PL199253B1 - Koniugat hapten-nośnik, przeciwciało, fragment funkcyjny przeciwciała, zestaw je zawierający, sposób wytwarzania przeciwciała oraz kompozycja szczepionki - Google Patents

Abstract

Nowe koniugaty hapten-no snik o podanych ni zej wzorach ogólnych s a zdolne do induko- wania in vivo produkcji przeciwcia l, które specy- ficznie lacz a si e z nikotyn a. Te koniugaty zawie- raja hapten nikotynowy sprz ezony z immuno- gennym no snikiem bia lkowym. Nowe koniugaty zachowuj a chiralno sc nikotyny w jej natywnym stanie (S)-(-) i maj a dobre w la sciwo sci trwa lo- sci. Koniugaty s a przydatne w komponowaniu szczepionek do immunizacji czynnej, któr a sto- suje si e do zapobiegania i leczenia uzale znie- nia od nikotyny. Przeciwcia la wytworzone w odpowiedzi na koniugat hapten-no snik z niko- tyn a stosuje si e do immunizacji biernej. Te przeciwcia la podaje si e w celu zapobiegania i leczenia uzale znienia od nikotyny. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest koniugat hapten-nośnik z nikotyną, przeciwciało wytworzone w odpowiedzi na ten koniugat, fragment funkcyjny tego przeciwciał a, zestaw je zawierają cy do określania obecności nikotyny w próbce, sposób wytwarzania przeciwciała oraz kompozycja szczepionki zawierająca koniugat hapten-nośnik.

W szczególności, przedmiotem wynalazku są nowe koniugaty hapten-noś nik, zdolne do indukowania produkcji przeciwciał, które z kolei są zdolne do specyficznego wiązania się z nikotyną. Wynalazek znajduje zastosowanie do zapobiegania lub leczenia uzależnienia od nikotyny przez podawanie koniugatu nikotyna-nośnik w farmaceutycznie dopuszczalnym preparacie.

Palenie papierosów, cygar i fajek jest powszechnym problemem w Stanach Zjednoczonych i na całym świecie. Tytoń dymiący i bezdymny są bogate w nikotynę, która jest znaną substancją uzależniającą. Nikotyna jest alkaloidem pochodzącym z tytoniu, odpowiedzialnym za psychoaktywny i uzależniający wpływ palenia. Nikotyna składa się z dwóch pierścieni związanych wiązaniem pojedynczym: aromatycznego pierścienia sześcioczłonowego (pirydyny) i alifatycznego pierścienia pięcioczłonowego (pirolidyny). Pirolidyna jest N-metylenowana i połączona poprzez atom węgla 2 do atomu węgla 3 pirydyny. Zatem atom węgla 2 jest chiralny i istnieje w zasadzie wolna rotacja wokół wiązania pojedynczego łączącego te dwa pierścienie. Bezwzględną konfigurację atomu węgla 2 ustalono jako S. Zatem, naturalna konfiguracja nikotyny to (S)-(-)-nikotyna.

Stosowanie nikotyny jest powszechne z uwagi na łatwą dostępność papierosów, cygar, fajek i tytoniu bezdymnego. Wedł ug Departamentu Zdrowia i Opieki Społ ecznej (Department of Health and Human Services) Stanów Zjednoczonych, palenie papierosów jest w Stanach Zjednoczonych jedyną główną przyczyną śmierci, której można zapobiegać. Patrz także McGinnis i in., J. Am. Med. Assoc., 270, 2207-2211 (1993). Stwierdzono również, że narażenie na bierne palenie ma poważny szkodliwy wpływ na zdrowie, w tym zaostrza astmę.

Mimo, że uzależniające własności nikotyny są dobrze znane, palenie papierosów jest rozpowszechnione. Szczytowe poziomy nikotyny we krwi, około 25 do 50 nanogramów/ml, są osiągane w cią gu 10-15 minut palenia papierosa. U ludzi wynikiem palenia papierosa jest 10-krotnie wię ksze stężenie nikotyny we krwi tętniczej, niż stężenie nikotyny we krwi żylnej, ponieważ nikotyna jest szybko dostarczana z płuc do serca (patrz Henningfield (1993) Drug Alcohol Depend. 33:23-29). Wynikiem tego jest gwałtowny napływ wysokiego stężenia nikotyny z krwią tętniczą do mózgu. Dowody sugerują, że kiedy tylko nikotyna przekroczy barierę krew-mózg, łączy się z receptorami cholinergicznymi, normalnie aktywowanymi przez neurotransmiter acetylocholinę, który jest zaangażowany w oddychanie, utrzymanie akcji serca, pamięć, czuwanie i ruch mięśni. Gdy nikotyna łączy się z tymi receptorami, może to wpływać na normalne działanie mózgu przez wywoływanie uwalniania innych neurotransmiterów, takich jak dopamina. Dopamina znajduje się w mózgu w obszarach zaangażowanych w procesy emocji, motywacji i uczuć przyjemnoś ci. To wł a ś nie uwalnianie neurotransmiterów, szczególnie dopaminy, jest odpowiedzialne za uzależnienie od nikotyny osób używających tytoń lub przyjmujących nikotynę w inny sposób.

Z uwagi na znaczą ce szkodliwe dla zdrowia skutki palenia, palacze czę sto próbuj ą rzucić palenie. Jednakże, uzależniające własności nikotyny i dostępność papierosów powiększają ciągłą zależność od nikotyny i wysoki wskaźnik niepowodzeń prób rzucania palenia. Objawy abstynencji po odstawieniu są nieprzyjemne i ulgę w nich przynosi palenie.

Przygotowano wiele terapii dla uzależnienia od nikotyny, lecz przeważnie nieskutecznych. Dwoma najbardziej popularnymi terapiami pozostają nikotynowy plaster przezskórny i nikotyna wprowadzona do gumy do żucia. Te terapie, określone jako „nikotynowe terapie zastępcze (NRT), zastępują ilość nikotyny, którą użytkownik uprzednio otrzymywał dzięki paleniu i działają tak, aby odzwyczaić użytkownika od nikotyny. Zauważalne są jednak pewne wady tego typu leczenia. Występuje szczególnie niska penetracja nikotyny do krwiobiegu i dlatego zwiększa się chęć palenia. Ze stosowaniem nikotynowej gumy do żucia związane są problemy takie jak podrażnienie jamy ustnej, bolesność szczęki, nudności. Z zastosowaniem nikotynowych plastrów przezskórnych związane są problemy takie jak podrażnienia skóry, zaburzenia snu i nerwowość.

Zatem potrzebny jest alternatywny sposób leczenia uzależnienia od nikotyny. To zapotrzebowanie znalazło oddźwięk w literaturze i poczyniono kilka prób uzyskania sposobu leczenia uzależnienia od nikotyny. Jeden ze sposobów wymaga podawania przeciwciał wytwarzanych w odpowiedzi na nikotynę. Wiadomo jednakże, że substancje o małej masie cząsteczkowej, nazwane haptenami, są

PL 199 253 B1 niezdolne do wyzwalania odpowiedzi immunologicznej u gospodarza. Nikotyna nie jest wyjątkiem, i jako mała cząsteczka nie jest immunogenna. Aby wywołać odpowiedź przeciwciała na hapten, typowo wiąże się go kowalencyjnie z białkiem nośnikowym i ten kompleks wywołuje produkcję przeciwciał, które rozpoznają hapten.

Na przykład kwas nikotyno-4'-karboksylowy, związany kowalencyjnie z hemocyjaniną o dopasowaniu typu otwór i klucz (keyhole limpet hemocyanin KLH), stosowano do wytwarzania przeciwciał dla metabolitu nikotyny. Te przeciwciała wykorzystywano w celu określenia obecności nikotyny w płynach fizjologicznych. Patrz Bjerke i in. J. Immunol. Methods, 96, 239-246 (1987).

Inne przeciwciała nikotynowe uzyskał Castro i in., (Eur. J. Biochem., 104, 331-340 (1980)). Castro i in. wytworzyli hapteny nikotyny, połączone z albuminą surowicy bydlęcej (BSA), z białkiem nośnikowym przyłączonym poprzez grupę łączącą w pozycji 6 nikotyny. Castro i in. wytworzyli dodatkowe koniugaty nikotyny z BSA, które wstrzykiwano ssakom w celu otrzymania przeciwciał. W innej publikacji, Castro i in. w Biochem. Biophys. Res. Commun. 67, 583-589 (1975) ujawniają dwa koniugaty nikotyny z albuminą: N-sukcynylo-6-amino-(±)-nikotyna-BSA i 6-^-aminokaproamido)-(±)-nikotyna-BSA. W tej publikacji z roku 1975, Castro i in. ujawnili także zastosowanie przeciwciał do koniugatu nikotyny z nośnikiem, 6y-aminokaproamido)-(±)-nikotyna-BSA, do określania poziomów nikotyny we krwi i moczu, patrz Res. Commun Chem. Path. Pharm. 51, 393-404 (1986).

Swain i in. (opis patentowy nr W098/14216) ujawnił koniugaty nikotyny z nośnikiem, w których hapten jest przyłączony w pozycji 1, 2, 4, 5, 6 lub 1' nikotyny. Hieda i in. wykazali, że zwierzęta immunizowane 6-(karboksymetyloureido)-(±)-nikotyną, która była związana z hemocyjaniną o dopasowaniu typu otwór i klucz, wytwarzały przeciwciała specyficzne dla nikotyny. J. Pharm. and Exper. Thera. 283, 1076-1081 (1997). Langone i in. otrzymał pochodną haptenu, O-sukcynylo-3'-hydroksymetylonikotynę, patrz Biochemistry, 12, 5025-5030, i wykorzystywał przeciwciała dla tego koniugatu haptenu z nośnikiem w testach radioimmunologicznych. Patrz Methods in Enzymology, 84, 628-635 (1982). Koniugat otrzymany przez Langone'a jest podatny na hydrolizę. Ponadto, Abad i in. w Anal. Chem., 65, 32273231 (1993) ujawnił sprzęganie 3'-(hydroksymetylo)nikotyny z albuminą surowicy bydlęcej w celu wytworzenia przeciwciał dla nikotyny, tak aby umożliwić pomiar zawartości nikotyny w kondensacie dymu papierosowego w teście ELISA.

Zatem, dotychczas w tej dziedzinie nie ujawniono trwałego, nieznanego wcześniej koniugatu nikotyna-nośnik, który zachowuje chiralne własności haptenu nikotyny i który wiąże hapten z nośnikiem w taki sposób, że zachowuje własności epitopu (epitopów) nikotyny. Ponadto, w tej dziedzinie nie ujawniono, ani nie proponowano metod zapobiegania i leczenia uzależnienia od nikotyny przez zastosowanie takich koniugatów. Seeman w Heterocycles, 22, 165-193, (1984) ujawnia wyniki analizy konformacyjnej i badania reaktywności chemicznej nikotyny.

W odpowiedzi na potrzebę bardziej skutecznego sposobu leczenia uzależnienia od nikotyny, jednym z przedmiotów według niniejszego wynalazku są nowe koniugaty nikotyna-nośnik, które są trwałe, zawierają nikotynę w jej naturalnej postaci (S)-(-), i w których stosuje się wiązanie nikotynanośnik, które zachowuje własności epitopu (epitopów) nikotyny i względną orientację dwóch pierścieni cząsteczki nikotyny. Przyjmuje się, że oba pierścienie nikotyny i ich względna orientacja są zasadnicze dla rozpoznania nikotyny przez przeciwciało w roztworze. Takie koniugaty mogą stymulować produkcję przeciwciał, które są zdolne do specyficznego wiązania nikotyny. Stosując koniugaty według wynalazku można zwiększyć osoczowe poziomy nikotyny i zmniejszyć poziomy nikotyny w mózgu ssaków. Ponadto, stosując koniugaty według wynalazku, można także zapobiegać wywoływanym przez nikotynę zmianom ciśnienia krwi i wpływom lokomotorycznym.

Wynalazek znajduje zastosowanie w leczeniu uzależnienia od nikotyny przez podawanie koniugatu według wynalazku pacjentowi uzależnionemu od nikotyny, tym samym wytwarzanie przeciwciał antynikotynowych u tego pacjenta. Zatem, gdy pacjent pali (lub używa tytoniu do żucia), nikotyna z tych produktów ulega związaniu przez przeciwciała antynikotynowe we krwi, co zapobiega przechodzeniu nikotyny przez barierę krew-mózg, i zatem eliminuje wywołane przez nikotynę zmiany w chemii mózgu, co jest źródłem uzależnienia od nikotyny. Pod tym względem ważny jest fakt, że koniugat nikotyna-nośnik wywołuje produkcję przeciwciał, które będą rozpoznawały natywną cząsteczkę nikotyny. Jak opisano powyżej, nowe koniugaty nikotyna-nośnik według wynalazku zachowują chiralność i epitop (epitopy) naturalnie występującej nikotyny.

