをジクロロメタンで抽出して溶媒をエバポレートする
と、4.2gのピンク色のオイルが得られる。
【００７２】 乾燥テトラヒドロフラン(100mL)に3.9gのそのエステルを入れた溶液を、乾燥
テトラヒドロフラン(70mL)に4等量のリチウムアルミニウムハイドライドを懸濁
した溶液に、乾燥アルゴン気流下、滴下して添加する。その懸濁液を二時間、室
温にて攪拌する。過剰のハイドライドを、氷浴中で冷却しつつ水を注意深く調節
しながら添加することにより分解する。得られた白色沈澱物を濾過して除去し、
濾過液を硫酸ナトリウム上で乾燥してから減圧下で濃縮することによって2.7gの
アルコールが黄色のオイルとして得られる。
【００７３】 このアルコール(1.9g)を20mLのジクロロメタンに溶解する。次にトリエチルア
ミン(0.75mL)とp-トルエンスルホニルクロライド(1g)を連続的にその溶液に添加
する。そのオレンジ色の溶液を24時間、室温にて攪拌する。沈澱させたトリエチ
ルアミン塩酸塩をセライト(Celite)ベット上で濾過して除去し、濾液を減圧下で
濃縮することによって茶色のオイルが得られる。スルホン酸塩は、シリカフラッ
シュクロマトグラフィーカラムで5％のメタノールを入れたジクロロメタンを用
いて溶出して精製することにより、2.1gの黄色のオイルが得られる。
【００７４】 このスルホン酸塩(1.8g)は、50mLのジメチルホルムアミドに入れたアジ化ナト
リウム(0.8g)を用いて80℃で1時間かけて置換する。高度の真空下でジメチルホ
ルムアミドをエバポレートした後、その残渣をジクロロメタン中に溶解し、水と
塩水で洗浄してから硫酸ナトリウム上で乾燥する。溶媒をエバポレートするとア
ジド(1.1g)が茶色がかったオイルとして得られる。
【００７５】 乾燥テトラヒドロフラン(20mL)に入れたアジドを乾燥テトラヒドロフラン(50m
L)に入れたリチウムアルミニウムハイドライドの懸濁液に添加して薄層クロマト
グラフィーによってモニターすると、所望のアミンが容易に得られた。精製した
アミンのプロトン核磁気共鳴及びカーボン核磁気共鳴のスペクトルは、予測した
構造に対応していた。
【００７６】実施例2-誘導されたニコチンハプテン(4'位が置換されている)の合成 ニコチンの4'位に官能基を結合したアームを導入するには、コチニンのエノレ
ートをアルキル化し、続いてそのアルキル化生成物を還元することによって行う
ことができる。適当に保護した3-ブロモ-プロピルアミンに似たさまざまなアル
キル化試薬を利用できる。例として3-ブロモ-N-カルボベンジルオキシ-プロピル
アミンまたはN-(3-ブロモプロピル)-フタルアミドを利用することが可能である
。このアミンの保護基は、アルキル化と還元を行った後で、キャリアタンパク質
に複合化させる前に除去する必要があると考えられる。環状ラクタム(ピロリジ
ノン環を含む)のエノレートアルキル化は、文献(一般的な論評としては、G. Hel
mchenら、(1995) Stereoselective Synthesis in Houben-Weyl-Methods of Orga
nic Chemistry, Vol. E21a, 762-881, Thieme, Stuttgart, Germany、そして反
応の立体的な考察としては、A. J. Meyersら、(1997) J. Am. Chem. Soc., 119,
4564-4566を参照のこと。)に充分に論じられている。またコチニン自体のエノ
レートアルキル化のいくつかの例もある(N.-H. Linら、(1994) J. Med. Chem.,
37, 3542-3553)。二つのエピマーの1：1の混合物である4'-アセチル-ニコチンの
関心がもたれている調製は、ケトン(またはアルデヒド)と2-アルコキシ-3-アル
ケンアミンから出発して一列につながったカチオン性のアザ-コープ再配列-マン
ニッヒ環化反応（tandem cationic aza-Cope rearrangement-Mannich cyclizati
on reaction）を用いて達成された(L. E. Overman (1983) J. Am. Chem. Soc.,
105, 6622-6629)。この反応は、複合体にとって適切な4'-アルデヒド-ニコチン
を合成するためにも拡張できる。
【００７７】 3-ブロモ-プロピルアミン臭酸塩(4.2g)を50mLのジクロロメタンに懸濁し、ト
リエチルアミン(約7mL)を透明な溶液が得られるまで添加した。この溶液を0℃に
冷却し、ベンジルクロロホルメート(2.5mL)を滴下して添加した。この反応は16
時間、室温にて攪拌しながら進行させた。沈澱した塩を濾過して除去し、透明の
有機層を冷水、冷却した1NのHCl、及び冷水を用いて洗浄してから硫酸ナトリウ
ム上で乾燥を行い、続いて減圧下でエバポレートすることによって黄色のオイル
(2.93gの粗精製物質)が得られた。
【００７８】 コチニン(62mg)と3-ブロモ-N-カルボベンジルオキシ-プロピルアミン(100mg)
を、乾燥トルエンと別々に共同エバポレートした。コチニンを5mLの新しく蒸留
した無水のテトラヒドロフランに溶解し、60μLのN,N,N',N'-テトラメチレンジ
