CN104897896B

CN104897896B - 一种林可霉素的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN104897896B
Application number: CN201510176795.6A
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 冯才伟; 杜美红; 崔海峰; 聂雯莹; 徐念琴; 马腊腊; 何勇
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2035-04-14
Also published as: CN104897896A

Abstract

本发明涉及了检测林可霉素的磁免疫化学发光试剂盒，包括的试剂有：酶标抗原，酶标抗原稀释液，磁标抗体，磁标抗体稀释液，林可霉素系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩复溶液，浓缩洗涤液。酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的林可霉素半抗原的标记物，林可霉素半抗原是由林可霉素中的醇羟基经重铬酸吡啶氧化后得到酮基林可霉素，酮基林可霉素再与氨基丁酸进行缩合反应，得到四碳链羧基半抗原，磁标抗体是林可霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到。本发明还涉及一种采用所述的试剂盒配套化学发光检测仪检测牛奶和奶粉中林可霉素的方法，本方法对林可霉素检测具有较高的灵敏度、特异性和较短的检测时间。

Description

一种林可霉素的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种化学发光检测试剂盒及其检测方法。特别是检测牛奶、奶粉等样品中林可霉素残留量的磁免疫化学发光检测试剂盒。属于免疫学检测领域。

背景技术

林可霉素(Lincomycin,LIN)又称洁霉素，是由林肯链霉菌发酵产生的林可酰胺类抗生素。林可霉素具有较强的抑菌活性，主要作用于革兰氏阳性细菌，是一个RNA依赖的乙酰胆碱酯酶抑制剂。林可霉素作为饲料添加剂，有提高增重速率、改善饲料报酬的功效。使用方法主要是添加林可霉素制品混合于饲料中使用，或采用直接注入患病乳牛乳房治疗奶牛乳房炎，两种给药方式都会造成药物在牛乳中残留。据文献报道对奶牛乳房灌注给药以后，其排泄主要经乳腺随乳汁排出，可能导致在牛奶产品中相当水平的药物残留。我国食品卫生法规定，在应用抗生素期间和停药后5天内的乳不能食用，牛奶中残留的抗生素会危害饮用者身体健康。因此，各国对其残留均作出限量要求。欧盟和中国农业部235号文件规定食品中林可霉素最大残留限量：牛奶中150μg/L，肌肉中100μg/kg，肝脏中500μg/kg。

林可霉素残留量常用的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱质谱串联法(HPLC-MS/MS)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)、氮磷气相色谱检测法、薄层色谱法(TLC)、免疫测定法等。由于昂贵的仪器设备和复杂繁琐的操作过程，以及对检验人员的高技能要求，使得上述仪器检测方法不适合大量样品的筛查。酶联免疫检测法和胶体金免疫层析检测法虽然属于快速筛检方法，但由于方法灵敏度较低，假阴性率和假阳性率较高，逐渐被灵敏度高、准确度高、检测时间短的化学发光免疫检测方法所替代，磁免疫化学发光免疫检测试剂配套磁免疫化学发光检测仪检测食品中林可霉素的残留，实现检测过程的全自动化，减少人为操作误差，灵敏度可达到0.3μg/L，准确度高，检测成本低，适用于大批量样品中林可霉素残留量的筛查。

发明内容

本发明所要解决的技术问题自在于提供一种林可霉素检测试剂盒，采用该试剂盒进行林可霉素的检测时具有较高的灵敏度、特异性和准确度。

本发明的另一个目的在于提供一种林可霉素的检测方法，采用该试剂盒配合化学发光检测仪进行林可霉素的检测时不仅具有较高的灵敏度、特异性和准确度，而且实现了全自动化检测，缩短检测时间，减少人为操作误差。

为实现上述目的，本发明提供一种林可霉素检测试剂盒，其包含的主要试剂有：酶标抗原、酶标抗原稀释液、磁标抗体、磁标抗体稀释液、林可霉素系列标准品溶液、化学发光底物A、B液。

所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的林可霉素半抗原的标记物，林可霉素半抗原是由林可霉素中的醇羟基经重铬酸吡啶氧化后得到酮基林可霉素，酮基林可霉素再与氨基丁酸进行缩合反应，得到四碳链羧基半抗原。

所述磁标抗体是林可霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到。

所述磁珠表面含有-OH、-COOH或-NH₂活性基团。

所述林可霉素单克隆抗体是由林可霉素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。

所述化学发光底物A液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷的溶液。化学发光液B液为含有柠檬酸、无水Na₂HPO₄和CO(NH₂)₂·H₂O₂的水溶液。