Zgłaszający nie wiążą się z żadną teorią dotyczącą sposobu hamowania przez koniugaty nikotyny, i przeciwciała wytwarzane w odpowiedzi na takie koniugaty, wpływu nikotyny przyjętej przez ssaki. Oprócz zapobiegania przechodzeniu nikotyny przez barierę krew-mózg, przeciwciała także

PL 199 253 B1 mogą zapobiegać wiązaniu nikotyny do innych receptorów w obwodowym układzie nerwowym przez prostą blokadę przestrzenną.

Koniugat hapten-nośnik według wynalazku ma strukturę określoną wzorem I:

w którym m oznacza 1 do 2500, n oznacza 0 do 12, y oznacza 1 do 12,

X jest wybrany z grupy obejmują cej NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S;

Y jest wybrany z grupy obejmują cej NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S, i grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- jest przyłączona w pozycji 3', 4' lub 5' nikotyny.

W korzystnym rozwiązaniu koniugatu hapten-nośnik, m oznacza 11 do 17, n oznacza 1, y oznacza 2, X oznacza NH-CO, Y oznacza CO-NH, a grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- jest przyłączona w pozycji 3' nikotyny.

W innym korzystnym rozwią zaniu koniugatu hapten-noś nik, m oznacza 11 do 17, n oznacza 1, y oznacza 2, X oznacza NH-CO, Y oznacza CO-NH, a grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- jest przyłączona w pozycji 4' nikotyny.

W innym korzystnym rozwią zaniu koniugatu hapten-noś nik, m oznacza 11 do 17, n oznacza 1, y oznacza 2, X oznacza NH-CO, Y oznacza CO-NH, a grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- jest przyłączona w pozycji 5' nikotyny.

W kolejnym korzystnym rozwią zaniu, m wynosi 1 do 20 albo 1 do 200.

Korzystnie nośnik białkowy oznacza egzoproteinę A.

Przedmiotem wynalazku jest także koniugat hapten-nośnik o strukturze określonej wzorem III:

w którym n oznacza 0 do 12, j oznacza 1 do 1000, k oznacza 1 do 20 i E oznacza no śnik macierzysty zawierający aminokwas.

W korzystnym rozwiązaniu, noś nikiem macierzystym jest kwas poli-L-glutaminowy.

Koniugaty hapten-nośnik zdefiniowane powyżej wytworzone są korzystnie z zastosowaniem trans-4'-karboksy-(-)-nikotyny jako substancji wyjściowej.

PL 199 253 B1

Koniugaty te znajdują zastosowanie jako lek, korzystnie jako lek do zapobiegania lub leczenia uzależnienia od nikotyny. Lek taki dodatkowo może zawierać związek przydatny do leczenia uzależnienia od nikotyny.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało wytworzone w odpowiedzi na koniugat haptennośnik zdefiniowany powyżej, zarówno przeciwciało monoklonalne, jak i poliklonalne.

Przeciwciało takie ma korzystnie zastosowanie jako lek.

Wynalazek obejmuje ponadto fragment funkcyjny przeciwciała wytworzonego w odpowiedzi na koniugat hapten-nośnik zdefiniowany powyżej, wybrany spośród Fv, Fab, Fab', F(ab)2 i F(ab')2. Fragment funkcyjny korzystnie znajduje zastosowanie jako lek, korzystnie zastosowanie jako lek do zapobiegania lub leczenia uzależnienia od nikotyny.

Zestaw do określania obecności nikotyny w próbce według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera przeciwciało opisane powyżej lub jego fragment funkcyjny w odpowiednim pojemniku.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania przeciwciała, w którym immunizuje się gospodarza jakim jest ssak koniugatem hapten-nośnik opisanym powyżej. W sposobie tym można stosować przeciwciało monoklonalne, lub w innym wariancie przeciwciało poliklonalne.

Kompozycja szczepionki według wynalazku zawiera co najmniej jeden koniugat hapten-nośnik opisany powyżej razem ze środkami wspomagającymi, rozczynnikami i środkami pomocniczymi.

Korzystnie, środki wspomagające są wybrane z grupy obejmującej ałun, QS-21, saponiny i monofosforylolipid A, natomiast rozczynniki są wybrane z grupy obejmującej sterylną wodę, roztwór soli taki jak solanka, fosforan sodu, chlorek sodu, alkohol, gumę arabską, oleje roślinne, alkohol benzylowy, glikol polietylenowy, żelatynę, mannitol, węglowodany, stearynian magnezu, gęstą parafinę, estry kwasów tłuszczowych, hydroksymetylocelulozę i bufory, a roztwór soli jest wybrany z grupy obejmującej fosforan sodu i chlorek sodu. Środki pomocnicze są korzystnie wybrane z grupy obejmującej ośrodek dyspersyjny, powłoki, mikrokulki, liposomy, mikrokapsułki, lipidy, surfaktanty, lubrikanty, środki konserwujące i stabilizatory.

Wynalazek znajduje zastosowanie w leczeniu lub zapobieganiu uzależnieniu od nikotyny u pacjenta wymagającego takiego leczenia, obejmujące podawanie terapeutycznie skutecznej ilości koniugatu hapten-nośnik o wzorze (I) lub (III) lub podawanie terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała wytworzonego w odpowiedzi na koniugat hapten-nośnik o wzorze (I) lub (III), lub przez zastosowanie kompozycji szczepionki, która zawiera koniugat hapten-nośnik o wzorze (I) lub (III). Ponadto ta szczepionka może ponadto zawierać dodatkowy związek terapeutyczny do leczenia uzależnienia od nikotyny.

Wynalazek dotyczy zatem koniugatu hapten-nośnik z nikotyną do leczenia uzależnienia od nikotyny. Koniugat hapten-nośnik z nikotyną ma wzór (I):

w którym m oznacza 1 do 2,500; n oznacza 0 do 12; y oznacza 1 do 12; X jest wybrany z grupy obejmującej NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S; Y jest wybrany z grupy obejmują cej NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S; białko nośnikowe jest dowolnym odpowiednim immunogennym białkiem lub polipeptydem. Korzystnie białko nośnikowe może obejmować epitop komórki T i grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y jest przyłączona w pozycji 3', 4' lub 5' czą steczki nikotyny.

We wzorze (I) m oznacza korzystnie 1 do 200. W innym korzystnym rozwiązaniu m oznacza 1 do 20. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu m oznacza 11 do 17. W innym korzystnym rozwiązaniu X jest wybrany z grupy obejmującej NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH i CO-NH-NH-CO.

PL 199 253 B1

Jeśli m oznacza więcej niż jeden, grupa w nawiasach jest przyłączona m razy w różnych punktach przyłączenia do białka nośnikowego. Np. jeśli m=2, wzór (I) wyglądałby następująco:

Ponieważ przeciwciała nie mogą być wytwarzane w odpowiedzi na samą nikotynę, zgłaszający opracowali hapten nikotynowy, który jest derywatyzowany w pozycji 3', 4' lub 5' nikotyny. Ta grupa jest związana z białkiem nośnikowym, w taki sposób że powstaje koniugat haptenu z nośnikiem, który wstrzyknięty odpowiedniemu gospodarzowi jakim jest ssak daje impuls do wytwarzania przeciwciał przeciw grupie nikotynowej. Dlatego, aby kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat haptenu z noś nikiem indukował a produkcję przeciwciał po podaniu jej ssakowi, białko noś nikowe musi być immunogenne. Korzystnie, będzie ono zawierać epitop komórki T. Zatem, gdy białko nośnikowe jest połączone z haptenem nikotynowym, i następnie podane ssakowi, ssak produkuje lub „wytwarza przeciwciała w odpowiedzi na hapten nikotynowy.

Hapteny i derywatyzacja

Stosowany termin „hapten według niniejszego wynalazku odnosi się do niskocząsteczkowego organicznego związku, który sam nie jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej, ale wywołuje odpowiedź immunologiczną po przyłączeniu do cząsteczki nośnika. W korzystnym rozwiązaniu, hapten jest przyłączony do nośnika poprzez grupę łączącą. Hapten według niniejszego wynalazku jest pochodną nikotyny. Ten hapten nikotynowy zawiera reaktywną grupę funkcyjną, do której nośnik może być przyłączony bezpośrednio lub poprzez grupę łączącą, lub poprzez nośnik, lub poprzez grupę łączącą i nośnik. Korzystnie, hapten nikotynowy jest przyłączony do białka nośnikowego poprzez wiązanie amidowe lub dwusiarczkowe. Wiązania amidowe i dwusiarczkowe mają pożądaną trwałość. Ponieważ koniugaty hapten-nośnik według wynalazku stosuje się jako szczepionki, ważne jest aby koniugaty były trwałe, co zapewni przedłużony dopuszczalny okres przechowywania szczepionki.

W korzystnym rozwią zaniu wedł ug niniejszego wynalazku, hapten nikotynowy jest reprezentowany wzorem (II):

w którym n oznacza 0 do 12 i Z oznacza NH2, COOH, CHO lub SH i grupa -(CH2)n-Z może być przyłączona w pozycji 3', 4' lub 5'. Grupa Z jest zdolna do wiązania nośnika bezpośrednio lub poprzez grupę łączącą. Koniugat hapten-nośnik będzie indukować produkcję przeciwciał po wprowadzeniu do ciała pacjenta lub zwierzęcia.

W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, hapten nikotynowy odpowiada następującemu wzorowi (3'-aminometylonikotyna):

PL 199 253 B1

1. Bezpośrednie koniugaty

W celu otrzymania „bezpośredniego koniugatu pojedynczy hapten nikotynowy bezpośrednio przyłącza się do nośnika z zastosowaniem lub bez grupy łączącej. Np. pojedynczy hapten nikotynowy można przyłączyć do każdej dostępnej grupy aminowej nośnika. Ogólne metody bezpośredniego sprzęgania haptenów z nośnikami białkowymi z zastosowaniem homodwufunkcyjnych lub heterodwufunkcyjnych czynników sieciujących, np. G.T. Hermanson w Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) oraz Dick i Beurret w Conjugate Vaccines. Contribu. Mikrobiol. Immunol., Karger, Basal (1989) tom 10, 48-114. Przy bezpośrednim sprzęganiu z zastosowaniem dwufunkcyjnych czynników sieciujących, stosunek molowy haptenu do białka jest ograniczony przez liczbę grup funkcyjnych dostępnych na białku, z powodu specyficznej chemii sprzęgania. Np. w przypadku białka nośnikowego posiadającego liczbę n grup lizynowych dostępnych będzie, teoretycznie, n+1 pierwszorzędowych grup aminowych (w tym końcowa grupa aminowa) do reakcji z grupą karboksylową grupy łączącej. Zatem stosując tę bezpośrednią procedurę sprzęgania, liczba utworzonych wiązań amidowych produktu będzie ograniczona do n+1, tj . przyłączonych zostanie maksymalnie n+1 haptenów.

Dla fachowca będzie oczywiste, że stosunek haptenu do nośnika będzie się zmieniać zależnie od stężenia reagentów stosowanych do sprzęgania haptenu nikotynowego z białkiem nośnikowym i wł asnoś ci biał ka noś nikowego. Również dla danego preparatu koniugatu nikotyna-noś nik, stosunek hapten/nośnik będzie się zmieniać dla każdego poszczególnego koniugatu. Np. egzoproteina A ma dostępnych, teoretycznie, 15 grup aminowych do sprzęgania z haptenem. Jednakże, zgłaszający stwierdzili, że gdy z tym białkiem sprzężono 3'-aminometylosukcynylo-nikotynę, do każdej egzoproteiny A nośnika przyłączyło się od 11-17 haptenów nikotynowych, w pojedynczym preparacie koniugatu. Ten przedział określono doświadczalnie stosując filtracyjną chromatografię gazową i mierząc zwiększenie absorbancji UV przy długości fali 260 nm. Do pewnych nośników przyłączyło się 17 grup nikotynowych, ponieważ hapten nikotynowy może przyłączać się do grup nie-aminowych na nośniku. Przykłady grup nie-aminowych, do których może przyłączać się hapten, obejmują między innymi grupy -SH i -OH. Jednakże, częstość występowania tych reakcji ubocznych jest niska.

