CN116782934A - 抗半乳糖凝集素9抗体及其在治疗眼部黑素瘤中的用途 - Google Patents

抗半乳糖凝集素9抗体及其在治疗眼部黑素瘤中的用途 Download PDF

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Abstract

一种用于治疗患者的眼部黑素瘤例如葡萄膜黑素瘤的方法，包括向所述患者施用有效量的结合半乳糖凝集素9的抗体。本文还提供了用于基于来自疑似患有所述眼部黑素瘤的受试者的生物样品(例如，血液样品)中的半乳糖凝集素9水平将受试者鉴定为患有所述眼部黑素瘤的方法。

Description

抗半乳糖凝集素9抗体及其在治疗眼部黑素瘤中的用途
相关申请
本申请要求2020年10月26日提交的美国临时申请第63/105,772号的提交日期的权益，所述申请的全部内容出于所有目的以引用的方式并入本文。
发明背景
半乳糖凝集素9是一种串联重复凝集素，其由两个碳水化合物识别结构域(CRD)组成，并于1997年首次在患有霍奇金淋巴瘤(HL)的患者中发现和描述(Tureci等人,J.Biol.Chem.1997,272,6416–6422)。存在三种同种型，并且可位于细胞内或细胞外。已在多种癌症中观察到升高的半乳糖凝集素9水平，包括黑素瘤、霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌和透明细胞肾细胞癌(Wdowiak等人Int.J.Mol.Sci.2018,19,210)。在肾癌中，具有半乳糖凝集素9高表达的患者表现出更晚期的疾病进展，具有更大的肿瘤体积(Kawashima等人；BJU Int.2014；113:320–332)。在黑素瘤中，半乳糖凝集素9在57％的肿瘤中表达，并且与健康对照相比，晚期黑素瘤患者的血浆中的半乳糖凝集素9显著增加(Enninga等人,Melanoma Res.2016年10月；26(5):429–441)。
半乳糖凝集素9已被描述在许多细胞过程(诸如粘附、癌细胞聚集、细胞凋亡和趋化性)中发挥重要作用。最近的研究表明，半乳糖凝集素9在支持肿瘤的免疫调节中发挥作用，例如，通过负调节Th1型应答、Th2极化和巨噬细胞向M2表型的极化。这项工作还包括一些研究，这些研究表明半乳糖凝集素9通过与T细胞免疫球蛋白和粘蛋白3(TIM-3)受体的相互作用参与了T细胞的直接灭活(Dardalhon等人,J Immunol.,2010,185,1383-1392；Sanchez-Fueyo等人,Nat Immunol.,2003,4,1093-1101)。
还发现半乳糖凝集素9在极化向肿瘤抑制表型的T细胞分化中，以及在促进致耐受巨噬细胞编程和适应性免疫抑制中发挥作用(Daley等人,Nat Med.,2017,23,556-567)。在胰腺导管腺癌(PDA)的小鼠模型中，在肿瘤微环境(TME)中半乳糖凝集素9与在先天免疫细胞上发现的受体Dectin-1之间的检查点相互作用的阻断已被显示增加TME中的抗肿瘤免疫应答并减缓肿瘤进展(Daley等人,Nat Med.,2017,23,556-567)。还发现半乳糖凝集素9与CD206(M2型巨噬细胞的表面标志物)结合，导致CVL22(MDC)的分泌减少，CVL22是一种巨噬细胞衍生的趋化因子，其与肺癌的更长生存期和更低复发风险相关(Enninga等人,JPathol.2018年8月；245(4):468-477)。
眼部黑素瘤是从眼睛中的黑色素细胞发展而来的癌症的亚型。绝大多数起源于葡萄膜(大于85％)，但少数起源于结膜和其他部位(Kaliki和C L Shields(2017)Eye 31,第241–257页)。尽管局部疾病可以得到很好的控制，但高达一半的葡萄膜黑素瘤患者会发生远处转移，5年和10年累积转移率分别为25％和34％，而肝脏是最常见的转移部位，见于90％的转移性疾病患者(Singh等人,Oncology and Therapy 6,第87–104页(2018)，以及其中的参考文献)。肝转移患者诊断后的中位生存期约为4-6个月，1年生存率约为10％-15％(Woodman,Cancer J.2012年三月-四月；18(2):148–152)。这些肝转移患者中约有50％有肝外受累。最常见的肝外转移部位是肺(30％)、骨(23％)和皮肤(17％)(Bedikian,IntOphthalmol Clin,Winter 2006；46(1):151-66.)。因此，对于一般的葡萄膜黑素瘤和眼部黑素瘤，迫切需要新的和改进的治疗策略。
发明内容