アミン(TMEDA)を添加してからその溶液をエタノール-ドライ氷浴に浸漬して-78
℃に冷却した。このコチニン溶液を、予め-78℃に冷却したテトラヒドロフラン
にリチウムジイソプロピルアミドを入れた溶液(LDA、2Mのヘプタン-テトラヒド
ロフラン溶液、200μL)に、滴下して加えた。このオレンジ色の混合液を-78℃で
15分間攪拌し、その後氷浴中で温まるように(2〜6℃)放置した。次にその反応を
再び-78℃に冷却し、無水のテトラヒドロフランに溶解した3-ブロモ-N-カルボベ
ンジルオキシ-プロピルアミンを15分間かけて滴下して添加した。この反応混合
物を-10℃に温まるまで放置し、その後メタノールを用いてクエンチした。その
反応生成物をシリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し
た。このコチニン誘導体のアミドの還元はボラン（borane）を用い、続いて熱エ
タノール中でフッ化セシウムを用いることで達成された。最終的なアミンは、酸
性条件でカルボベンジルオキシ基を除去して得られた。
【００７９】実施例3-誘導されたニコチンハプテン(5'位が置換されている)の合成 ニコチンの5'位に官能基を結合したアームを導入するには、Shibagakiら、(19
86) Heterocycles, 24, 423-428 及びN. -H. Linら、(1994) 前記に記載された
のと同様の方法で、コチニンと適当に保護したアルキルリチウム化合物とを反応
させ、続いてナトリウムシアノボロハイドライドを用いて還元することで達成で
きる。
【００８０】実施例4-誘導されたニコチンハプテンのキャリアタンパク質への複合化 組換えエキソプロテインA(rEPA)は誘導したニコチンハプテンに、コハク酸ア
ームを介して結合する。rEPAの15個のリジンはコハク酸無水物を用いて容易にサ
クシニル化された。続いて一般的な複合化反応において、pH6.0で0.15MのNaClを
含む2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液0.05Mに、そのサクシニル化
した組換えエキソプロテインA(Suc-rEPA)を入れた溶液、5〜10mg／mLを調製した
。蒸留した水の最小量に溶解した等量の3'-アミノメチル-(-)-ニコチン(3'AMNic
)ハプテンをそのタンパク質溶液に添加した。そのハプテン溶液のpHは添加を行
う前に0.1NのHClを用いて6.0に調節した。最後に等量の1-エチル-3-(3-ジエチル
アミノ)プロピルカルボジイミド・ハイドロクロライド(EDC)をそのハプテンタン
パク質混合物に添加して、攪拌しながら室温で30分間その反応を進行させた。こ
うして得られたニコチン複合体は、セファデックスG-25カラムにおいて、燐酸緩
衝塩溶液(PBS)、pH7.4を用いて溶出させた。複合体の回収は80〜90％の範囲であ
った。
【００８１】実施例5-ニコチンをロードしたマトリックスの複合化 この実施例は、誘導されたハプテンとしての3'-アミノメチル-(-)-ニコチンと
、キャリアタンパク質としての組換えエキソプロテインA(rEPA)と、リンカーと
してのアジピン酸ジヒドラジド(ADH)と、「マトリックス」としてのポリ-L-グル
タミン酸またはハプテンのためのポリマー支持体とを含むハプテン-キャリア複
合体の合成について記載している。
【００８２】 平均分子量が39,900で、多分散性(polydispersity)が1.15そして重合化の程度
が264であるポリ-L-グルタミン酸をこの実施例では用いた。ハプテンとポリマー
の反応量は、ターゲットの置換割合が約80％であるように算出した。即ち置換が
80％に達する場合には、グルタミン酸ポリマーの平均的な分子における全体で26
4の繰り返しユニットのうち、約208ハプテンユニットが複合化していた。
【００８３】 ニコチンをロードしたこのポリ-L-グルタミン酸は次の化学式を有する。
【化１２】
【００８４】 図に示されたようにポリグルタミン酸ポリマーは、約52個のグルタミン残基を
含んでいる。この数は、マトリックス用に選択したポリアミノ酸残基のバッチと
起源に依存して変わる。またこの図は、それぞれの繰り返しユニットに4個のニ
コチンハプテンがあることを示している。この数は、マトリックス及びニコチン
ハプテンが複合化される場合に用いられる反応物の比率に応じて異なると考えら
れる。
【００８５】 誘導されたニコチンを用いて複合化させるのに続いて、非反応性のカルボキシ
ル基(約20％)をADHを用いて誘導した。実施例6に記載したようにこのマトリック
スをキャリアに複合化させる場合には、タンパク質に対するニコチン-ロードマ
トリックスのモル比は1：1であった。しがたってこの複合体では、タンパク質に
対する理論的なニコチンハプテンのモル比は複合化反応が完遂すると200：1であ
った。
【００８６】 ポリグルタミン酸におけるニコチン置換の実際の比率は、その生成物のNMR分
析を利用して推定した。ニコチンのピリジン環の4個の水素に比較したグルタミ
ン酸のα-水素のピーク強度によって、導入したニコチンの比率が与えられる。
推定された平均的な比率は143：1(ニコチン／キャリアタンパク質)であった。
