DE69332637T2 - Kokainderivat,Proteinkonjugat,davon,einen monoklonalen Antikörper produzierende Hybridom-Zellinie, Verfahren zur Herstellung der Hybridom-Zellinie und des monoklonalen Antikörpers - Google Patents

Kokainderivat,Proteinkonjugat,davon,einen monoklonalen Antikörper produzierende Hybridom-Zellinie, Verfahren zur Herstellung der Hybridom-Zellinie und des monoklonalen Antikörpers

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Cocain-Protein-Konjugat zur Verwendung als Antigen zur Herstellung eines anti-Cocain-Antikörpers, ein Cocainderivat als Ausgangsmaterial für das Konjugat, eine monoclonalen Antikörper produzierende Hybridom-Zelllinie, die von dem Antigen erhalten wird, sowie einen monoclonalen Antikörper, der von der Hybridom-Zelllinie produziert wird. Der monoclonale Antikörper ist nützlich, um Cocain oder dessen Derivat aus Blut oder Luft mit hoher Empfindlichkeit immunchemisch nachzuweisen.
  • J. Pharmacol. Exp. Ther. Bd. 199, S. 171 (1976) schlägt eine Synthese eines anti- Cocain-Antikörpers zur Verwendung in einem Immuntest für Cocain und ein Antigen vor, das für die Herstellung des Antikörpers notwendig ist. Der Antikörper, über den berichtet wird, ist jedoch ein polyclonaler Antikörper, der aus dem reinem Blut einer immunisierten Ziege oder eines immunisierten Kaninchens erhalten werden kann, wobei ein Ecgonin-Antigen der Formel (1) verwendet wird. Formel (1)
  • Um einen für Cocain hochspezifischen anti-Cocain-Antikörper zu erhalten, muss ein Cocain-Protein-Konjugat erzeugt werden, indem ein Derivat verwendet wird, das das Cocaingerüst so genau wie möglich beibehält. Leider fehlt Ecgonin eine Methoxycarbonylgruppe und eine Benzoylgruppe, die beide für das Cocainmolekül charakteristisch sind.
  • Die polyclonalen Antikörper vom Stand der Technik können einfach hergestellt werden; andererseits sind sie schlechter reproduzierbar, da die Eigenschaften des Produkts von jedem Individuum der Versuchstiere abhängen. Daher ist es ziemlich schwierig, Antikörper derselben Qualität bereitzustellen.
  • Polyclonale Antikörper sind ein Gemisch einer Vielfalt von Antikörpern, die eine entsprechende Affinität besitzen. Alle Affinitäten, die sie besitzen, hielten uns davon ab, einen polyclonalen Antikörper aufgrund seiner geringen Affinität für ein Molekül von Interesse in einem sensitiven Nachweissystem zu verwenden. Wir versuchten nach dem vorstehenden Dokument einen monoclonalen Antikörper mit hoher Affinität für Cocain zu erhalten; wir waren jedoch nicht erfolgreich, da Ecgonin als Antigen sich zu sehr in der Struktur von Cocain unterscheidet.
  • U.S.-Patent Nr. 4,045,420 stellt Cocainderivate mit nicht-Oxocarbonyl-Funktionalitäten zur Bindung an Proteine bereit. Diese Derivate werden als Antigenmaterial zur Herstellung von Antikörpern gegen Ecgonin oder Cocain verwendet.
  • Chemical Abstract Bd. 118(3), 1993, 20930 m offenbart ein Ecgoninkonjugat, das über seine Carboxygruppe an eine Aminogruppe von Hühner-&gamma;-Globulin, Rinderserumalbumin oder Muschel-Hämocyanin zur Herstellung von anti-Cocain-Antikörpern konjugiert ist.
  • U.S.-Patent Nr. 3,888,866 offenbart Stickstoffderivate von Benzoylecgonin und Cocain, die an Antigen-Proteine zur Erzeugung von Antikörpern für Benzoylecgonin und/oder Cocain konjugiert sind.
  • Die Erfindung ist auf die Bereitstellung eines Pyridyldithioderivats eines Aminococainderivats, das auf Cocain basiert und durch eine Methoxycarbonylgruppe und eine Benzoylgruppe gerichtet ist, und eines Cocain-Protein-Konjugats, das das Pyridyldithioderivat eines Aminococainderivats enthält, charakterisiert.
  • Die Erfindung ist ferner auf die Bereitstellung eines monoclonalen Antikörpers mit hoher Affinität für Cocain oder Cocainderivate gerichtet, indem mit dem Cocain-Protein- Konjugat immunisiert wird.
  • Die Erfindung ist ferner auf die Bereitstellung einer Hybridom-Zelllinie zur Herstellung des monoclonalen Antikörpers gerichtet.