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗人受试者的表达半乳糖凝集素9的实体瘤(例如，眼部黑素瘤)的方法。所述方法包括向有需要的人受试者施用有效量的包含结合半乳糖凝集素9的抗体(抗半乳糖凝集素9抗体)的药物组合物。在一些情况下，其中所述眼部黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。在其他情况下，所述眼部黑素瘤是转移性的。在一些实例中，眼部黑素瘤是可能位于脉络膜、睫状体或虹膜的葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中抗半乳糖凝集素9抗体可包含(a)重链可变区(VH)，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)；以及(b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:2所示的轻链CDR2和如SEQ ID NO:3所示的轻链CDR3。在一些实例中，抗半乳糖凝集素9抗体可包含如SEQID NO:7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体可以是全长抗体、其抗原结合片段，或单链可变片段(scFv)。在一些实例中，抗半乳糖凝集素9抗体可以是全长抗体，所述全长抗体可以是IgG分子。在一个实例中，抗体是IgG1分子。在另一个实例中，抗体是IgG4分子。
在一些实例中，本文公开的抗半乳糖凝集素9抗体可包含如SEQ ID NO:14所示的重链恒定区和/或如SEQ ID NO:11所示的轻链恒定区。在具体实例中，抗半乳糖凝集素9抗体含有包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链。在一个实例中，抗体是G9.2-17 IgG4。
在一些实施方案中，如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17 IgG4)以约0.2mg/kg至约32mg/kg的剂量，例如以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至人受试者。在一些实例中，抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17 IgG4)以约0.2mg/kg至约16mg/kg的剂量施用至人受试者。在一些实例中，抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17 IgG4)以约0.2mg/kg、约0.63mg/kg、约2mg/kg、约6.3mg/kg、约10mg/kg或约16mg/kg的剂量施用至人受试者。在一些实例中，抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17 IgG4)以约0.5mg/kg至约32mg/kg或约2mg/kg至约16mg/kg的剂量施用至所述受试者。或者或另外，所述抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17 IgG4)每两周一次施用至人受试者。在一些情况下，所述抗半乳糖凝集素9抗体通过静脉内输注施用至所述受试者。
在一些实施方案中，用于通过本文公开的任何方法治疗的人受试者没有接受与所述抗半乳糖凝集素9抗体同时进行的其他抗癌疗法。
或者，本文公开的任何方法还可包括向人受试者施用有效量的检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。实例包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、替雷利珠单抗或西米普利单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗和阿替利珠单抗。在其他实施方案中，检查点抑制剂可以是抗CTLA-4抗体。任何免疫检查点抑制剂均可通过静脉内输注施用。在一个实例中，结合PD-1的抗体是纳武单抗，其可以每两周一次240mg的剂量施用至受试者。在另一个实例中，结合PD-1的抗体是替雷利珠单抗，其可以每3周一次约200mg的剂量或以每六周一次约400mg的剂量(例如，以每4周一次约300mg的剂量)施用。
在其他实施方案中，本文公开的任何方法还可包括向人患者施用化学疗法。在一些实例中，化学疗法包括抗代谢物、微管抑制剂或它们的组合。例如，所述抗代谢物是吉西他滨和/或所述微管抑制剂是紫杉醇。在一些实例中，紫杉醇是蛋白质结合的紫杉醇，所述蛋白质结合的紫杉醇优选地是纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇。紫杉醇可以125mg/m2静脉内施用至受试者。或者或另外，吉西他滨以1000mg/m2施用至受试者。在一些情况下，所述方法包括一个或多个周期，每个周期有28天，并且其中在每个周期中，在第1天和第15天将所述抗半乳糖凝集素9抗体施用至人受试者并且在第1天、第8天和第15天将所述吉西他滨和紫杉醇施用至人受试者。