【００８７】実施例6-ニコチンをロードしたマトリックスを用いるニコチン複合体ワクチンの 調製 A.マトリックス上にニコチンハプテンをロードする 10mgのポリ-L-グルタミン酸塩(Sigma, Cat #P-4761)を、pH6.0で0.15MのNaCl
を含む0.05Mの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液、2mLに溶解した
。10mgの3'-アミノメチル-(-)-ニコチンを蒸留した水の最小量に溶解し、その溶
液のpHを0.1NのHClを用いて6.0に調整した。そのニコチンハプテン溶液を攪拌し
ながらポリペプチド溶液に滴下して添加し、続いてpHを6.0に調整した。次に20m
gの固体状1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・ハイドロク
ロライド(EDC)を三つの部分でそのハプテンポリペプチド混合物に20分間かけて
添加した。その反応は、室温で1時間進行させた。その反応生成物(ニコチン-置
換されたマトリックス)を水を三回変えて透析し、凍結乾燥した。12mgのニコチ
ン-置換されたポリグルタミン酸は、白色のふわふわした物質として得られた。
【００８８】 B.ニコチン-置換されたマトリックスへのリンカーの結合 10mgのニコチン-置換されたポリグルタミン酸を、pH6.0で2mLのMES緩衝液に溶
解した。8mgのアジピン酸ジヒドラジド(ADH)、続いて10mgのEDCを攪拌しながら
その溶液に添加した。その反応は、室温で1時間進行させた。得られた溶液を最
終的にはpH6.0でMES緩衝駅を三回変えて透析した。
【００８９】 C.キャリアタンパク質への複合化 10mgの組換えエキソプロテインA(rEPA)を、pH5.6で0.15NaClを含む0.05MのMES
緩衝液、2mL中に溶解した。7.5mgのこの誘導された物質を含むと推定されている
ADH-結合したニコチン-置換のポリグルタミン酸溶液の容量を、タンパク質溶液
に添加した。固体状のEDCを、室温で攪拌しながら20分間かけて三つの部分に分
けてこの混合液に添加した。その反応は室温で一晩進行させた。得られた複合体
は最終的にセファデックスG-25カラムで精製し、pH7.4で燐酸緩衝塩溶液(PBS)で
溶出した。これによって精製された複合体の調製物を作成でき、その複合体には
ニコチンの(S)-(-)型のみが含まれている。
【００９０】実施例7-実施例4のニコチンキャリア複合体の特徴付け 実施例4の精製複合体のワクチンを、スーパーローズ（Superose）12サイズ排
除クロマトグラフィーカラム上で分析し、pH7.4のPBSを用いて溶出した。タンパ
ク質に対するハプテンのモル比は17に対して11であり、ニコチンを導入した後の
260nmにおけるUV吸収の増加を、280nmにおける吸収に比較して検出することによ
って算出した。この範囲は、ハプテン-キャリア複合体からなる6個の別個に調製
したロットのハプテン／キャリアタンパク質の比率(ロット1：17.2、ロット2：1
6.2、ロット3：13.2、ロット4：12.0、ロット5：11.0、ロット6：17.2)を計算す
ることによって検出した。さらにMALDI-TOFマススペクトロメトリーを用いてこ
の比を決定しようとする分析によっても、UV吸収の差によって得られるのと同じ
数字が本質的に得られる。複合体ワクチンのタンパク質濃度はBCA分析を用いて
測定した。実施例4のニコチン-キャリア複合体の安定性試験を行った。この研究
では、1mLのガラス瓶に0.5mg／mLの濃度で入れたワクチンを用い、その瓶に入れ
たワクチンの安定性を三つの異なる温度、即ち-70℃、2〜8℃及び室温で試験し
た。
【００９１】実施例8-実施例4のニコチンキャリア複合体の安定性 エステル結合ではなくハプテン-リンカー-キャリアの間のアミド結合の形成
に基づいた複合化方法によれば、-70℃、2〜8℃及び室温程度での6カ月間の複合
体の安定性を観察した場合に利点があることが明らかとなった。この安定性試験
は、以下の工程を用いて複合化ワクチンをモニターしアッセイ法を行うことより
成っていた： 1.)形成された何らかの粒子(濁り、沈澱)を探すための視覚的観察。 2.)何らかの有意なpH変化のチェック。 3.)ニコチンの導入の比率が変化したかどうかを検出するために、260nmと280n
mでのUV吸収と組み合わせてサイズ排除クロマトグラフィーのデータを明らかに
する。 4.)何らかのキャリアタンパク質の減成をチェックするための逆相クロマトグ
ラフィー。 5.)複合化タンパク質の何らかのタンパク質分解を調べる銀染色を利用したSDS
PAGE。
【００９２】 リンカーとキャリアとの間だけでなく、ハプテンとリンカーとの間のアミド結
合の形成に基づいた複合化方法も、-70℃及び2〜8℃での6カ月間の複合体の安定
性を観察した場合に利点があることが明らかとなった。
【００９３】実施例9-実施例4及び6のキャリア複合体の免疫原性の立証 二種のニコチンハプテン-キャリア複合体ワクチンをマウス、ラット及びウサ
ギを免疫するために用いた。
【００９４】 A.動物試験-ポリクローナル抗体 動物を標準的なプロトコールを用いて免疫した。マウスではワクチンを2週間
の間隔をあけて三回皮下注入することで投与し、一回目と二回目の注入を行った
