CN108362891B - 一种泼尼松的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种泼尼松的磁免疫化学发光检测试剂盒，它包括：酶标抗原、酶标抗原稀释液、磁标抗体、磁标抗体稀释液、泼尼松系列标准品溶液、化学发光底物A液、化学发光底物B液、复溶液、洗涤液，其中酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的泼尼松半抗原，磁标抗体是免疫磁珠标记的泼尼松单克隆抗体。本发明还公开了一种利用上述试剂盒配套化学发光检测仪检测牛奶中泼尼松残留量的方法，本方法对泼尼松检测具有较高的灵敏度、特异性和较短的检测时间。

Description

一种泼尼松的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种化学发光检测试剂盒及其检测方法，特别是检测牛奶中泼尼松残留量的磁免疫化学发光检测试剂盒，属于免疫学检测领域。

背景技术

泼尼松属于糖皮质激素，在生物合成和代谢过程中具有较强的调节作用，还具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用。在畜牧生产中，由于其对提高饲料转化率有显著作用，进而促进禽畜和水生生物的生长繁殖而得到广泛使用。然而近年来因为生产者对其认识不清、应用原则掌握不严、市场监管不力等原因，使其在畜牧生产过程中出现滥用。研究发现，糖皮质激素类药物在畜牧业中的过量使用导致的药物残留可引起肥胖、高血压、骨质疏松等疾病，危害消费者健康。

目前，针对兽药残留监控的标准技术规范日益完善。糖皮质激素检测手段主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法，由于以上诸分析法样品前处理比较复杂，操作时需专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用，因此亟需便携、高灵敏度的快速检测产品的出现。免疫检测方法是以抗原、抗体的特异性反应为基本原理建立起来的快速分析方法，由于抗原、抗体的结合具有高选择性和灵敏性，使得这一技术在药物残留检测领域得到广泛的应用。目前，最常用的免疫检测方法包括酶联免疫检测法和胶体金免疫层析检测法，但由于灵敏度较低，假阴性率和假阳性率较高，逐渐被灵敏度高、准确度高、检测时间短的化学发光免疫检测方法所替代。磁免疫化学发光检测试剂配套磁免疫化学发光检测仪检测动物源性产品中泼尼松的残留，实现检测过程的全自动化，减少人为操作误差，灵敏度高，准确度高，检测成本低，适用于大批量样品中泼尼松残留量的筛查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种泼尼松检测试剂盒，采用该试剂盒进行泼尼松残留量检测时，具有较高的灵敏度、特异性和准确度。

本发明的另一个目的在于提供一种检测泼尼松的方法，采用试剂盒配套化学发光检测仪进行泼尼松残留量检测时，不仅具有较高的灵敏度、特异性和准确度，而且实现了全自动化检测，缩短检测时间，减少人为操作误差。

本发明试剂盒，它包括：酶标抗原、酶标抗原稀释液、磁标抗体、磁标抗体稀释液、泼尼松系列标准品溶液、化学发光底物A液、化学发光底物B液、复溶液、洗涤液。

所述酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的泼尼松半抗原，所述磁标抗体是免疫磁珠标记的泼尼松单克隆抗体，所述泼尼松单克隆抗体是由泼尼松半抗原与钥孔血蓝蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原免疫动物制备获得；所述泼尼松半抗原是氯泼尼松与己二酰肼反应得到，其分子结构式为：

所述免疫磁珠表面含有—OH、—COOH或—NH₂活性基团。

所述化学发光底物A液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷溶液，化学发光底物B液为含有柠檬酸、无水Na₂HPO₄和CO(NH₂)₂·H₂O₂的水溶液。

所述泼尼松系列标准品溶液浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L。

所述酶标抗原稀释液是pH 7.2～7.6、Na₃PO₄浓度为0.01mol/L、NaCl浓度为0.25mol/L的缓冲溶液。

所述磁标抗体稀释液是pH 7.2～7.6、Na₃PO₄浓度为0.01mol/L、NaCl浓度为0.25mol/L的缓冲溶液。

所述复溶液是pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

所述洗涤液是pH 7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。

所述试剂盒配套化学发光检测仪检测牛奶中泼尼松的残留量。

本发明还提供一种利用上述试剂盒配套化学发光检测仪检测泼尼松残留量的方法，包括下列步骤：

1)将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；

2)将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪磁标抗体工作液容器中；

3)化学发光检测仪分别吸取30～60μL酶标抗原工作液、30～60μL待测样品液和30～60μL磁标抗体工作液，依次加入到反应杯存储装置中，室温下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离2～4min，弃上清液后用洗涤液300～500μL对复合物沉淀清洗3～5次；