或者或另外，本文公开的任何抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17 IgG4)可以与一种或多种另外的治疗剂(例如，化学治疗剂或生物制剂)共同使用以用于治疗眼部黑素瘤诸如葡萄膜黑素瘤。实例包括但不限于达卡巴嗪、替莫唑胺、顺铂、苏消安、福莫司汀、司美替尼、曲美替尼、比尼美替尼、索曲妥林(sotrastaurin)、曲古抑菌素、tenocin-6、丙戊酸、克唑替尼、贝伐珠单抗、雷珠单抗、卡博替尼、硼替佐米、西妥昔单抗、吉非替尼、替本福司(tebentafusp)和钌106近距离放射治疗。在一些实例中，司美替尼、曲美替尼、比美替尼、索曲妥林、曲古抑菌素、tenocin-6、丙戊酸、克唑替尼、贝伐珠单抗、雷珠单抗、卡博替尼、硼替佐米、西妥昔单抗、吉非替尼、替本福司和钌106近距离放射治疗中的一者或多者可与抗半乳糖凝集素9抗体共同用于治疗葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，人受试者已经历过一种或多种先前抗癌疗法。在一些实例中，一种或多种先前抗癌疗法包括化学疗法、免疫疗法、放射疗法、涉及生物制剂的疗法或它们的组合。在一些情况下，人受试者经过所述一种或多种先前抗癌疗法已有疾病进展，或者对所述一种或多种先前疗法具有抗性。
在一些实施方案中，人受试者可具有相对于对照值升高的半乳糖凝集素9水平。例如，人受试者可具有相对于所述对照值升高的血清或血浆半乳糖凝集素9水平。或者或另外，人受试者可具有表达半乳糖凝集素9的癌细胞和/或免疫细胞，所述癌细胞和/或免疫细胞可处于源自所述人患者的肿瘤类器官中。
在一些情况下，在所述治疗之前、期间和/或之后检查人受试者的以下特征中的一项或多项：
(a)来自所述受试者的肿瘤活检样品中的一种或多种肿瘤标志物，任选地其中所述一种或多种肿瘤标志物包括CA15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和/或细胞角蛋白片段21(CYFRA-21)；
(b)细胞因子谱，其任选地包括干扰素γ(IFN-γ)、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-1b、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MIP-1a、IL-17a、IL-5和/或TGF-β；和
(c)半乳糖凝集素9水平，任选地是在血液和/或肿瘤组织中的半乳糖凝集素9水平；
(d)PD-L1水平，任选地是在组织中的PD-L1水平；
(e)错配修复状态，任选地是在组织中的错配修复状态，以及
(f)肿瘤突变负荷(TMB)。
本文公开的任何治疗方法还可包括监测人受试者中一种或多种不良作用的发生。在一些实例中，一种或多种不良作用包括肝损伤、血液毒性、神经毒性、皮肤毒性、胃肠毒性或它们的组合。在一些实施方案中，本文公开的方法还可包括当在人受试者中观察到不良作用时，减少所述抗半乳糖凝集素9抗体的剂量，任选地减少所述检查点抑制剂的剂量、所述化学疗法的剂量或它们的组合。
在其他方面，本公开的特征在于一种用于鉴定眼部黑素瘤患者并且任选地治疗所述患者的方法，所述方法包括：
(i)提供疑似患有眼部黑素瘤的受试者的生物样品，
(ii)测量所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平，以及
(iii)基于所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平将所述受试者鉴定为患有所述眼部黑素瘤或有患所述眼部黑素瘤的风险，其中所述受试者的所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于预定参考水平升高表明所述受试者患有所述眼部黑素瘤或有患所述眼部黑素瘤的风险。
同样在本公开范围内的是(b)药物组合物，所述药物组合物包含单独使用或与如本文所公开的检查点抑制剂或化学疗法联合使用的用于治疗眼部黑素瘤的任何抗半乳糖凝集素9抗体，和(b)单独使用或与如本文所公开的检查点抑制剂或化学疗法联合使用的抗半乳糖凝集素9抗体在制造用于治疗眼部黑素瘤的药剂中的用途。
此外，本公开的特征还在于一种用于确定患有眼部黑素瘤的患者的肿瘤负荷或转移状态并且任选地治疗所述患者的方法，所述方法包括：
(i)提供患有眼部黑素瘤的患者的生物样品，
(ii)测量所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平，以及
(iii)基于所述血液样品中的半乳糖凝集素9水平确定所述患者的肿瘤负荷，其中所述受试者的所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于预定参考水平升高表明所述受试者具有高肿瘤负荷。
