KR20010090854A - 니코틴 중독의 치료 및 예방을 위한 합텐-담체 접합체 - Google Patents

니코틴 중독의 치료 및 예방을 위한 합텐-담체 접합체 Download PDF

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Abstract

신규한 합텐-담체 접합체는 생체 내에서 니코틴에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도할 수 있다. 이들 접합체는 면역원성 담체 단백질에 콘쥬게이트된 니코틴 합텐을 포함한다. 본 신규한 접합체는 천연의 (S)-(-) 상태로 니코틴의 카이랄성을 보존하며, 우수한 안정성을 갖는다. 본 접합체는 니코틴 중독의 예방 및 치료에 사용되는 능동 면역용 백신을 제조하는데 유용하다. 니코틴 합텐-담체 접합체에 반응하여 생성되는 항체를 수동 면역에 사용한다. 니코틴 중독의 예방 및 치료를 위해 이들 항체를 투여한다.

Description

니코틴 중독의 치료 및 예방을 위한 합텐-담체 접합체{Hapten-carrier conjugates for treating and preventing nicotine addiction}
담배, 시가 및 파이프 담배의 흡연은 미국과 전세계에 널리 퍼진 문제이다. 유연 담배와 무연 담배에는 중독성 물질로 알려진 니코틴이 풍부하다. 니코틴은 담배 식물로부터 유래되며 흡연의 정신 활성 및 중독성 효과의 원인이 되는 알칼로이드 물질이다. 니코틴은 단일 결합에 의해 서로 연결된 두 개의 환[방향족 6-원 환(피리딘)과 지방족 5-원 환(피롤리딘)]으로 이루어져 있다. 피롤리딘은 N-메틸화되어 있으며 C-2를 통하여 피리딘의 C-3에 연결되어 있다. 따라서, C-2는 카이랄성(chiral)이며, 두 개의 환을 연결하는 단일 결합 주위로 사실상 자유 회전한다. C-2의 절대 배치는 S형인 것으로 확립되어 있다. 따라서, 니코틴의 천연 배치는 (S)-(-)-니코틴이다.
니코틴의 사용은 담배, 시가, 파이프 담배 및 무연 담배를 쉽게 이용할 수 있기 때문에 널리 퍼져있다. 미국 보건복지부에 따르면, 흡연은 미국의 예방가능한 사망의 주요한 하나의 원인이다. 또한 맥기니스(McGinnis) 등의J. Am. Med. Assoc., 270, 2207-2211(1993)을 참조한다. 간접 흡연에 대한 노출도 또한 천식의 악화를 포함하여 건강에 매우 해로운 영향을 주는 것으로 보고되었다.
비록 니코틴의 중독성이 잘 알려져 있지만, 흡연은 널리 퍼져있다. 혈중 니코틴의 피크 레벨은 약 25~50ng/ml이며, 흡연 후 10~15분 이내에 도달한다. 인간에 있어서, 흡연은 니코틴이 폐에서 심장으로 빠르게 전달되기 때문에 동맥의 니코틴 농도가 정맥의 니코틴 농도보다 10배 높다[헤닝필드(Henningfield)(1993)Drug Alcohol Depend. 33:23-29 참조]. 이것은 동맥의 고농도의 니코틴을 뇌로 빠르게 전달하는 결과를 낳는다. 일단 니코틴이 혈뇌 장벽을 통과하면, 호흡, 심장 박동수의 유지, 기억, 경계심 및 근육 운동에 관여하는 신경 전달 물질인 아세틸콜린에 의해 일반적으로 활성화되는 콜린작동성 수용체에 니코틴이 결합한다는 증거가 제안되어 있다. 니코틴이 상기 수용체에 결합하면, 도파민과 같은 다른 신경 전달 물질의 방출을 유도함으로써 정상적인 뇌 기능에 영향을 미칠 수 있다. 도파민은 감정, 동기 부여 및 기쁨의 감정에 관여하는 뇌 영역에서 발견된다. 흡연자의 니코틴 중독 또는 다른 니코틴 흡수로 인한 중독은 바로 신경 전달 물질, 특히 도파민의 방출에 기인한 것이다.
건강에 미치는 흡연의 상당한 역효과로 인하여, 흡연자들은 종종 금연하려고노력한다. 그러나, 니코틴의 중독성 및 담배의 구입 용이성으로 인하여 니코틴에 대한 의존성이 계속 증가하며 금연을 시도한 사람들의 실패율이 높다. 금단 증상은 불쾌하며, 흡연에 의해 제거된다.
니코틴 중독에 대한 각종 치료법이 개발되었지만, 거의 효과가 없다. 두 가지의 가장 인기 있는 치료법은 니코틴 경피성 패치와 니코틴이 혼합된 껌이다. 이들 치료법은 "니코틴 대체 치료법(NRT, nicotine replacement therapies)"이라고 하며, 사용자가 전에 흡연으로부터 받은 니코틴의 양을 대체하며 사용자로부터 니코틴을 떼어놓는 역할을 한다. 그러나, 상기 치료법에서 몇 가지 약점이 발견된다. 특히, 혈류로 니코틴의 침투가 낮으며 따라서 흡연 욕구가 증가한다. 구강 염증, 턱의 통증, 멀미와 같은 문제는 니코틴 껌의 사용과 관련되어 있다. 피부 염증, 수면 장애 및 신경 과민과 같은 문제는 니코틴 경피성 패치의 사용과 관련되어 있다.
따라서, 니코틴 중독을 치료하기 위한 다른 방법이 요구된다. 문헌이 이러한 요구를 인식하고, 니코틴 중독의 치료 방법을 제공하기 위한 몇몇 시도가 있었다. 그 방법 중에 하나는 니코틴에 반응하여 생성된 항체의 투여에 관한 것이다. 그러나, 합텐이라 불리는 저분자량 물질은 숙주 동물에서 면역 반응을 유도할 수 없는 것으로 알려져 있다. 니코틴도 예외가 아니며, 작은 분자로서 면역원성이 없다. 합텐에 대한 항체 반응을 유도하기 위하여, 통상 담체 단백질에 공유 결합되어 있으며, 이 접합체가 합텐을 인식하는 항체의 생산을 유도한다.
예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 공유 결합된 코티닌 4'-카르복시산은 니코틴 대사 산물인 코티닌에 대한 항체를 생성하기 위하여 사용되었다. 이들항체는 생리수 중의 코티닌의 존재를 결정하는데 사용되었다. 브저크(Bjerke) 등의J. Immunol. Methods, 96, 239-246(1987)을 참조한다.
다른 니코틴 항체가 카스트로(Castro) 등에 의해 제조되었다[Eur. J. Biochem.,104, 331-340(1980)]. 카스트로 등은 니코틴 합텐을 준비하고 소 혈청 알부민(BSA, bovine serum albumin)에 콘쥬게이트(conjugate)하였으며, 상기 담체 단백질은 니코틴의 6-위치에서 링커(linker)를 통하여 콘쥬게이트된다. 카스트로 등은 항체를 생성하기 위하여 포유동물에 주입될 또 다른 니코틴-BSA 접합체(conjugates)를 준비하였다. 또 다른 문헌에서, 카스트로 등은 두 개의 니코틴-알부민 접합체[N-숙시닐-6-아미노-(±)-니코틴-BSA 및 6-(σ-아미노카프라미도)-(±)-니코틴-BSA]를 개시하고 있다[Biochem. Biophys. Res. Commun.67, 583-589(1975)]. 상기 1975년 문헌에서, 카스트로 등은 또한 니코틴-담체 접합체 6-(σ-아미노카프라미도)-(±)-니코틴-BSA에 대한 항체를 사용하여 혈액과 소변중의 니코틴의 수준을 측정하였다[Res. Commun. Chem. Path. Pharm.51, 393-404(1986)].
스와인(Swain) 등은 합텐이 니코틴의 1-, 2-, 4-, 5-, 6- 또는 1'-위치에서 콘쥬게이트된 니코틴-담체 접합체를 개시하였다(WO98/14216). 히에다(Hieda) 등은 키홀 림펫 헤모시아닌에 연결된 6-(카르복시메틸유레이도)-(±)-니코틴으로 면역된 동물이 니코틴에 특이적인 항체를 생산함을 보여주었다[J. Pharm. and Exper. Thera. 283, 1076-1081(1997)]. 랑곤(Langone) 등은 합텐 유도체인 O-숙시닐-3'-히드록시메틸-니코틴을 제조하고, 방사면역분석법에서 상기 합텐-담체 접합체에 대한항체를 사용하였다(Biochemistry, 12, 5025-5030 참조).Methods in Enzymology, 84, 628-635(1982)를 참조한다. 랑곤에 의해 제조된 접합체는 가수분해되기 쉽다. 또한, 아바드(Abad) 등은 ELISA 분석법으로 담배 연기 응축물 중의 니코틴 함량을 측정하기 위하여Anal. Chem., 65, 3227-3231(1993)에서 3'-(히드록시메틸)니코틴 헤미숙시네이트를 소 혈청 알부민에 콘쥬게이트하여 니코틴에 대한 항체 생산을 기술하였다.
따라서, 종래 기술은 니코틴 합텐의 카이랄 특성을 유지하며 니코틴 에피토프의 성질을 보존하면서 합텐을 담체에 연결하는 안정한 니코틴-담체 접합체에 이르지는 못하였다. 더욱이, 종래 기술은 이러한 접합체를 사용하여 니코틴 중독의 예방 및 치료법을 달성하거나 제안하지 못했다. 시만(Seeman)은Heterocycles, 22, 165-193(1984)에서 니코틴의 배좌 해석 및 화학 반응에 관한 연구 결과를 발표하였다.
본 발명은 니코틴 중독의 치료 및 예방에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항체 생산을 유도할 수 있는 신규한 합텐-담체 접합체(conjugates)에 관한 것이다. 이러한 항체는 니코틴에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 제제로 니코틴-담체 접합체를 투여함으로써 니코틴 중독의 예방 또는 치료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 니코틴 중독의 예방 및 치료를 위하여 합텐-담체 접합체에 반응하는 항체를 사용하는 것에 관한 것이다.
도 1은 니코틴의 단일 주사 후, 3'AMNic-Suc-rEPA 접합체 백신을 사용하여 쥐 혈청의 니코틴 수준에 미치는 능동 면역의 효과를 나타내는 차트이다. 니코틴 주사 후 3분 및 10분에서의 혈청의 니코틴 수준을 나타낸다.
도 2는 3'AMNic-Suc-rEPA에 대한 항체를 사용하여 쥐의 혈액 및 뇌에서의 니코틴 수준에 미치는 수동 면역의 효과를 나타낸다. 쥐는 12.5mg, 25mg 및 50mg의항체로 처리하였다.
도 3은 3'AMNic-Suc-rEPA에 대한 항체를 사용하여 쥐의 혈청 및 뇌에서의 니코틴 수준에 미치는 수동 면역의 효과를 나타낸다. 니코틴 수준은 항체 투여 30분 및 1일 후에 측정하였으며 샘플은 니코틴 주사 3분 후에 채취하였다.
도 4는 니코틴의 복수 주사 후, 3'AMNic-Suc-rEPA에 대한 항체를 사용하여 쥐 혈청의 니코틴 수준에 미치는 수동 면역의 효과를 나타낸다.
도 5는 니코틴의 복수 주사 후, 3'AMNic-Suc-rEPA에 대한 항체를 사용하여 쥐 뇌의 니코틴 수준에 미치는 수동 면역의 효과를 나타낸다.
도 6은 3'AMNic-Suc-rEPA에 대한 항체를 사용하여 쥐에서 니코틴-유도성 이동 효과에 미치는 수동 면역의 효과를 나타낸다.
도 7은 3'AMNic-Suc-rEPA에 대한 항체를 사용하여 니코틴-유도성 수축 혈압 증가에 미치는 수동 면역의 효과를 나타낸다. 본 도면은 항체 양의 증가가 니코틴에 의한 혈압 상승을 줄이는데 있어서 항체의 유효성을 증대시킴을 나타내다.
니코틴 중독의 치료를 위한 더욱 효과적인 방법에 대한 요구에 응하여, 본 발명의 하나의 목적은 안정하고, 천연의 (S)-(-) 형태의 니코틴을 포함하며, 니코틴 에피토프의 성질 및 니코틴 분자의 두 개의 환의 상대적 배향을 보존하는 니코틴-담체 결합을 이용하는 신규한 니코틴-담체 접합체를 제공하는 것이다. 니코틴의 두 개의 환 및 이들의 상대적 배향은 용액에서 항체에 의한 니코틴의 인식에 필수적인 것으로 생각된다. 이러한 접합체는 니코틴에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 생산을 자극할 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 접합체를 사용하여 포유동물에서 혈청의 니코틴 수준을 증가시키고, 뇌의 니코틴 수준은 감소시켰다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 접합체를 사용하여 니코틴에 의해 유도된 혈압의 변화 및 이동 효과(locomotor effect)를 방지하였다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 접합체를 니코틴 중독 환자에 투여하여 항-니코틴 항체를 환자에 생성함으로써 니코틴 중독을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 환자가 흡연할 때(또는 담배 껌을 씹을 때), 이들 제품으로부터 나온 니코틴은 혈중 항-니코틴 항체에 결합하여 니코틴이 혈뇌 장벽을 통과하지 못하게 함으로써, 니코틴 중독의 원인인 니코틴-유도성 뇌 화학적 변형을 제거한다. 이 점에 있어서, 니코틴-담체 접합체가 천연의 니코틴 분자를 인식하는 항체의 생산을 유도한다는 것은 중요하다. 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 신규한 니코틴-담체 접합체는 자연발생적인 니코틴의 카이랄성과 에피토프를 보존한다.