一週間後にテスト採血を行い、三回目の注入を行った一週間後には全採血を行っ
た。血清試料を実施例10に記載されたELISAアッセイ法で評価した。ELISAアッセ
イ法では、ミクロタイタープレートに結合した3'AMNic-pGluを用いた。
【００９５】 ラットは、ワクチンを三回腹腔内注入して免疫した。注入は、一回目と二回目
の注入の一週間後にテスト採血をしながら二週間の間隔をあけて行った。続いて
そのラットに、三回目の注入の一週間後に全採血を行った。フロイント(Freund)
の完全アジュバントを最初の注入の際に用い、続く注入では不完全フロイントア
ジュバントを用いた。血清試料は、ELISAアッセイ法で評価した。
【００９６】 ウサギには、100μgのワクチンを用いて三週間の間隔をあけて三回、筋肉内に
注入して免疫した。最初の注入はフロイントアジュバンドを含んでいて、続く注
入は不完全フロイントアジュバントを含んでいた。ウサギは、二回目と三回目の
注入の一週間後にテスト採血したところ、採血の結果として充分な力価を確保で
きた。ELISAによって測定して充分な力価が得られたら、ウサギを一週間毎の研
究結果採血スケジュール(ウサギ一匹あたり20〜40mLの血清)に従わせた。抗体力
価は時間経過と共にモニターし、抗体レベルを回復させる必要があれば動物に追
加抗原刺激した。
【００９７】 これらの免疫原性試験の結果は表1〜5に示されている。表1及び2は、マウスに
おける免疫原性試験の結果を示している。表1において用いた複合体は3'アミノ
メチル-(-)-ニコチン-サクシニル-rEPA(実施例4)であった。表2において用いた
複合体は、3-アミノメチル-(-)-ニコチン-ポリグルタミン酸-ADH-rEPA(実施例6)
であった。これらの表は、ニコチンに特異的に結合する抗体が高い力価で産生す
ることを示している。そのうえこれらの複合体は、追加抗原刺激の応答を誘導す
る能力も示した。
【００９８】 表3及び4は、ラットにおける免疫原性試験の結果を示している。表3において
、用いた複合体は3'アミノメチル-(-)-ニコチン-サクシニル-rEPA(実施例4)であ
った。表4において用いた複合体は、3-アミノメチル-(-)-ニコチン-ポリグルタ
ミン酸-ADH-rEPA(実施例6)であった。
【００９９】 これらの表は、ニコチンに特異的に結合する抗体が高い力価で産生されること
を示している。そのうえこれらの複合体は、追加抗原刺激の応答を誘導する能力
も示した。
【０１００】 表5は、ウサギにおける免疫原性試験の結果を示している。3'アミノメチル-サ
クシニル-rEPA(実施例4)または3-アミノメチル-ポリグルタミン酸-ADH-rEPA(実
施例6)のいずれを用いても、この二つの複合体に対して高い力価の抗体が産生さ
れた。これらの力価は、6カ月以上もの間高いままであった。
【０１０１】
【表１】 3'AMNic-Suc-rEPAを用いたマウスの処理 用量はタンパク質アッセイ法に基づく。 力価は対応する注入を行った1週間後の相加平均である。
【０１０２】
【表２】 3'AMNic-pGlu-ADH-rEPAを用いたマウスの処理 用量は凍結乾燥した複合体の乾燥重量に基づく。 力価は対応する注入を行った1週間後の相加平均である。
【０１０３】
【表３】 3'AMNic-Suc-rEPAを用いたラットの処理 用量はタンパク質アッセイ法に基づく。 力価は対応する注入を行った1週間後の相加平均である。
【０１０４】
【表４】 3'AMNic-pGlu-ADH-rEPAを用いたラットの処理 用量は凍結乾燥した複合体の乾燥重量に基づく。 対応する注入を行った1週間後の相加平均。
【０１０５】
【表５】 3'AMNic-Suc-rEPA及び3'AMNic-pGlu-ADH-rEPAを用いたウサギの処理 用量は、3'AMNic-Suc-rEPAについてはタンパク質アッセイ法に基づき、また3'
AMNic-pGlu-rEPAについては乾燥重量に基づく。 力価は、3回目の注入を行った6週間から7週間後の相加平均である。
【０１０６】 実施例10-ELISAアッセイ法および抗体特異性 ニコチン分子自体はELISAプレートを被膜するのに適当ではなく、よりうまく
接着性の性質を備えた大きな分子に結合させる必要がある。ポリ-L-リジンまた
はポリ-L-グルタミン酸はこの目的のために一般的に用いられる。誘導したニコ
チンハプテン3'-アミノメチル-(-)-ニコチン(3'AMNic)をポリ-L-グルタミン酸に
複合化し、得られた3'-アミノメチル-(-)-ニコチン-ポリ-L-グルタミン酸複合体
(3'AMNic-pGlu)をELISAプレートを被覆するために用いた。
【０１０７】 3'AMNicワクチンに対して生じた抗体を、以下のように3'AMNic-pGlu ELISAを
用いて評価した。即ち、ダイナテックイムロン（Dynatech Immulon）4ミクロタ
イタープレート(Chantilly, VA)をpH9.6の0.1M重炭酸塩緩衝液中に入れた10ng／
mLの3'AMNic-pGluを用いて100μL／ウェルで被覆し、それを室温(RT)で一晩(ON)
インキュベートした。続いてこのプレートをアスピレートし、RTで1時間、1％BS