所述试剂盒还包括标准品溶液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液。

所述试剂盒可以配套化学发光检测仪进行动物源性样品中林可霉素残留量的检测。

本发明还提供一种利用试剂盒配套化学发光仪检测林可霉素的方法，包括下列步骤：

1)将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；

2)将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪磁标抗体工作液容器中；

3)化学发光检测仪自分别动吸取30μL～80μL酶标抗原、30μL～80μL样品提取液和30μL～80μL磁标抗体，依次加入到反应区，在室温下反应15min，在磁分离区分离4min，弃上清液后用洗涤液300μL～500μL对复合物沉淀清洗3～5次；

4)将分离好的复合物放入测量暗箱，加入化学发光底物A液和B液各30μL～80μL，检测发出的相对光强度(RLU)，样品中林可霉素的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU标准曲线计算林可霉素的残留浓度。

本发明中分析测试方法所用的化学发光检测仪包括电源电路、反应杯存储装置、样品存储装置、样品臂、试剂存储装置、试剂臂、运动式冷藏装置、清洗装置、自动注射泵、微光检测器，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果存储和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存和更新功能，两点自动修正标准曲线。

本发明所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的林可霉素半抗原的标记物，其保存于含pH7.2～7.6，含吐温0.03％～0.05％吐温-20，0.02mol/L～0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。

所述酶标抗原稀释液是pH7.2～pH7.6、Na₃PO₄浓度为0.01mol/L、NaCl浓度为0.25mol/L的缓冲溶液。

所述磁标抗体是林可霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到。磁珠表面基团的含量是0.1eq/g～0.3eq/g，所述磁标抗体保存在pH7.2～7.6，含吐温0.1％～0.3％吐温-20，0.02mol/L～0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。

所述磁标抗体稀释液是pH7.2～pH7.6、Na₃PO₄浓度为0.01mol/L、NaCl浓度为0.25mol/L的缓冲溶液。

所述林可霉素单克隆抗体通过林可霉素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆和小鼠腹水的效价测定得到。

所述化学发光底物A液为鲁米诺含量为0.01μg/L～0.03μg/L、对甲苯酚含量为0.001μg/L～0.005μg/L、pH为8.0～9.0的三羟甲基氨基甲烷溶液，B液为每100mL水溶液含柠檬酸1.7g～2.3g，无水Na₂HPO₄2.2g～3.0g和体积百分含量为0.75％的CO(NH₂)₂·H₂O₂0.5mL～0.8mL。

所述林可霉素标准品溶液浓度分别为：0μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、10.8μg/L，标准品稀释液为pH7.4，含0.05％吐温-20，0.05mol/L的磷酸盐缓冲液。所述百分含量是质量百分含量。

所述浓缩复溶液具体为浓缩磷酸盐缓冲液，是每升含5.0g～8.0g的NaH₂PO₄·2H₂O、30.0g～35.0g Na₂HPO₄·12H₂O的水溶液。

所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.03％～0.08％吐温-20的pH＝7.4～7.6，0.1mol/L～0.7mol/L磷酸盐缓冲液。

本发明的有益效果如下：

1)本发明试剂盒的具有较高的灵敏度和特异性，对林可霉素的检测灵敏度可达到0.3μg/L。

2)本发明试剂盒配套化学发光检测仪对样品中林可霉素残留量进行检测，实现检测过程的全自动化，减少人为操作误差，检测时间短，仅需20min即可完成对样品中林可霉素残留量的检测。

附图说明

图1为林可霉素半抗原合成反应式。

图2为林可霉素半抗原核磁共振氢谱图。

图3为本发明磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线。

具体实施方式

实施例1：试剂盒具体组分的制备

1.林可霉素半抗原合成

林可霉素半抗原是由林可霉素中的醇羟基经重铬酸吡啶氧化后得到酮基林可霉素，酮基林可霉素再与氨基丁酸进行缩合反应，得到四碳链羧基半抗原。取0.8g～1.2g林可霉素加入到乙腈中溶解，再加入0.80g～0.85g重铬酸吡啶，搅拌，加入0.5mL～1.1mL乙酸酐和0.3mL～0.7mL乙酸，室温搅拌6h，待反应完全，停止反应并蒸干，上硅胶柱纯化，乙酸乙酯：石油醚＝1:1洗脱分离，得到产物1。取产物1加甲醇溶解，再加含1.0g～1.4g氨基丁酸的水溶液2mL～4mL和0.5g～0.8g氢氧化钾的水溶液2mL，于60℃加热反应7h，反应完全，停止反应，旋蒸，加水，调节pH值至6，加乙酸乙酯萃取，蒸干，得到无色油状物，再加乙醇重结晶得到林可霉素半抗原产物0.4g～0.6g。合成反应式如图1所示。