본 발명자들은 니코틴 접합체, 및 이러한 접합체에 반응하여 생성된 항체가 포유동물에 의해 섭취된 니코틴의 영향을 억제하는 방법에 관한 특정 이론에 의해 구애받지 않는다. 본 항체는 니코틴이 혈뇌 장벽을 통과하는 것을 방지하며, 또한 단일 입체적 방해에 의해 말초신경계에서 니코틴이 다른 수용체에 결합하는 것도 방지한다.
이들 목적은 하기 화학식(I)의 합텐-담체 접합체를 제공함으로써 얻을 수 있다:
[화학식 I]
식 중, m은 1~2500, n은 0~12, y는 1~12이며, X는 NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO 및 S-S로 구성된 군으로부터 선택되고; Y는 NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO 및 S-S로 구성된 군으로부터 선택되며, -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- 잔기는 3'-, 4'- 또는 5'-위치에 결합된다. 합텐-담체 접합체의 바람직한 구현예는 m이 11~17, n은 1, y는 2이며, X는 NH-CO이고, Y는 CO-NH이며, 담체 단백질은 엑소프로틴A이며 -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- 잔기는 3'-위치에 결합된다. 합텐-담체 접합체의 다른 바람직한 구현예는 m이 11~17, n은 1, y는 2이며, X는 NH-CO이고, Y는 CO-NH이며, 담체 단백질은 엑소프로틴A이며 -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- 잔기는 5'-위치에 결합된다. 추가적으로 바람직한 구현예는 m이 1 내지 20 및 1 내지 200으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 목적은 또한 하기 화학식(III)의 합텐-담체 접합체를 제공함으로써 얻어진다:
[화학식 III]
식 중, n은 0~12, j는 1~1000, k는 1~20이며, E는 아미노산-함유 매트릭스이다. 바람직한 구현예는 상기 매트릭스가 폴리-L-글루탐산이다.
본 목적은 또한 화학식(I)의 합텐-담체 접합체에 반응하여 생성된 항체를 제공함으로써 달성할 수 있다. 추가적인 구현예는 상기 항체가 관능성 단편이다. 바람직한 구현예는 상기 항체가 단일클론성 항체이다. 본 발명의 추가적인 구현예는 상기 항체가 다클론성이다.
본 목적은 또한 화학식(III)의 합텐-담체 접합체에 반응하여 생성된 항체를 제공함으로써 달성할 수 있다. 추가적인 구현예는 상기 항체가 관능성 단편이다. 바람직한 구현예는 상기 항체가 단일클론성 항체이다. 본 발명의 추가적인 구현예는 상기 항체가 다클론성이다.
본 목적은 화학식(I) 또는 화학식(III)의 합텐-담체 접합체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이러한 치료를 필요로 하는 환자의 니코틴 중독을 치료 또는 예방하는 방법을 제공함으로써 얻을 수 있다. 다르게는, 본 목적은 화학식(I) 또는 화학식(III)의 합텐-담체 접합체에 반응하여 생성된 항체를 치료 유효량으로투여하는 것을 포함하여 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 니코틴 중독을 치료 또는 예방하는 방법을 제공함으로써 얻을 수 있다.
또한, 본 목적은 화학식(I) 또는 화학식(III)의 합텐-담체 접합체를 포함하는 백신 조성물을 제공함으로써 달성할 수 있다. 또한 상기 백신은 니코틴 중독을 치료하기 위한 추가적인 치료 조성물을 더 포함할 수 있다.
본 목적은 또한 화학식(I) 또는 화학식(III)의 합텐-담체 접합체로 숙주 동물을 면역시키는 단계를 포함하는 항체 생산 방법을 제공함으로써 달성할 수 있다. 바람직한 구현예는 생성된 항체가 단일클론성 항체이다. 추가적인 구현예는 상기 항체가 다클론성이다.
추가적인 목적은 화학식(I) 또는 화학식(III)의 합텐-담체 접합체에 반응하여 생성된 항체를 포함하여 샘플 중의 니코틴의 존재를 결정하기 위한 키트를 제공함으로써 달성할 수 있다.
당업자에게 명백한 상기 목적들은 이하 상세한 설명과 첨부된 청구범위에서 하기 기술한 본 발명에 의해 달성하였다.
본 발명은 니코틴 중독을 치료하기 위한 니코틴 합텐-담체 접합체를 제공한다. 본 니코틴 합텐-담체 접합체는 하기 화학식(I)이다:
식 중, m은 1~2500, n은 0~12, y는 1~12이며, X는 NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO 및 S-S로 구성된 군으로부터 선택되고; Y는 NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO 및 S-S로 구성된 군으로부터 선택되며; 담체 단백질은 임의의 적합한 면역원성 단백질 또는 폴리펩티드이다. 바람직하게는 담체 단백질은 T-세포 에피토프를 포함해도 좋으며, -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- 잔기는 니코틴 분자의 3'-, 4'- 또는 5'-위치에 결합된다.
화학식(I)에서, m은 1~200이 바람직하다. 다른 바람직한 구현예는 m이 1~20이다. 특히 바람직한 구현예는 m이 11~17이다. 다른 바람직한 구현예는 X가 NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH 및 CO-NH-NH-CO로 구성된 군으로부터 선택된다.
m이 1이상이면, 각괄호 내의 잔기가 담체 단백질의 상이한 부착점에 m회 부착된다. 예를 들면, m=2이면, 화학식(I)은 하기와 같이 된다:
항체가 니코틴 자체에 대해서는 생성될 수 없기 때문에, 본 발명자들은 니코틴의 3'-, 4'- 또는 5'-위치에서 유도된 니코틴 합텐을 개발하였다. 본 잔기는 담체 단백질에 결합되어 합텐-담체 접합체를 생성하고, 적합한 숙주 포유동물에 주사될 때 니코틴 잔기에 대한 항체를 생성할 것이다. 이 점에 있어서, 포유동물에 투여될 때 항체 생산을 유도하는 합텐-담체 접합체를 포함하는 약학 조성물을 위하여, 상기 담체 단백질은 면역원성을 가져야 한다. 바람직하게는, T-세포 에피토프를 포함한다. 따라서, 담체 단백질이 니코틴 합텐에 콘쥬게이트되고, 이어서 포유동물에 투여될 때, 포유동물은 상기 니코틴 합텐에 반응하여 항체를 생산 또는 "키운다(raise)".
합텐 및 유도법
본 발명에서 사용된 "합텐"이란 용어는 그 자체로는 면역 반응을 유발할 수 없지만 담체 단백질에 결합되면 면역 반응을 유발하는 저분자량 유기 화합물을 지칭한다. 바람직한 구현예는 합텐이 링커를 통하여 담체에 결합된다. 본 발명의 합텐은 니코틴 유도체이다. 본 니코틴 합텐은 담체가 직접 결합되거나, 링커를 통하여 결합되거나, 또는 매트릭스를 통하여, 또는 링커와 매트릭스를 통하여 결합될 수 있는 반응성 관능기를 함유한다. 바람직하게는, 니코틴 합텐은 아미드 또는 이황화 결합을 통하여 담체 단백질에 결합된다. 아미드 또는 이황화 결합은 바람직한 안정성을 갖는다. 본 발명의 합텐-담체 접합체가 백신으로 사용되기 때문에, 백신의 저장 수명을 연장하는데 있어서 접합체가 안정하다는 것은 중요하다.
본 발명의 바람직한 구현예는 니코틴 합텐이 하기 화학식(II)으로 표시되는 것이다:
[화학식 II]
식 중, n은 0~12이며, Z는 NH2, COOH, CHO 또는 SH이고, -(CH2)n-Z는 3'-, 4'- 또는 5'-위치에 결합될 수 있다. Z 잔기는 직접 또는 링커를 통하여 담체에 결합할 수 있다. 본 합텐-담체 접합체는 환자 또는 동물의 몸 속에 도입되면 항체의 생산을 유도할 수 있다.
특히 바람직한 구현예는 니코틴 합텐이 하기 화학식(3'-아미노메틸 니코틴)이다:
1. 직접 접합체
"직접 접합체"를 제조하기 위하여, 단일 니코틴 합텐이 링커의 사용 여부에 관계없이 담체에 직접 결합된다. 예를 들면, 단일 니코틴 합텐이 담체의 각 사용가능한 아민기에 결합될 수 있다. 호모이관능성(homobifunctional) 또는 헤테로이관능성(heterobifunctional) 크로스링커를 사용하여 합텐을 담체 단백질에 직접 콘쥬게이트하는 일반적인 방법은 예를 들면 지.티.헤르만손(G.T.Hermanson)의 "Bioconjugate Techniques"[Academic Press(1996)] 및 딕(Dick) 및 뷰렛(Beurret)의 "Conjugate Vaccines"[Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basal(1989) vol.10, 48-114]에 기재되어 있다. 이관능성 크로스링커를 사용한 직접 콘쥬게이션에서는 합텐 대 단백질의 몰 비율이 특정 콘쥬게이션 화학에서 사용되는 단백질 상의 이용가능한 관능기의 수에 의해 제한된다. 예를 들면, n개의 리신 잔기를 갖는 담체 단백질을 사용하면, 링커의 카르복시기와 반응할 수 있는 1차 아민(말단 아미노 포함)의 수는 이론적으로 n+1개이다. 따라서, 직접 콘쥬게이션 방법을 사용하면 생성물은 형성되는 아미도 결합의 수가 n+1개, 즉 결합되는 합텐의 수가 최대 n+1개로 제한될 것이다.
당업자는 니코틴 합텐을 담체 단백질에 콘쥬게이트하는데 사용되는 반응물의 농도와 담체 단백질의 성질에 따라 합텐 대 담체의 비율이 다양함을 인식할 것이다. 또한, 주어진 니코틴-담체 접합체의 제조물 내에서도 각 접합체의 합텐/담체 비율은 다양할 것이다. 예를 들면, 엑소프로틴A는 이론적으로 합텐과 콘쥬게이트할 수 있는 15개의 아민을 갖고 있다. 그러나, 본 발명자들은 3'-아미노메틸-숙시닐-니코틴이 상기 단백질에 콘쥬게이트될 때, 접합체의 단일 제조에서 11~17개의 니코틴 합텐이 각 엑소프로틴A 담체에 결합된다는 것을 알아냈다. 상기 범위는 기체 여과 크로마토그래피를 사용하고 260nm에서 UV 흡광도의 증가를 측정하여 실험적으로 결정되었다. 니코틴 합텐이 담체의 비-아민 잔기에 결합할 수 있기 때문에 17개의 니코틴이 몇몇 담체에 결합되었다. 합텐이 결합할 수 있는 비-아민 잔기의 예로는 -SH 및 -OH 잔기를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 이들 부반응의 발생률은 낮다.
2. 매트릭스 접합체
직접 접합체를 사용할 때 담체에 결합될 수 있는 합텐의 수의 한계를 극복하기 위하여, 아미노산 "매트릭스"를 사용할 수 있다. "매트릭스"라는 용어는 올리고머성 및 폴리머성 폴리펩티드를 포함하는 아미노산, 펩티드, 디펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 매트릭스는 또한 선형 또는 분지형 폴리펩티드여도 좋다. 매트릭스를 형성하는데 사용될 수 있는 아미노산의 예로는 아스파르트산, 리신, 시스테인 및 L-글루탐산을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 매트릭스 물질은 폴리-L-글루탐산과 같은 폴리머 형태로 제조되어도 좋다. 시스테인과 같은 아미노산이 사용되면, 티올기가 보호되며, 이로써 합텐이 아미노산의 카르복시기에 결합되게 된다. 보호기의 종류와 보호기를 아미노산 관능기에 결합시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 검토용으로 그린(Green)의 "Protective Groups in Organic Chemistry(John Wiley & Sons, 뉴욕, 1991)"을 참조한다.
적합한 매트릭스는 적합한 관능기를 갖고 있으며 2이상의 합텐이 탑재되어 있다. 따라서, 본 발명의 다른 바람직한 구현예는 합텐-담체 접합체에서 합텐 대 담체의 몰 비율을 증가시키기 위하여 니코틴-치환 매트릭스가 담체 단백질에 콘쥬게이트되어 있는 것이다. 매트릭스는 이중 역할을 하는데, 하나는 수많은 합텐에 대한 지지체로서, 다른 하나는 크로스 링커로서의 역할을 한다. 담체 단백질에 콘쥬게이트된 니코틴-치환 매트릭스는 하기 화학식(III)으로 표시된다:
식 중, n은 0~12, j는 1~1000, k는 1~20이며, E는 합텐이 결합될 수 있는 아미노산-함유 매트릭스이며, 담체 단백질은 T-세포 에피토프를 포함하는 임의의 적합한 단백질 또는 폴리펩티드이다. 아미노산-함유 매트릭스(E)는 올리고머성뿐만 아니라 폴리머성 폴리펩티드를 포함하는 아미노산, 펩티드, 디펩티드 또는 폴리펩티드여도 좋다. 매트릭스는 아스파르트산, 리신, 시스테인 및 폴리-L-글루탐산을 포함하는 하나 이상의 아미노산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구현예는 j가 1~200이며, 다른 바람직한 구현예는 j가 1~4이다.