Aを含むPBS溶液でブロックした。試料と参照の血清をPBB(1％のBSA、0.3％のBRI
Jを含むPBS溶液、pH7.2)で希釈することによって、450nmにおけるおおよその吸
光度(OD)が2.0となるように希釈できる。このプレートを5回洗浄(9％のNaCl、0.
1％のBRIJ)し、希釈された試料および参照血清をロードした。この参照および試
料の最終用量が100μL／ウェルになるようにそのプレートを2倍希釈して薄めて
から、1時間37℃でインキュベートした。続いてそのプレートを再び洗浄し、PBB
で希釈されたペルオキシダーゼが複合化した抗-種のFc特異性のIgG(Jackson, We
st Grove, PA)を100μL／ウェルでロードし、37℃で1時間インキュベートした。
そのプレートを洗浄し、H2O2(TMB試薬キットとともに提供されている)で1：1に
希釈した3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質(KPL, Gaithersburg, MD)
、100μl／ウェルを用いてRTで10分間インキュベートした。この反応は、1Mの燐
酸、100μL／ウェルを添加して停止させ、MR4000ミクロタイタープレート読み取
り器(Dynatech)を用いて450nmで読み取った。試料を平行ライン分析法を用いて
参照と関連させて定量する。参照は、450nmにおけるODが約2.0となる希釈物に対
応する絶対値(U／mL)が割り当てられる。
【０１０８】 抗体の特異性は、阻害ELISAアッセイ法を用いて評価した。それぞれの抗-[3'A
MNic-Suc-rEPA]血清は、450nmにおける吸光度が結果的に約2.0になるように2分
の1の濃度に希釈した。上記に記載した3'AMNic-pGlu ELISAを用いる場合、テス
トできるように希釈した抗血清は、37℃で3時間、量の多い被験抗原(インヒビタ
ー)とともに1：1(v／v)で吸収され、その吸収された試料は参照としての吸収さ
れなかった血清を用いるELISAにおいて試験した。吸収されなかった試料に関す
る吸収のパーセントを、それぞれの試料について測定した。
【０１０９】 3'AMNic-Suc-rEPAに応答して生じた抗体を含むラットの血清の特異性は、イン
ヒビターとしてニコチン酒石酸を用いる阻害ELISAを利用して算出した。この抗
体についてのIC50は3.5×10-6Mであった。3'AMNic-Suc-rEPAに応答して生じた抗
体を含むウサギ血清の特異性は、インヒビターとしてニコチン酒石酸を用いる阻
害ELISAを利用して算出した。この抗体についてのIC50は2.3×10-5Mであった。
【０１１０】実施例11-抗体親和性及び結合能力 抗体結合能力は、0.7mLの血漿、テフロン（登録商標）製のセミ-ミクロセル、 12〜14kDの分子量を除去するスペクトラポール(Spectrapor)2メンブラン、及び ソレンソン(Sorenson)緩衝液(0.13ホスフェート、pH7.4)を用いる平衡透析法を 、37℃で4時間行って測定した。Pentelら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 246, 106 1-1066 (1987)参照。血漿のpHは、平衡透析法の進行が終わりに到達した時に測 定し、試料は最終のpHが7.30〜7.45である場合のみ用いた。
【０１１１】 ニコチンに対する抗体親和性は、Mueller, Meth. Enzymol., 92, 589-601 (19
83)を参照して可溶性のラジオイムノアッセイ法を用いて算出した。IgGの分子量
は、150kDであると測定された。
【０１１２】 ラジオイムノアッセイ法を用いて得られた結合定数と親和性は次のとおりであ
った。抗-[3'AMNic-Suc-rEPA]ラット血清については、IC50(モル)は1.36×10-7
であった。Ka(モル-1)は2.57×107であった。結合部位の濃度は2.61×10-6結合
部位／Lであり、ニコチン-特異性IgGの濃度は0.2mg／mLであった。
【０１１３】実施例12-動物モデルの血漿及び脳におけるニコチン分布の評価 本発明のワクチンは、さまざまな動物モデルで評価されている。ラットモデル
を用いて、血漿及び脳におけるニコチン分布についての能動免疫または受動免疫
の効果を調べた。ある研究では、ニコチンの持つ中枢神経系(CNS)作用であるニ
コチンの運動作用の減少ついて、受動免疫の効果を調べた。別の実験では、心臓
血管系に対するニコチンの作用、即ち最高血圧の上昇について、受動免疫の効果
を評価した。
【０１１４】 本発明の免疫治療法を評価するために、ヒトにおいて二本の紙巻タバコからの
ニコチンの急速な吸収を誘導できるよう動物モデルが開発されている。この動物
モデルは、Hieda (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 283 (3): 1076-1081に記載
されている。このモデルではラットに、ヒトの喫煙者の肺からのニコチンの急速
な吸収が誘導されるよう、10秒間かけて0.03mg／kgのニコチンを静脈内注入して
投与した。血漿中のニコチンを測定するために、血液試料をニコチンの注入を行