上文公开的方法可还包括：进行一种或多种另外的诊断测定以确认癌症的发生或癌症的肿瘤负荷。
此外，本公开的特征在于一种用于评估受试者的眼部黑素瘤的进展并且任选地治疗所述受试者的方法，所述方法包括：
(i)在第一时间点提供患有眼部黑素瘤的受试者的第一生物样品；
(ii)在第二时间点提供所述受试者的第二生物样品，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后；
(iii)测量所述第一生物样品和所述第二生物样品中的半乳糖凝集素9水平；以及
(iv)基于所述第一生物样品和所述第二生物样品中的半乳糖凝集素9水平确定所述受试者的眼部黑素瘤的进展，其中所述第二生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于所述第一生物样品中的半乳糖凝集素9水平升高表明所述受试者的眼部黑素瘤进展。
本文公开的任何诊断/预后方法可还包括，例如，基于诊断和/或预后结果对患者进行眼部黑素瘤的治疗。可以对眼部黑素瘤患者进行本文公开的任何治疗方法。
在其他方面，本文提供了一种用于确定患有眼部黑素瘤的受试者对治疗的应答并且任选地修改所述治疗的方法，所述方法包括：
(i)提供正在接受包括抗癌疗法的治疗的眼部黑素瘤患者的多个生物样品，其中所述多个生物样品至少包括在所述抗癌疗法的第一剂量之前收集的第一生物样品和在所述抗癌疗法的第一剂量之后收集的第二生物样品；
(ii)测量所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平；以及
(iii)基于所述第一生物样品中的Gal-9水平与所述第二生物样品中的Gal-9水平之间的差异确定所述患者对所述抗癌疗法的应答；其中所述第二生物样品中的Gal-9水平相对于所述第一生物样品降低表明所述受试者对所述抗癌疗法有应答。
所述方法可包括所述抗癌疗法的多次剂量并且所述多个生物样品包括在所述抗癌疗法的第一剂量之前收集的第一生物样品和各自在所述抗癌疗法的一个剂量之后收集的多个第二生物样品，并且其中较晚收集的生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于较早收集的生物样品中的半乳糖凝集素9水平降低表明所述患者对所述治疗有应答。
在一些情况下，所述方法可还包括基于在步骤(iii)中确定的所述患者对所述抗癌疗法的应答来修改所述抗癌疗法，其中所述修改选自由以下组成的组：(i)增加或减少所述抗癌疗法的剂量，(ii)终止所述抗癌疗法，(iii)增加或减少所述抗癌疗法的频率，以及(iv)增加或减少所述抗癌疗法的持续时间。本文公开的任何治疗方法均可用作抗癌疗法。
在本文公开的任何方法中，生物样品是血液样品，所述血液样品任选地是血清样品或血浆样品。在一些实施方案中，通过免疫测定测量半乳糖凝集素9水平。
另外，本文提供了用于确定眼部黑素瘤癌症患者的预后并且任选地治疗所述患者的方法，所述方法包括：(i)从人眼部黑素瘤患者获得肿瘤组织样品；(ii)测量所述肿瘤样品中的半乳糖凝集素9水平；以及(iii)基于在步骤(ii)中测量的半乳糖凝集素9水平相对于预定参考水平评估所述患者的预后，并且其中所述癌症是眼部黑素瘤。
本文还提供了用于预测眼部黑素瘤患者的生存率或生存可能性的方法，所述方法包括：(i)从人眼部黑素瘤患者获得肿瘤组织样品；(ii)测量所述肿瘤样品中的半乳糖凝集素9水平；以及(iii)基于在步骤(ii)中测量的半乳糖凝集素9水平相对于预定参考水平评估癌症患者的生存率，并且其中所述癌症是眼部黑素瘤。
下文描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。本发明的其他特征或优势根据以下附图和若干实施方案的详细描述以及所附权利要求而显而易知。
附图说明
下列附图构成本说明书的一部分，并被包括在内以进一步说明本公开的某些方面，通过参考附图并结合本文提出的具体实施方案的详细描述可以更好地理解这些方面。
图1A至图1F包括条形图，显示了在使用抗半乳糖凝集素9G9.2-17Fab片段和市售的抗半乳糖凝集素9抗体(9M1-3)的胰腺腺癌活检所得的S2和S3类器官级分中，在T细胞(CD3+)、巨噬细胞(CD11b+)和肿瘤细胞(Epcam+)中测量的半乳糖凝集素9表达的水平。S2级分：类器官。S3级分：单细胞。G9.2-17Fab的相应同种型(“Fab同种型”)和“荧光减一”(FMO)9M1-3(“Gal9 FMO”)用作特异性、背景染色和从其他通道渗出的荧光的对照。图1A显示了在S3级分中测量的CD3+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图1B显示了在S3级分中测量的CD11b+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图1C显示了在S3级分中测量的Epcam+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图1D显示了在S2级分中测量的CD3+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图1E显示了在S2级分中测量的CD11b+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图1F显示了在S2级分中测量的Epcam+细胞中半乳糖凝集素9的水平。