  • Um die vorstehend erwähnten Ziele zu erreichen, haben die Erfinder ein Aminoderivat von Cocain, das auf Norcocain basiert, das mit einer Aminoalkylgruppe in seiner sekundären Aminogruppe substituiert ist, ein Pyridyldithioderivat eines Aminoderivats von Cocain, das mit einer 3-(2-Pyridyldithio)propynoylgruppe in seiner Aminogruppe substituiert ist, sowie ein Cocain-Protein-Konjugat hergestellt. Ferner etablierten die Erfinder eine einen monoclonalen Antikörper produzierende Hybridom-Zelllinie durch Fusionieren einer Milzzelle, die von einer Maus abstammt, die mit einem Cocain-Protein-Konjugat-Antigen immunisiert wurde, und einer von einer Myelom-Zellkultur abstammenden Zelllinie sowie durch Clonieren des Fusionsprodukts.
  • Die erfindungsgemäße Verbindung wird in Formel (3) dargestellt: Formel (3)
  • wobei n eine ganze Zahl von 1 oder mehr und Ph ein Benzeolring ist.
  • Das erfindungsgemäße Cocain-Protein-Konjugat ist das Cocainderivat der Formel (3), das an ein Protein mittels einer Disulfidbindung konjugiert ist.
  • Das Verfahren zur Herstellung einer einen monoclonalen Antikörper produzierenden Hybridom-Zelllinie umfasst das Fusionieren einer Milzzelle, die von einer Maus abstammt, die mit einem Cocain-Protein-Konjugat-Antigen immunisiert wurde, und einer von einer Myelom-Zellkultur abstammenden Zelllinie sowie das Clonieren des Fusionsprodukts.
  • Beim vorstehenden Verfahren ist das Protein vorzugsweise KLH ("keyhole limpet hemocyanin").
  • Beim vorstehenden Verfahren ist die von einer Myelom-Zelllinie abstammende Zelllinie vorzugsweise auch P3X63-Ag8.653.
  • Beim vorstehenden Verfahren stammt die Maus vorzugsweise auch von einem A/J- Stamm ab.
  • Die erfindungsgemäße Zelllinie ist vorzugsweise eine einen monoclonalen Antikörper produzierende, beim Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Japanese Ministry of Industrial Trade and Industry, als Nr. BP-4177 hinterlegte Hybridom-Zelllinie, die mit dem vorstehenden Verfahren hergestellt wurde, gekennzeichnet durch die Herstellung eines Antikörpers, der Cocain oder Cocainderivate spezifisch binden kann.
  • Die Erfindung ist ferner auf die Bereitstellung eines monoclonalen Antikörpers von der vorstehenden einen monoclonalen Antikörper produzierenden Hybridom-Zelllinie gerichtet.
  • Eine Verbindung, die nützlich ist, um zur erfindungsgemäßen Verbindung zu führen, wird in Formel (2) dargestellt: Formel (2)
  • wobei n eine ganze Zahl von 1 oder mehr und Ph ein Benzolring ist.
  • Der Vollständigkeit halber wird angemerkt, dass ein Cocain-Protein-Konjugat des vorstehenden Cocainderivats, das an ein Protein konjugiert ist, monoclonale Antikörper mit hoher Affinität für Cocain oder ein Cocainderivat, bei dem das Konjugat verwendet wird, sowie eine Zelllinie zu Herstellung des Antikörpers hergestellt werden können, in der vorliegenden Erfindung jedoch nicht eingeschlossen sind.
  • Mit dem Aminoderivat von Cocain kann man, wie vorstehend erwähnt, leicht das vorliegende Pyridyldithioderivat eines Aminococainderivats, das eine Disulfidgruppe besitzt, die ein Protein binden kann, herstellen, wobei das Cocaingerüst beibehalten wird. Durch Immunisieren eines Versuchstieres mit einem Cocain-Protein-Konjugat, das aus dem vorstehenden Pyridyldithioderivat hergestellt wurde, kann man eine Zelllinie zur Herstellung eines Antikörpers mit höherer Affinität für Cocain erhalten, da das Cocain-Protein-Konjugat das Cocaingerüst erhält.
  • Nach der Immunreaktion werden die Antikörper produzierenden Zellen in der Milz bewahrt. Obwohl die Milz sich selbst nicht reproduzieren kann, kann sie proliferieren und eine Hybridom-Zelllinie durch Fusionieren mit einer Zelllinie produzieren, die von einem Myelom abstammt. Die Hybridom-Zelllinie produziert bei ihrer Proliferation intensiv Antikörper. Durch Selektion einer Hybridom-Zelle, die eine hohe Multiplikationsfähigkeit besitzt und einen Antikörper produziert, der die höchste Affinität für ein bestimmtes Molekül besitzt, sowie Clonieren des Hybridoms kann man den gewünschten Antikörper herstellen. Der so erhaltene monoclonale Antikörper ist eine einzelne Art von Antikörper und hoher Affinität. Eine konstante Qualität der monoclonalen Antikörper kann permanent durch Züchten des Hybridoms hergestellt werden.
  • Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die Bindungsfähigkeit eines monoclonalen Antikörpers für ein Antigen in der festen Phase mit einem ELISA-Test in einer Ausführungsform der Erfindung zeigt.
  • Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse des Cocain-Nachweises mit dem ELISA-Verfahren unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers von einem Beispiel der Erfindung zeigt.
  • Bei der Erfindung wird ein Aminoderivat von Cocain aus Norcocain und einer Aminogruppe erhalten. Die Aminogruppe ist beispielsweise (X(CH&sub2;)nR, wobei X ein Halogenatom ist, n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist und R eine Succinimidyl- oder Maleimidyl- oder Phthalimidylgruppe ist.
  • Das Pyridyldithioderivat von Cocain der vorliegenden Erfindung wird erhalten, indem eine 3- (2-Pyridyldithio)propynoylgruppe in das vorstehende Aminoderivat eingeführt wird.
  • Welches Potein als Träger geeignet ist, hängt sowohl von dem Versuchstier als auch von dem Antigen ab. Unsere Experimente unter Verwendung von einer Reihe von Proteinen wie Hühner-Gammaglobulin, Rinderserumalbumin oder KLH ("keyhole limpet hemocyanin") zeigten, dass KLH ("keyhole limpet hemocyanin") (hier nachstehend mit KLH bezeichnet) das bestmögliche Trägerprotein in der Erfindungspraxis ist.
  • Um eine Zelllinie zu erhalten, die einen monoclonalen Antikörper mit hoher Affinität produziert, ist es erforderlich, Antiseren mit hohem Antikörpertiter zu erhalten. Eine derartige Immunreaktion hängt von der Art und dem Stamm der Versuchstiere ab. Die Erfinder immunisierten verschiedene Mäusearten wie A/J, BALB/c, DBA/2, C57BL/6, C3H/He und fanden heraus, dass eine A/J-Maus der beste Kandidat zur Herstellung eines Antikörpers mit dem höchsten Titer war.
  • Schließlich hängt die Proliferationsfähigkeit eines Hybridoms in der Zellfusion größtenteils von der Art der Zelllinie ab, die von dem Maus-Myelom stammt. Unsere Experimente unter Verwendung von von verschiedenen Mäusen abstammenden Zelllinien zeigten, dass die Zelllinie P3X63-Ag8.653 ein Hybridom mit der bestmöglichen Geschwindigkeit proliferieren lässt.
  • Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden hier nachstehend unter Bezugnahme auf ein Cocainderivat, ein 2-Pyridyldithioderivat von Cocain, ein Cocain-Protein- Konjugat, ein Verfahren zur Herstellung einer einen monoclonalen Antikörper produzierenden Hybridom-Zelllinie, einen monoclonalen Antikörper und letztendlich den Nachweis von Cocain davon erklärt.
    • Beispiel 1
  • Ein Verfahren zur Herstellung eines Aminoderivats von Cocain wird unter Bezugnahme auf ein Beispiel erklärt, bei dem eine Aminobutylgruppe verwendet wird. Zuerst wurde Norcocain aus Cocain hergestellt. Dann ließ man Norcocain mit Butylphthalimid reagieren, um das betreffende Aminoderivat zu erzeugen.
    • (A) Herstellung von Norcocain
  • Norcocain der Formel (4) wurde wie folgt hergestellt.
  • Cocain (500 mg) wurde in einem Gemisch (21 ml) aus Acetonitril und Wasser aufgelöst (1 : 2). Der Lösung wurde Essigsäure (0,5 ml) zugegeben, um deren pH-Wert auf etwa 5 einzustellen. Der Lösung wurden 3 Stunden lang tropfenweise 21 ml wässriges Kaliumpermanganat (KMnO&sub4; = 534 mg, 3,78 mmol, 2,05 Äq.) zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des sich ergebenden Präzipitats durch Filtration wurde dem Filtrat Kaliumcarbonat (1050 mg) zugegeben, um dessen pH-Wert auf ungefähr 8 einzustellen. Das Filtrat wurde dreimal mit Ether extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat über Nacht getrocknet. Das Natriumsulfat wurde aus dem Extrakt entfernt, und der Ether wurde unter reduziertem Druck abdestilliert, so dass sich eine farblose Flüssigkeit ergab. Die Flüssigkeit wurde durch eine Kieselgeldünnschichtchromatographie (hier nachstehend mit DC abgekürzt) gereinigt, wobei als Elutionsmittel Ammoniak gesättigtes Chloroform verwendet wurde, so dass sich Norcocain (269 mg) der Formel (4) ergab: Formel (4)
  • Ausbeute: 56%
  • Dann ließ man Norcocain mit Butylphthalimid reagieren, so dass das betreffende Aminoderivat erzeugt wurde.