매트릭스-담체 접합체는 다중결합성 "격자(lattice)"를 형성할 수 있다. 이러한 격자는 하기 도면에 나타낸다. "격자"라는 용어는 모두 함께 공유 결합된 다중 매트릭스, 합텐, 링커 및 담체 단백질을 포함하는 공유 결합된 결합체를 지칭하는데 사용된다. 니코틴-치환 매트릭스가 담체와 콘쥬게이션할 수 있는 복수의 니코틴 잔기를 포함하기 때문에, 복수의 담체를 포함하는 격자 및 복수의 니코틴-치환 매트릭스가 형성될 수 있다. 이러한 격자를 단순화시킨 도면은 하기와 같다:
당업자는 본 발명에 따른 격자가 화학식(III)의 합텐-담체 접합체를 포함하는 것으로 인식할 것이다.
매트릭스를 사용하는 본 콘쥬게이션 방법은 단백질 상의 콘쥬게이션에 사용가능한 관능기의 수에 무관하게 합텐 대 단백질의 몰 비율을 융통성 있게 조절할 수 있다. 이것은 특정 담체 단백질이 사용될 때와 접합체의 높은 면역원성을 얻기 위하여 최적 비율을 얻을 필요가 있을 때 특히 유용하다. 매트릭스를 이용할 때 사용할 필요가 없지만, 상기 링커를 사용할 수 있다. 링커를 본 구현예와 함께 사용하기 위하여, 니코틴-치환 매트릭스를 활성 링커 화합물과 반응시킨다. 예를 들면, ADH(adipic acid dihydrazide)가 매트릭스 접합체에 대한 링커로 사용될 수 있다.
담체 단백질
니코틴 합텐이 제조되면, 이어서 니코틴-담체 접합체에 대한 항체를 생성시키는데 사용될 담체 단백질에 콘쥬게이트시킨다. 본 발명의 니코틴 담체 접합체에사용되는 담체 단백질은 화학식(I) 및 화학식(III)에서와 같이 표시되며 임의의 적합한 면역원성 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. "면역원성" 분자는 면역 반응을 유발할 수 있는 분자이다. 바람직하게는, 담체 단백질이 T-세포 에피토프를 포함한다. "담체 단백질"에는 또한 분지된 펩티드인 MAPs 즉 다중-항원성 펩티드도 포함된다. MAP를 사용함으로써, 합텐 밀도 및 수가는 다중 분지된 아미노산 잔기 때문에 최대화된다. MAP를 형성하는데 사용될 수 있는 아미노산의 예로는 리신을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 담체 단백질은 T-세포를 자극할 수 있고, 이어서 B-세포로 하여금 전체 합텐-담체 접합체 분자에 대한 항체를 생산하도록 유도하는 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 함유하는 분자를 포함한다. 본 발명을 기술하는데 사용된 "에피토프"라는 용어는 항체 분자와의 특이적 상호작용에 관여하는 항원 상의 결정 인자를 포함한다. 에피토프의 결정 인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹들로 구성되며, 특정 전하 특성뿐만 아니라 특정한 3차원 구조적 특성을 갖는다. 면역원성을 가지기 위해서는 단백질 또는 폴리펩티드가 T-세포를 자극할 수 있어야 한다고 여겨진다. 그러나, T-세포 에피토프가 결핍된 담체 단백질도 또한 면역원성을 가질 수 있다.
강한 면역 반응을 유발하는 것으로 알려진 담체 단백질을 선택함으로써, 본 발명의 합텐-담체 접합체에 의해 다양한 집단의 환자를 치료할 수 있다. 담체 단백질은 백신에 대하여 강한 면역 반응을 유발하기 위하여 충분히 외래적이어야 한다.통상, 바람직하게 사용되는 담체 단백질은 공유 결합된 합텐에 면역원성을 부여할 수 있는 거대 분자이다. 특히 바람직한 담체 단백질은 본래부터 면역원성이 높은 것이다. 따라서, 면역원성의 정도가 높고 합텐에 대한 항체 생산을 최대화할 수 있는 담체 단백질이 매우 바람직하다.
BSA와 KLH는 동물을 이용하여 실험할 때 접합체 백신의 개발에서 담체로서 흔히 사용되고 있다. 그러나, 이들 단백질은 인간에 사용하기에는 적합하지 않을 수 있다. 치료용 접합체 백신을 제조하는데 사용되는 단백질로는 병원성 박테리아의 수많은 독소 및 변성 독소를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 예로는 디프테리아와 파상풍 독소 및 이의 의학적으로 허용가능한 상응하는 변성 독소를 들 수 있다. 다른 후보 물질은 교차 반응성 물질(CRMs, cross-reacting materials)로 불리는 박테리아 독소와 항원적으로 유사한 단백질이다.
니코틴 접합체의 약학 조성물을 제조할 때는 재조합Pseudomonas aeruginosa엑소프로틴A(rEPA)가 구조 및 생물학적 활성이 잘 분석되어 있기 때문에 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 또한, 이 재조합 단백질은 미국 NIH와 본 발명자들에 의해Staphylococcus aureus캡슐형 다당류 접합체 백신으로 인간에게 성공적이고 안전하게 사용되었다[파톰(Fattom) 등,Infect Immun.61, 1023-1032(1993)]. 이 단백질은 553번 위치의 아미노산 결실에 의해 원래의 외독소의 내생적인 효소 활성이 제거되었기 때문에 적합한 단백질 담체로서 확인되었다. 그 결과, rEPA는 천연 외독소A(ETA)와 동일한 면역 프로필을 갖지만, 천연 ETA의 간세포 독성은 갖지 않는다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, "엑소프로틴A"는 변형된 비-간세포 독성을 갖는 ETA를 지칭한다. 이러한 엑소프로틴A의 한 예는 553번 위치에서 아미노산 결실이 있다.
담체 단백질에 대한 합텐의 콘쥬게이션
담체를 합텐과 같은 작은 분자에 연결 또는 콘쥬게이션을 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있는 수많은 관능기가 있다. 그 예로는 카르복시산, 무수물, 혼합 무수물, 아실 할로겐화물, 아실 아지화물, 알킬 할로겐화물, N-말레이미드, 이미노 에스테르, 이소시아네이트, 아민, 티올 및 이소티오시아네이트와 같은 관능성 잔기 및 당업자에 공지된 다른 잔기를 들 수 있다. 이들 잔기는 단백질 분자의 반응기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 사용된 관능성 잔기에 따라, 반응기는 반응시 아미드, 아민, 티오에테르, 아미딘유레아 또는 티오유레아 결합을 형성하는 담체 단백질 또는 변형된 담체 단백질 분자 상의 리신 잔기의 ε아미노기 또는 티올기일 수 있다. 당업자는 다른 적합한 활성화 기 및 콘쥬게이션 기술이 사용될 수 있음을 알 것이다. 예를 들면, 웡(Wong)의 "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking"[CRC Press, Inc. (1991)]을 참조한다. 또한 헤르만손(Hermanson)의 "BIOCONJUGATE TECHNIQUES"[Academic Press(1996)] 및 딕(Dick)과 뷰렛(Beurret)의 "Conjugate Vaccines"[Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basal(1989) vol.10, 48~114]을 참조한다.
담체 단백질에 대한 합텐의 콘쥬게이션용으로는 환형 또는 분지형 링커보다 선형 링커 잔기가 바람직하다. 바람직한 링커는 숙시닐 잔기이다. 그러나, 링커는 선형 잔기뿐만 아니라 환형 구조여도 좋다. 링커의 또 다른 예는 ADH이다.
따라서, 본 발명의 니코틴 합텐-담체 접합체는 면역원성 합텐-담체 접합체에 반응하여 항체 생산을 자극하는 특정 B-세포를 활성화하는 T-세포 증식 및 매개체의 방출을 유도하는 T-세포를 자극할 수 있는 합텐-담체 접합체를 만들기 위하여 하나 이상의 합텐을 담체 단백질과 반응시켜 제조된다. 합텐-담체 접합체에 반응하여 생성된 어떤 항체는 합텐-담체 접합체의 합텐 부위에 대하여 특이적이다. 본 발명에서는 니코틴 중독의 치료에 사용되는 합텐과 담체 단백질의 각종 적합한 조합을 심사숙고하였다.
단일클론성 및 다클론성 항체
단일클론성 항체의 제조 기술은 당업계에 공지되어 있다. 단일클론성 항체는 니코틴 합텐-담체 접합체를 포함하는 조성물을 쥐에 주사하고, 이어서 혈청 샘플을 제거하여 항체 생성을 확인하며, 비장을 제거하여 B-림프구를 얻고, 이 B-림프구와 골수종 세포를 융합하여 하이브리도마를 제조하고, 이 하이브리도마를 클로닝하고, 합텐-담체 접합체에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선발하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하고, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리함으로써 얻을 수 있다.
단일클론성 항체는 잘 확립된 각종 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 분리 기술로는 단백질-A 세파로오스를 이용한 친수성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 들 수 있다. 예를 들면, 콜리간(Coligan)의 2.7.1~2.7.12페이지 및 2.9.1~2.9.3페이지를 참조한다. 또한, 바인스(Baines) 등의 "Purification of ImmunoglobulinG(IgG)"(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL.10, 79~104페이지, The Humana Press, Inc. 1992)을 참조한다.
다클론성 항체의 제조 기술도 당업계에 공지되어 있다. 다클론성 항체는 공지된 표준 기술에 따라 제조된다. 다클론성 항체를 제조하기 위하여, 면역원성 물질을 동물에 주사하고 주사된 면역원의 수많은 에피토프에 대한 항체 혼합물을 함유하는 혈청을 채취한다. 항체 생산용으로 적합한 숙주 포유동물로는 인간, 쥐, 마우스, 토끼 및 염소를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 관능성 항체 단편도 사용할 수 있다. 이 단편은 펩신 또는 파파인과 같은 효소를 이용한 분해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합의 절단을 포함하는 방법에 의해 생성된다. 다르게는, 본 발명에 의해 포함되는 항체 단편은 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 멀티플 펩티드 시스템스(Multiple Peptide Systems) 등에 의해 시판되는 자동 펩티드 합성기를 사용하여 합성되거나, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 수작업으로 제조될 수 있다. 게이센(Geysen) 등의J. Immunol. Methods102: 259(1978)를 참조한다. 본 발명에 따른 단일클론성 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변부의 아미노산 서열의 직접적인 결정은 통상적인 기술을 사용하여 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 단편은 Fv 단편일 수 있다. 항체의 Fv 단편은 항체의 중쇄의 가변부(Vh) 및 항체의 경쇄의 가변부(Vl)로 이루어져 있다. 항체의 단백질 분해성 절단은 Vh와 Vl 영역이 비공유적으로 연결되면서 항원 결합 능력을 보유하는 이중 사슬의 Fv 단편을 생산할 수 있다. Fv 단편은 또한 경쇄와 중쇄의 가변부가 펩티드링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 항체 분자를 포함한다. 스케라(Skerra) 등의Science, 240, 1038~41(1988)을 참조한다. 본 발명에 따른 항체 단편은 또한 온전한 항체의 Fc 단편이 결핍된 Fab, Fab', F(ab)2및 F(ab')2를 포함한다.
치료 방법
니코틴이 혈뇌 장벽을 통과한 후에는 많은 중요한 영향을 나타내기 때문에, 본 발명은 니코틴이 혈뇌 장벽을 통과하지 못하게 하는 치료 방법을 포함한다. 특히, 환자에게 니코틴 합텐-담체 접합체를 투여하면 환자의 혈류 내에 니코틴에 대한 항체가 생성된다. 다르게는, 치료할 환자의 체외에서 적합한 숙주 포유동물에서 생성된 항-니코틴 항체를 환자에게 투여할 수 있다. 환자가 흡연을 하면, 혈중 니코틴이 순환하는 항-니코틴 항체에 의해 결합되어 니코틴이 뇌에 도달하지 못하게 된다. 따라서, 항체가 뇌에서 비롯되는 니코틴의 생리적 및 심리적 영향을 방지한다. 흡연자가 상기 영향의 감소 또는 중단을 경험하기 때문에 흡연 욕구를 상실하게 된다. 환자가 본 발명의 니코틴 합텐-담체 접합체로 면역된 후 무연 담배를 사용해도 동일한 치료 효과가 기대된다. 또한, 본 발명의 접합체 및 항체는 말초 신경계를 자극하는 니코틴의 능력에 영향을 미침으로써 그 효과를 발휘할 것이다.
상기에서 논한 바와 같이, 본 발명의 신규한 니코틴-담체 접합체는 니코틴 분자 본래의 카이랄성과 구조를 보존한다. 특히, 이들 접합체의 니코틴 잔기는 (S)-(-) 배치를 갖는다. 따라서, 이러한 접합체에 반응하여 생성된 항체는 본래 형태의 니코틴에 특이적일 것이며, 흡연으로 흡입되거나 무연 담배로부터 흡수된 니코틴에 특이적으로 결합하고 흡수된 니코틴의 영향을 억제하는데 있어서 가장 효과적일 것이다. 또한, 본 발명의 접합체는 화학적으로 안정하며, 안정성은 긴 저장 수명을 갖는 백신을 생산하는데 있어서 중요하다.