图2A至图2F包括条形图，显示了在使用抗半乳糖凝集素9G9.2-17Fab片段和市售的抗半乳糖凝集素9抗体(9M1-3)的结直肠癌活检所得的S2和S3类器官级分中，在T细胞(CD3+)、巨噬细胞(CD11b+)和肿瘤细胞(Epcam+)中测量的半乳糖凝集素9表达的水平。S2级分：类器官。S3级分：单细胞。G9.2-17Fab的相应同种型(“Fab同种型”)和FMO 9M1-3(“Gal9FMO”)用作特异性、背景染色和从其他通道渗出的荧光的对照。图2A显示了在S3级分中测量的CD3+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图2B显示了在S3级分中测量的CD11b+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图2C显示了在S3级分中测量的Epcam+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图2D显示了在S2级分中测量的CD3+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图2E显示了在S2级分中测量的CD11b+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图2F显示了在S2级分中测量的Epcam+细胞中半乳糖凝集素9的水平。
图3A至图3F包括条形图，显示了在使用抗半乳糖凝集素9G9.2-17Fab片段和市售的半乳糖凝集素9抗体(9M1-3)的第二胰腺腺癌活检所得的S2和S3类器官级分中，在T细胞(CD3+)、巨噬细胞(CD11b+)和肿瘤细胞(Epcam+)中测量的半乳糖凝集素9表达的水平。S2级分：类器官。S3级分：单细胞。G9.2-17Fab的相应同种型(“Fab同种型”)和FMO 9M1-3(“Gal9FMO”)用作特异性、背景染色和从其他通道渗出的荧光的对照。图3A显示了在S3级分中测量的CD3+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图3B显示了在S3级分中测量的CD11b+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图3C显示了在S3级分中测量的Epcam+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图3D显示了在S2级分中测量的CD3+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图3E显示了在S2级分中测量的CD11b+细胞中半乳糖凝集素9的水平。图3F显示了在S2级分中测量的Epcam+细胞中半乳糖凝集素9的水平。
图4是显示患者血清中半乳糖凝集素9水平的测量值的图。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量患者血清中的半乳糖凝集素9水平(括号中为样品量)。使用人半乳糖凝集素9PicoKine ELISA试剂盒(Bolster Biological Technology)以夹心形式运行ELISA。将患者血清半乳糖凝集素9水平与健康人血清对照进行比较。通过非成对学生t检验进行统计分析。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。结果显示，癌症患者血清中的半乳糖凝集素9水平显著升高。
图5A至图5C包括使用抗半乳糖凝集素9抗体1G3的各种肿瘤的免疫组织化学分析的照片。所有放大倍数均为200X。图5A显示了具有异质强度评分2和3(中等和高)半乳糖凝集素9表达的化学疗法治疗的结直肠癌。特别地在细胞膜处观察到半乳糖凝集素9染色；此外，腺内巨噬细胞呈中度阳性，肿瘤中的基质反应显示具有中等强度的半乳糖凝集素9表达的多核巨噬细胞巨细胞。图5B显示了具有高(强度评分3)半乳糖凝集素9表达的结直肠癌的肝转移。染色位于膜上和细胞质中。图5C显示了半乳糖凝集素9阳性(强度评分2)截留的胆管和半乳糖凝集素9阴性癌症。