    • (B) Einführung von Butylphthalimid in Norcocain
  • Das Butylphthalimid-Derivat von Norcocain der Formel (5) wurde wie folgt hergestellt. Norcocain (268 mg, 0,93 mmol), Brombutylphthalimid (314 mg, 1,11 mmol, 1,2 Äq.) und wasserfreies Natriumcarbonat (147 mg, 1,39 mmol, 1,5 Äq.) wurden in Benzol (10 ml) gelöst, und das Gemisch wurde 72 Stunden unter Stickstoffatmosphäre einem Rückfluss unterzogen. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Lösung gefiltert. Das Filtrat wurde mit 1 N Salzsäure dreimal extrahiert, und die wässrige Schicht wurde dreimal mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Chloroform wurde unter reduziertem Druck abdestilliert, so dass sich farblose Kristalle ergaben. Die Kristalle wurden mit DC (Elutionsmittel: Ammoniak gesättigtes Chloroform/Benzol = 1/3) gereinigt, so dass sich ein Butylphthalimidderivat (270 mg) der Formel (5) ergab: Formel (5)
  • Ausbeute 60%
    • (3) Herstellung eines Aminoderivats
  • Das Aminoderivat der Formel (6) wurde wie folgt hergestellt.
  • Das Butylphthalimidderivat der Formel (5) (100 mg, 0,20 mmol) wurde in 95% Ethanol (3 ml) gelöst, dem Hydrazinhydrat (0,20 mmol) vor einem 2-stündigen Rückfluss zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mittels DC gereinigt (Elutionsmittel: Ammoniak gesättigtes Chloroform/Methanol = 10/1), so dass sich ein Aminoderivat (57 mg) der Formel (6) ergab: Formel (6)
  • Ausbeute 78%
  • Was die Aminogruppe betrifft, wurde Bromalkylphthalimid zur Herstellung des Aminoderivats in der vorstehenden Ausführungsform verwendet; zudem waren andere Aminogruppen, die eine Aminoalkylgruppe enthielten, ebenfalls verwendbar.
    • Beispiel 2
  • Das 2-Pyridyldithioderivat von Cocain der Formel (7) wurde wie folgt hergestellt. Das vorstehende Aminoderivat (84 mg, 0,23 mmol), das wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde in Ethanol gelöst (1 ml). Der Lösung wurde tropfenweise eine o-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)-1-proprionat-Lösung (hier nachstehend als SPDP abgekürzt) (73 mg, 0,23 mmol) in Ethanol (1 ml) zugegeben. Nachdem die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde sie durch eine DC gereinigt (Elutionsmittel: Ammoniak gesättigtes Chloroform), so dass sich ein 2-Pyridyldithioderivat (133 mg) der Formel (7) ergab: Formel (7)
  • Ausbeute: 100%
  • In der vorstehenden Ausführungsform war das Ausgangsmaterial ein Aminobutylderivat. Stattdessen waren auch andere Alkylderivate verwendbar.
  • In der vorstehenden Ausführungsform wurde SPDP verwendet, um eine Pyridyldithiogruppe in das Aminococainderivat einzuführen. Statt SPDP waren auch andere Verbindung verwendbar, solange sie eine 3-(2-Pyridyldithio)propynoylgruppe enthielten.
    • Beispiel 3
  • Ein Verfahren zur Herstellung eines Cocain-Protein-Konjugats wird unter Bezugnahme auf ein Beispiel erklärt, bei dem KLH verwendet wird.
  • Zuerst wurde ein Komplex aus KLH und SPDP (hier nachstehend als KLH-SPDP abgekürzt) hergestellt. Dann wurde ein Cocain-KLH-Konjugat hergestellt.
    • (A) Herstellung von KLH-SPDP
  • KLH (200 mg) wurde in 30 ml Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (hier nachstehend als PBS abgekürzt) gelöst. Der Lösung wurden tropfenweise 0,5 ml SPDP (9,4 mg, 15 Äq.) in Ethanol zugegeben, während sie bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt wurde. Das sich ergebende Präzipitat wurde durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 20000 UpM entfernt. Der erhaltene Überstand wurde einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer 2 · 80-cm-Sephadex G25-Säule (Pharmacia Fine Chemicals) unterzogen, so dass sich eine KLH-SPDP-Lösung in PBS (40 ml) ergab. Die Anzahl der SPDP-Bindungen an ein KLH- Molekül wurde wie folgt bestimmt.
  • Aus der so erhaltenen KLH-SDPD-Lösung in PBS wurde ein Volumen von 1 ml verwendet, um die Absorption bei 280 nm zu messen. Die Absorption (A&sub2;&sub8;&sub0;) betrug 3,6005. Der Lösung wurden 50 ul 100 mM wässrige Dithiothreit-Lösung (hier nachstehend als DTT abgekürzt) zugegeben. Nach 5 Minuten wurde die Lösung verwendet, um die Absorption bei 343 nm zu messen. Die Absorption (A&sub3;&sub4;&sub3;) betrug 1,576. Die Konzentration von Pyridin-2- thion wurde, wie in Formel (8) dargestellt, berechnet, vorausgesetzt dass 1,12 · 10&sup5; ein molekularer Absorptionskoeffizient bei 343 nm von Pyridin-2-thion war, das aus der DTT- Reduzierung freigesetzt wurde.