본 백신 조성물은 중독 치료에 유용한 화합물 또는 다른 치료법과 조합하여 사용할 수 있다. 그 예로는 자이반(Zyban)과 프로작(Prozac)과 같은 항울제를 포함하는 화합물의 투여를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
1. 니코틴 합텐-담체 접합체의 투여
본 발명의 접합체는 니코틴 중독의 치료 및 예방에 적합하다. 니코틴 중독의 치료에 있어서는 본 발명의 니코틴-담체 접합체를 니코틴 중독 환자에게 투여한다. 니코틴 중독의 예방에 있어서는 10대와 같이 니코틴 중독으로 발전할 위험이 있는 환자를 본 발명에 따른 접합체로 치료한다. 환자에 접합체를 직접 투여하는 것을 "능동 면역"이라고 한다.
본 발명의 백신 조성물은 적어도 하나의 니코틴 합텐-담체 접합체를 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 포함한다. 본 니코틴 합텐-담체 접합체는 이후의 니코틴 흡입에 대하여 충분히 활성을 갖는 농도로 생체 내에 잔류할 수 있다.
본 발명의 니코틴 합텐-담체 접합체를 사용하여 1차 예방 접종을 실시하면 니코틴에 특이적인 항체의 역가가 높다. 니코틴 중독에 대한 치료가 필요한 환자에게 투여되는 접합체의 치료 유효량은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 적합한 투여량의 범위는 1~1000μg/용량이다. 일반적으로 환자가 외래 항원에 대한 항체를 생성하는데 1~수 주일이 걸린다. 환자 혈액 내의 항체 생성은 ELISA, 방사면역분석법및 웨스턴블롯팅방법 와 같이 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 모니터할 수 있다. 치료 효과도 또한 혈압과 같은 니코틴의 각종 물리적 영향을 측정함으로써 모니터할 수 있다.
하기 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명의 니코틴 합텐-담체 접합체는 환자에게 용이하게 투여할 수 있는 조성물의 형태로 가공하여 제공할 수 있다. 바람직한 투여 방법은 비강내, 기관내, 구강, 피내, 점막내 피하 주사 및 정맥 주사를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 1차 주사에 이어 1회 이상의 접합체의 "추가 면역(booster)"의 후속 투여가 행해질 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 2차 주사는 본 발명의 니코틴 합텐-담체 접합체에 대한 항체의 생산을 증가시킬 것이다.
본 발명의 백신 조성물은 적어도 하나의 아쥬반트를 함유해도 좋다. 본 발명에서 사용되는 아쥬반트는 담체-단백질의 효과가 억제되지 않도록 선택될 것이다. 본 발명에서 사용되는 아쥬반트는 인간에게 생리학적으로 허용가능한 것으로 명반(alum), QS-21, 사포닌 및 MPLA(monophosphoryl lipid A)를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 경우에 따라 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유해도 좋다. 본 발명에서 유용한 부형제로는 멸균수, 식염수와 같은 염 용액, 인산나트륨, 염화나트륨, 알코올, 아라비아 고무, 야채 기름, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 만니톨, 탄수화물, 마그네슘 스테아레이트, 점성 파라핀, 지방산 에스테르, 히드록시메틸 셀룰로오스 및 완충액을 들 수 있다. 물론, 당업자에게 공지된 추가적인 부형제도 본 발명에 있어서 유용하다.
본 발명의 합텐-담체 접합체는 니코틴 중독의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 투여하기 위하여 약학 조성물에 혼입된다. 합텐-담체 접합체를 함유하는 조성물을 주사용으로 사용할 때는 합텐-담체 접합체를 약학적으로 허용가능한 pH를 갖는 물, 식염수 용액에 용해하는 것이 바람직하다. 그러나, 합텐-담체 접합체의 주사용 현탁액을 사용할 수 있다. 조성물은 일반적인 약학적으로 허용가능한 부형제 이외에, 순도를 확실히 하고 생체 이용률을 향상시키고 및/또는 침투성을 증가시키기 위하여 임의의 성분을 함유해도 좋다.
또한, 백신 조성물은 경우에 따라 분산매, 피복제, 마이크로스페어, 리포솜, 마이크로캡슐, 지질, 계면활성제, 윤활제, 방부제 및 안정화제와 같은 적어도 하나의 보조제를 함유해도 좋다. 물론, 당업자에게 공지된 추가적인 보조제도 본 발명에서 유용하다. 또한 백신 조성물의 효과를 상승시키는 역할을 하는 임의의 약물도 본 발명에서 유용하다.
본 발명의 약학 조성물은 무균이며 저장, 유통 및 사용시에 충분히 안정하다. 또한, 본 조성물은 미생물의 침투 및 성장으로부터 조성물을 보호하기 위하여 추가적인 성분을 함유해도 좋다. 본 조성물은 투여하기 직전에 약학적으로 허용가능한 희석액에 의해 재조성될 수 있는 동결 건조된 분말의 형태로 제조하는 것이 바람직하다. 멸균 주사액을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예로는 진공 건조, 동결 건조 및 스핀 건조를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 기술은 예비 혼합물에 혼입된 추가적인 부형제와 함께 활성 성분의 분말을 생산한다.
2. 니코틴-담체 접합체에 반응하여 생성된 항체의 투여
수동 면역은 본 발명의 니코틴 합텐-담체 접합체에 반응하여 생성된 다클론성 항체 또는 단일클론성 항체를 투여하거나 또는 이들 항체에 노출시키는 것을 포함한다. 이러한 항체는 동물 또는 인간에서 생성될 수 있다. 본 발명의 니코틴 접합체에 반응하여 생성된 항체는 니코틴 중독을 예방하기 위하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 10대와 같이 니코틴 중독으로 발전할 위험이 있는 사람들에게 상기 항체를 투여할 수 있다. 본 항체는 또한 니코틴 중독 환자를 치료하기에 적합하다. 상기 기술한 바와 같이, 항체는 혈중 니코틴에 결합하여 니코틴의 혈뇌 장벽 통과를 방해한다. 본 발명의 합텐-담체 접합체의 투여에 의해 생성된 항체의 분자량 범위는 약 150kDa~약 1,000kDa이다.
니코틴 중독에 대한 치료가 필요한 환자에게 투여되는 본 발명의 치료 항체의 치료 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 적합한 투여량은 1~1000μg/용량이다.
본 발명의 치료 조성물은 적어도 본 발명의 니코틴-담체 접합체에 반응하여 생성된 항체를 포함한다. 본 발명의 이들 조성물은 경우에 따라 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유해도 좋다. 본 발명에 유용한 부형제로는 멸균수, 식염수와 같은 염 용액, 인산나트륨, 염화나트륨, 알코올, 아라비아 고무, 야채 기름, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 만니톨, 탄수화물, 마그네슘 스테아레이트, 점성 파라핀, 지방산 에스테르, 히드록시메틸 셀룰로오스 및 완충액을 들수 있다. 물론, 당업자에게 공지된 추가적인 부형제도 본 발명에 있어서 유용하다.
본 발명의 항체는 니코틴 중독의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 투여하기 위하여 약학 조성물에 혼입된다. 항체를 함유하는 조성물을 주사용으로 사용할 때는 약학적으로 허용가능한 pH를 갖는 물, 식염수 용액에 항체를 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 항체의 주사용 현탁액을 사용할 수 있다. 조성물은 일반적인 약학적으로 허용가능한 부형제 이외에, 순도를 확실히 하고 생체 이용률을 향상시키고 및/또는 침투성을 증가시키기 위하여 임의의 성분을 함유해도 좋다.
본 발명의 항체를 포함하는 약학 조성물은 무균이며 저장, 유통 및 사용시에 충분히 안정하다. 또한, 본 조성물은 미생물의 침투 및 성장으로부터 조성물을 보호하기 위하여 추가적인 성분을 함유해도 좋다. 멸균 주사액을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예로는 진공 건조, 동결 건조 및 스핀 건조를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 기술은 예비 혼합물에 혼입된 추가적인 부형제와 함께 활성 성분의 분말을 생산한다.
본 발명의 항체를 포함하는 키트
본 발명의 항체는 또한 샘플 중의 니코틴 수준을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있는 키트를 제조하는데 유용하다. 본 발명에 따른 키트는 적합한 용기 내에 본 발명에 따른 니코틴-특이적 항체를 포함한다. 방사면역분석법에서는 상기 키트가 표지된 니코틴을 포함해도 좋다. 샘플 중의 니코틴은 표지된 니코틴을 항체에 결합시킨 후, 항체로부터의 니코틴과 검사할 샘플을 경쟁시킴으로써 검출한다. ELISA 키트도 또한 본 발명에 따른 항체를 포함할 것이다. ELISA는 니코틴을 함유하는 것으로 보이는 샘플과의 억제와 비교하여 기지의 양의 니코틴과 결합하는 항체의 억제에 관여한다. 이것으로 기지의 니코틴 농도의 표준 억제 곡선과 샘플을 비교함으로써 샘플 중의 미지의 니코틴의 양을 측정할 수 있다. 다른 형태의 ELISA에서는 니코틴을 함유하는 것으로 보이는 샘플을 니코틴과 결합하는 물질로 피복된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 배양한다. 본 발명의 항체를 첨가하고, 효소-결합된 항-항체 항체를 플레이트에 첨가한다. 기질을 첨가하여 플레이트에 결합된 니코틴의 양을 정량한다.
하기 실시예는 단지 본 발명의 제조 및 용도를 더욱 상세히 설명한다. 본 발명의 범위는 하기 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1: 유도된 니코틴 합텐의 합성(3'-위치에서 치환됨)
합텐의 합성을 위한 출발 물질은 시판되는trans-4'-카르복시-(-)-코티닌이다. 쿠쉬맨(Cushman) 및 카스타그놀리(Castagnoli,Jr.)[(1972)J. Org. Chem. 37(8):1268~1271]에 의해 기술된 방법을 변형하여 산을 메틸 에스테르화시킨 후 에스테르를 환원시켜 알코올인trans-3'-히드록시메틸-(-)-코티닌을 얻는다. 그 후, 상기 알코올을 술폰화하고 이 술포네이트를 아지도기로 치환하고, 최종적으로는 아민으로 환원시킨다.
4g의trans-4'-카르복시-(-)-코티닌을 무수 메탄올 중 2N 황산 용액 50mL에 용해하고 실온에서 하룻밤 교반하였다. 얻어진 현탁액을 와트만 1번 여과지로 여과시키고 100mL의 중탄산나트륨 포화용액에 천천히 첨가하였다. 이 에스테르를 디클로로메탄으로 추출하고 용매를 증발시킨 후 4.2g의 분홍색 오일을 얻었다.
무수 테트라히드로푸란(100mL)중 상기 에스테르 용액 3.9g을 무수 아르곤하에서 무수 테트라히드로푸란(70mL)중 리튬 알루미늄 수소화물 4당량의 현탁액에 적가하였다. 이 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 과량의 수소화물은 얼음조에서 냉각시에 물을 조심스럽게 조절하면서 첨가하여 제거하였다. 얻어진 백색 침전물은 여과 제거하고, 여과물은 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압하에서 농축하여 2.7g의 알코올을 황색 오일로서 얻었다.
상기 알코올(1.9g)을 20mL의 디클로로메탄에 용해하였다. 그 후, 트리에틸아민(0.75mL) 및p-톨루엔술포닐 클로라이드(1g)를 연속적으로 상기 용액에 첨가하였다. 이 오렌지색 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 침전된 트리에틸아민 히드로클로라이드를 셀라이트(Celite) 베드 상에서 여과 제거하고 여과물을 감압하에서 농축하여 갈색 오일을 얻었다. 이 술포네이트를 디클로로메탄 중 5% 메탄올로 용출된 실리카 플래시 크로마토그래피 칼럼에서 정제하여 2.1g의 황색 오일을 얻었다.
상기 술포네이트(1.8g)를 80℃에서 1시간 동안 50mL 디메틸포름아미드 중 아지드화나트륨(0.8g)을 사용하여 치환하였다. 고 진공하에서 디메틸포름아미드를 증발시킨 후, 잔류물은 디클로로메탄에 용해하고, 물과 식염수로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시킨 후, 아지드(1.1g)를 갈색 오일로서 얻었다.
무수 테트라히드로푸란(20mL)중 아지드를 무수 테트라히드로푸란(50mL)중 리튬 알루미늄 수소화물의 현탁액에 첨가하고 박층 크로마토그래피에 의해 검출하여원하는 아민을 용이하게 생산하였다. 상기 정제된 아민의 양자 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼은 예상된 구조와 일치하였다.