2. Koniugaty z nośnikiem macierzystym

Aby zmniejszyć ograniczenia liczby haptenów, którą można przyłączyć do nośnika z zastosowaniem bezpośredniego sprzęgania, można stosować aminokwasowy „nośnik macierzysty. Termin „nośnik macierzysty oznacza aminokwas, peptyd, dipeptyd lub polipeptyd, w tym oligomeryczne i polimeryczne polipeptydy. Nośnikiem macierzystym może takż e być liniowy lub rozgałęziony polipeptyd. Przykłady aminokwasów, które można stosować w celu otrzymania nośnika macierzystego obejmują między innymi kwas asparaginowy, lizynę, cysteinę i kwas L-glutaminowy. Takie substancje nośnika macierzystego można komponować w polimery, takie jak poli(kwas L-glutaminowy). Gdy stosuje się aminokwas taki jak cysteina, grupę tiolową zabezpiecza się, tym samym pozwalając na związanie haptenu z karboksylową grupą aminokwasu. Fachowcom w tej dziedzinie są dobrze znane typy grup zabezpieczających i sposoby przyłączania grup zabezpieczających do aminokwasowych grup funkcyjnych. Wyczerpujące omówienie przedstawiono w Green, Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York, 1991.

Odpowiedni nośnik macierzysty zawiera odpowiednią grupę funkcyjną i jest obciążony dwoma lub więcej haptenami. Zatem, w innym korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, podstawiony przez nikotynę nośnik macierzysty jest sprzężony z białkiem nośnikowym w celu zwiększenia stosunku molowego haptenu do nośnika w koniugacie hapten-nośnik. Nośnik macierzysty odgrywa podwójną rolę, po pierwsze stanowi bazę dla dużej liczby haptenów i po drugie stanowi czynnik sieciujący. Podstawiony przez nikotynę nośnik macierzysty sprzężony z białkiem nośnikowym reprezentuje wzór (III):

PL 199 253 B1

w którym n oznacza 0 do 12, j oznacza 1 do 1000, k oznacza 1 do 20, E oznacza noś nik macierzysty zawierający aminokwas, do którego może zostać przyłączony hapten, i białko nośnikowe obejmuje dowolne odpowiednie białko lub polipeptyd zawierający epitop komórki T. Nośnik macierzysty E zawierający aminokwas może obejmować aminokwas, peptyd, dipeptyd lub polipeptyd, w tym oligomeryczne, jak również polimeryczne polipeptydy. Nośnik macierzysty zawiera jeden lub więcej aminokwasów, które obejmują między innymi kwas asparaginowy, lizynę, cysteinę i kwas poli-L-glutaminowy. W korzystnym rozwiązaniu, j oznacza 1 do 200 i w innym korzystnym rozwiązaniu j oznacza 1 do 4.

Koniugaty nośnik macierzysty-nośnik są zdolne do tworzenia multimerycznych „sieci. Taką sieć przedstawiono na rysunku poniżej. Termin „sieć oznacza kowalencyjnie związany kompleks, zawierający liczne nośniki macierzyste, hapteny, grupy łączące i białka nośnikowe, przy czym wszystkie są ze sobą związane kowalencyjnie. Ponieważ nośnik macierzysty podstawiony przez nikotynę zawiera liczne grupy nikotynowe dostępne dla reakcji sprzęgania z nośnikiem, można utworzyć sieć zawierającą liczne nośniki i liczne nośniki macierzyste podstawione przez nikotynę. Uproszczone odwzorowanie części takiej sieci przedstawia się następująco:

Fachowiec w tej dziedzinie łatwo zauważy, że sieć według wynalazku zawiera koniugat haptenu z noś nikiem o wzorze (III).

Ta metoda sprzęgania z zastosowaniem nośnika macierzystego oferuje elastyczność i kontrolę stosunków molowych haptenu do białka, bez względu na liczbę grup funkcyjnych dostępnych dla rePL 199 253 B1 akcji sprzęgania z białkiem. Jest to szczególnie przydatne, gdy stosuje się specyficzne białko nośnikowe i gdy trzeba uzyskać optymalny stosunek w celu osiągnięcia większej immunogenności koniugatu. Podczas gdy zastosowanie tego nie jest konieczne w przypadku nośnika macierzystego, można zastosować taką grupę łączącą. Aby zastosować w tym rozwiązaniu grupę łączącą, podstawiony przez nikotynę nośnik macierzysty poddaje się reakcji ze związkiem z aktywną grupą łączącą. Na przykład jako grupę łączącą z koniugatami nośnika macierzystego można stosować ADH, dihydrazyd kwasu adypinowego.

Białka nośnikowe

Po otrzymaniu haptenu nikotynowego sprzęga się go następnie z białkiem nośnikowym, które stosuje się w celu wytworzenia przeciwciał dla koniugatu nikotyny z nośnikiem. Białko nośnikowe stosowane w koniugacie nikotyny z nośnikiem według niniejszego wynalazku jest oznaczone jako

we wzorach (I) i (III) i obejmuje ono dowolne odpowiednie immunogenne białko lub polipeptyd. Cząsteczka „immunogenna oznacza taką cząsteczkę, która jest zdolna do wywoływania odpowiedzi immunologicznej. Korzystnie, białko nośnikowe będzie obejmowało epitop komórki T. Oznaczenie „białko nośnikowe obejmuje także MAP lub peptydy o wielu antygenach, które są peptydami rozgałęzionymi. Zastosowanie MAP maksymalizuje gęstość i wartościowość haptenu ze względu na liczne reszty aminokwasów rozgałęzionych. Przykłady aminokwasów, które można stosować w celu wytworzenia MAP, obejmują między innymi lizynę.

Białko nośnikowe według wynalazku obejmuje cząsteczkę zawierającą co najmniej jeden epitop komórki T, który jest zdolny do stymulowania komórek T osobnika, który następnie indukuje komórki B, w celu wytworzenia przeciwciał przeciw całej cząsteczce koniugatu hapten-nośnik. Termin „epitop stosowany w opisie tego wynalazku oznacza dowolną determinantę na antygenie, która jest odpowiedzialna za jego specyficzne oddziaływanie z cząsteczką przeciwciała. Determinanty epitopów zazwyczaj składają się z chemicznie aktywnych powierzchniowych grup cząsteczek takich jak aminokwasowe lub cukrowe łańcuchy boczne i mają specyficzne trójwymiarowe własności strukturalne, jak również specyficzne właściwości ładunku. Przyjmuje się, że aby mieć właściwości immunogenne, białko lub polipeptyd muszą być zdolne do stymulowania komórek T. Jednakże możliwe jest, aby białko nośnikowe, któremu brakuje epitopu komórki T, także było immunogenne.

Wybierając białko nośnikowe, o którym wiadomo, że wywołuje silną odpowiedź immunologiczną, można leczyć różnorodną populację pacjentów z zastosowaniem koniugatów hapten-nośnik według wynalazku. Białko nośnikowe musi być dostatecznie obce, tak aby wywołało silną odpowiedź immunologiczną na szczepionkę. Typowo stosowane białko nośnikowe korzystnie obejmuje dużą cząsteczkę, która jest zdolna do przekazywania immunogenności kowalencyjnie związanemu haptenowi. Szczególnie korzystne białko nośnikowe to takie, które jest w naturalny sposób wysoce immunogenne. Zatem wysoce pożądane jest białko nośnikowe, które ma wysoki stopień immunogenności i jest zdolne do zmaksymalizowania produkcji przeciwciała dla haptenu.

Przy opracowywaniu sprzężonych szczepionek z zastosowaniem eksperymentów na zwierzętach, jako nośniki powszechnie stosowano zarówno albuminę surowicy bydlęcej (BSA), jak i hemocyjaninę o dopasowaniu typu otwór i klucz (KLH). Jednakże te białka mogą nie nadawać się do zastosowania u ludzi. Białka, których używano do wytwarzania sprzężonych szczepionek terapeutycznych obejmują między innymi pewną liczbę toksyn bakterii patogennych i ich anatoksyn. Przykłady obejmują toksyny błonicy i tężca oraz ich medycznie dopuszczalne odpowiednie anatoksyny. Inne warianty obejmują białka podobne antygenowo do toksyn bakteryjnych znane pod nazwą substancji o działaniu krzyżowym (cross-reacting materials CRM).

W wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznych sprzężonej nikotyny, jako białko nośnikowe można stosować rekombinacyjną egzoproteinę A Pseudomonas aeruginosa (rEPA), ponieważ jej budowa i biologiczne aktywności zostały dobrze scharakteryzowane. Ponadto to białko rekombinacyjne było z powodzeniem i bezpiecznie stosowane u ludzi w szczepionkach sprzężonych polisacharyd u otoczkowego Staphylococcus aureus przez Krajowy Instytut Zdrowia (National Institutes of Health) i przez zgłaszających ten wynalazek. Fattom i in., Infect Immun. 61 1023-1032 (1993). To białko zostało zidentyfikowane jako odpowiedni nośnik białkowy, ponieważ wewnętrzna aktywność enzymatyczna natywnej egzotoksyny została wyeliminowana dzięki usunięciu aminokwasu w pozycji 553. W wyniku tego, rEPA ma taki sam profil immunologiczny jak natywna egzotoksyna A (ETA), ale nie posiada

PL 199 253 B1 hepatotoksycznych właściwości natywnej ETA. Stosowany w tym zgłoszeniu termin „egzoproteina A odnosi się do zmodyfikowanej nie hepatotoksycznej ETA. Przykładowa taka egzoproteina A ma usunięty aminokwas w pozycji 553.

Sprzęganie haptenu z nośnikiem białkowym

Istnieje duża liczba grup funkcyjnych, które można stosować w celu ułatwienia wiązania lub sprzęgania nośnika z małą cząsteczką, taką jak hapten. Obejmują one części funkcyjne takie jak kwasy karboksylowe, bezwodniki, mieszane bezwodniki, halogenki acylu, azydki acylu, halogenki alkilu, N-maleimidy, estry iminowe, izocyjaniany, aminy, tiole i izotiocyjaniany i inne znane fachowcom w tej dziedzinie. Te grupy posiadają zdolność do tworzenia wiązania kowalencyjnego z reaktywną grupą cząsteczki białka. Zależnie od użytej grupy funkcyjnej, grupą reaktywną może być grupa ε-aminowa reszty lizynowej lub grupa tiolowa, cząsteczki nośnika białkowego lub zmodyfikowanego nośnika białkowego, która, po reakcji, zostaje związana wiązaniem amidowym, aminowym, tioeterowym, amidynomocznikowym lub tiomocznikowym. Dla fachowców w tej dziedzinie będzie oczywiste, że można stosować inne odpowiednie grupy aktywujące i techniki sprzęgania. Patrz np. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Inc. (1991). Patrz także Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press: 1996 oraz Dick i Beurret w Conjugate Vaccines. Contribu. Mikrobiol. Immunol, Karger, Basal (1989) tom 10, 48-114.

W celu sprzęgania haptenów z białkami nośnikowymi korzystniejsze są liniowe grupy łączące, niż cykliczne lub rozgałęzione grupy łączące. Korzystna grupa łącząca obejmuje sukcynyl. Jednakże grupa łącząca może mieć strukturę cykliczną, jak również liniową. Innym przykładem grupy łączącej jest ADH.

Zatem, koniugaty hapten-nośnik z nikotyną według niniejszego wynalazku wytwarza się przez poddanie reakcji jednego lub więcej haptenów z nośnikiem białkowym w celu uzyskania koniugatu haptenu z nośnikiem, który jest zdolny do stymulowania komórek T, co prowadzi do proliferacji komórki T i uwolnienia mediatorów, które aktywują specyficzne komórki B do stymulowania produkcji przeciwciał w odpowiedzi na immunogenny koniugat hapten-nośnik. Pewne przeciwciała wytworzone w odpowiedzi na koniugat haptenu z nośnikiem będą specyficzne dla części haptenowej koniugatu hapten-nośnik. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie różnych odpowiednich kombinacji haptenów z białkami nośnikowymi w leczeniu uzależnienia od nikotyny.

Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne

Techniki wytwarzania przeciwciał monoklonalnych są dobrze znane w tej dziedzinie. Przeciwciała monoklonalne można otrzymać przez wstrzykiwanie myszom kompozycji zawierającej nikotynowy koniugat hapten-nośnik, następnie sprawdzenie rozpoczęcia wytwarzania przeciwciał pobierając próbkę osocza, usunięcie śledziony w celu uzyskania limfocytów B, połączenie limfocytów B z komórkami szpiczaka w celu wytworzenia hybrydom, klonowanie hybrydom, wybieranie pozytywnych klonów, które wytwarzają przeciwciała dla koniugatu hapten-nośnik, hodowanie klonów, które wytwarzają przeciwciała dla tego antygenu i oddzielenie przeciwciał od hodowli hybrydomy.