4)将分离好的复合物放入测量暗箱，加入化学发光底物A液和化学发光底物B液各50μL，检测发出的相对光强度，样品中泼尼松的含量与相对光强度成负相关关系，通过相对光强度标准曲线计算泼尼松的残留量。

本发明中分析测试方法所用的化学发光检测仪包括电源电路、反应杯存储装置、样品存储装置、样品臂、试剂存储装置、试剂臂、运动式冷藏装置、清洗装置、自动注射泵、微光检测器，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果存储和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存和更新功能，两点自动修正标准曲线。

本发明的有益效果如下：

1)本发明试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，对泼尼松的检测灵敏度可达到0.1μg/L。

2)本发明试剂盒配套化学发光检测仪对样品中泼尼松残留量进行检测，实现检测过程的全自动化，减少人为操作误差，检测时间短，仅需20min即可完成对样品中泼尼松残留量的检测。

附图说明

图1：泼尼松半抗原合成路线图

图2：磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1：泼尼松磁免疫化学发光检测试剂盒具体组分的制备

1.泼尼松半抗原的合成(合成路线见附图1)

取氯泼尼松1.0g，加甲醇溶解，加氢化钠0.3g，搅拌，混匀，加己二酰肼0.49g，搅拌，70℃反应4h，停止反应，旋蒸，浓缩，加水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥蒸干，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(V/V，5/1)洗脱分离，得到己酰泼尼松半抗原产物1.2g，收率89％。

2.酶标抗原的制备

取己酰泼尼松半抗原8mg，加N,N-二甲基甲酰胺200μL溶解，得到A液；取辣根过氧化物酶100mg，加水6mL溶解，加碳化二亚胺(EDC)10mg，搅拌反应30min，得到B液；将A液滴加到B液中，4℃继续反应18h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化，得到酶标抗原，-20℃保存备用。

3.免疫原的制备

取己酰泼尼松半抗原17mg，加N,N-二甲基甲酰胺300μL溶解，得到A液；取钥孔血蓝蛋白50mg，加水3mL溶解，加EDC 13mg，搅拌反应30min，得到B液；将A液滴加到B液中，4℃继续反应18h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化，得到免疫原，-20℃保存备用。

4.泼尼松单克隆抗体的制备

(1)杂交瘤细胞的获得

1)首次免疫：将泼尼松半抗原-钥孔血蓝蛋白偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0.2mL；

2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；

3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1mL，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；

4)采用间接酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌泼尼松单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。

(2)单克隆抗体的制备

1)细胞复苏：取出泼尼松单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。

5.磁标抗体的制备

该过程以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠可与泼尼松单克隆抗体进行偶联，具体步骤如下：

(1)清洗：取100μL羧基磁珠(购于DYNAL，粒径为2.8μm，含量是0.15eq/g)于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；

(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/L MES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；

(3)偶联：将泼尼松单克隆抗体溶解到60μL pH5.0、25mmol/L MES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；

(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μL pH7.4的TRIS溶液反应15min封闭磁珠；

(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％BSA、0.1％吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％BSA、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN₃的TRIS溶液中(浓度为10mg/mL)，2-8℃保存备用。

实施例2：泼尼松磁免疫化学发光检测试剂盒的组建

组建泼尼松磁免疫化学发光检测试剂盒，使其包含下述组分：

(1)辣根过氧化物酶标记的泼尼松半抗原；

(2)酶标抗原稀释液为pH 7.2～7.6、Na₃PO₄浓度为0.01mol/L、NaCl浓度为0.25mol/L的缓冲溶液；

(3)免疫磁珠标记的泼尼松单克隆抗体；

(4)磁标抗体稀释液为pH 7.2～7.6、Na₃PO₄浓度为0.01mol/L、NaCl浓度为0.25mol/L的缓冲溶液；

(5)泼尼松系列标准品溶液浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L；

(6)化学发光底物A液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷溶液，化学发光底物B液为含有柠檬酸、无水Na₂HPO₄和CO(NH₂)₂·H₂O₂的水溶液；