    • Formel (8)
  • [Pyridin-2-thion] = 1,576/1,12 · 10&sup5; = 1,9505 · 10&supmin;&sup4; (M)
  • Hier nachstehend bedeutet ein Name der Verbindung in Klammern eine molare Konzentration der Verbindung.
  • Die Konzentration ist zu derjenigen von SPDP äquivalent, die in KLH eingeführt wurde. Zudem trägt die 2-Pyridylsulfidgruppe in SPDP größtenteils zu A&sub2;&sub8;&sub0; bei, so dass die folgende Korrektur benötigt wird, um die Konzentration von KLH zu berechnen. A280 KLH, die von KLH abhängt, wird wie folgt berechnet:
  • A280 KLH = 3,6005 - (1,9505 · 10&supmin;&sup4; · 5,1 · 10³) = 2,6057, vorausgesetzt dass 5,1 · 10³ ein molekularer Absorptionskoeffizient bei 280 nm der 2-Pyridylsulfidgruppe war. Folglich werden die KLH-Konzentration und die Anzahl der in ein KLH-Moleküle eingeführten SPDP- Moleküle nach der Formel (9) berechnet:
    • Formel (9)
  • [KLH] = 2,6057/1,12 · 10&sup5; = 2,3265 · 10&supmin;&sup5; (M);
  • [SPDP]/[KLH] = 1,9505 · 10&supmin;&sup4;/2,3265 · 10&supmin;&sup5; = 8,3
    • (B) Herstellung eines Cocain-KLH-Konjugats
  • Ein Cocain-KLH-Konjugat wurde wie folgt hergestellt.
  • DTT (77,1 mg, 50 Äq.) wurde zu 40 ml KLH-SPDP/PBS-Lösung (2,3265 · 10&supmin;&sup5; M) gegeben, gefolgt von einem 30-minütigen Rühren bei Raumtemperatur. Nach Entfernen des sich ergebenden Präzipitats durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 20000 UpM wurde der erhaltene Überstand einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer 2 · 80 cm- Sephadex G25-Säule (Pharmacia Fine Chemicals) unterzogen, so dass sich 48 ml KLH- SPDP-(SH-frei)/PBS-Lösung (1,7316 · 10&supmin;&sup5; M) ergaben. Der sich ergebenden Lösung wurden 4,63 mg (8,312 · 103 mmol) des Pyridyldithioderivats der Formel (7) zugegeben, worauf ein Rühren bei 4ºC über Nacht folgte. Nach Entfernen des sich ergebenden Präzipitats durch, eine 10-minütige Zentrifugation bei 20000 UpM wurde der erhaltene Überstand verwendet, um die Absorption bei 343 nm (A&sub3;&sub4;&sub3;) zu messen. Die Absorption betrug 1,0352.
  • Der erhaltene Überstand wurde einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer 2 · 80 cm-Sephadex G25-Säule (Pharmacia Fine Chemicals) unterzogen, so dass sich 48 ml Cocain-KLH PBS-Lösung ergaben.
  • Die Anzahl der Pyridyldithioderivat-Bindungen an ein KLH-Molekül wurde wie folgt bestimmt. Die Tatsache, dass A&sub3;&sub4;&sub3; genau nach der Reaktion 1,0352 betrug und dass 8,08 · 10³ ein molekularer Absorptionskoeffizient bei 343 nm des freigesetztem Pyridin-2-thions war, führte dazu, dass eine Pyridin-2-thion-Konzentration, wie in Formel (10) dargestellt, berechnet wurde:
    • Formel (10)
  • [Pyridin-2-thion] = 1,0352/8,08 · 10³ = 1,2812 · 10&supmin;&sup4; (M)
  • Die Konzentration ist zu derjenigen des in KLH eingeführten Pyridyldithioderivats äquivalent.
  • Da die KLH-Konzentration 1,7316 · 10&supmin;&sup5; M betrug, wird die Anzahl des in ein KLH- Molekül eingeführten Pyridyldithioderivats nach Formel (11) berechnet.
  • [Pyridyldithioderivat]/[KLH] = 1,2812 · 10&supmin;&sup4;/1,7316 · 10&supmin;&sup5; = 7,4 Formel (11)
  • Das gibt an, dass bei einem Cocain-KLH-Konjugat 7,4 Cocain-Moleküle an ein KLH- Molekül binden.
  • In der vorstehenden Ausführungsform wurde das Antigen unter Verwendung von KLH als Protein hergestellt. Nach der vorliegenden Erfindung kann ein Immunogen für die Herstellung einer monoclonalen Antikörper produzierenden Zelllinie unter Verwendung anderer Träger-Proteine auf ähnliche Weise produziert werden, wie Rinderserumalbumin oder Hühner-Gamma-Globulin anstatt KLH.
    • Beispiel 4
  • Herstellung einer monoclonalen Antikörper produzierenden Hybridom-Zellinie und eines monoclonalen Antikörpers.
  • Ein Verfahren zur Herstellung einer monoclonalen Antikörper produzierenden Hybridom-Zellinie und eines monoclonalen Antikörpers wird nach und nach unter Bezugnahme auf die folgenden Ausführungsformen erklärt.