Przeciwciała monoklonalne można wydzielić i oczyścić z hodowli hybrydomy stosując różne dobrze opracowane techniki. Takie techniki izolacji obejmują chromatografię powinowactwa z Proteiną-A na sefarozie, chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek i chromatografię jonowymienną. Patrz np. Coligan na str. 2.7.1-2.7.12 i str. 2.9.1-2.9.3. Patrz także, Baines i in., „Purification of Immunoglobulin G (IgG), w Methods in Molecular Biology, tom 10, str. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).

Techniki wytwarzania przeciwciał poliklonalnych są także dobrze znane w tej dziedzinie. Przeciwciała poliklonalne wytwarza się według standardowych technik znanych w tej dziedzinie. Aby przygotować przeciwciało poliklonalne, zwierzęciu wstrzykuje się immunogenny materiał i zbiera się osocze bogate w przeciwciała, które zawiera mieszaninę przeciwciał ukierunkowanych przeciw licznym epitopom wstrzykiwanego immunogenu. Odpowiedni gospodarze jakimi są ssaki do wytwarzania przeciwciał obejmują między innymi ludzi, szczury, myszy, króliki i kozy.

Według niniejszego wynalazku można także stosować funkcyjne fragmenty przeciwciała. Te fragmenty wytwarza się metodami, które obejmują trawienie enzymami takimi jak pepsyna lub papaina i/lub rozrywanie wiązań dwusiarczkowych metodą reakcji chemicznej redukcji. Alternatywnie, fragmenty przeciwciała według niniejszego wynalazku można zsyntetyzować stosując automatyczny syntezator peptydów taki jak dostępne w handlu z firm Applied Biosystems, Multiple Peptide Systems i innych, lub można je wytwarzać ręcznie, stosując techniki dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz Geysen i in., J. Immunol. Methods 102: 259 (1978). Bezpośrednie określanie aminokwasowych sekwencji

PL 199 253 B1 zmiennych obszarów ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciał monoklonalnych według wynalazku można prowadzić z zastosowaniem technik typowych.

Fragmentem według niniejszego wynalazku może być fragment Fv. Fragment Fv przeciwciała składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (Vh) przeciwciała i regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała (VI). Dzięki proteolitycznemu rozerwaniu przeciwciała można otrzymać dwułańcuchowe fragmenty Fv, w których obszary Vh i VI pozostają nieprzyłączone kowalencyjnie i zachowują zdolność wiązania antygenu. Fragmenty Fv obejmują także rekombinacyjne cząsteczki przeciwciał o pojedynczym łańcuchu, w których zmienne obszary łańcucha lekkiego i ciężkiego są połączone peptydową grupą łączącą. Patrz Skerra, i in. Science, 240, 1038-41 (1988). Fragmenty przeciwciała według wynalazku obejmują także Fab, Fab', F(ab)2 i F(ab')2, w których brak fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała.

Metody terapeutyczne

Ponieważ nikotyna wywiera znaczące niekorzystne działanie po przejściu przez barierę krew-mózg, wynalazek znajduje zastosowanie w metodach terapeutycznych, które uniemożliwiają przejście przez nikotynę bariery krew-mózg. W szczególności, podawanie koniugatu hapten-nośnik z nikotyną pacjentowi będzie stymulować wytwarzanie przeciwciał przeciw nikotynie w krwiobiegu pacjenta. Alternatywnie, pacjentowi można podawać przeciwciała antynikotynowe wytwarzane poza organizmem pacjenta, który ma być leczony, w organizmie odpowiedniego gospodarza jakim jest ssak. Jeśli pacjent pali, nikotyna w jego krwi będzie wiązana przez krążące przeciwciała antynikotynowe, co nie pozwoli nikotynie dotrzeć do mózgu. Zatem, przeciwciała będą zapobiegać fizjologicznym i psychologicznym działaniom nikotyny, które pochodzą z mózgu. Ponieważ palacz doświadczy zmniejszania się lub braku tych działań, straci ochotę na palenie. Oczekuje się tych samych efektów terapeutycznych, jeśli pacjent zastosuje tytoń bezdymny, po immunizacji koniugatem hapten-nośnik z nikotyną według wynalazku. Ponadto, koniugaty i przeciwciała według wynalazku mogą działać przez wpływ na zdolność nikotyny do stymulowania obwodowego układu nerwowego.

Jak omówiono powyżej, nowe koniugaty nikotyna-nośnik według wynalazku zachowują natywną chiralność i budowę cząsteczki nikotyny. W szczególności, grupa nikotynowa tych koniugatów ma konfigurację (S)-(-). Zatem, przeciwciała wytwarzane w odpowiedzi na taki koniugat będą specyficzne dla natywnej formy nikotyny i będą najskuteczniejsze w specyficznym wiązaniu nikotyny, którą wdycha się paląc lub absorbuje z tytoniu bezdymnego, i w hamowaniu działania tej pochłoniętej nikotyny. Ponadto, koniugaty według wynalazku są chemicznie trwałe, a trwałość ma podstawowe znaczenie w wytwarzaniu szczepionki o dł ugim dopuszczalnym okresie przechowywania.

Kompozycję szczepionki według wynalazku można stosować w połączeniu ze związkami lub innymi terapiami, które są przydatne w leczeniu uzależnienia. Obejmuje to podawanie związków, do których należą między innymi leki przeciwdepresyjne takie jak Zyban i Prozac.

1. Podawanie nikotynowego koniugatu hapten-nośnik

Koniugaty według wynalazku nadają się do zastosowania w leczeniu i zapobieganiu uzależnieniu od nikotyny. Do leczenia uzależnienia od nikotyny pacjentowi cierpiącemu z powodu uzależnienia od nikotyny podaje się koniugat nikotyna-nośnik według wynalazku. W celu zapobiegania uzależnieniu od nikotyny, pacjentów, u których istnieje ryzyko rozwinięcia się uzależnienia od nikotyny, takich jak nastolatki, leczy się koniugatem według wynalazku. Bezpośrednie podawanie pacjentowi koniugatu nazywa się „immunizacją czynną.

Kompozycja szczepionki według niniejszego wynalazku zawiera co najmniej jeden koniugat hapten-nośnik z nikotyną w ilości wystarczającej do wywołania odpowiedzi immunologicznej. Koniugat hapten-nośnik z nikotyną jest zdolny do pozostawania in vivo w stężeniu wystarczającym do zachowania aktywności przeciw później wchłoniętej nikotynie.

Początkowe szczepienie koniugatem hapten-nośnik z nikotyną według niniejszego wynalazku wytwarza wysokie miana przeciwciał, które są specyficzne dla nikotyny. Dla fachowców w tej dziedzinie łatwe jest określenie terapeutycznie skutecznej ilości koniugatu, którą podaje się pacjentowi wymagającemu leczenia uzależnienia od nikotyny. Zakresy odpowiedniego dawkowania wynoszą 1-1000 μg/dawkę.

Wytworzenie przeciwciał przeciw obcemu antygenowi na ogół trwa u pacjenta od jednego do kilku tygodni. Produkcję przeciwciał we krwi pacjenta można monitorować stosując techniki dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie, takie jak ELISA, test radioimmunologiczny i bibułowy Western'a. Terapeutyczną skuteczność można także monitorować oceniając różne fizyczne oddziaływania nikotyny, takie jak na ciśnienie krwi.

PL 199 253 B1

Jak opisano szczegółowo poniżej, koniugat hapten-nośnik z nikotyną według wynalazku można przetwarzać w celu uzyskania kompozycji, którą można łatwo podawać pacjentowi. Korzystne rodzaje podawania obejmują, lecz nie ograniczają się do nich, podawanie donosowe, dotchawicze, doustne, skórne, dośluzówkowe, iniekcje podskórne i dożylne. Dla fachowca w tej dziedzinie będzie zrozumiałe, że początkowej iniekcji można później podać jedną lub więcej „dawek przypominających koniugatu. Taka dawka przypominająca zwiększy produkcję przeciwciał przeciw koniugatowi hapten-nośnik z nikotyną według wynalazku.

Kompozycje szczepionki według niniejszego wynalazku mogą zawierać co najmniej jeden środek wspomagający. Środek wspomagający użyty według niniejszego wynalazku należy wybrać tak, aby nie hamował wpływu białka nośnikowego. Środki wspomagające stosowane według niniejszego wynalazku są fizjologicznie dopuszczalne u ludzi i obejmują między innymi ałun, QS-21, saponiny i MPLA (monofosforylolipid A).

Kompozycje szczepionki według niniejszego wynalazku mogą ewentualnie zawierać jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych rozczynników. Rozczynniki przydatne w niniejszym wynalazku obejmują sterylną wodę, roztwory soli takie jak solanka, fosforan sodu, chlorek sodu, alkohol, gumę arabską, oleje roślinne, alkohole benzylowe, glikol polietylenowy, żelatynę, mannitol, węglowodany, stearynian magnezu, gęstą parafinę, estry kwasów tłuszczowych, hydroksymetylocelulozę i bufory. Oczywiście, według niniejszego wynalazku można stosować dowolne dodatkowe rozczynniki znane fachowcom w tej dziedzinie.

W celu podania pacjentowi wymagającemu leczenia lub zapobiegania uzależ nieniu od nikotyny, koniugaty hapten-nośnik według niniejszego wynalazku wprowadza się do kompozycji farmaceutycznej. Gdy kompozycję zawierającą koniugat hapten-nośnik stosuje się w iniekcji, zaleca się rozpuszczenie koniugatu hapten-nośnik w wodnym roztworze solanki o farmaceutycznie dopuszczalnym pH. Jednakże możliwe jest zastosowanie zawiesiny koniugatu hapten-nośnik do wstrzykiwania. Oprócz zwykłych farmaceutycznie dopuszczalnych rozczynników, kompozycja może zawierać ewentualne składniki stosowane w celu zapewnienia czystości, zwiększenia biodostępności i/lub zwiększenia penetracji.

Ponadto, kompozycja szczepionki może ewentualnie zawierać co najmniej jeden środek pomocniczy, taki jak ośrodek dyspersyjny, powłoki, mikrokulki, liposomy, mikrokapsułki, lipidy, surfaktanty, lubrikanty, środki konserwujące i stabilizatory. Oczywiście, dowolne dodatkowe środki pomocnicze znane fachowcom w tej dziedzinie są przydatne według niniejszego wynalazku. Także przydatne są tu dowolne środki, których działają synergistycznie z kompozycją szczepionki według niniejszego wynalazku.

Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku jest sterylna i dostatecznie trwała do przechowywania, dystrybucji i zastosowania. Ponadto, kompozycja może zawierać dodatkowe składniki chroniące ją przed zakażeniem i wzrostem mikroorganizmów. Korzystne kompozycje wytwarza się w formie liofilizowanego proszku, odtwarzalnego farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem tuż przed podaniem. Metody przygotowywania sterylnych roztworów do wstrzykiwania są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie i obejmują między innymi suszenie próżniowe, liofilizację i suszenie wirówkowe. Te techniki zapewniają aktywny składnik w postaci proszku wraz z dowolnym dodatkowym rozczynnikiem wprowadzonym przed zmieszaniem.

2. Podawanie przeciwciał wytwarzanych w odpowiedzi na koniugat nikotyna-nośnik

Immunizacja bierna obejmuje podawanie lub ekspozycję na działanie przeciwciała poliklonalnego lub przeciwciała monoklonalnego, które zostało wytworzone w odpowiedzi na koniugat hapten-nośnik z nikotyną według wynalazku. Takie przeciwciała mogą wytwarzać zwierzęta lub ludzie. Przeciwciała wytworzone w odpowiedzi na koniugat z nikotyną według wynalazku można podawać w celu zapobiegania uzależnieniu od nikotyny. Na przykład takie przeciwciała można podawać ludziom, których uważa się za narażonych na ryzyko rozwinięcia się uzależnienia od nikotyny, takich jak nastolatki. Przeciwciała nadają się także do leczenia pacjenta uzależnionego od nikotyny. Jak omówiono powyżej, przeciwciała łączą się z nikotyną we krwi i zapobiegają przejściu nikotyny przez barierę krew-mózg. Przeciwciała wytwarzane przez podawanie koniugatu hapten-nośnik według wynalazku mają masę cząsteczkową w zakresie od około 150 kDa do około 1000 kDa.