取上述林可霉素半抗原产物经核磁氢谱测定，如图2所示，化学位移δ＝11ppm的位置为羧基氢共振吸收峰，化学位移δ＝2.3、1.6、1.3ppm的位置为间隔臂上亚甲基的氢共振吸收峰，证明间隔臂连接成功，林可霉素半抗原合成成功。

2.酶标抗原的制备

取10mg～15mg林可霉素半抗原，溶解于1mL～1.5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；取27mg～32mg二氯乙烷(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.1mL～0.3mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取辣根过氧化物酶(HRP)30mg～50mg，使之充分溶解在pH7.2，3.8mL的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到HRP溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到林可霉素酶标抗原；分装，于-20℃保存备用。

3.免疫原的制备

将HRP 30mg～50mg替换为牛血清白蛋白(BSA)40mg～60mg，制备方法同上，得到免疫原。

4.林可霉素单克隆抗体的制备

A)动物免疫：用上述制备出的免疫原(RAC-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

B)细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

C)杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入林可霉素标准品溶液50μL，再加入细胞上清液50μL和羊抗鼠IgG-HRP 50μL，于37℃反应30min，洗板，再加入底物液显色液100μL，于25℃下避光反应15min，再加入终止液50μL，测定OD_450nm值下降到对照孔的50％以下，判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

D)单克隆抗体制备：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

5.磁标抗体的制备

A)磁珠活化

表面有-COOH基团的磁珠(购于DYNAL，粒径为2.8μm)，其含量是0.1eq/g～0.3eq/g，取100μL磁珠，用含有pH5.0、0.05％的吐温-20的浓度为25mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)100mL洗涤两次，磁分离后移除上清；磁珠活化前，用4℃贮存的上述MES溶液分别配制50mmol/L的EDC和NHS溶液；分别向装有磁珠的离心管中加入新配置的EDC和NHS溶液各50μL，涡旋混匀，室温活化30min；将离心管置于磁分离架上进行磁分离4min，移除上清液，再向其中加入100μL、pH5.0、25mmol/L的MES清洗2～3次后即可得到表面有羧基活化的磁珠。所述百分含量为质量百分含量。

B)磁珠偶联林可霉素单克隆抗体的制备

将8μg～12μg林可霉素单克隆抗体溶解到60μL、pH5.0、25mmol/L的MES中，向其中加入2mg～5mg活化的磁珠，并用上述浓度MES溶液调节总体积至100μL，轻柔地混匀磁珠与林可霉素单克隆抗体；室温条件下偶联30min～40min或4℃偶联2h，该期间可利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态；离心管置于磁分离架上进行磁分离3min～5min，移除上清液；为了淬灭未反应的-COOH，可加入100μL，pH7.2～pH7.6的三羟甲基氨基甲烷(TRIS)反应15min或100μL、pH8.0、乙醇胺浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液封闭磁珠；用100μL、0.1％～0.3％BSA、0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗封闭好的磁珠3～5次，将磁珠复溶于含0.1％～0.5％的BSA、 0.01％～0.1％吐温-20、0.02％NaN₅的磷酸盐缓冲液中，于2℃～8℃保藏。所述百分含量为质量百分含量。

实施例2：试剂盒的组建

组建检测林可霉素类药物的磁免疫化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：

辣根过氧化物酶标记的林可霉素半抗原的标记物

酶标抗原稀释液

林可霉素单克隆抗体与磁珠的偶联物

磁标抗体稀释液

林可霉素标准品溶液，浓度分别为：0μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、10.8μg/L，标准品稀释液为pH7.4，含0.05％吐温-20，0.05mol/L的磷酸盐缓冲液。所述百分含量是质量百分含量。

浓缩复溶液为浓缩磷酸盐缓冲液，是每升含5.0g～8.0g的NaH₂PO₄·2H₂O、30.0g～35.0g Na₂HPO₄·12H₂O的水溶液。

浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.03％～0.08％吐温-20的pH＝7.4～7.6，0.1mol/L～0.7mol/L磷酸盐缓冲液。

实施例3：样品中林可霉素残留量的检测

1.样品前处理方法

(1)牛奶

取50μL鲜牛奶样品加入950μL样品稀释液(用去离子水将浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释)，涡动混匀，取该溶液用于样品分析。