실시예 2: 유도된 니코틴 합텐의 합성(4'-위치에서 치환됨)
니코틴의 에놀레이트 알킬화 후, 알킬화된 생성물을 환원시켜 니코틴의 4'-위치에 관능성 가지(arm)를 도입할 수 있었다. 적합하게 보호된 3-브로모-프로필아민과 같은 각종 알킬화제를 사용할 수 있다. 예를 들면, 3-브로모-N-카르보벤질옥시-프로필아민 또는 N-(3-브로모프로필)-프탈아미드를 사용할 수 있다. 담체 단백질에 콘쥬게이션하기 전에 아민 보호기는 알킬화 및 환원 후에 제거해야 한다. 환형 락탐(피롤리디논 환을 함유함)의 에놀레이트 알킬화는 문헌에 상세히 기재되어 있다[개론서로서는 지. 헬름첸(G. Helmchen) 등(1995) Steroselective Synthesis inHouben-Weyl-Methods of Organic Chemistry, Vol. E21a, 762~881, Thieme, 스튜트가르트, 독일; 반응의 입체적 고찰은 에이. 제이. 메이어스(A. J. Meyers) 등(1997)J. Am. Chem. Soc., 119, 4564~4566 참조]. 또한 코티닌 자체의 에놀레이트 알킬화의 몇몇 예가 있다[엔. 에이치. 린(N. H. Lin) 등(1994)J. Med. Chem., 37, 3542~3553]. 케톤(또는 알데히드)과 2-알콕시-3-알켄아민을 출발물질로 한 탠덤(tandem) 양이온성 아자-코프 재배열-만니흐(Mannich) 환화 반응을 사용하여 두 에피머의 1:1 혼합물로서 4'-아세틸-니코틴이 흥미롭게 제조되었다[엘. 이. 오버맨(L. E. Overman)J. Am. Chem. Soc., 105, 6622~6629]. 이 반응을 확장하여 콘쥬게이션에 적합한 4'-알데히드-니코틴을 제조할 수 있다.
3-브로모-프로필아민 히드로브로미드(4.2g)를 50mL 디클로로메탄에 현탁하고투명 용액이 얻어질 때까지 트리에틸아민을 첨가하였다(약 7mL). 이 용액을 0℃로 냉각하고 벤질 클로로포르메이트(2.5mL)를 적가하였다. 교반하면서 16시간 동안 실온에서 상기 반응을 진행시켰다. 침전되는 염을 여과 제거하고 투명한 유기층은 차가운 물, 차가운 1N HCl 및 차가운 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압하에서 증발시켜 황색 오일을 얻었다(2.93g의 원료).
코티닌(62mg)과 3-브로모-N-카보벤질옥시-프로필아민(100mg)을 무수 톨루엔으로 따로 공증발시켰다. 코티닌을 5mL의 새로 증류된 무수 테트라히드로푸란에 용해하고, 60μL의 N,N,N',N'-테트라메틸렌디아민(TMEDA)을 첨가하고, 이 용액을 에탄올-드라이아이스 조에 침지하여 -78℃로 냉각시켰다. 이 코티닌 용액을 미리 -78℃로 냉각된 테트라히드로푸란 중 리튬 디이소프로필아미드(LDA, 헵탄-테트라히드로푸란 중 2M 용액의 200μL)에 적가하였다. 이 오렌지색 혼합물을 -78℃에서 15분 동안 교반한 후, 얼음조(2~6℃)에 방치하여 온도를 높였다. 이 반응물을 다시 -78℃로 냉각하고 무수 테트라히드로푸란에 용해된 3-브로모-N-카보벤질옥시-프로필아민을 15분 동안 적가하였다. 이 반응 혼합물을 방치하여 -10℃로 온도를 높인 후, 메탄올로 급랭시켰다. 이 반응 생성물을 실리카겔 칼럼 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 코티닌 유도체의 아미드의 환원은 보란으로 처리한 후 뜨거운 에탄올 중 불화세슘에 의해 달성하였다. 산 조건에서 카보벤질옥시기를 제거한 후 최종 아민을 얻었다.
실시예 3: 유도된 니코틴 합텐의 합성(5'-위치에서 치환됨)
시바가키(Shibagaki) 등[(1986)Heterocycles, 24, 423~428] 및 엔. 에이치.린(N. H. Lin) 등[(1994), 상기]에 의해 기술된 것과 유사한 방법으로, 적합하게 보호된 알킬 리튬 화합물과 코티닌을 반응시키고 나서, 시아노보론수소화나트륨으로 환원시켜 니코틴의 5'-위치에 관능성 가지를 도입할 수 있었다.
실시예 4: 유도된 니코틴 합텐과 담체 단백질의 콘쥬게이션
재조합 엑소프로틴A(rEPA)는 숙신산 가지를 통하여 유도된 니코틴 합텐에 결합된다. rEPA의 15개 리신을 숙신산 무수물로 용이하게 숙시닐화시켰다. 그 후, 통상적인 콘쥬게이션 반응으로, 0.15M NaCl을 함유하는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 완충액(pH6.0) 0.05M 중 5~10mg/mL의 숙시닐화 재조합 엑소프로틴A(Suc-rEPA) 용액을 제조하였다. 최소량의 증류수에 용해된 동량의 3'-아미노메틸-(-)-니코틴(3'AMNic) 합텐을 상기 단백질 용액에 첨가하였다. 첨가하기 전에 합텐 용액의 pH를 0.1N HCl로 6.0으로 조정하였다. 마지막으로, 동량의 1-에틸-3-(3-디에틸아미노)프로필 카보디이미드 히드로클로라이드(EDC)를 합텐 단백질 혼합물에 첨가하고 교반하면서 실온에서 30분 동안 반응을 진행시켰다. 이렇게 얻어진 니코틴 접합체를 pH7.4에서 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 용출된 세파덱스 G-25 칼럼으로 정제하였다. 접합체 회수율은 80~90%이었다.
실시예 5: 니코틴-탑재 매트릭스의 콘쥬게이션
본 실시예에서는 유도된 합텐으로서 3'-아미노메틸-(-)-니코틴, 담체 단백질로서 재조합 엑소프로틴A(rEPA), 링커로서 아디프산 디히드라지드(ADH) 및 합텐에 대한 "매트릭스" 또는 중합체 지지체로서 폴리-L-글루탐산을 포함하는 합텐-담체 접합체의 합성을 기술한다.
평균 분자량 39,900, 다분산도 1.15, 중합도 264인 폴리-L-글루탐산을 본 실시예에 사용하였다. 합텐과 중합체의 반응량은 목표 치환율이 약 80%가 되도록 계산하였다. 즉, 치환율이 80%에 도달하면, 글루탐산 중합체의 평균 분자에서 총 264개의 반복 단위 중에서 약 208개의 합텐 단위가 콘쥬게이트되었다.
니코틴-탑재 폴리-L-글루탐산은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서 알 수 있듯이, 글루탐산 중합체는 약 52개의 글루타민 잔기를 포함한다. 이 개수는 배치(batch)와 매트릭스에 선정된 폴리아미노산 잔기의 기원에 따라 다르다. 또한, 상기 식은 각 반복 단위마다 4개의 니코틴 합텐이 있음을 나타내고 있다. 이 개수는 매트릭스와 니코틴 합텐이 콘쥬게이트될 때 사용되는 반응물의 비율에 따라 다르다.
유도된 니코틴과 콘쥬게이트한 후, 미반응 카르복시기(약 20%)는 ADH로 유도하였다. 이 매트릭스가 실시예 6에서 기술한 바와 같이 담체에 콘쥬게이트될 때,니코틴-탑재 매트릭스 대 단백질의 몰 비율은 1:1이었다. 따라서, 이 접합체에서 콘쥬게이션 반응의 완료시 니코틴 합텐 대 단백질의 이론상의 몰 비율은 200:1이었다.
폴리글루탐산에 대한 니코틴의 실재 치환율은 생성물의 NMR 분석을 사용하여 추정하였다. 니코틴의 피리딘 환의 4개의 수소에 대한 글루탐산 α-수소 피크의 강도는 도입된 니코틴의 비율을 제공한다. 추정된 평균 비율은 143:1(니코틴/담체 단백질)이었다.
실시예 6: 니코틴-탑재 매트릭스를 사용한 니코틴 접합체 백신의 제조
A. 매트릭스 상에 니코틴 합텐의 탑재
10mg의 폴리-L-글루탐산염(시그마, Cat#P-4761)을 0.15M NaCl을 함유하는 2mL의 0.05M 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 완충액(pH6.0)에 용해하였다. 10mg의 3'-아미노메틸-(-)-니코틴을 최소량의 증류수에 용해하고 용액의 pH는 0.1N HCl로 pH6.0으로 조정하였다. 이 니코틴 합텐 용액을 교반하면서 폴리펩티드 용액에 적가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 그 후, 20mg의 고형 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드(EDC)를 3부분으로 나누어 20분 동안 상기 합텐-폴리펩티드 혼합물에 첨가하였다. 이 반응을 실온에서 1시간 동안 진행시켰다. 반응 생성물(니코틴-치환 매트릭스)은 물을 3번 교체하면서 투석하고 동결 건조시켰다. 12mg의 니코틴-치환 폴리글루탐산을 백색 보풀 물질로서 얻었다.
B. 니코틴-치환 매트릭스에 대한 링커의 결합
10mg의 니코틴-치환 폴리글루탐산을 2mL의 MES 완충액(pH6.0)에 용해하였다.교반하면서 상기 용액에 8mg의 아디프산 디히드라지드(ADH)를 첨가하고 10mg의 EDC를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 상기 반응을 진행시켰다. 얻어진 용액은 최종적으로 MES 완충액(pH6.0)을 3번 교체하면서 투석하였다.
C. 담체 단백질에 대한 콘쥬게이션
10mg의 재조합 엑소프로틴A(rEPA)를 0.15M NaCl을 함유하는 2mL의 0.05M MES 완충액(pH6.0)에 용해하였다. 7.5mg의 상기 유도된 물질을 함유하는 것으로 추정되는 용량의 ADH-결합 니코틴-치환 폴리글루탐산 용액을 상기 단백질 용액에 첨가하였다. 고형 EDC를 3부분으로 나누어 20분 동안 실온에서 교반하면서 상기 혼합물에 첨가하였다. 이 반응을 하룻밤 동안 실온에서 진행시켰다. 얻어진 접합체를 최종적으로 pH7.4에서 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 용출된 세파덱스 G-25 칼럼으로 정제하였다. 이것으로 단지 (S)-(-)형태의 니코틴을 함유하는 정제된 접합체를 제조하였다.
실시예 7: 실시예 4의 니코틴 담체 접합체의 특성 규명
실시예 4의 정제된 접합체 백신을 pH7.4에서 PBS로 용출된 슈페로오스 12 크기-배제 크로마토그래피 칼럼 상에서 분석하였다. 합텐 대 단백질의 몰 비율은 280nm에서의 흡광도에 비하여, 니코틴 도입 후 260nm에서의 UV 흡광도의 증가를 측정함으로써 11:17로 계산되었다. 이 범위는 합텐-담체 접합체의 6개의 따로 제조된 구획의 합텐/담체 단백질 비율을 계산하여 결정하였다(구획1: 17.2; 구획2: 16.2; 구획3: 13.2; 구획4: 12.0; 구획5: 11.0; 구획6: 17.2). MALDI-TOF 질량 분광법을 사용하여 상기 비율을 측정하는 추가적인 분석도 UV 흡광도 차이에 의해 얻어진 바와 본질적으로 같은 수치를 나타냈다. 접합체 백신의 단백질 농도는 BCA 분석법을 사용하여 측정하였다. 실시예 4의 니코틴-담체 접합체의 안정성 검사를 실시하였다. 이 검사는 1mL 유리병에 0.5mg/mL의 농도로 든 백신을 사용하였으며 병에 든 백신의 안정성은 3개의 다른 온도(-70℃, 2~8℃, 실온)에서 검사하였다.
실시예 8: 실시예 4의 니코틴 담체 접합체의 안정성
-70℃, 2~8℃ 및 심지어 실온에서 6개월 동안 접합체의 안정성을 관찰해보면 에스테르 결합보다 합텐-링커-담체 사이의 아미드 결합의 형성에 의거한 콘쥬게이션 방법이 유리해 보였다. 안정성 검사는 하기 단계를 사용하여 접합체 백신을 모니터하고 분석하는 것으로 구성된다:
1) 형성된 미립자를 찾기 위한 시각 관찰
2) 현저한 pH 변화 체크
3) 도입된 니코틴의 비율 변화를 측정하기 위한 260nm 및 280nm에서의 UV 흡광도와 조합된 크기-배제 크로마토그래피 프로필
4) 담체 단백질 분해를 체크하기 위한 역상 크로마토그래피
5) 콘쥬게이트된 단백질의 단백질 가수분해성 절단을 찾기 위한 은-착색을 이용한 SDS PAGE
-70℃ 및 2~8℃에서 6개월 동안 접합체의 안정성을 관찰해보면 링커와 담체 사이뿐만 아니라 합텐과 링커 사이의 아미드 결합의 형성에 의거한 콘쥬게이션 방법이 유리해 보였다.
실시예 9: 실시예 4 및 6의 담체 접합체의 면역원성의 증거
마우스, 쥐 및 토끼를 면역시키는데 2개의 니코틴 합텐-담체 접합체 백신을 사용하였다.