Fachowcy w tej dziedzinie mogą łatwo określić terapeutycznie skuteczną ilość terapeutycznego przeciwciała według wynalazku podawaną pacjentowi wymagającemu leczenia uzależnienia od nikotyny. Odpowiednie dawkowanie mieści się w zakresie 1-1000 μg/dawkę.

PL 199 253 B1

Kompozycja terapeutyczna według niniejszego wynalazku zawiera co najmniej przeciwciało wytwarzane w odpowiedzi na koniugat nikotyna-nośnik według wynalazku. Te kompozycje według niniejszego wynalazku mogą ewentualnie zawierać jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych rozczynników. Rozczynniki przydatne w niniejszym wynalazku obejmują sterylną wodą, roztwory soli takie jak solanka, fosforan sodu, chlorek sodu, alkohol, gumę arabską, oleje roślinne, alkohole benzylowe, glikol polietylenowy, żelatynę, mannitol, węglowodany, stearynian magnezu, gęstą parafinę, estry kwasów tłuszczowych, hydroksymetylocelulozę i bufory. Oczywiście, dowolne dodatkowe rozczynniki znane fachowcom w tej dziedzinie są przydatne według niniejszego wynalazku.

W celu podania pacjentowi wymagają cemu leczenia lub zapobiegania uzale ż nieniu od nikotyny, do kompozycji farmaceutycznej wprowadza się przeciwciała według niniejszego wynalazku. Gdy kompozycję zawierającą koniugat hapten-nośnik stosuje się w iniekcji, zaleca się rozpuszczenie koniugatu hapten-nośnik w wodnym roztworze solanki o farmaceutycznie dopuszczalnym pH. Jednakże możliwe jest zastosowanie zawiesiny koniugatu hapten-nośnik do wstrzykiwania. Oprócz zwykłych farmaceutycznie dopuszczalnych rozczynników, kompozycja może zawierać ewentualne składniki stosowane w celu zapewnienia czystoś ci, zwiększenia biodostępności i/lub zwiększenia penetracji.

Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku jest sterylna i dostatecznie trwała do przechowywania, dystrybucji i zastosowania. Ponadto, kompozycja może zawierać dodatkowe składniki chroniące kompozycję przed zakażeniem i wzrostem mikroorganizmów. Metody przygotowania sterylnych roztworów do wstrzykiwania są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie i obejmują między innymi suszenie próżniowe, liofilizację i suszenie wirówkowe. Te techniki zapewniają aktywny składnik w postaci proszku wraz z dowolnym dodatkowym rozczynnikiem wprowadzonym przed zmieszaniem.

Zestawy zawierające przeciwciała według wynalazku

Przeciwciała według niniejszego wynalazku są także przydatne do przygotowania zestawu, który można stosować do wykrywania i oceny ilościowej poziomów nikotyny w próbce. Zestaw według wynalazku zawiera przeciwciało specyficzne w stosunku do nikotyny według wynalazku, w odpowiednim pojemniku. Dla potrzeb testu radioimmunologicznego, zestaw może także zawierać znakowaną nikotynę. Nikotynę w próbce wykrywa się metodą wiązania znakowanej nikotyny do przeciwciała i następnie konkurencyjnego wiązania znakowanej nikotyny z przeciwciała z badaną próbką. Zestaw ELISA również mógłby zawierać przeciwciało według wynalazku. Test ELISA może obejmować hamowanie wiązania przeciwciała z zastosowaniem znanych ilości nikotyny, w porównaniu do hamowania z zastosowaniem próbki, która prawdopodobnie zawiera nikotynę. To umożliwiłoby określanie nieznanej ilości nikotyny w próbce, na podstawie porównania próbki ze standardową krzywą hamowania przy znanym stężeniu nikotyny. W innym teście ELISA próbkę, która prawdopodobnie zawiera nikotynę, inkubuje się z płytką do mikromiareczkowania pokrytą substancją, która łączy się z nikotyną. Do płytek dodaje się przeciwciała według wynalazku i związane z enzymem przeciwciała przeciw przeciwciałom. Dodanie substratu umożliwia ilościową ocenę nikotyny związanej z płytką.

Działanie wynalazku zostało zilustrowane na rysunku, na którym:

fig. 1 przedstawia wykres, który wskazuje wpływ immunizacji czynnej z zastosowaniem szczepionki koniugatu 3'AMNic-Suc-rEPA na osoczowe poziomy nikotyny u szczurów, po pojedynczej iniekcji nikotyny. Pokazano osoczowe poziomy nikotyny po 3 i 10 minutach po iniekcji nikotyny;

fig. 2 przedstawia wpływ biernej immunizacji przeciwciałami przeciw 3'-AMNic-Suc-rEPA na poziomy nikotyny we krwi i w mózgu szczurów. Szczury potraktowano 12,5, 25 i 50 mg przeciwciał;

fig. 3 przedstawia wpływ biernej immunizacji przeciwciałami przeciw 3'-AMNic-Suc-rEPA na poziomy nikotyny w osoczu krwi i w mózgu u szczurów. Poziomy nikotyny zmierzono 30 minut i 1 dzień po podaniu przeciwciał i 3 minuty po iniekcji nikotyny;

fig. 4 przedstawia wpływ biernej immunizacji przeciwciałami przeciw 3'-AMNic-Suc-rEPA na osoczowe poziomy nikotyny u szczurów otrzymujących wiele dawek nikotyny;

fig. 5 przedstawia wpływ biernej immunizacji przeciwciałami przeciw 3'-AMNic-Suc-rEPA na poziomy nikotyny w mózgu szczura u szczurów otrzymujących wiele dawek nikotyny;

fig. 6 przedstawia wpływ biernej immunizacji przeciwciałami przeciw 3'-AMNic-Suc-rEPA na wywołane przez nikotynę wpływy lokomocyjne u szczurów;

fig. 7 przedstawia wpływ biernej immunizacji przeciwciałami przeciw 3'-AMNic-Suc-rEPA na wywołany przez nikotynę wzrost skurczowego ciśnienia krwi. Ta fig. wskazuje, że wzrastające ilości przeciwciał zwiększają skuteczność przeciwciał w zmniejszaniu nikotynowego wzrostu ciśnienia krwi.

PL 199 253 B1

Poniżej zamieszczono przykłady w celu dalszego zilustrowania otrzymywania i zastosowania niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Synteza pochodnej haptenu nikotynowego (podstawionej w pozycji 3')

Substancją wyjściową w syntezie haptenu jest trans-4'-karboksy-(-)-nikotyna, dostępna w handlu. Zmodyfikowana procedura opisana przez Cushman i Castagnoli, Jr. (1972) J. Org. Chem. 37(8): 1268-1271 daje alkohol, trans-3'-hydroksymetylo-(-)-nikotynę, po estryfikacji kwasu alkoholem metylowym i redukcji estru. Alkohol następnie sulfonuje się i sulfonian zastępuje przez grupę azydową, którą na koniec redukuje się do aminowej.

g trans-4'-karboksy-(-)-nikotyny rozpuszcza się w 50 ml 2 N roztworu kwasu siarkowego w suchym metanolu i miesza przez noc w temperaturze pokojowej. Uzyskaną zawiesinę przesącza się przez bibułę filtracyjną Whatman nr 1 i dodaje powoli do 100 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Ester ekstrahuje się dichlorometanem, uzyskując 4,2 g różowego oleju po odparowaniu rozpuszczalnika.

Roztwór 3,9 g estru w suchym tetrahydrofuranie (100 ml) wkrapla się do zawiesiny 4 równoważników wodorku litowoglinowego w suchym tetrahydrofuranie (70 ml), w atmosferze suchego argonu. Zawiesinę miesza się przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Nadmiar wodorku usuwa się przez ostrożne i kontrolowane dodanie wody, podczas oziębienia w łaźni lodowej. Uzyskany biały osad odsącza się i przesącz osusza nad siarczanem sodu i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 2,7 g alkoholu w postaci żółtego oleju.

Alkohol (1,9 g) rozpuszcza się w 20 ml dichlorometanu. Następnie kolejno do roztworu dodaje się trietyloaminę (0,75 ml) i chlorek p-toluenosulfonylu (1 g). Pomarańczowy roztwór miesza się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Wytrącony chlorowodorek trietyloaminy odsącza się przez Celit i przesącz zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując brunatny olej. Sulfonian oczyszcza się metodą szybkiej chromatografii w kolumnie z krzemionką, eluując 5% metanolem w dichlorometanie, uzyskując 2,1 g żółtego oleju.

Sulfonian (1,8 g) usuwa się stosując azydek sodu (0,8 g) w 50 ml dimetyloformamidu, przez jedną godzinę, w temperaturze 80°C. Po odparowaniu dimetyloformamidu pod silnie zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszcza się w dichlorometanie, przemywa wodą i solanką, i osusza nad siarczanem sodu. Po odparowaniu rozpuszczalnika, otrzymuje się azydek (1,1 g) w postaci brunatnawego oleju.

Dodanie azydku w suchym tetrahydrofuranie (20 ml) do zawiesiny wodorku litowoglinowego w suchym tetrahydrofuranie (50 ml) szybko daje pożądaną aminę, co monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Widma protonowego i węglowego jądrowego rezonansu magnetycznego oczyszczonej aminy potwierdzają oczekiwaną budowę.

P r z y k ł a d 2

Synteza pochodnej haptenu nikotynowego (podstawionej w pozycji 4')

Wprowadzenie funkcyjnego odgałęzienia w pozycji 4' nikotyny można uzyskać przez enolanowe alkilowanie nikotyny, a następnie redukcję alkilowanego produktu. Można stosować różne czynniki alkilujące środki, takie jak odpowiednio zabezpieczona 3-bromopropyloamina. Przykładowo można stosować 3-bromo-N-karbobenzyloksypropyloaminę lub N-(3-bromopropylo)-ftalamid. Grupę zabezpieczającą grupę aminową można usunąć po alkilowaniu i redukcji, i przed sprzęganiem z białkiem nośnikowym. Enolanowe alkilowanie cyklicznych laktamów (zawierających pierścień pirolidynonowy) jest wyczerpująco opisane w literaturze (patrz G. Helmchen i in. (1995) Steroselective Synthesis in Houben-Weylo-Methods of Organic Chemistry, tom E21a, 762-881, Thieme, Stuttgart, Germany, przegląd ogólny, i A.J. Meyers i in. (1997) J. Am. Chem. Soc., 119, 4564-4566, przestrzenne uwarunkowania reakcji). Istnieją także pewne przykłady enolanowego alkilowania samej nikotyny (N. H. Lin i in. (1994) J. Med. Chem., 37, 3542-3553). Interesujące otrzymywanie 4'-acetylonikotyny, w postaci mieszaniny 1:1 dwóch epimerów, osiągnięto stosując dwukationową aza-Cope cyklizację z przegrupowaniem Mannich'a, wychodząc z ketonu (lub aldehydu) i 2-alkoksylo-3-alkenoaminy (L.E. Overman (1983) J. Am. Chem. Soc., 105, 6622-6629). Tę reakcję można przedłużyć w celu wytworzenia aldehydu 4'-nikotynowego, odpowiedniego do reakcji sprzęgania.

Bromowodorek 3-bromo-propyloaminy (4,2 g) zawieszono w 50 ml dichlorometanu i dodawano trietyloaminę (około 7 ml) aż do uzyskania klarownego roztworu. Roztwór ochłodzono do temperatury 0°C i dodano kroplami chloromrówczan benzylu (2,5 ml). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono, mieszając, w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Wytrącone sole odsączono i klarowną warstwę

PL 199 253 B1 organiczną przemyto zimną wodą, zimnym 1N HCl i zimną wodą, osuszono nad siarczanem sodu i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do żółtego oleju (2,93 g surowej substancji).