(7)复溶液为pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；

(8)洗涤液为pH 7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。

实施例3：样品中泼尼松残留量的检测

1.样品前处理

吸取200μL牛奶样品，加入800μL复溶液，用振荡器振荡2min，混匀；取50μL用于分析。

2.用试剂盒检测

将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪磁标抗体工作液容器中；对每个样品/标准品设置样品架上的位置，输入样品信息和需要检测的测试项目名称；将样品管/标准品管放入已设定好的样品架上，化学发光检测仪依次吸取50μL酶标抗原工作液、50μL待测样品/标准品和50μL磁标抗体工作液加入到反应杯存储装置中，混匀，室温下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离4min，弃上清液后用洗涤液对复合物沉淀清洗3～5次，再加入化学发光底物A液和化学发光底物B液各50μL，检测其发出的相对光强度(RLU)，样品中泼尼松的含量与RLU成负相关关系，可以通过RLU结合标准曲线法计算泼尼松的残留量。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的RLU平均值(RLU)除以第一个标准品溶液(0标准)的RLU值(RLU₀)再乘以100％，得到相对发光强度(％)。以泼尼松标准品浓度(μg/L)的对数值为横坐标，相对发光强度为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。用同样的办法计算样品溶液的相对发光强度，相对应每一个样品的泼尼松含量则可从标准曲线上读出。

实施例4：泼尼松磁免疫化学发光检测试剂盒的质量评价

1.检测限

对空白牛奶样品20份进行检测，从标准曲线上查出对应于各相对发光强度的浓度，以20份样品浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对牛奶样品的检测限为0.5μg/L。

2.样品精密度和准确度试验

以回收率作为准确度评价指标，以重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差(RSD％)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率(％)＝实际测定值/理论值×100％，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差RSD％＝SD/X×100％，其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。

按0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L三个浓度泼尼松对空白牛奶样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂盒进行测定，计算样品平均回收率及精密度，结果见表1。

表1精密度及准确度试验

以0.5、1.0、2.0μg/L三个浓度的泼尼松对空白牛奶样品进行添加，平均回收率在80％～120％；批内、批间相对标准偏差均小于10％。

3.特异性试验

选择其他糖皮质激素类药物进行测定，通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度，用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率，结果见表2。

表2交叉反应率试验

药物名称	IC<sub>50</sub>(μg/L)	交叉反应率(％)
			泼尼松	0.297	100
氢化泼尼松	0.561	52.9
			醋酸泼尼松龙	0.662	44.9
可的松	2.305	12.9
			氢化可的松	19.3	1.54
地塞米松	—	＜0.1
			倍他米松	—	＜0.1
丙酸倍率米松	—	＜0.1
			甲基氢化泼尼松	—	＜0.1
氟氢可的松	—	＜0.1

注：IC₅₀为“—”是因为曲线扭曲变形，无法用于计算得出具体数值。

4.稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大RLU值(零标准)、50％抑制浓度、泼尼松添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。

Claims (5)

1.一种泼尼松的磁免疫化学发光检测试剂盒，包括酶标抗原、酶标抗原稀释液、磁标抗体、磁标抗体稀释液、泼尼松系列标准品溶液、化学发光底物A液、化学发光底物B液、复溶液、洗涤液；其特征在于：所述酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的泼尼松半抗原，所述磁标抗体是免疫磁珠标记的泼尼松单克隆抗体，所述泼尼松单克隆抗体是由泼尼松半抗原与钥孔血蓝蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原免疫动物制备获得；所述泼尼松半抗原的合成方法为：取氯泼尼松1.0g，加甲醇溶解，加氢化钠0.3g，搅拌，混匀，加己二酰肼0.49g，搅拌，70℃反应4h，停止反应，旋蒸，浓缩，加水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥蒸干，上硅胶柱，体积比为5:1的石油醚/乙酸乙酯洗脱分离，得到己酰泼尼松半抗原产物1.2g，即为泼尼松半抗原，其分子结构式为：

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述免疫磁珠表面含有—OH、—COOH或—NH₂活性基团。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述化学发光底物A液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷溶液，化学发光底物B液为含有柠檬酸、无水Na₂HPO₄和CO(NH₂)₂·H₂O₂的水溶液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒配套化学发光检测仪检测泼尼松的残留量。

5.一种利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒检测泼尼松的方法，包括下列步骤：

1)将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；

2)将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪磁标抗体工作液容器中；

3)化学发光检测仪分别吸取30～60μL酶标抗原工作液、30～60μL待测样品液和30～60μL磁标抗体工作液，依次加入到反应杯存储装置中，室温下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离2～4min，弃上清液后用洗涤液300～500μL对复合物沉淀清洗3～5次；

4)将分离好的复合物放入测量暗箱，加入化学发光底物A液和化学发光底物B液各50μL，检测发出的相对光强度，样品中泼尼松的含量与相对光强度成负相关关系，通过相对光强度标准曲线计算泼尼松的残留量。

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