    • (A) Herstellung der Adjuvans-Emulsion
  • Das Cocain-KLH-Konjugat (hier nachstehend als CC-KLH abgekürzt), das durch eine Reihe von Verfahren in den Beispielen 1, 2 und 3 erhalten wurde, wurde mit PBS verdünnt, um seine Konzentration auf 1 mg/ml einzustellen. Aus einem Adjuvans (komplettes Freund- Adjuvans, das durch Hitze abgetötetes und getrocknetes Mycobacterium tuberculosis, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., H37rv) enthielt, wurden 6 ml entnommen, während kräftig gerührt wurde. Dem Adjuvans wurden nach und nach 6 ml CC-KLH-Lösung in 3 Portionen zugegeben, während mit einem Homogenisator (10000 UpM) gerührt wurde, um eine Emulsion herzustellen, bis einige wenige Wassertropfen sich nicht mehr auf der Lösung verteilten.
    • (B) Immunisierung von Mäusen
  • Es wurden jeweils 100 ul der hergestellten Adjuvans-Emulsion, die CC-KLH enthielt, intraperitoneal in jede von zehn 8 Wochen alten Mäuse (A/J) injiziert.
    • (C) Nachweis der Antikörperproduktion
  • 70 Tage nach der immunogenen Injektion wurden 50 bis 100 ul Blut der immunisierten Mäuse aus den Augenvenen in einem Zentrifugenröhrchen gesammelt. Das Serum wurde durch Zentrifugation isoliert, und ein Absuchen mit ELISA zeigte, dass jede Maus einen anti- Cocain-Antikörper produzierte.
    • (D) Booster-Injektion der Mäuse
  • Eine Booster-Injektion (ergänzende schwache immunogene Injektion) wurde zwei Mäusen verabreicht, um deren Milz zu vergrößern.
  • Die beiden Mäuse zeigten beim vorstehenden Absuchen eine höhere Reaktivität als jede andere Maus. Adjuvans-freie CC-KLH-Lösung (1 mg/ml), verdünnt mit PBS, wurde als Immunogen verwendet. Dieses Immunogen (100 ul) wurde den beiden Mäusen intraperitoneal 71 Tage nach der immunogenen Injektion verabreicht.
    • (E) Zellfusion
  • Eine Milzzelle wurde den Mäusen 3 Tage nach der Booster-Injektion entnommen. Die Zelle wurde mit einer Zelllinie (P3X63-Ag8.653), die von einem Maus-Myelom abstammte, auf herkömmliche Weise fusioniert, wobei Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 1500 verwendet wurde. Eine Milzzelle von derselben Maus wie die Nährzelle (Wachstumsfaktoren produzierende Zelle) wurde auf zwei Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet, von denen jede HAT-Medium mit 15 Gew.-% fötalen Kälberserum (hier nachstehend als PCS abgekürzt) enthielt. Eine Woche später wurde das HAT-Medium durch HT-Medium ersetzt, das 15 Gew.-% PCS enthielt.
    • (F) Clonieren
  • Das ELISA-Durchmusterung wurde durchgeführt, um 12 Vertiefungen auszuwählen, die den höchsten Antikörpertiter von allen Vertiefungen zeigten. Es wurde die gesamte Flüssigkeit in den 12 ausgewählten Vertiefungen gesammelt und mit einem Medium, das 15 Gew-.% FCS enthielt, bis zu einer Konzentration von einer einzelnen Zelle pro Vertiefung (begrenzende Verdünnung) verdünnt. Sie wurde zu gleichen Teilen in zwölf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen aufgeteilt. Um die Anfangsproliferation zu beschleunigen, wurden Thymusdrüsenzellen einer 5 Wochen alten Maus (Balb/c als Nährzellen verwendet. Nach jeder Kultur unter Verwendung verschiedener Plattengrößen, Platten mit 24 und 6 Vertiefungen, wurde das Absuchen mit ELISA für das Serum wiederholt, um eine Zelllinie zu finden, die einen höheren Antikörpertiter für Cocain zeigte und sich gut vermehrte. Die Endkonzentration der Zellkultur betrug 5 · 10&sup5; Zellen/ml.
  • (G) Nach Entfernen des Überstands ließ man schließlich die ausgewählte Zelllinie in einer Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup6; Zellen/ml in einer Lösung aus FCS und Dimethylsulfoxid (9 : 1) schwimmen, und sie wurde bei -80ºC eingefroren. Die eingefrorene Zelllinie wurde dann bei -135ºC für zukünftige Verwendungszwecke aufbewahrt.
  • (H) Monoclonale Antikörper wurden mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Protein A bindenden Gels (Protein A-Sepharose, CL-4B, Pharmacia) aus dem Überstand der Zellkultur gereinigt. Die SDS-Polyacryamidgelelektrophorese zeigte beim Vergleich mit Proteinstandards, dass der gereinigte monoclonale Antikörper IgG war, der aus der schweren Kette (mit einem Molekulargewicht von ca. 50000) und der leichten Kette (mit einem Molekulargewicht von ca. 20000) bestand.