Nikotynę (62 mg) i 3-bromo-N-karbobenzyloksypropyloaminę (100 mg) oddzielnie współodparowano z suchym toluenem. Nikotynę rozpuszczono w 5 ml świeżo destylowanego bezwodnego tetrahydrofuranu, dodano 60 μΐ Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametylenodiaminy (TMEDA) i roztwór ochłodzono do temperatury -78°C przez zanurzenie w łaźni z suchym lodem i etanolem. Roztwór nikotyny dodano kroplami do roztworu diizopropyloamidku litowego (LDA, 200 μl 2 M roztworu w mieszaninie heptantetrahydrofuran) w tetrahydrofuranie, uprzednio schłodzonego do temperatury -78°C. Pomarańczową mieszaninę mieszano przez 15 minut w temperaturze -78°C i następnie pozostawiono do ogrzania w łaźni lodowej (2 do 6°C). Mieszaninę reakcyjną następnie ochłodzono ponownie do temperatury -78°C i kroplami przez 15 minut dodawano 3-bromo-N-karbobenzylooksypropyloaminę rozpuszczoną w bezwodnym tetrahydrofuranie. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania aż do temperatury -10°C i następnie reakcję zatrzymano stosując metanol. Produkt reakcji oczyszczono metodą szybkiej chromatografii w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym. Redukcję amidu tej pochodnej nikotyny przeprowadzono z zastosowaniem borowodoru, a następnie fluorku cezu w wrzącym etanolu. Końcową aminę otrzymano po usunięciu grupy karbobenzylooksylowej w warunkach kwasowych.

P r z y k ł a d 3

Synteza pochodnej haptenu nikotynowego (podstawionej w pozycji 5')

Wprowadzenie funkcyjnego odgałęzienia w pozycji 5' nikotyny można uzyskać przez poddanie odpowiednio zabezpieczonych związków alkilolitowych reakcji z nikotyną, a następnie redukcję cyjanoborowodorkiem sodu, metodami podobnymi do opisanych przez Shibagaki i in. (1986) Heterocycles, 24, 423-428 i N.H. Lin i in. (1994) powyżej.

P r z y k ł a d 4

Sprzęganie pochodnej haptenu nikotynowego z białkiem nośnikowym

Rekombinacyjną egzoproteinę A (rEPA) przyłączono do pochodnej haptenu nikotynowego poprzez odgałęzienia kwasu bursztynowego. 15 grup lizynowych rEPA łatwo poddano reakcji sukcynylowania z bezwodnikiem kwasu bursztynowego. Następnie, w typowej reakcji sprzęgania, wytworzono 5 do 10 mg/ml roztworu sukcynylowanej rekombinacyjnej egzoproteiny A (Suc-rEPA) w buforze 0,05 M kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) zawierającego 0,15 M NaCl, o pH 6,0. Do roztworu białka dodano równowagową ilość haptenu 3'-aminometylo-(-)-nikotyny (3'AMNic) rozpuszczoną w minimalnej ilości wody destylowanej. Przed dodaniem wartość pH roztworu haptenu uregulowano do 6,0 z zastosowaniem 0,1 N HCl. Na koniec, do mieszaniny haptenu i białka dodano równowagową ilość chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dietyloamino)propylokarbodiimidu (EDC) i reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej, mieszając. Tak otrzymany koniugat nikotyny oczyszczono w kolumnie Sephadex G-25, eluując solanką buforowaną fosforanem (PBS), o pH 7,4. Koniugat odzyskano w ilości 80 do 90%.

P r z y k ł a d 5

Sprzęganie nośnika macierzystego obciążonego nikotyną

Ten przykład opisuje syntezę koniugatu hapten-nośnik zawierającego 3'-aminometylo-(-)-nikotynę jako pochodną haptenu, rekombinacyjną egzoproteinę A (rEPA) jako nośnik białkowy, dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) jako grupę łączącą i kwas poli-L-glutaminowy jako „nośnik macierzysty lub baza polimeryczna dla haptenów.

W tym przykładzie zastosowano kwas poli-L-glutaminowy o średniej masie cząsteczkowej 39900, polidyspersyjności 1,15 i stopniu polimeryzacji 264. Odpowiednie do reakcji ilości haptenu i polimeru obliczono tak, aby docelowy stopień substytucji wynosił około 80%. Oznacza to, że gdy uzyska się 80% substytucję, sprzężonych jest około 208 jednostek haptenu spośród ogółem 264 powtarzających się jednostek w przeciętnej cząsteczce polimeru kwasu glutaminowego.

Ten obciążony nikotyną poli(kwas L-glutaminowy) ma następujący wzór:

PL 199 253 B1

Jak wskazano na rysunku, polimer poli(kwasu glutaminowego) zawiera około 52 reszt glutaminy. Ta liczba będzie się zmieniać zależnie od partii i źródła reszt poli(aminokwasów) wybranego dla nośnika macierzystego. Na rysunku także wskazano, że na każdą powtarzającą się jednostkę przypadają 4 hapteny nikotynowe. Ta liczba będzie się zmieniać zależnie od stosunku reagentów stosowanych podczas sprzęgania nośnika macierzystego i haptenu nikotynowego.

Po sprzęganiu z pochodną nikotyny, nieprzereagowane grupy karboksylowe (około 20%) następnie derywatyzuje się z ADH. Gdy ten nośnik macierzysty sprzężono z nośnikiem, jak opisano w przykładzie 6, stosunek molowy nośnika obciążonego nikotyną do białka wynosił 1:1. Zatem, w tym koniugacie, teoretyczny stosunek molowy haptenu nikotynowego do białka wynosił 200:1 na zakończenie reakcji sprzęgania.

Faktyczny stosunek substytucji nikotyny na poli(kwasie glutaminowym) oszacowano stosując analizę NMR produktu. Intensywność piku atom wodoru α kwasu glutaminowego w stosunku do czterech atomów wodoru pierścienia pirydynowego nikotyny odpowiada ilości wprowadzonej nikotyny. Oszacowany średni stosunek wynosił 143:1 (nikotyna/nośnik białkowy).

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie szczepionki z koniugatu nikotynowego z zastosowaniem nośnika macierzystego naładowanego nikotyną

A. Wprowadzanie haptenu nikotynowego na nośnik mg soli poli(L-kwasu glutaminowego) (Sigma, nr katalogowy P-4761) rozpuszczono w 2 ml 0,05 M buforze kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego (MES) zawierającym 0,15 M NaCl, o pH 6,0. 10 mg 3'-aminometylo-(-)-nikotyny rozpuszczono w minimalnej ilości wody destylowanej i wartość pH roztworu uregulowano do 6,0, stosując 0,1N HCl. Roztwór haptenu nikotynowego dodano kroplami do roztworu polipeptydu, mieszając, i następnie wartość pH uregulowano do 6,0. Następnie dodano w trzech porcjach 20 mg stałego chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetylo-aminopropylo)karbodiimidu (EDC) do mieszaniny hapten-polipeptyd w czasie 20 minut. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do przereagowania przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Produkt reakcji (nośnik podstawiony przez nikotynę) dializowano trzykrotnie zmieniając wodę i liofilizowano. 12 mg poli(kwasu glutaminowego) podstawionego przez nikotynę otrzymano w postaci białej puszystej substancji.

B. Przyłączenie grupy łączącej do nośnika macierzystego podstawionego przez nikotynę mg poli(kwasu glutaminowego) podstawionego przez nikotynę rozpuszczono w 2 ml buforu MES o pH 6,0. Do roztworu dodano, mieszając, 8 mg dihydrazydu kwasu adypinowego (ADH), a następnie 10 mg EDC. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do przereagowania przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Otrzymany roztwór na koniec dializowano trzykrotnie zmieniając bufor MES o pH 6,0.

PL 199 253 B1

C. Sprzęganie z nośnikiem białkowym mg rekombinacyjnej egzoproteiny A (rEPA) rozpuszczono w 2 ml 0,05 M buforu MES o pH 5,6, zawierającego 0,15 M NaCl. Do roztworu białka dodano objętość roztworu poli(kwasu glutaminowego) podstawionego przez nikotynę związanego z ADH, zawierającą po oszacowaniu 7,5 mg tej derywatyzowanej substancji. Do tej mieszaniny dodano, mieszając, stały EDC w trzech porcjach w czasie 20 minut, w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do przereagowania w temperaturze pokojowej przez noc. Uzyskany koniugat na koniec oczyszczono w kolumnie Sephadex G-25 i eluowano solanką buforowaną fosforanem (PBS) o pH 7,4. Dało to oczyszczony preparat koniugatu, w którym koniugat zawiera jedynie (S)-(-)nikotynę.

P r z y k ł a d 7

Charakterystyka koniugatu nikotyny z nośnikiem według przykładu 4

Oczyszczoną szczepionkę koniugatu według przykładu 4 zanalizowano w kolumnie Superose 12 do chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząstek i eluowano PBS o pH 7,4. Stosunek molowy haptenu do białka jako 11 do 17 obliczono przez określenie zwiększenia absorpcji UV przy długości fali 260 nm po włączeniu nikotyny, w stosunku do absorpcji przy długości fali 280 nm. Ten zakres określono przez obliczenie stosunku hapten/nośnik białkowy dla sześciu oddzielnie przygotowanych partii koniugatów hapten-nośnik (partia 1: 17,2, partia 2: 16,2, partia 3: 13,2; partia 4: 12,0; partia 5: 11,0; partia 6: 17,2). Następnie analiza w celu określenia tego stosunku z zastosowaniem spektrometrii masowej MALDI-TOF dała w istocie takie same liczby jak otrzymane dzięki różnicy w absorbancji UV. Stężenie białka w koniugacie szczepionki określono z zastosowaniem testu BCA. Przeprowadzono badanie trwałości koniugatu nikotyna-nośnik według przykładu 4. Do badania wykorzystano szczepionkę w szklanych fiolkach o pojemności 1 ml, o stężeniu 0,5 mg/ml i trwałość szczepionki w fiolkach badano w trzech różnych temperaturach: -70°C, 2 do 8°C i temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d 8

Trwałość koniugatu nośnika nikotynowego z przykładu 4

Korzystniejsza okazała się procedura sprzęgania raczej na bazie powstawania wiązań amidowych pomiędzy haptenem-grupą łączącą-nośnikiem, niż wiązań estrowych, jak to obserwowano dla trwałości koniugatów przez sześć miesięcy w temperaturze -70°C, 2 do 8°C i nawet w temperaturze pokojowej. Badanie trwałości składało się z monitorowania i testowania szczepionki koniugatu w następujący sposób:

1. ) obserwacja wizualna w poszukiwaniu dowolnych utworzonych cząstek (zmętnienie, wytrącanie).

2. ) Sprawdzanie dowolnej znaczącej zmiany wartości pH.

3. ) Profil chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząstek w połączeniu z absorpcją UV przy długości fali 260 i 280 nm w celu określenia czy zmienił się stosunek włączania nikotyny.

4. ) Chromatografia w odwróconym układzie faz w celu sprawdzenia jakiejkolwiek degradacji nośnika białkowego.

5. ) SDS PAGE z barwieniem srebrem w poszukiwaniu dowolnego proteolitycznego rozerwania sprzężonego białka.

Procedura sprzęgania na bazie powstawania wiązania amidowego pomiędzy haptenem i grupą łączącą, jak również pomiędzy grupą łączącą i nośnikiem okazała się korzystna, jak to obserwowano w trwałości koniugatu przez sześć miesięcy w temperaturze -70°C i 2 do 8°C.

P r z y k ł a d 9

Dowód na immunogenność koniugatu nośnika według przykładów 4 i 6

Do immunizacji myszy, szczurów i królików zastosowano dwie szczepionki z koniugatu hapten-nośnik z nikotyną.

A. Testy na zwierzętach - przeciwciała poliklonalne

Zwierzęta immunizowano stosując standardowe protokoły. Myszom podawano trzy podskórne iniekcje szczepionki w odstępie dwóch tygodni, z przeprowadzeniem upustów testowych tydzień po pierwszej i drugiej iniekcji, i poddano całkowitemu upustowi krwi tydzień po trzeciej iniekcji. Próbki osocza oszacowano w teście ELISA opisanym w przykładzie 10. W teście ELISA stosowano 3' AMNic-pGlu związaną z płytkami do mikromiareczkowania.

Szczury immunizowano dootrzewnowo szczepionkami trzykrotnie. Iniekcje podawano w odstępie dwóch tygodni z przeprowadzeniem upustów testowych tydzień po pierwszej i drugiej iniekcji. Następnie szczury poddano całkowitemu upustowi krwi tydzień po trzeciej iniekcji. Zastosowano kom18

PL 199 253 B1 pletny środek wspomagający Freunda przy pierwszej iniekcji i niekompletny środek wspomagający Freunda przy późniejszych iniekcjach. Próbki osocza oszacowano w teście ELISA.

Króliki immunizowano domięśniowo trzy razy w odstępie trzech tygodni 100 μg szczepionki. Początkowa iniekcja zawierała środek wspomagający Freunda, późniejsze iniekcje zawierały niekompletny środek wspomagający Freunda. Króliki poddano upustowi krwi dla potrzeb testu tydzień po drugiej i trzeciej iniekcji w celu uzyskania odpowiednich mian wytwarzania krwi. Jeśli uzyskano odpowiednie miano, co zmierzono testem ELISA, króliki wprowadzano następnie w tygodniowy schemat upustów (20 do 40 ml osocza na królika). Miana przeciwciał monitorowano w czasie i zwierzęta pobudzano, jeśli to było konieczne, w celu przywrócenia poziomów przeciwciał.