ってから3分後と10分後に採取した。脳のニコチン濃度を測定すべき場合には、
ニコチンを注入してから3分後に動物を殺してその脳をすばやく取り出した。実
施例4のワクチンは、血漿と脳におけるニコチンの分布に対するそのワクチンの
影響を調べるためにラットで評価した。
【０１１５】 A.能動免疫 ラットに、二週間の間隔をあけてワクチン(3'AMNic-Suc-rEPA)の一回注入に対
して全部で25μgの腹腔内注入を3回行ってニコチンワクチンで免疫感作した。こ
れらの動物では、免疫していない対照のレベルに比較して、10秒間かけて0.03mg
／kgのニコチンの注入を行った3分後と10分後の血漿中のニコチンレベルが増加
した。図１参照。したがって能動免疫は、血漿においてニコチン結合を増大させ
るのに有効であった。脳に到達するニコチンの量が適度に減少して、ニコチンの
行動の影響を劇的に変化させうることがわかる。
【０１１６】 B.受動免疫 受動免疫を用いて、血漿のニコチンレベルの増加と脳のニコチンレベルの減少
における免疫IgGの用量応答性の効果を調べることができた。ラットには、注入
あたりの抗-(3'AMNic-Suc-rEPA)IgGの全体量を12.5〜50mgに変えた量を投与した
。図2に示されているように、血清中のニコチンレベルを増加させ脳のニコチン
レベルを減少させるIgGの用量の増加につれて、明らかな用量応答効果があった
。
【０１１７】 図3は、注入によって全部の抗体(50mg)を投与した30分後と1日後のラットの血
清において、抗-ニコチン抗体(抗-3'AMNic-Suc-rEPA)が存在すること、及び活性
であることを示している。図3は、続いてニコチンで攻撃する(10秒間かけて0.03
mg／kgを注入する)と、抗体を投与した30分後及び1日後でこれらの抗体が脳のニ
コチン濃度を減少させ、かつ血漿のニコチンレベルを増加させるのに有効であっ
たことを示している。
【０１１８】 本発明のニコチンワクチンを用いて受動免疫した効果の別の証拠は、続いて行
ったニコチンの注入に対抗する能力である。ラットにおける別個の受動免疫実験
では、ニコチンを多数回投与しても抗体の存在が涸渇せず、即ち新しく注入した
ニコチンに結合する能力を有意に減少させなかった。図4においては、50mgの抗-
[3'AMNic-Suc-rEPA]を0時点で注入した。24時間後、5回のニコチン注入を行った
。即ち0.03mg／kgのニコチンを10秒間かけて、20分毎に80分間、右の頚部静脈か
ら注入した。全部で5回のニコチンの注入を行った。ニコチンの5回目の注入は、 3 H-ニコチンを用いて刺激した。全部の血液と脳を、5回目の注入を行ってから1
分後に収集した。その結果が下記に示されていて、図4及び5においてグラフ化し
て表されている。
【０１１９】
【表】
【０１２０】 これらの結果は、ニコチンの5回目の投与を行った後でさえその抗体が血清中
のニコチンレベルを増加させ、かつ脳のニコチンレベルを減少させるのに有効で
あることを示している。3H-ニコチンを用いた結果は、抗体が5回目の投与で注入
されたニコチンに対しても有効であることを証明している。
【０１２１】実施例13-ニコチンの運動作用についての評価 用いたこの実験は、受動免疫によって直接CNSが仲介するニコチンの作用を抑
制できるかどうかについて調べられるように設計した。この実験で用いたラット
モデルはDavid Malin博士によって開発され、それは、第五回 ニコチンおよびタ
バコに関する調査団体の年次会合（the Fifth Annual Meeting of the Society
for Research on Nicotine and Tobacco）、San Diego, CA、1999年3月5〜7日に
要約されているMalinら、ラットにおいてニコチン特異的IgGは脳への関与を減少
し、その行動および心筋作用を減衰させる（Nicotine-specific IgG reduced di
stribution to brain and attenuates its behavioral and cardiovascular eff
ects in rats）に記載されている。ベースラインを確立するために、0.8mg／kg
用量のニコチン酒石酸塩を皮下注入したラットの、運動活動レベルについての効
果を測定した。0.8mg／kgのニコチン酒石酸塩は、運動の異常性を誘導すること
なく用いることが可能な最大の用量である。
【０１２２】 抗-[3'AMNic-Suc-rEPA]を用いて予め処理されていないラット、及び50mgの正
常のウサギ血清IgGを用いて予め処理したラットにニコチンを注入した後では活
動レベルが向上した。図6Aの右側のバーと図6Bの左側のバーを参照されたい。こ
の効果は、50mgの抗-[3'AMNic-Suc-rEPA]免疫IgG(図6Bの右側のバー)を用いて動
物を前処理することによって抑制された。このことは、抗-ニコチン抗血清が、
インビボにおいてニコチンの興奮作用を弱めることを示している。
【０１２３】実施例14-最高血圧に対するニコチンの評価 この実験では、ニコチンの行動作用の別の指標を測定した。即ち収縮期血圧の
変化である。ラットは抗-[3'AMNic-Suc-rEPA]IgG、または対照のIgGを用いて前