  • In der vorstehenden Ausführungsform wurde KLH als Protein verwendet, um Cocain zu binden. Nach der vorliegenden Erfindung kann eine monoclonalen Antikörper produzierende Hybridom-Zelllinie auf ähnliche Weise hergestellt werden, indem andere Trägerproteine wie Rinderserumalbumin oder Hühner-Gamma-Globulin anstatt KLH verwendet werden.
    • Beispiel 5 Nachweis mittels ELISA
  • Die Bewertung des Antiserums, das durch die Verfahren wie in Beispiel 4 erhalten wurde, und des Kulturüberstands und der Nachweis von Cocain oder Cocainderivaten erfolgte mittels eines ELISA-Tests unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers.
    • (A) Antigenbeschichtung
  • Eine Antigen-Lösung mit BSA in einer Konzentration von 0,1 mg/ml wurde durch Verdünnung mit PBS hergestellt, die 0,4 Gew.-% Natriumazid enthielt, und ein Konjugat wurde auf ähnliche Weise wie die CC-KLH-Zubereitung hergestellt, bei der ein Cocainmolekül ein BSA-Molekül im Verhältnis 1 : 1 bindet. Diese Lösung wird mit BSA·PBS·Az abgekürzt. Die Antigen-Lösung wurde zu gleichen Teilen in eine Vinylchlorid-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Coster) in einer Konzentration von 100 ul/Vertiefung gegeben. Man ließ die Mikrotiterplatte über Nacht bei 20ºC stehen.
  • Nachdem die Antigen-Lösung mit einem Absauggerät entfernt worden war, wurde die Platte dreimal mit PBS gewaschen, das anschließend vollständig mit einem Absauggerät entfernt wurde.
    • (B) Blockieren
  • Die BSA·PBS·Az-Lösung wurde in die Platte mit einer Konzentration von 250 ul/Vertiefung gegeben. Man ließ die Mikrotiterplatte 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, bevor BSA·PBS·Az mit einem Absauggerät entfernt wurde. Wenn die Platte an jenem Tag nicht verwendet wurde, wurde die Platte auf einem feuchten Filterpapier in einem luftdichten Behälter bei 4ºC für die weitere Verwendung aufbewahrt.
    • (C) Reaktion des Antikörpers
  • Antikörperlösungen wie das Antiserum, der Kulturüberstand oder der gereinigte Antikörper, von denen jedes in verschiedenen Konzentrationen mit BSA·PBS·Az verdünnt wurde, wurden in die vorstehende Platte in einer Konzentration von 100 ul/Vertiefung gegeben. Die Inhibitionslösung (50 ul/Vertiefung), d. h. Cocain-, Norcocain-, Ecgonin-, Methylecgonin- und Benzoylecgonin-Lösungen wurden in die Platte gegeben, gefolgt von einer Zugabe der Antigen-Lösung (50 ul/Vertiefung) während des Schütteins. Die Platte wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Dann wurde die Antigen-Lösung mit einem Absauggerät entfernt, und die Platte wurde dreimal mit PBS gewaschen, das dann vollständig mit einem Absauggerät entfernt wurde.
    • (D) Sekundäre Antikörperreaktion
  • Eine sekundäre Antikörper-Lösung mit 0,2 ug/ml Peroxidase-markiertem Ziegen-anti- Maus-IgG (KLP, Cat. 141806 Charge HL10-5) in PBS, die 1 Gew.-% BSA enthielt, wurde in die Platte in einem Verhältnis von 50 ul/Vertiefung gegeben. Man ließ die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann wurde die sekundäre Antikörperlösung mit einem Absauggerät entfernt, und die Platte wurde dreimal mit PBS gewaschen, das dann vollständig mit einem Absauggerät entfernt wurde.
    • (E) Beenden der Substratreaktion
  • o-Phenylendiamin für die biochemische Verwendung (40 mg) wurde in 10 ml Zitronensäure-Phosphat-Puffer (pH = 5) gelöst. Der Lösung wurde eine Substratlösung mit 30 Gew.-% wässrigem Wasserstoffperoxid (4 ul) zu einer Konzentration von 100 ul/Vertiefung zugegeben, und man ließ das Gemisch 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann wurde die Reaktion mit 4 N Schwefelsäure in einer Konzentration von 25 ul/Vertiefung gestoppt.
    • (F) Messung
  • Die Absorption bei mehr als 492 nm wurde unter Verwendung eines TOYOSODA MIKROTITTERPLATTEN-LESEGERÄTS gemessen. Der Referenzwert wurde gewöhnlich in einer ersten Reihe der Vertiefungen erhalten, wobei jede gereinigtes Wasser enthielt. Ein Kontrollabsorptionswert für die Vertiefungen, die dem Verfahren (C) nicht unterzogen wurden, wurde entsprechend verwendet.