Wyniki tych badań immunogenności przedstawiono w tabelach 1-5. Tabele 1 i 2 pokazują wyniki badania immunogenności u myszy. W tabeli 1 zastosowanym koniugatem był 3'aminometylo-(-)-nikotynosukcynylo-rEPA (Przykład 4). W tabeli 2 zastosowanym koniugatem był 3-aminometylo-(-)-nikotyno-poli(kwas glutaminowy)-ADH-rEPA (Przykład 6). Te tabele pokazują wytwarzanie wysokiego miana przeciwciał, które specyficznie wiążą nikotynę. Ponadto, te koniugaty wykazały zdolność do indukowania odpowiedzi na dawkę przypominającą.

Tabele 3 i 4 przedstawiają wyniki badania immunogenności u szczurów. W tabeli 3 zastosowano koniugat 3'-aminometylo-(-)-nikotyno-sykcynylo-rEPA (Przykład 4). W tabeli 4 zastosowano koniugat 3-aminometylo-(-)-nikotyno-poli(kwas glutaminowy)-ADH-rEPA (Przykład 6).

Te tabele pokazują wytwarzanie wysokiego miana przeciwciał, które specyficznie wiążą nikotynę. Ponadto, te koniugaty wykazały zdolność do indukowania odpowiedzi na dawkę przypominającą.

Tabela 5 przedstawia wyniki badania immunogenności na królikach. Stosując albo 3'aminometylosykcynylo-rEPA (Przykład 4) albo 3-aminometylo-poli(kwas glutaminowy)-ADH-rEPA (Przykład 6) , wytwarzano wysokie miana przeciwciał przeciw tym dwóm koniugatom. Te miana pozostawały podwyższone przez ponad 6 miesięcy.

T a b e l a 1

Leczenie myszy z zastosowaniem 3'AMNic-Suc-rEPA

Liczba zwierząt	Dawka	Miano
1 iniekcja	2 iniekcje	3 iniekcje
10	1 μ g	0	36	4280
10	5 μο	1	884	10727
10	15 μο	3	2476	14160

Dawka opiera się na teście białkowym.

Miano jest średnią arytmetyczną, tydzień po odpowiadającej iniekcji.

T a b e l a 2

Leczenie myszy z zastosowaniem 3'AMNic-pGlu-ADH-rEPA

Liczba zwierząt	Dawka	Miano
1 iniekcja	2 iniekcje	3 iniekcje
10	2 μο	2	739	6586
10	10 μο	2	2490	9573
10	30 μο	11	2822	8195

Dawka na bazie suchej masy liofilizowanego koniugatu.

Miano jest średnią arytmetyczną, tydzień po odpowiadającej iniekcji.

PL 199 253 B1

T a b e l a 3

Leczenie szczurów z zastosowaniem 3'AMNic-Suc-rEPA

Liczba zwierząt	Dawka	Miano
1 iniekcja	2 iniekcje	3 iniekcje
3	15 ąg	18	7942	9947
3	25 ąg	4	1446	5991
3	50 ąg	353	7211	8996

Dawka opiera się na teście białkowym.

Miano jest średnią arytmetyczną, tydzień po odpowiadającej iniekcji.

T a b e l a 4

Leczenie szczurów z zastosowaniem 3'AMNic-pGlu-ADH-rEPA

Liczba zwierząt	Dawka	Miano
1 iniekcja	2 iniekcje	3 iniekcje
5	100 ąg	0	1067	3752

Dawka na bazie suchej masy liofilizowanego koniugatu.

Średnia arytmetyczna, tydzień po odpowiadającej iniekcji.

T a b e l a 5

Leczenie królików z zastosowaniem 3'AMNic-Suc-rEPA i 3'AMNic-pGlu-ADH-rEPA

Immunogen	Liczba zwierząt	Dawka	Miano
3'AMNic-Suc-rEPA	10	100 ąg	132000
3'AMNic-pGlu-ADH-rEPA	10	100 ąg	147000

Dawka w oparciu o test białkowy dla 3'AMNic-Suc-rEPA i na bazie suchej masy dla 3'AMNic-pGlu-rEPA

Miano jest średnią arytmetyczną, sześć do siedmiu tygodni po trzeciej iniekcji.

P r z y k ł a d 10

Test ELISA i specyficzność przeciwciał

Sama cząsteczka nikotyny nie nadaje się do powlekania płytek ELISA i wymaga związania z większą cząsteczką o lepszych właściwościach adhezyjnych. Powszechnie do tego celu stosuje się poli(L-lizynę) lub poli(kwas L-glutaminowy). Pochodną haptenu nikotynowego, 3'-aminometylo-(-)-nikotynę (3'AMNic), sprzężono z poli(L-kwasem glutaminowym) i otrzymany koniugat 3'-aminometyloO-nikotyna-poli(L-kwas glutaminowy) (3'AMNic-pGlu) zastosowano do pokrycia płytek ELISA.

Przeciwciała wytwarzane przeciw szczepionce 3'AMNic oszacowano stosując test ELISA dla

3'AMNic-pGlu w następujący sposób: 4 płytki do mikromiareczkowania Dynatech Immulon (Chantilly,

VA) pokryto 100 μΐ/studzienkę 10 ng/ml roztworem 3'AMNic-pGlu w 0,1 M buforze wodorowęglanowym o pH 9,6 i pozostawiono do inkubacji przez noc (ON) w temperaturze pokojowej (RT). Płytki następnie aspirowano i blokowano 1% BSA w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Próbki i osocze wzorcowe rozcieńczono w PBB (1% BSA, 0,3% BRU w PBS, pH 7,2), tak aby uzyskać przybliżoną gęstość optyczną (OD) 2,0 przy długości fali 450 nm. Płytki przemyto (9% NaCl, 0,1% BRU) pięciokrotnie, próbki rozcieńczono i obciążono wzorcowe osocze. Wzorzec i próbki 2-krotnie rozcieńczono w dół płytek do końcowej objętości 100 μl/studzienkę i płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Płytki następnie ponownie przemyto i obciążono w ilości 100 μl/studzienkę antygatunkową IgG sprzężoną z peroksydazą, specyficznym Fc (Jackson, West Grove, PA), rozcieńczono w PBB i inkubowano w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Płytki przemyto i inkubowano 10 minut w temperaturze pokojowej z 100 μl/studzienkę 3, 3', 5, 5'-tetrametylobenzydyną (TMB) jako substratem (KPL, Gaithersburg, MD) rozcieńczono 1:1. H2O2 (dostarczoną z zestawem odczynników TMB). Reakcję zatrzymano przez dodanie 100 μl/studzienkę 1M kwasu fosforowego i próbki odczytano przy długości fali 450 nm na czytniku płytek do mikromiareczkowania MR4000 (Dynatech). Próbki oszacowano ilościowo w odniesieniu do wzorca, stosując analizę prostych równoległych. Wzorcowi

PL 199 253 B1 przypisano wartość liczbową (U/ml), która odpowiada rozcieńczeniu dającym OD w przybliżeniu 2,0 przy długości fali 450 nm.

Specyficzności przeciwciał oszacowano stosując test hamowania ELISA. Każdą surowicę odpornościową [3'AMNic-Suc-rEPA] rozcieńczono do stężenia dwukrotnie większego od zapewniającego gęstość optyczną około 2,0 przy długości fali 450 nm. Stosując test ELISA dla 3'AMNic-pGlu opisany powyżej, rozcieńczoną surowicę odpornościową do badania absorbowano 1:1 (objętościowo) ze wzrastającymi ilościami badanego antygenu (inhibitora) przez trzy godziny, w temperaturze 37°C, i zaabsorbowaną próbkę badano testem ELISA, stosując niezaabsorbowane osocze jako wzorzec. Dla każdej próbki określono procent absorpcji w stosunku do niezaadsorbowanej próbki.

Obliczono specyficzność osocza szczura zawierającego przeciwciała wytworzone w odpowiedzi na 3'AMNic-Suc-rEPA, stosując test hamowania ELISA z winianem nikotyny jako inhibitorem. IC50 dla tego przeciwciała wynosiło 3,5 x 10^-6 M. Obliczono specyficzność osocza królika zawierającego przeciwciała wytworzone w odpowiedzi na 3'AMNic-Suc-rEPA, stosując test hamowania ELISA z winianem nikotyny jako inhibitorem. IC50 dla tego przeciwciała wynosiło 2,3 x 10^-5 M.

P r z y k ł a d 11

Powinowactwo przeciwciał i zdolność wiązania

Zdolność wiązania przeciwciała zmierzono z zastosowaniem dializy równowagowej przez 4 godziny, w temperaturze 37°C, stosując 0,7 ml osocza, półmikro komórki Teflon, membrany Spectrapor 2 o przepuszczalności do masy cząsteczkowej 12 do 14 kD i bufor Sorenson'a (0,13 fosforan, pH 7,4) patrz Pentel i in., J. Pharmacol. Exp. Ther. 246, 1061-1066 (1987). Wartość pH osocza zmierzono pod koniec uzyskania przebiegu równowagowego dializy i próbki wykorzystano tylko jeśli końcowa wartość pH wynosiła 7,30 do 7,45.

Powinowactwo przeciwciał do nikotyny obliczono stosując test radioimmunologiczny rozpuszczalności, patrz Mueller, Meth. Enzymol., 92, 589-601 (1983). Zmierzona masa cząsteczkowa IgG wynosiła 150 kD.

Stałe wiązania i powinowactwa otrzymano z testu radioimmunologicznego były następujące: dla surowicy odpornościowej [3'AMNic-Suc-rEPA] szczura, 1050 (molarne) wynosiło 1,36 x 10^-7. Ka (M^-1) wynosiła 2,57 x 10⁷. Ilość miejsc wiążących wynosiła 2,61 x 10^-6 miejsc wiążących/l i stężenie IgG specyficznej wobec nikotyny wynosiło 0,2 mg/ml.

P r z y k ł a d 12

Oszacowanie rozkładu nikotyny w osoczu i mózgu modeli zwierzęcych

Szczepionkę według niniejszego wynalazku oceniono na różnych modelach zwierzęcych. Modele szczurze stosowano w celu określenia wpływu aktywnej lub biernej immunizacji na dystrybucję nikotyny w osoczu i mózgu. Jedno z badań dotyczyło wpływu biernej immunizacji na osłabienie lokomotorycznego działania nikotyny na ośrodkowy układ nerwowy (OUN). Inne doświadczenie oceniało wpływ biernej immunizacji na działanie nikotyny na układ sercowo-naczyniowy: podwyższenie skurczowego ciśnienia krwi.

Aby ocenić niniejszą immunoterapię, rozwinięto model zwierzęcy tak, aby symulował szybką absorpcję nikotyny z dwóch papierosów u ludzi. Ten model zwierzęcy opisał Hieda w (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 283(3): 1076-1081. W tym modelu, szczurom podawano 0,03 mg/kg nikotyny jako wlew dożylny przez 10 sekund, symulując szybką absorpcję nikotyny z płuc u palaczy. Próbki krwi pobierano w 3 i 10 minut po iniekcji nikotyny do pomiaru nikotyny w osoczu. Gdy miały być określane stężenia nikotyny w mózgu, zwierzęta zabijano 3 minuty po iniekcji nikotyny i ich mózgi szybko usuwano. Szczepionkę według przykładu 4 szacowano u szczurów na jej wpływ na dystrybucję nikotyny w osoczu i mózgu.

A. Immunizacja czynna

Szczury immunizowano szczepionką nikotynową podając trzy iniekcje dootrzewnowe 25 μg szczepionki na jedną iniekcję (3'AMNic-Suc-rEPA) w odstępie dwóch tygodni. Te zwierzęta miały zwiększone poziomy nikotyny w osoczu 3 i 10 minut po wlewie 0,03 mg/kg nikotyny w ciągu 10 sekund, w porównaniu z poziomami u nieimmunizowanych zwierząt kontrolnych. Patrz fig. 1. Zatem, immunizacja czynna była skuteczna w zwiększaniu wiązania nikotyny w osoczu. Wiadomo, że niewielka redukcja ilości nikotyny docierającej do mózgu może dramatycznie zmieniać wpływ nikotyny na zachowanie.