処理した。ラットに0.1mg／kgのニコチン酒石酸塩を皮下注入して処理した。対
照のラットは、ニコチンで処理すると収縮期血圧が42.6±3.2mmHgに増加したこ
とを示した。ラットが抗-ニコチン抗血清IgGで前処理されている場合、ニコチン
の攻撃の影響は小さかった。より多くの量の抗-ニコチン血清が投与されている
場合、血圧を上昇させるニコチンの能力が減少した。図7に示されているように
、IgGの投与量の関数として、血圧は右下がりに直線状に傾いた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、後で一回のニコチン注入を行うラットのニコチン血清レ
ベルについて、3'AMNic-Suc-rEPA複合体ワクチンを用いて能動免疫した影響を示
すチャートである。ニコチン注入の3分及び10分後のニコチン血清レベルが示さ
れている。
【図２】 図2は、ラットの血清及び脳におけるニコチンレベルについて、3
'AMNic-Suc-rEPAに対する抗体を用いて受動免疫した影響を示す。ラットは12.5
、25及び50mgの抗体を用いて処置した。
【図３】 図3は、ラットの血清及び脳におけるニコチンレベルについて、3
'AMNic-Suc-rEPAに対する抗体を用いて受動免疫した影響を示す。ニコチンレベ
ルは、抗体投与の後30分後と1日後で、ニコチン注入した3分後に測定した。
【図４】 図4は、多数回のニコチンの投与を受けたラットのニコチン血清
レベルについて、3'AMNic-Suc-rEPAに対する抗体を用いて受動免疫した影響を示
す。
【図５】 図5は、多数回のニコチンの投与を受けたラットの脳におけるニ
コチンレベルについて、3'AMNic-Suc-rEPAに対する抗体を用いて受動免疫した影
響を示す。
【図６】 図6は、ラットのニコチン-誘導性の運動作用について、3'AMNic-
Suc-rEPAに対する抗体を用いて受動免疫を行った影響を示す。
【図７】 図7は、ニコチンが誘導する収縮期血圧の上昇について、3'AMNic
-Suc-rEPAに対する抗体を用いて受動免疫を行った影響を示す。この図は、抗体
の量を多くすると、ニコチンによる血圧の上昇を減少させる点で抗体の効力が高
まることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 47/48 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 25/34 Ａ６１Ｐ 25/34 Ｃ０７Ｋ 14/16 Ｃ０７Ｋ 14/16 14/21 14/21 16/44 16/44 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 33/577 33/577 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ナソ ロバート ビー． アメリカ合衆国 メリーランド州 ガイサ ーズバーグ ロキャベン ドライブ 8630 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 DA13 4C076 AA95 CC06 CC07 CC41 EE59 4C084 AA17 MA02 NA05 NA13 NA14 ZB051 ZB052 ZC391 ZC392 4C085 AA03 AA13 AA14 BB24 CC21 CC31 FF24 4C086 AA01 AA02 AA03 FA03 MA01 MA02 MA04 MA07 NA05 NA13 NA14 ZB05 ZC39 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA51 CA11 DA76 EA20 EA50 FA10 FA51 FA72 GA22

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の化学式のハプテン-キャリア複合体： 【化１】 この式中、 mは1〜2500であり、 nは0〜12であり、 yは1〜12であり、 XはNH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、及びS-Sか
    らなる群より選択され、 YはNH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、及びS-Sか
    らなる群より選択され、 且つ-(CH2)n-X-(CH2)y-Y-部分は3'、4'または5'位に結合している。
  2. 【請求項２】 前記mが11〜17であり、nが1であり、yが2であり、XがNH-CO
    であり、YがCO-NHであって、前記キャリアタンパク質がエキソプロテインAであ
    り、且つ前記-(CH2)n-X-(CH2)y-Y-が3'位に結合している請求項1記載の複合体。
  3. 【請求項３】 前記mが11〜17であり、nが1であり、yが2であり、XがNH-CO
    であり、YがCO-NHであって、前記キャリアタンパク質がエキソプロテインAであ
    り、且つ前記-(CH2)n-X-(CH2)y-Y-が4'位に結合している請求項1記載の複合体。