  • Fig. 1 zeigt die Bindungsfähigkeit zwischen jeder Konzentration einer monoclonalen Antikörperlösung und CC-BSA als Festkörper-Antigen, das die Platte beschichtete. Vertikale und horizontale Linien in Fig. 1 zeigen die Absorption bzw. den Logarithmus der Antikörperkonzentration in mol/l (hier nachstehend als M bezeichnet).
  • Wie Fig. 1 zeigt, ist die Bindung bei einer Konzentration von mehr als 10&supmin;&sup9; M gesättigt; d. h. der Hemmwert bei 10&supmin;&sup9; M Cocain beträgt null oder mehr.
  • Als nächstes wird der Nachweis für jede Cocainkonzentration unter Verwendung von 10&supmin;&sup9; M Antikörpern in Fig. 2 dargestellt. Vertikale und horizontale Linien in Fig. 2 zeigen die Hemmung (%) bzw. den Logarithmus der Cocainkonzentration (M).
  • Die Hemmung (%) wurde wie folgt berechnet:
  • Hemmung (%) = (1-ODx/ODmax) · 100
  • ODx: Absorption bei xM Cocain
  • ODmax: Absorption bei 0 M Cocain
  • Mit diesem Nachweisverfahren führt eine Erhöhung bei der Cocainkonzentration zu einer Abnahme der Absorption. Somit nimmt die Hemmung, wie vorstehend dargestellt, zusammen mit der Cocainkonzentration zu.
  • Wie in Fig. 2 dargestellt, wurde unter diesen Bedingungen 10-9,0 M Cocain nachgewiesen.
  • Übrigens scheint der monoclonale Antikörper eine gute Affinität für strukturverwandte Substanzen des entsprechenden Immunogens zu haben. Cocainderivate können mit einem monoclonalen Antikörper nachgewiesen werden, der durch das immunologische Verfahren unter Verwendung von CC-KLH Antikörper hergestellt wird, obwohl die Nachweisbarkeit ziemlich verringert war.
  • Hier werden die relativen Empfindlichkeiten für Cocain und dessen Derivate auf dieselbe Weise dargestellt, wie vorstehend darauf Bezug genommen wird.
  • Norcocain 10
  • Ecgonin 13
  • Methylecgonin 20
  • Benzoylecgonin 30
  • Der Begriff "relative Empfindlichkeit" bedeutet das niedrigste nachweisbare Konzentrationsverhältnis jeder Substanz zu derjenigen von Cocain. Eine höhere Zahl bedeutet niedrigere Nachweisbarkeit.
  • Wie vorstehend erklärt, stellt die Erfindung ein Cocain-Protein-Konjugat, das Methoxycarbonyl- und Benzoylgruppen besitzt, die beide charakteristisch für Cocain sind, aus einem Aminoderivat von Norcocain, das mit einer Aminoalkylgruppe in seiner sekundären Aminogruppe substituiert ist, und ein Pyridyldithioderivat des vorstehenden Aminoderivats, das mit einer 2-Pyridyldithiopropynoylgruppe in seiner Aminogruppe substituiert ist, bereit.
  • Ferner stellt die Erfindung einen monoclonalen Antikörper mit hoher Affinität für Cocain oder Cocainderivate sowie eine einen monoclonale Antikörper produzierende Hybridom- Zelllinie bereit.

Claims (10)

1. Pyridyldithioderivat eines Aminococainderivats der Formel B
Formel B,
wobei n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist und Ph einen Benzolring darstellt.
2. Cocainderivat nach Anspruch 1, das durch eine Dilsulfidbindung an ein Protein konjugiert ist.
3. Verfahren zur Herstellung einer Hybridomzelllinie, die einen monoclonalen Antikörper produziert, der gegen das Protein-konjugierte Derivat nach Anspruch 2 gerichtet ist, umfassend das Fusionieren einer Milzzelle, die von einer Maus abstammt, die mit einem Antigen immunisiert ist, das das Protein-konjugierte Derivat nach Anspruch 2 umfasst, und einer von einer Myelomzelle abstammenden Zelllinie, sowie das Clonieren des Fusionsprodukts.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Keyhole-Limpet-Hämocyanin ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die von einer Myelomzelllinie abstammende Zelllinie P3X63-Ag8.653 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Maus von einem A/J-Stamm abstammt.
7. Hybridomzelllinie, die einen monoclonalen Antikörper produziert, der gegen das Protein-konjugierte Cocainderivat nach Anspruch 2 gerichtet ist.
8. Hybridomzelllinie, hergestellt gemäß dem Verfahren nach Anspruch 3, die beim National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, Japanese Ministry of Industrial Trade and Industry unter der Nummer BP-4177 hinterlegt ist, gekennzeichnet durch die Herstellung eines Antikörpers, der Cocain oder ein Cocainderivat spezifisch binden kann.
9. Monoclonaler Antikörper, der gegen das Protein-konjugierte Cocainderivat nach Anspruch 2 gerichtet ist.
10. Monoclonaler Antikörper, hergestellt durch die Hybridomzelllinie nach Anspruch 8.
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