A. 동물 시험: 다클론성 항체
표준 프로토콜을 사용하여 동물을 면역시켰다. 마우스인 경우, 2주 간격으로 백신을 3차 피하 주사로 투여하였으며, 1차 및 2차 주사한지 1주 후에 시험 혈액을 채취하고, 3차 주사한지 1주 후에 채혈을 실시하였다. 혈청 샘플은 실시예 10에서 기술하는 ELISA 분석법으로 평가하였다. ELISA 분석법에서는 마이크로타이터 플레이트에 결합된 3'AMNic-pGlu를 사용하였다.
쥐의 경우에는 복막 내에 3차에 걸쳐 백신으로 면역시켰다. 2주 간격으로 주사하고, 1차 및 2차 주사한지 1주 후에 시험 혈액을 채취하였다. 그 후, 3차 주사한지 1주 후에 채혈을 실시하였다. Freund의 완전 아쥬반트를 1차 주사에 사용하였으며, 불완전한 Freund의 아쥬반트를 그 이후의 주사에 사용하였다. 혈청 샘플은 ELISA 분석법으로 평가하였다.
토끼인 경우에는 근육 내에 3주 간격으로 3차에 걸쳐 100μg의 백신으로 면역시켰다. 1차 주사물은 Freund의 아쥬반트를 함유하였으며, 그 이후의 주사물은 불완전한 Freund의 아쥬반트를 함유하였다. 채혈을 위한 적합한 역가를 확인하기 위하여 2차 및 3차 주사한지 1주 후에 토끼의 시험 혈액을 채취하였다. ELISA에 의한 측정으로 적합한 역가가 얻어지면, 토끼의 주간 채혈 계획(토끼 당 혈청 20~40mL)에 따라 채혈하였다. 시간에 따라 항체 역가를 모니터하고 필요한 경우 항체 수준을 회복시키기 위하여 동물을 추가 면역시켰다.
이들 면역원성 검사의 결과는 표 1~5에 나타낸다. 표 1 및 2는 마우스에서의 면역원성 검사의 결과를 나타낸다. 표 1에서, 사용된 접합체는 3'아미노메틸-(-)-니코틴-숙시닐-rEPA이었다(실시예 4). 표 2에서, 사용된 접합체는 3-아미노메틸-(-)-니코틴-폴리글루탐산-ADH-rEPA이었다(실시예 6). 이들 표는 니코틴에 특이적으로 결합하는 높은 역가의 항체 생산을 나타낸다. 또한, 이들 접합체는 추가면역 반응을 유도하는 능력을 나타냈다.
표 3 및 4는 쥐에서의 면역원성 검사의 결과를 나타낸다. 표 3에서, 사용된 접합체는 3'아미노메틸-(-)-니코틴-숙시닐-rEPA이었다(실시예 4). 표 4에서, 사용된 접합체는 3-아미노메틸-(-)-니코틴-폴리글루탐산-ADH-rEPA이었다(실시예 6).
이들 표는 니코틴에 특이적으로 결합하는 높은 역가의 항체 생산을 나타낸다. 또한, 이들 접합체는 추가면역 반응을 유도하는 능력을 나타냈다.
표 5는 토끼에서의 면역원성 검사의 결과를 나타낸다. 3'아미노메틸-숙시닐-rEPA(실시예 4) 또는 3-아미노메틸-폴리글루탐산-ADH-rEPA(실시예 6)를 사용하여, 상기 두 접합체에 대한 높은 역가의 항체가 생성되었다. 이들 역가는 6개월 이상 상승된 상태로 남아있었다.
3'AMNic-Suc-rEPA를 마우스에 처리
동물 수 용량 역가
1차 주사 2차 주사 3차 주사
10 1μg 0 36 4,280
10 5μg 1 884 10,727
10 15μg 3 2,476 14,160
용량은 단백질 분석법에 의거함
역가는 해당하는 주사한지 1주 후의 산술 평균임
3'AMNic-pGlu-ADH-rEPA를 마우스에 처리
동물 수 용량 역가
1차 주사 2차 주사 3차 주사
10 2μg 2 739 6,586
10 10μg 2 2,490 9,573
10 30μg 11 2,822 8,195
용량은 동결 건조된 접합체의 건조 중량에 의거함
역가는 해당하는 주사한지 1주 후의 산술 평균임
3'AMNic-Suc-rEPA를 쥐에 처리
동물 수 용량 역가
1차 주사 2차 주사 3차 주사
3 15μg 18 7,942 9,947
3 25μg 4 1,446 5,991
3 50μg 353 7,211 8,996
용량은 단백질 분석법에 의거함
역가는 해당하는 주사한지 1주 후의 산술 평균임
3'AMNic-pGlu-ADH-rEPA를 쥐에 처리
동물 수 용량 역가
1차 주사 2차 주사 3차 주사
5 100μg 0 1,067 3,752
용량은 동결 건조된 접합체의 건조 중량에 의거함
역가는 해당하는 주사한지 1주 후의 산술 평균임
3'AMNic-Suc-rEPA 및 3'AMNic-pGlu-ADH-rEPA를 토끼에 처리
면역원 동물 수 용량 역가
3'-AMNic-Suc-rEPA 10 100μg 132,000
3'AMNic-pGlu-ADH-rEPA 10 100μg 147,000
용량은 3'AMNic-Suc-rEPA인 경우 단백질 분석법에 의거하고 3'AMNic-pGlu-ADH-rEPA인 경우 건조 중량에 의거함
역가는 3차 주사한지 6~7주 후의 산술 평균임
실시예 10: ELISA 분석법 및 항체 특이성
니코틴 분자 자체는 ELISA 플레이트를 피복하기에 적합하지 않으며 더 나은 점착성을 갖는 거대 분자에 연결할 필요가 있다. 폴리-L-리신 또는 폴리-L-글루탐산이 이 목적을 위하여 흔히 사용된다. 유도된 니코틴 합텐 3'-아미노메틸-(-)-니코틴(3'AMNic)을 폴리-L-글루탐산에 콘쥬게이트하여 얻어진 3'-아미노메틸-(-)-니코틴-폴리-L-글루탐산 접합체(3'AMNic-pGlu)를 사용하여 ELISA 플레이트를 피복하였다.
3'AMNic-pGlu ELISA를 사용하여 3'AMNic 백신에 대하여 생성된 항체를 하기와 같이 평가하였다: 다이나테크 임뮬론4(Dynatech Immulon 4) 마이크로타이터 플레이트(미국 버지니아주 찬틸리 소재)를 0.1M 중탄산염 완충액(pH9.6) 중 10ng/mL의 3'AMNic-pGlu를 사용하여 100μL/웰로 피복하고 실온(RT)에서 하룻밤(ON) 배양하였다. 그 후, 이 플레이트를 흡인하고 실온에서 1시간 동안 PBS중 1% BSA로 차단하였다. 샘플과 기준 혈청을 PBB(PBS중 1% BSA, 0.3% BRIJ, pH7.2)로 희석하여 450nm에서의 광학 밀도(OD)를 대략 2.0으로 하였다. 이 플레이트를 5회세척하고(9% NaCl, 0.1% BRIJ), 희석된 샘플과 기준 혈청을 로딩하였다. 기준 혈청 및 샘플을 2배 희석하여 100μL/웰의 최종 부피로 하고, 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 이 플레이트를 다시 세척하고 PBB로 희석된 Fc 특이적인 과산화효소-콘쥬게이트형 항-IgG(잭슨, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재) 100μL/웰을 로딩하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이 플레이트를 세척하고 H2O2(TMB 시약 키트와 함께 제공됨)와 1:1로 희석된 100μl/웰의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(KPL, 미국 메릴랜드 개더스버그 소재)을 사용하여 실온에서 10분 동안 배양하였다. 100μL/웰의 1M 인산을 첨가하여 반응을 중지시키고 MR4000 마이크로타이터 플레이트 판독기(다이나테크)로 450nm에서 판독하였다. 샘플은 평행선 분석을 사용하여 기준 혈청과 비교하여 정량하였다. 기준 혈청에는 450nm에서 약 2.0의 OD값을 주는 희석에 상응하는 수치(U/mL)가 부여된다.
항체 특이성은 억제 ELISA 분석법을 사용하여 평가하였다. 각 항-[3'AMNic-Suc-rEPA] 혈청은 450nm에서 약 2.0의 광학 밀도가 되도록 하는 농도의 2배 농도로 희석하였다. 상기 기술한 3'AMNic-pGlu ELISA를 사용하여, 검사할 희석된 항혈청은 37℃에서 3시간 동안 검사 항원(억제제)의 양을 증가시키면서 1:1(v/v)로 흡수시키고, 흡수된 샘플은 비흡수 혈청을 기준으로 사용한 ELISA 분석법으로 검사하였다. 비흡수 샘플에 대한 흡수율을 각 샘플에 대하여 측정하였다.
니코틴 주석산염을 억제제로 사용한 억제 ELISA를 이용하여 3'AMNic-Suc-rEPA에 반응하여 생성된 항체를 함유하는 쥐 혈청의 특이성을 계산하였다. 이 항체에 대한 IC50은 3.5×10-6M이었다. 니코틴 주석산염을 억제제로 사용한 억제 ELISA를 이용하여 3'AMNic-Suc-rEPA에 반응하여 생성된 항체를 함유하는 토끼 혈청의 특이성을 계산하였다. 이 항체에 대한 IC50은 2.3×10-5M이었다.
실시예 11: 항체 친화도 및 결합 능력
항체 결합 능력은 0.7mL의 혈장, 테프론(Teflon) 세미-마이크로 세포, 12~14kD의 분자량 차단값을 갖는 스펙트라포(Spectrapor) 2 멤브레인 및 소렌손(Sorenson) 완충액(0.13포스페이트, pH7.4)을 사용하여 37℃에서 4시간 동안 평형투석법으로 측정하였다[펜텔(Pentel) 등,J. Pharmacol. Exp. Ther. 246, 1061~1066(1987) 참조]. 혈장 pH는 각 평형 투석의 마지막에 측정하고, 샘플은 최종 pH가 7.30~7.45인 것만 사용하였다.
니코틴에 대한 항체 친화도는 가용성 방사면역분석법을 사용하여 계산하였다[뮤엘러(Mueller), Meth. Enzymol., 92, 589~601(1983) 참조]. IgG의 분자량은 150kD로 측정되었다.
방사면역분석법으로 얻어진 결합 상수 및 친화도는 다음과 같다: 항-[3'AMNic-Suc-rEPA] 쥐 혈청인 경우, IC50(몰)은 1.36×10-7이었다. Ka(몰-1)는 2.57×107이었다. 결합 위치 농도는 2.61×10-6결합위치/L이었으며 니코틴-특이성 IgG 농도는 0.2mg/mL이었다.
실시예 12: 동물 모델의 혈장 및 뇌에서 니코틴 분포의 평가
본 발명의 백신은 각종 동물 모델에서 평가하였다. 쥐 모델은 혈장과 뇌에서 니코틴 분포에 미치는 능동 또는 수동 면역의 효과를 측정하는데 사용되었다. 한 연구는 니코틴의 중추신경계(CNS) 작용인 니코틴의 이동 효과의 완화에 미치는 수동 면역의 효과를 검사하였다. 또 다른 실험은 심장혈관계에 대한 니코틴의 영향(심장 수축 혈압의 증가)에 미치는 수동 면역의 효과를 평가하였다.
본 면역치료법을 평가하기 위하여, 인간에서 두 개의 담배로부터 니코틴의 빠른 흡수를 흉내내는 동물 모델을 개발하였다. 이 동물 모델은 히에다(Hieda)[1997,J. Pharmacol. Exp. Ther. 283(3): 1076~1081]에 의해 기재되어 있다. 이 모델에서는 10초 동안 혈관내 주입에 의해 0.03mg/kg의 니코틴을 쥐에 투여하였으며, 이는 인간 흡연자의 폐로부터 니코틴이 빠르게 흡수되는 것과 동일하다. 혈장 니코틴을 측정하기 위하여 니코틴 주사 후 3분 및 10분에 혈액 샘플을 채취하였다. 뇌의 니코틴 농도를 측정할 때는 니코틴을 주입한지 3분 후에 동물을 희생시키고, 그 뇌를 재빨리 제거하였다. 실시예 4의 백신을 쥐에서 평가하여 혈장과 뇌에서 니코틴의 분포에 미치는 영향을 측정하였다.
A. 능동 면역
니코틴 백신(3'AMNic-Suc-rEPA)을 2주 간격으로 총 25μg을 3차에 걸쳐 복막 내 주사하여 쥐를 면역시켰다. 이들 동물은 10초 동안 0.03mg/kg의 니코틴을 도입한지 3분 및 10분 후에 혈장의 니코틴 수준이 비-면역화된 대조군에 비하여 증가하였다. 도 1을 참조한다. 따라서, 능동 면역은 혈장에서의 니코틴 결합을 증가시키는데 효과적이다. 뇌에 도달하는 니코틴의 양을 완만하게 감소시키면 니코틴의 행동학적 영향을 극적으로 변화시킬 수 있음이 밝혀졌다.
B. 수동 면역
수동 면역을 사용하여, 혈장 니코틴 수준을 증가시키고 뇌 니코틴 수준을 감소시키는 면역 IgG의 투여 반응 효과를 측정할 수 있었다. 항-(3'AMNic-Suc-rEPA) IgG를 다양한 양(주사마다 총 12.5~50mg)으로 쥐에 투여하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 분명한 투여 반응 효과, 즉 IgG의 투여량을 증가시키면 혈청 니코틴 수준이 증가하고 뇌 니코틴 수준이 감소되었다.