  4. 【請求項４】 前記mが11〜17であり、nが1であり、yが2であり、XがNH-CO
    であり、YがCO-NHであって、前記キャリアタンパク質がエキソプロテインAであ
    り、且つ前記-(CH2)n-X-(CH2)y-Y-が5'位に結合している請求項1記載の複合体。
  5. 【請求項５】 前記mが1〜20及び1〜200からなる群より選択される請求項1
    記載の複合体。
  6. 【請求項６】 次の化学式のハプテン-キャリア複合体： 【化２】 この式中、nは0〜12であり、jは1〜1000であり、kは1〜20であり、且つEはア
    ミノ酸-含有マトリックスである。
  7. 【請求項７】 前記マトリックスがポリ-L-グルタミン酸である請求項6記載
    のハプテン-キャリア複合体。
  8. 【請求項８】 請求項1記載のハプテン-キャリア複合体に応答して産生され
    る抗体。
  9. 【請求項９】 請求項8記載の抗体の機能的断片。
  10. 【請求項１０】 モノクローナル抗体である請求項8記載の抗体。
  11. 【請求項１１】 ポリクローナル抗体である請求項8記載の抗体。
  12. 【請求項１２】 請求項6記載のハプテン-キャリア複合体に応答して産生さ
    れる抗体。
  13. 【請求項１３】 請求項12記載の抗体の機能的断片。
  14. 【請求項１４】 モノクローナル抗体である請求項12記載の抗体。
  15. 【請求項１５】 ポリクローナル抗体である請求項12記載の抗体。
  16. 【請求項１６】 ニコチン中毒の治療を必要とする患者において、請求項1
    記載のハプテン-キャリア複合体の治療的に有効な量を投与することを含む、ニ
    コチン中毒を治療する方法。
  17. 【請求項１７】 ニコチン中毒の治療を必要とする患者において、請求項8
    記載の抗体の治療的に有効な量を投与することを含む、ニコチン中毒を治療する
    方法。
  18. 【請求項１８】 ニコチン中毒の予防を必要とする患者において、請求項1
    記載のハプテン-キャリア複合体の治療的に有効な量を投与することを含む、ニ
    コチン中毒を予防する方法。
  19. 【請求項１９】 ニコチン中毒の治療を必要とする患者において、請求項8
    記載の抗体の治療的に有効な量を投与することを含む、ニコチン中毒を予防する
    方法。
  20. 【請求項２０】 中毒の治療に有用な化合物を投与することをさらに含む、
    請求項16記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ニコチン中毒の治療を必要とする患者において、請求項6
    記載のハプテン-キャリア複合体の治療的に有効な量を投与することを含む、ニ
    コチン中毒を治療する方法。
  22. 【請求項２２】 中毒の治療に有用な化合物を投与することをさらに含む、
    請求項21記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ニコチン中毒の治療を必要とする患者において、請求項12
    記載の抗体の治療的に有効な量を投与することを含む、ニコチン中毒を治療する
    方法。
  24. 【請求項２４】 ニコチン中毒の予防を必要とする患者において、請求項6
    記載のハプテン-キャリア複合体の治療的に有効な量を投与することを含む、ニ
    コチン中毒を予防する方法。
  25. 【請求項２５】 ニコチン中毒の治療を必要とする患者において、請求項12
    記載の抗体の治療的に有効な量を投与することを含む、ニコチン中毒を予防する
    方法。
  26. 【請求項２６】 請求項1記載のハプテン-キャリア複合体を用いて宿主哺乳
    動物を免疫することを含む、抗体を生産する方法。
  27. 【請求項２７】 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項26記載の方法
    。
  28. 【請求項２８】 前記抗体がポリクローナル抗体である請求項26記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 請求項6記載のハプテン-キャリア複合体を用いて宿主哺乳
    動物を免疫することを含む、抗体を生産する方法。
  30. 【請求項３０】 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項29記載の方法
    。
  31. 【請求項３１】 前記抗体がポリクローナル抗体である請求項29記載の方法
    。
  32. 【請求項３２】 請求項1記載の少なくとも一つの複合体を含むワクチン組
    成物。
  33. 【請求項３３】 請求項6記載の少なくとも一つの複合体を含むワクチン組
    成物。
  34. 【請求項３４】 請求項8記載の抗体を含む、試料中のニコチンの存在を検
    出するためのキット。
  35. 【請求項３５】 請求項12記載の抗体を含む、試料中のニコチンの存在を検
    出するためのキット。
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