(2)奶粉

称取0.5g±0.05g奶粉样品，加入5mL样品稀释液，涡动混匀，从中取出200μL加入至600μL样品稀释液中，涡动混匀，取该溶液用于样品分析。

2.用试剂盒检测与结果分析

将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；对每个样品/标准品设置样品架上的位置，输入样品信息和需要检测的测试项目名称；将样品管/标准品管放入已设定好的样品架上，化学发光检测仪依次吸取30μL～60μL酶标抗原、30μL～60μL待测样品/标准品和30μL～60μL磁标抗体加入到反应杯中，混匀，并在室温下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离2min～4min，再用洗涤液为pH7.2～pH7.6、300μL～500μL的磷酸盐缓冲液清洗3次～5次，再加入化学发光底物A液和B液各50μL，检测其发出的相对光强度(RLU)，样品中林可霉素的含量与RLU成负相关关系，可以通过RLU结合标准曲线法计算林可霉素的浓度。

本发明采用6个林可霉素标准品(0μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、10.8μg/L)进行曲线测绘。将所获得的标准品和样品RLU值的平均值除以第一个标准品的RLU值(RLU₀值)再乘以100，以相对发光强度(％)＝RLU/RLU₀为纵坐标，林可霉素浓度的对数为横坐标做标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。标准曲线如图3所示。

实施例4：试剂盒质量的测定

1.试剂盒的检测限

试剂盒检测限的定义为：测定20次阴性样品，测定的平均值加上3倍标准差。该试剂盒的检测限为：牛奶6μg/L，奶粉12μg/kg。

2.试剂盒的准确度和精密度

准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒准确度常用回收率表示。精密度又称可重复性，常用变异系数表示。

按照实施例3的样品前处理方法，以6μg/L、12μg/L和24μg/L浓度的林可霉素对牛奶样品进行添加，以12μg/kg、24μg/kg和48μg/kg浓度的林可霉素对奶粉样品进行添加，每种样品每个浓度测定4个平行，用三批试剂盒进行测定，计算样品的回收率及精密度。实验结果见表1。

表1 准确度和精密度的测定

从表1可知，牛奶样品中林可霉素的添加回收率范围在85.8％～113.3％，奶粉样品中林可霉素的添加回收率范围在81.7％～119.2％。批内和批间变异系数均小于15％。

3.特异性

以林可霉素作为标准，设林可霉素的交叉反应率为100％，用于抗体交叉反应性研究的药物均为与林可霉素结构或者功能相似的竞争药物：林可霉素、克林霉素、北里霉素、螺旋霉素、红霉素、泰乐菌素、替米考星、安普霉素、泰妙菌素、大观霉素。按试剂盒步骤操作，制作抑制曲线，根据线性方程计算各药物的50％抑制浓度(IC₅₀)。交叉反应率(％CR)即为抗体对林可霉素的IC₅₀与抗体对林可霉素竞争物的IC₅₀之比的百分数，按下式进行计算：

结果列于表2：

表2 试剂盒特异性试验

竞争物	IC₅₀(μg/L)	交叉反应率(％)
			林可霉素	0.68	100.0
克林霉素	36.14	1.5
			北里霉素	58.77	<0.1
螺旋霉素	87.31	<0.1
			红霉素	103.48	<0.1
泰乐菌素	124.63	<0.1

替米考星	134.88	<0.1
			安普霉素	158.96	<0.1
泰妙菌素	169.53	<0.1
			大观霉素	204.97	<0.1

从表2可以看出，试剂盒对林可霉素具有较高的特异性，对与林可霉素结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。

Claims

1.一种林可霉素的磁免疫化学发光检测试剂盒，包括的试剂有：酶标抗原，酶标抗原稀释液，磁标抗体，磁标抗体稀释液，林可霉素系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩复溶液，浓缩洗涤液；其特征在于：所述酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的林可霉素半抗原的标记物，林可霉素半抗原是由林可霉素中的醇羟基经重铬酸吡啶氧化后得到酮基林可霉素，酮基林可霉素再与氨基丁酸进行缩合反应，得到四碳链羧基半抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述磁标抗体是林可霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到，所述林可霉素单克隆抗体是由林可霉素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述磁珠表面含有-OH、-COOH或-NH₂活性基团。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述化学发光底物A液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷的溶液，化学发光底物B液为含有柠檬酸、无水Na₂HPO₄和CO(NH₂)₂·H₂O₂的水溶液。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒配套化学发光检测仪检测林可霉素的残留量。

6.一种利用权利要求1～5任一项所述的试剂盒检测林可霉素的方法，包括下列步骤：

3)化学发光检测仪分别吸取30μL～60μL酶标抗原、30μL～60μL样品提取液和30μL～60μL磁标抗体，依次加入到反应杯存储装置中，在室温下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离2min～4min，弃上清液后用浓缩洗涤液300μL～500μL对复合物沉淀清洗3次～5次；

4)将分离好的复合物放入测量暗箱，加入化学发光底物A液和B液各50μL，检测发出的相对光强度，样品中林可霉素的含量与相对光强度成负相关关系，通过相对光强度标准曲线计算林可霉素的残留浓度。