도 3은 항-니코틴 항체(항-3'AMNic-Suc-rEPA)를 투여한지(주사마다 총 50mg) 30분 및 1일 후에도 쥐 혈청에 상기 항체가 존재하며 활성이 있음을 나타낸다. 도 3은 다음과 같이 니코틴을 주입하면(10초 동안 0.03mg/kg 주입), 이들 항체가 항체를 투여한지 30분 및 1일 후에 뇌의 니코틴 농도를 감소시키고 혈장의 니코틴 수준을 증가시키는데 유효함을 나타낸다.
본 발명의 니코틴 백신을 이용한 수동 면역의 효능을 입증하는 또 다른 예는 연속적으로 주입되는 니코틴과 싸우는 능력이다. 쥐의 독립된 수동 면역 실험에서, 니코틴을 복수 투여해도 존재하는 항체가 고갈되지 않았으며 새로 주입된 니코틴에 대한 결합 능력도 현저히 감소되지 않았다. 도 4에서, 50mg의 항-[3'AMNic-Suc-rEPA]를 시간 0일 때 주입하였다. 24시간 후, 80분 동안 20분 간격으로 5회에 걸쳐 니코틴을 우경정맥으로부터 0.03mg/kg의 니코틴을 10초 동안 주사하였다. 총 5회에걸쳐 니코틴을 주사하였다. 5차 니코틴 주사에는3H-니코틴을 사용하였다. 모든 혈액과 뇌는 5차 주사한지 1분 후에 채취하였다. 그 결과는 하기와 같으며, 도 4 및 5에 그래프로 나타냈다:
니코틴 농도(평균±SD)
혈청(ng/mL) 뇌(ng/g)
1차 투여 5차 투여 5차 투여
니코틴 니코틴 3H-니코틴 코티닌 니코틴 3H-니코틴
면역 IgG 245±30 343±46 121±17 30±4 244±33 90±16
대조군 IgG 21±3 55±9 41±4 35±5 257±29 126±14
%변화 +1067 +524 +195 -17 -13 -29
이들 결과는 니코틴의 5차 투여 이후에도 항체가 혈청 니코틴 수준을 증가시키고 뇌의 니코틴 수준을 감소시키는데 유효함을 나타낸다.3H-니코틴을 사용한 결과는 항체가 5차 투여에서 주사된 니코틴에 대하여 유효함을 설명한다.
실시예 13: 니코틴의 이동 효과의 평가
사용된 실험은 수동 면역이 니코틴의 즉각적인 CNS-매개 작용을 방지할 수 있는지를 측정하도록 설계되었다. 본 실험에서 사용된 쥐 모델은 데이비드 말린(David Malin)박사에 의해 개발되었으며, 1999년 3월 5일~7일 미국 캘리포니아주 샌디에고에서 개최된 제5회 니코틴 및 담배에 관한 연구 협회의 연간 모임(Annual Meeting of Society for Research on Nicotine and Tobacco)에 제출된 말린 등의 "뇌에 대한 분포를 감소시키고 행동 및 심장혈관에 미치는 영향을 완화시키는 쥐의 니코틴-특이적 IgG(Nicotine-specific IgG reduced distribution to brain and attenuates its behavioral and cardiovascular effects in rats)"에 기술되어 있다. 기준을 확립하기 위하여, 쥐의 이동 활성 수준에 대한 니코틴 주석산염 0.8mg/kg의 피하 주사의 효과를 측정하였다. 니코틴 주석산염 0.8mg/kg의 투여량은 이동 이상(locomotor abnormalities)을 유도하지 않으면서 사용될 수 있는 최대 투여량이다.
항-[3'AMNic-Suc-rEPA]로 예비 처리되지 않은 쥐에서 및 50mg의 정상 토끼 혈청 IgG로 예비 처리된 쥐에서 니코틴 주사 후 활성 수준이 증가하였다. 도 6a의 우측 막대와 도 6b의 좌측 막대를 참조한다. 이 효과는 50mg의 항-[3'AMNic-Suc-rEPA]를 동물에 예비 처리함으로써 억제되었다(도 6b의 우측 막대). 이것은 항-니코틴 항혈청이 생체 내에서 니코틴의 자극 효과를 제거했음을 보여준다.
실시예 14: 수축 혈압에 대한 니코틴의 평가
본 실험에서는 니코틴의 행동학적 효과의 또 다른 지표인 수축 혈압의 변화를 측정하였다. 항-[3'AMNic-Suc-rEPA]IgG 또는 대조군 IgG로 쥐를 예비 처리하였다. 0.1mg/kg의 니코틴 주석산염을 쥐에 피하 주사하였다. 대조군 쥐에 니코틴을 처리하면 수축 혈압이 42.6±3.2mmHg 증가하였다. 항-니코틴 항혈청 IgG를 쥐에 예비 처리하면 니코틴의 영향이 덜하였다. 항-니코틴 혈청의 투여량을 증가시키면 니코틴의 혈압 증가 능력이 감소되었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, IgG 투여량의 함수로서 혈압은 음의 선형 경향을 나타냈다.

Claims (35)

  1. 하기 화학식의 합텐-담체 접합체:
    식 중,
    m은 1~2500이고,
    n은 0~12이며,
    y는 1~12이고,
    X는 NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO 및 S-S로 구성된 군으로부터 선택되며;
    Y는 NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO 및 S-S로 구성된 군으로부터 선택되고,
    -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- 잔기는 3'-, 4'- 또는 5'-위치에 결합된다.
  2. 제1항에 있어서, m이 11~17이고, n이 1이며, y가 2이고, X가 NH-CO이며, Y가 CO-NH이고, 상기 담체 단백질이 엑소프로틴A이고 -(CH2)n-X-(CH2)y-Y-가 3'-위치에 결합되는 것을 특징으로 하는 합텐-담체 접합체.
  3. 제1항에 있어서, m이 11~17이고, n이 1이며, y가 2이고, X가 NH-CO이며, Y가 CO-NH이고, 상기 담체 단백질이 엑소프로틴A이고 -(CH2)n-X-(CH2)y-Y-가 4'-위치에 결합되는 것을 특징으로 하는 합텐-담체 접합체.
  4. 제1항에 있어서, m이 11~17이고, n이 1이며, y가 2이고, X가 NH-CO이며, Y가 CO-NH이고, 상기 담체 단백질이 엑소프로틴A이고 -(CH2)n-X-(CH2)y-Y-가 5'-위치에 결합되는 것을 특징으로 하는 합텐-담체 접합체.
  5. 제1항에 있어서, m이 1~20 및 1~200으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합텐-담체 접합체.
  6. 하기 화학식의 합텐-담체 접합체:
    식 중, n은 0~12이고, j는 1~1000이며, k는 1~20이고, E는 아미노산-함유 매트릭스이다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 매트릭스가 폴리-L-글루탐산인 것을 특징으로 하는 합텐-담체 접합체.
  8. 제1항의 합텐-담체 접합체에 반응하여 생성되는 항체.
  9. 제8항의 항체의 관능성 단편.
  10. 제8항에 있어서, 단일클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  11. 제8항에 있어서, 다클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  12. 제6항의 합텐-담체 접합체에 반응하여 생성되는 항체.
  13. 제12항의 항체의 관능성 단편.
  14. 제12항에 있어서, 단일클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  15. 제12항에 있어서, 다클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  16. 제1항의 합텐-담체 접합체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이러한 치료를 필요로 하는 환자의 니코틴 중독을 치료하는 방법.
  17. 제8항의 항체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이러한 치료를 필요로 하는 환자의 니코틴 중독을 치료하는 방법.
  18. 제1항의 합텐-담체 접합체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이러한 예방을 필요로 하는 환자의 니코틴 중독을 예방하는 방법.
  19. 제8항의 항체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이러한 예방을 필요로 하는 환자의 니코틴 중독을 예방하는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 중독 치료에 유용한 화합물을 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제6항의 합텐-담체 접합체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이러한 치료를 필요로 하는 환자의 니코틴 중독을 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 중독 치료에 유용한 화합물을 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제12항의 항체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이러한 치료를 필요로 하는 환자의 니코틴 중독을 치료하는 방법.
  24. 제6항의 합텐-담체 접합체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이러한 예방을 필요로 하는 환자의 니코틴 중독을 예방하는 방법.
  25. 제12항의 항체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이러한 예방을 필요로 하는 환자의 니코틴 중독을 예방하는 방법.
  26. 제1항의 합텐-담체 접합체로 숙주 포유동물을 면역시키는 것을 포함하는 항체 생산 방법.
  27. 제26항에 있어서, 항체가 단일클론성인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 항체가 다클론성인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제6항의 합텐-담체 접합체로 숙주 포유동물을 면역시키는 것을 포함하는 항체 생산 방법.
  30. 제29항에 있어서, 항체가 단일클론성인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 항체가 다클론성인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 적어도 하나의 제1항의 접합체를 포함하는 백신 조성물.
  33. 적어도 하나의 제6항의 접합체를 포함하는 백신 조성물.
  34. 제8항의 항체를 포함하여 샘플 중에 니코틴의 존재를 측정하는 키트.
  35. 제12항의 항체를 포함하여 샘플 중에 니코틴의 존재를 측정하는 키트.