PL 199 253 B1

B. Immunizacja bierna

W przypadku immunizacji biernej możliwe było określenie efektu odpowiedzi dawki odpornościowej IgG na zwiększanie osoczowych poziomów nikotyny i zmniejszanie poziomów nikotyny w mózgu. Szczurom podawano różne ilości IgG przeciw (3'AMNic-Suc-rEPA) (12,5 do 50 mg) na jedną iniekcję. Jak pokazano na fig. 2 uzyskano jasny wpływ odpowiedzi na dawkę - zwiększanie dawki IgG zwiększało poziom nikotyny w osoczu i obniżało poziomy nikotyny w mózgu.

Figura 3 obrazuje, że przeciwciała antynikotynowe (anty-3'AMNic-Suc-rEPA) występowały i były aktywne w osoczu szczurów 30 minut i 1 dzień po podaniu przeciwciał (50 mg na jedną iniekcję). Figura 3 obrazuje, że po prowokacji nikotyną (wlew 0,03 mg/kg przez 10 sekund), te przeciwciała skutecznie zmniejszały stężenia nikotyny w mózgu i zwiększały poziomy nikotyny w osoczu, w 30 minut i 1 dzień po podaniu przeciwciała.

Inna demonstracja efektywności immunizacji biernej szczepionką nikotynową według wynalazku obejmuje jej zdolność unieszkodliwiania kolejnych wlewów nikotyny. W oddzielnym doświadczeniu immunizacji biernej u szczurów, liczne dawki nikotyny nie wyczerpały obecnych przeciwciał, ani nie zmniejszyły znacznie ich zdolności do łączenia się ze świeżo wstrzykiwaną nikotyną. Na fig. 4, 50 mg anty-[3'AMNic-Suc-rEPA] poddano jako wlew w czasie zero. 24 godziny później wykonano pięć iniekcji nikotyny - podawano wlew z 0,03 mg/kg nikotyny w ciągu 10 sekund, do prawej żyły szyjnej, co 20 minut przez 80 minut. Ogółem wykonano pięć iniekcji nikotyny. Do piątej iniekcji nikotyny dodano nikotynę ³H. Krew całkowitą i mózg pobrano 1 minutę po piątej iniekcji. Wyniki przedstawiono poniżej i graficznie zaprezentowano na fig. 4 i 5.

	Stężenia nikotyny (średnia + SD)
Osocze (ng/ml)	Mózg (ng/g)
1-sza dawka	5-ta dawka	5-ta dawka
Nikotyna	Nikotyna	Nikotyna 3H	Nikotyna	Nikotyna	Nikotyna 3H
Odpornościowa IgG	245±30	343±46	121±17	30±4	244±33	90±16
Kontrola IgG	21±3	55±9	41±4	35±5	257±29	126±14
% zmiany	+ 1067	+524	+ 195	-17	-13	-29

Te wyniki wskazują, że nawet po piątej dawce nikotyny, przeciwciała są skuteczne w zwiększaniu osoczowych poziomów nikotyny i zmniejszaniu poziomów nikotyny w mózgu. Wyniki dla nikotyny ³H wykazują, że przeciwciała są skuteczne przeciw nikotynie wstrzykiwanej w piątej dawce.

P r z y k ł a d 13

Ocena lokomotorycznych wpływów nikotyny

Zastosowane doświadczenie miało na celu określenie czy immunizacja bierna może zapobiegać natychmiastowemu działaniu nikotyny, w którym pośredniczy OUN. Model szczurzy zastosowany w tym doświadczeniu rozwinął dr David Malin i jest on opisany w Malin i in. „Nicotine-specyfic IgG reduced distribution to brain and attenuates its behavioral and cardiovascular effects in rats, przedstawionym na Piątym Dorocznym Spotkaniu Towarzystwa Badań nad Nikotyną i Tytoniem, w San Diego, Kalifornia, 5-7 marca 1999. Aby ustalić warunki podstawowe, zmierzono wpływ podskórnej iniekcji 0,8 mg/kg winianu nikotyny na poziom lokomotorycznej aktywności szczurów. Dawka 0,8 mg/kg winianu nikotyny jest najwyższą dawką, którą można stosować bez indukowania nieprawidłowości w poruszaniu się.

Po iniekcji nikotyny u szczurów, których nie potraktowano uprzednio anty-[3'AMNic-Suc-rEPA] i u szczurów, które potraktowano uprzednio 50 mg normalnego osoczowego IgG królika, wystąpiło zwiększenie poziomu aktywności. Patrz fig. 6A, prawy słupek i fig. 6B, lewy słupek. Ten efekt tłumiło uprzednie potraktowanie zwierząt 50 mg odpornościowej IgG anty-[3'AMNic-Suc-rEPA] (Fig. 6B, prawy słupek). To obrazuje, że przeciwnikotynowa surowica odpornościowa eliminuje stymulujący wpływ nikotyny in vivo.

P r z y k ł a d 14

Ocena wpływu nikotyny na skurczowe ciśnienie krwi

W tym doświadczeniu zmierzono inny wskaźnik wpływu nikotyny na zachowanie: zmianę skurczowego ciśnienia krwi. Szczury uprzednio potraktowano IgG anty-[3'AMNic-Suc-rEPA], lub kontrolną

PL 199 253 B1

IgG. Szczurom wstrzyknięto podskórnie 0,1 mg/kg winianu nikotyny. Szczury kontrolne wykazały wzrost skurczowego ciśnienia krwi o 42,6±3,2 mm Hg po potraktowaniu nikotyną. Gdy szczury uprzednio potraktowano surowicą odpornościową IgG przeciwnikotynową, prowokacja nikotyną była mniej skuteczna. Podawanie wzrastających ilości osocza przeciwnikotynowego zmniejszyło zdolność nikotyny do podnoszenia ciśnienia krwi. Jak pokazano na fig. 7, w funkcji dawki IgG wystąpiła negatywna liniowa tendencja ciśnienia krwi.

Claims (29)

1. Koniugat hapten-nośnik, znamienny tym, że ma strukturę określoną wzorem:

w którym m oznacza 1 do 2500, n oznacza 0 do 12, y oznacza 1 do 12,

X jest wybrany z grupy obejmującej NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH,

CO-NH-NH-CO i S-S;

Y jest wybrany z grupy obejmującej NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S, i grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- jest przyłączona w pozycji 3', 4' lub 5' nikotyny, lub wzorem:

w którym n oznacza 0 do 12, j oznacza 1 do 1000, k oznacza 1 do 20 i E oznacza nośnik macierzysty zawierający aminokwas.

2. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 1, znamienny tym, że ma strukturę określoną wzorem:

PL 199 253 B1 w którym m oznacza 1 do 2500, n oznacza 0 do 12, y oznacza 1 do 12,

X jest wybrany z grupy obejmującej NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S;

Y jest wybrany z grupy obejmującej NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S, i grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- jest przyłączona w pozycji 3', 4' lub 5' nikotyny.

3. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 2, w którym m oznacza 11 do 17, n oznacza 1, y oznacza 2, X oznacza NH-CO, Y oznacza CO-NH, w którym grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- jest przyłączona w pozycji 3' nikotyny.

4. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 2, w którym m oznacza 11 do 17, n oznacza 1, y oznacza 2, X oznacza NH-CO, Y oznacza CO-NH, w którym grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- jest przyłączona w pozycji 4' nikotyny.

5. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 2, w którym m oznacza 11 do 17, n oznacza 1, y oznacza 2, X oznacza NH-CO, Y oznacza CO-NH, w którym grupa -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- jest przyłączona w pozycji 5' nikotyny.

6. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 2, w którym m wynosi 1 do 20 albo 1 do 200.

7. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 2, w którym nośnik białkowy oznacza egzoproteinę A.

8. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 1, znamienny tym, że ma strukturę określoną wzorem:

w którym n oznacza 0 do 12, j oznacza 1 do 1000, k oznacza 1 do 20 i E oznacza nośnik macierzysty zawierający aminokwas.

9. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 8, w którym nośnikiem macierzystym jest poli(kwas L--glutaminowy).

10. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 1, wytworzony z zastosowaniem trans-4'-karboksy-(-)-nikotyny jako substancji wyjściowej.

11. Koniugat hapten-nośnik według zastrz. 1 do zastosowania jako lek.

12. Koniugat według zastrz. 11 do zastosowania jako lek do zapobiegania lub leczenia uzależnienia od nikotyny.

PL 199 253 B1

13. Koniugat według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że lek dodatkowo zawiera związek przydatny do leczenia uzależnienia od nikotyny.

14. Przeciwciało wytworzone w odpowiedzi na koniugat hapten-nośnik, znamienne tym, że jest wytworzone w odpowiedzi na koniugat hapten-nośnik z zastrz. 1.

15. Przeciwciało według zastrz. 14, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.

16. Przeciwciało według zastrz. 14, znamienne tym, że jest przeciwciałem poliklonalnym.

17. Przeciwciało według zastrz. 14 do zastosowania jako lek.

18. Fragment funkcyjny przeciwciała wytworzonego w odpowiedzi na koniugat hapten-nośnik, znamienny tym, że jest fragmentem przeciwciała z zastrz. 14, wybranym spośród Fv, Fab, Fab', F(ab)2 i F(ab')2.

19. Fragment funkcyjny według zastrz. 18 do zastosowania jako lek.

20. Fragment funkcyjny według zastrz. 18 do zastosowania jako lek do zapobiegania lub leczenia uzależnienia od nikotyny.

21. Zestaw do określania obecności nikotyny w próbce, znamienny tym, że zawiera przeciwciało z zastrz. 14 lub fragment funkcyjny z zastrz. 18 w odpowiednim pojemniku.

22. Sposób wytwarzania przeciwciała, w którym immunizuje się gospodarza, znamienny tym, że immunizuje się gospodarza jakim jest ssak koniugatem hapten-nośnik z zastrz. 1.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się przeciwciało monoklonalne.

24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się przeciwciało poliklonalne.

25. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden koniugat haptennośnik z zastrz. 1 razem ze środkami wspomagającymi, rozczynnikami i środkami pomocniczymi.

26. Kompozycja szczepionki według zastrz. 25, znamienna tym, że środki wspomagające są wybrane z grupy obejmującej ałun, QS-21, saponiny i monofosforylolipid A.

27. Kompozycja szczepionki według zastrz. 25, znamienna tym, że rozczynniki są wybrane z grupy obejmującej sterylną wodę, roztwór soli taki jak solanka, fosforan sodu, chlorek sodu, alkohol, gumę arabską, oleje roślinne, alkohol benzylowy, glikol polietylenowy, żelatynę, mannitol, węglowodany, stearynian magnezu, gęstą parafinę, estry kwasów tłuszczowych, hydroksymetylocelulozę i bufory.

28. Kompozycja szczepionki według zastrz. 27, znamienna tym, że roztwór soli jest wybrany z grupy obejmującej fosforan sodu i chlorek sodu.

29. Kompozycja szczepionki według zastrz. 25, znamienna tym, że środki pomocnicze są wybrane z grupy obejmującej ośrodek dyspersyjny, powłoki, mikrokulki, liposomy, mikrokapsułki, lipidy, surfaktanty, lubrikanty, środki konserwujące i stabilizatory.

PL 199 253 B1

Rysunki

Wpływ aktywnej immunizacji szczurów z zastosowaniem szczepionki

Fig. 1

PL 199 253 B1

Wpływ biernej immunizacji szczurów z zastosowaniem przeciwciał przeciw 3’AMNic-Suc-rEPA na poziomy nikotyny w osoczu krwi i mózgu: odpowiedź dla dawki

Fig. 2

PL 199 253 B1

Wpływ biernej immunizacji szczurów z zastosowaniem przeciwciał przeciw 3’AMNic-Suc-rEPA na poziomy nikotyny w osoczu krwi i mózgu: odpowiedź w czasie

30 min i dzień

PL 199 253 B1

Wpływ biernej immunizacji szczurów z zastosowaniem przeciwciał przeciw 3’AMNic-Suc-rEPA na poziomy nikotyny w osoczu krwi po wielu

PL 199 253 B1

Wpływ biernej immunizacji szczurów z zastosowaniem przeciwciał przeciw

Fig. 5

PL 199 253 B1

Wpływ biernej immunizacji szczurów z zastosowaniem przeciwciał przeciw 3’AMNic-Suc-rEPA na poziom aktywności po iniekcji nikotyny

PL 199 253 B1

Wpływ biernej immunizacji szczurów z zastosowaniem przeciwciał przeciw 3’AMNic-Suc-rEPA na skurczowe ciśnienie krwi po iniekcji