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NZ (1) NZ512103A (ko)
PL (1) PL199253B1 (ko)
PT (1) PT1135166E (ko)
RS (1) RS51273B (ko)
TR (1) TR200102411T2 (ko)
WO (1) WO2000032239A1 (ko)
ZA (1) ZA200104477B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170007810A (ko) * 2014-05-19 2017-01-20 더 스크립스 리서치 인스티튜트 니코틴 백신 개발을 위한 광학순도 합텐

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020032316A1 (en) * 1995-03-31 2002-03-14 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same
US6232082B1 (en) * 1998-12-01 2001-05-15 Nabi Hapten-carrier conjugates for treating and preventing nicotine addiction
WO2002058635A2 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 The Scripps Research Institute Nicotine immunogens and antibodies and uses thereof
SE521512C2 (sv) * 2001-06-25 2003-11-11 Niconovum Ab Anordning för administrering av en substans till främre delen av en individs munhåla
US20030148260A1 (en) * 2001-08-07 2003-08-07 Bernard Levin Method of diagnosing colorectal adenomas and cancer using proton maggnetic resonance spectroscopy
CA2477268A1 (en) * 2002-03-01 2003-10-09 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and compounds for use as molecular adjuvant for a nicotine vaccine
EP1523334A2 (en) * 2002-07-18 2005-04-20 Cytos Biotechnology AG Hapten-carrier conjugates and uses thereof
US20040115244A1 (en) * 2002-12-17 2004-06-17 Holgate Eric Jamison Methods and compositions for nicotine replacement therapy
ATE359075T1 (de) 2002-12-20 2007-05-15 Niconovum Ab Chemisch und physikalisch stabiles teilchenförmiges material enthaltend nikotin und microcrystalline cellulose
WO2005040338A2 (en) * 2003-05-21 2005-05-06 The Scripps Research Institute Constrained alkaloid immunogens and antibodies and uses thereof
GB0313916D0 (en) 2003-06-16 2003-07-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
US7220842B2 (en) * 2004-04-05 2007-05-22 Dade Behring Inc. Immunoassays for buprenorphine and norbuprenorphine
US7678551B2 (en) * 2004-10-25 2010-03-16 Seradyn, Inc. Immunoassays for lamotrigine
WO2007001448A2 (en) 2004-11-04 2007-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals
WO2006091796A2 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Acucela, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating retinal diseases
WO2007064478A2 (en) * 2005-11-28 2007-06-07 Nabi Biopharmaceuticals Method for making nicotine hapten
US20070134169A1 (en) * 2005-12-11 2007-06-14 Rabinoff Michael D Methods for smoking cessation or alcohol cessation or other addiction cessation
US9267937B2 (en) 2005-12-15 2016-02-23 Massachusetts Institute Of Technology System for screening particles
US7547712B2 (en) * 2006-02-27 2009-06-16 Nabi Biopharmaceuticals Methods for decreasing the toxic effects of nicotine on fetuses in pregnant women
WO2007104573A2 (en) 2006-03-16 2007-09-20 Niconovum Ab Improved snuff composition
EP2007435B1 (en) 2006-03-31 2019-12-18 Massachusetts Institute Of Technology System for targeted delivery of therapeutic agents
EP1849780A1 (en) 2006-04-21 2007-10-31 De Staat der Nederlanden, vert. door de minister van VWS Vaccine against nicotine addiction
EP1854478A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-14 Cytos Biotechnology AG Nicotine-carrier vaccine formulation
EP2019691B1 (en) 2006-05-15 2020-08-12 Massachusetts Institute of Technology Polymers for functional particles
WO2007137117A2 (en) * 2006-05-17 2007-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Aptamer-directed drug delivery
US9381477B2 (en) * 2006-06-23 2016-07-05 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic synthesis of organic nanoparticles
US20100144845A1 (en) * 2006-08-04 2010-06-10 Massachusetts Institute Of Technology Oligonucleotide systems for targeted intracellular delivery
EP2134830A2 (en) 2007-02-09 2009-12-23 Massachusetts Institute of Technology Oscillating cell culture bioreactor
JP2010523595A (ja) * 2007-04-04 2010-07-15 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ポリ（アミノ酸）ターゲッティング部分
WO2008124634A1 (en) * 2007-04-04 2008-10-16 Massachusetts Institute Of Technology Polymer-encapsulated reverse micelles
CN105770878A (zh) 2007-10-12 2016-07-20 麻省理工学院 疫苗纳米技术
CN101878228A (zh) * 2007-11-29 2010-11-03 赛托斯生物技术公司 尼古丁特异性人单克隆抗体
EP2065398A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-03 Cytos Biotechnology AG Human monoclonal nicotine specific antibodies
WO2009149252A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Cornell University Vaccines for prevention and treatment of addiction
CA2727617A1 (en) * 2008-06-13 2009-12-17 Nabi Biopharmaceuticals Smoking cessation kit and method
US20110182918A1 (en) 2008-06-13 2011-07-28 Nabi Biopharmaceuticals Personalized drug treatment and smoking cessation kit and method
CA2731494A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 Novartis Ag Process for the preparation of nicotine-based haptens
US8343497B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics
US8277812B2 (en) 2008-10-12 2012-10-02 Massachusetts Institute Of Technology Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen
US8591905B2 (en) * 2008-10-12 2013-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nicotine immunonanotherapeutics
US8343498B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 Massachusetts Institute Of Technology Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics
AU2009325926B2 (en) 2008-12-09 2013-05-16 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
US8552165B2 (en) * 2008-12-09 2013-10-08 Heather Davis Immunostimulatory oligonucleotides
TW201109031A (en) * 2009-07-31 2011-03-16 Nabi Biopharmaceuticals Method and kit for treating nicotine addiction
KR101873179B1 (ko) * 2009-08-26 2018-06-29 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. Ｔ－세포 도움을 유도하는 조성물
WO2011031327A2 (en) * 2009-09-14 2011-03-17 The Scripps Research Institute Nicotine haptens, immunoconjugates and their uses
US20110182831A1 (en) * 2010-01-25 2011-07-28 Aradigm Corporation Systems and methods used in conjunction with nicotine vaccines for effecting cessation of tobacco use
US9682133B2 (en) 2010-03-17 2017-06-20 Cornell University Disrupted adenovirus-based vaccine against drugs of abuse
WO2011123042A1 (en) * 2010-04-01 2011-10-06 Independent Pharmaceutica Ab Vaccination procedure and products for use therein
GB201006324D0 (en) 2010-04-15 2010-06-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AU2011258171B2 (en) 2010-05-26 2016-11-24 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarrier combination vaccines
TWI455722B (zh) 2010-06-04 2014-10-11 Pfizer Vaccines Llc 用於預防或治療菸鹼成癮之共軛體
WO2012061717A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Selecta Biosciences, Inc. Modified nicotinic compounds and related methods
US20140039063A1 (en) * 2011-01-04 2014-02-06 National Jewish Health Leukotrienes and asthma exacerbation risk
WO2012138774A2 (en) 2011-04-04 2012-10-11 University Of Iowa Research Foundation Methods of improving vaccine immunogenicity
CA2843274A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers that generate humoral and cytotoxic t lymphocyte (ctl) immune responses
WO2013130393A1 (en) 2012-02-28 2013-09-06 Cornell University Aav-directed persistent expression of an anti-nicotine antibody gene for smoking cessation
WO2013154744A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Cornell University Development of a highly efficient second generation nicotine-conjugate vaccine to treat nicotine addiction
TWI600905B (zh) * 2012-09-21 2017-10-01 國立臺灣師範大學 聚合半抗原成為免疫原的技術方法
US9303013B2 (en) 2014-05-16 2016-04-05 Pfizer Inc. Conjugates and associated methods of producing them for the prevention or treatment of nicotine addiction
CN104402992B (zh) * 2014-11-28 2018-09-18 杭州安旭科技有限公司 一种合成大麻抗原的合成方法及合成大麻抗原的应用
WO2016116477A1 (en) * 2015-01-20 2016-07-28 Universiteit Antwerpen Neuregulin in the treatment of fibrotic disorders
CN106496309A (zh) * 2016-11-24 2017-03-15 北京开景基因技术有限公司 微球抗原及其制备方法以及抗可替宁抗体的制备方法
WO2018231706A1 (en) 2017-06-11 2018-12-20 Molecular Express, Inc. Methods and compositions for substance use disorder vaccine formulations and uses thereof
MX2020001725A (es) 2017-08-15 2020-08-20 BliNK Biomedical Anticuerpos de fijacion a nicotina novedosos.
CN108362891B (zh) * 2017-12-27 2020-09-25 北京勤邦生物技术有限公司 一种泼尼松的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
US11333372B2 (en) 2018-03-09 2022-05-17 Scot Matthew Duncan Energy recovery high efficiency dehumidification system
CN112512549A (zh) 2018-06-06 2021-03-16 安蒂多特疗法公司 改善循环和治疗心血管疾病的方法
KR102237349B1 (ko) 2019-10-23 2021-04-07 한국과학기술연구원 니코틴 중독 또는 금단 증상 예방 또는 치료용 약학 조성물

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4375414A (en) 1971-05-20 1983-03-01 Meir Strahilevitz Immunological methods for removing species from the blood circulatory system and devices therefor
US3766162A (en) 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US3888886A (en) * 1972-06-08 1975-06-10 Mobil Oil Corp Oxidation of alkanes to maleic anhydride using promoted vanadium-phosphorus catalyst
US4045420A (en) 1973-05-29 1977-08-30 Syva Company Non-oxo-carbonyl containing benzoyl ecgonine and cocaine compounds polypeptide and derivatives thereof
US3888866A (en) 1973-06-01 1975-06-10 Syva Co Nitrogen derivatives of benzoyl ecgonine
US4053459A (en) 1975-09-24 1977-10-11 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody specific to methaqualone and its metabolites
US4235864A (en) 1978-04-10 1980-11-25 Research Corporation Simultaneous radio immunoassay of multiple antigens and _assay for cocaine metabolites
US4376825A (en) 1979-05-07 1983-03-15 Syva Company Enzyme amplification compounds for assays for androgens
US4666837A (en) 1982-05-24 1987-05-19 Smithkline-Rit DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing the A and B subunits of cholera toxin and preparations containing so-obtained subunit or subunits
SU1123704A1 (ru) 1983-04-08 1984-11-15 Научно-Исследовательский Институт По Биологическим Испытаниям Химических Соединений Способ получени конъюгированных антигенов
EP0194158A3 (en) 1985-03-08 1988-02-24 Baylor College of Medicine Anti-nicotine and anti-cotinine antibodies (monoclonal and other), and their uses in nicotine and cotinine assays
US5019384A (en) 1986-06-30 1991-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Immunonodulating compositions and their use
US4791067A (en) 1987-06-25 1988-12-13 Fisher Scientific Co. Agglutination immunoassay for hapten involving monoclonal antibody of IgA class reagent
DE3884731D1 (de) 1987-10-09 1993-11-11 Ube Industries Monoklonaler Antikörper gegen Methamphetamin, seine Herstellung, Testverfahren und Testsatz für Methamphetamin.
US5268276A (en) 1988-09-16 1993-12-07 Jan Holmgren Recombinant systems for expression of cholera B-sub-unit with the aid of foreign promoters and/or leader peptides
EP0363041A1 (en) 1988-09-21 1990-04-11 Ube Industries, Ltd. Monoclonal antibody to morphine, preparation of monoclonal antibody, assaying kit and assaying method of morphine
GB9001694D0 (en) 1990-01-25 1990-03-28 Therapeutic Antibodies Inc Immunogenic compositions
CH678394A5 (ko) 1990-08-22 1991-09-13 Cerny Erich H
US5674978A (en) 1990-09-21 1997-10-07 The Regents Of The University Of California Peptides derived from glutamic acid decarboxylase
US5290784A (en) * 1991-07-18 1994-03-01 Yueqian Qu Aconitane derivatives used as a medication to treat addiction
US5233042A (en) 1991-12-16 1993-08-03 Biosite Diagnostics, Inc. Cocaine derivatives
US5283066A (en) 1992-02-19 1994-02-01 Development Center For Biotechnology Method of stimulating an immune response by using a hapten
DE4216133A1 (de) 1992-05-15 1993-11-18 Bissendorf Peptide Gmbh Anwendung von Urodilatin bei Lungen- und Bronchialerkrankungen
WO1993023076A1 (en) 1992-05-20 1993-11-25 The Johns-Hopkins University Alternative receptor therapy
US5278176A (en) * 1992-08-21 1994-01-11 Abbott Laboratories Nicotine derivatives that enhance cognitive function
DE69332637T2 (de) 1993-03-04 2003-10-23 Matsushita Electric Ind Co Ltd Kokainderivat,Proteinkonjugat,davon,einen monoklonalen Antikörper produzierende Hybridom-Zellinie, Verfahren zur Herstellung der Hybridom-Zellinie und des monoklonalen Antikörpers
US5375414A (en) 1993-10-04 1994-12-27 Ford Motor Company Automotive engine exhaust aftertreatment system including hydrocarbon adsorber with internal engine purge flow control
WO1995027786A1 (en) 1994-04-08 1995-10-19 Immulogic Pharmaceutical Corporation Pharmaceutical formulations for treating japanese cedar pollen allergy
US5510102A (en) 1995-01-23 1996-04-23 The Regents Of The University Of California Plasma and polymer containing surgical hemostatic adhesives
US5876727A (en) 1995-03-31 1999-03-02 Immulogic Pharmaceutical Corporation Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same
WO1996030049A2 (en) 1995-03-31 1996-10-03 Immulogic Pharmaceutical Corporation Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy
US5773003A (en) 1995-03-31 1998-06-30 Immulogic, Inc. Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same
US6455047B1 (en) * 1997-09-19 2002-09-24 Serex, Inc. Methods to improve immunogenicity of antigens and specificity of antibodies
US6232082B1 (en) * 1998-12-01 2001-05-15 Nabi Hapten-carrier conjugates for treating and preventing nicotine addiction

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170007810A (ko) * 2014-05-19 2017-01-20 더 스크립스 리서치 인스티튜트 니코틴 백신 개발을 위한 광학순도 합텐

Also Published As

Publication number Publication date
MEP34208A (en) 2011-02-10
US20020004208A1 (en) 2002-01-10
HUP0104365A3 (en) 2002-05-28
JP2011079849A (ja) 2011-04-21
WO2000032239A1 (en) 2000-06-08
US6232082B1 (en) 2001-05-15
TR200102411T2 (tr) 2002-01-21
AU763001B2 (en) 2003-07-10
DK1135166T3 (da) 2005-02-14
PT1135166E (pt) 2005-01-31
JP4971542B2 (ja) 2012-07-11
US7247502B2 (en) 2007-07-24
ATE279211T1 (de) 2004-10-15
EP1135166A1 (en) 2001-09-26
CA2352765A1 (en) 2000-06-08
US20080026000A1 (en) 2008-01-31
CA2352765C (en) 2011-02-15
RS51273B (sr) 2010-12-31
EA004956B1 (ru) 2004-10-28
CN1768861A (zh) 2006-05-10
AU2033500A (en) 2000-06-19
WO2000032239A9 (en) 2002-08-22
US8026109B2 (en) 2011-09-27
HUP0104365A2 (hu) 2002-04-29
EP2324855A1 (en) 2011-05-25
PL199253B1 (pl) 2008-08-29
PL349012A1 (en) 2002-06-17
US20050136047A1 (en) 2005-06-23
US20110217320A1 (en) 2011-09-08
HK1042428B (zh) 2005-07-29
NO20012589D0 (no) 2001-05-25
YU39601A (sh) 2003-10-31
HK1042428A1 (en) 2002-08-16
BR9915852A (pt) 2004-06-29
NO20012589L (no) 2001-07-20
DE69921178T2 (de) 2005-11-17
CN1220521C (zh) 2005-09-28
IL143474A (en) 2006-06-11
EA200100610A1 (ru) 2002-04-25
US20110002957A1 (en) 2011-01-06
CN100586481C (zh) 2010-02-03
DE69921178D1 (de) 2004-11-18
NO331998B1 (no) 2012-05-21
EP1135166B1 (en) 2004-10-13
KR100656836B1 (ko) 2006-12-12
IL143474A0 (en) 2002-04-21
MXPA01005511A (es) 2004-08-19
ES2229800T3 (es) 2005-04-16
EP1512414A1 (en) 2005-03-09
ZA200104477B (en) 2002-01-16
US7776620B2 (en) 2010-08-17
US20030165950A1 (en) 2003-09-04
NZ512103A (en) 2003-09-26
HK1043061A1 (en) 2002-09-06
US6773891B2 (en) 2004-08-10
US6518031B2 (en) 2003-02-11
HK1091415A1 (en) 2007-01-19
CN1329508A (zh) 2002-01-02
EP1135166B9 (en) 2005-02-02
HK1043061B (zh) 2006-07-07
JP2002531421A (ja) 2002-09-24

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EP1024834B1 (en) Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same
US20060286095A1 (en) Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same
US20090196886A1 (en) Vaccine against nicotine addiction
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