图6A和图6B描绘了显示9.2-17在B16F10皮下同基因模型中的作用的图。皮下移植肿瘤并用G9.2-17 IgG1小鼠mAb、抗PD1抗体或G9.2-17 IgG1小鼠mAb和抗PD1抗体的组合进行治疗。图6A描绘了显示对肿瘤体积的影响的图。图6B描绘了显示肿瘤内CD8 T细胞浸润的图。结果表明，在联合臂中，效应T细胞的肿瘤内存在得到增强。
图7包括显示被绘制为所用抗体浓度的函数的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)阳性细胞的分数的图。MOLM-13细胞与不同浓度的G9.2-17或人IgG4同种型抗体和重组人半乳糖凝集素9共孵育16小时。用膜联蛋白V和碘化丙啶染色细胞，之后通过流式细胞术进行分析。每个条件一式三份进行。在FlowJo软件上进行分析。
图8A和图8B描绘了显示用G9.2-17的IgG1形式(图8A)和G9.2-17的IgG4形式(图8B)进行的ADCC测定的结果的图。如对人IgG4 mAb所预期的，G9.2-17不介导ADCC(图8B)。这是针对作为阳性对照的G9.2-17的IgG1人对应物(其介导ADCC和ADCP)进行试验的，如所预期的(图8A)。
具体实施方式
半乳糖凝集素9(一种串联重复凝集素)是一种β-半乳糖苷结合蛋白，其已被证明在调节细胞-细胞和细胞-基质相互作用中发挥作用。本公开至少部分基于半乳糖凝集素9(例如，半乳糖凝集素9的血液水平)作为与某些实体瘤的发生、肿瘤负荷和/或转移状态相关的生物标志物的意外发现。在多个群组中，与健康个体相比，患有原发性和转移性胰腺癌、肺癌和结直肠癌的个体的血液样品中的半乳糖凝集素9显著增加。因此，在本公开的一些实施方案中，半乳糖凝集素9水平的测量值可用作，例如，用以选择或鉴定患者，或诊断患者的生物标志物。
眼部黑素瘤是从眼睛中的黑色素细胞发展而来的癌症的亚型。在眼部黑素瘤中，绝大多数起源于葡萄膜(大于85％)，但少数起源于结膜和其他部位(Kaliki和C L Shields(2017)Eye 31,第241–257页，以及其中的参考文献)。葡萄膜黑素瘤是发生在眼睛葡萄膜的一种黑素瘤亚型，是成年人中最常见的原发性眼内肿瘤，平均年龄调整发病率为每年百万分之5.1例(Damato and Damato(2012),Ophthalmology,119(8),1582–1589)。结膜恶性黑素瘤是一种罕见的肿瘤，约占所有眼肿瘤的2％，占眼区黑素瘤的5％(Wong等人,ExpertRev Ophthalmol.2014年六月；9(3):185–204)。
尽管局部疾病可以得到很好的控制，但高达一半的葡萄膜黑素瘤患者会发生远处转移，5年和10年累积转移率分别为25％和34％，而肝脏是最常见的转移部位，见于90％的转移性疾病患者(Singh等人,Oncology and Therapy 6,第87–104页(2018)，以及其中的参考文献)。肝转移患者诊断后的中位生存期约为4-6个月，1年生存率约为10％-15％(Woodman,Cancer J.2012年三月-四月；18(2):148–152)。这些肝转移患者中约有50％有肝外受累。最常见的肝外转移部位是肺(30％)、骨(23％)和皮肤(17％)(Bedikian,IntOphthalmol Clin,Winter2006；46(1):151-66.)。
3号染色体单体和8q扩增是最常观察到的细胞遗传学改变。这些扩增在转移灶中是保守的，并且与不良预后相关(Singh等人,Arch ives of Pathology&LaboratoryMedicine.2009；133(8):1223–1227)。
皮肤黑素瘤和眼部黑素瘤的生物学特性似乎不同。例如，在葡萄膜黑素瘤中，MAP激酶和免疫检查点抑制剂在皮肤黑素瘤中取得的成功并没有被概括。例如，针对PD1或其配体PD-L1的免疫检查点阻断疗法在大部分皮肤黑素瘤患者中诱导长期生存，但在转移性葡萄膜黑素瘤患者中仅显示出有限的活性(Algazi等人,Cancer.2016年11月15日；122(21):3344–3353)。
编码G蛋白Gα亚基的两个基因GNAQ和GNA11以相互排斥的方式存在于超过80％的葡萄膜黑色素中，并通过肌醇3-磷酸、甘油二酯和环AMP激活经典的G蛋白信号级联，导致MAP激酶、蛋白激酶B(Akt)和蛋白激酶C(PKC)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)的激活。GNAQ和GNA11还被证明能够以HIPPO非依赖性方式激活转录因子复合物YAP/TAZ(Amaro等人,Cancer Metastasis Rev.2017；36(1):109–140，以及其中的参考文献)。
眼球保留疗法(放射、激光疗法、手术切除)或手术切除整个眼球(摘除术)被用于眼部黑素瘤诸如葡萄膜黑素瘤的局部治疗(Yang等人,(2018)Ther Adv Med Oncol,10:1–17)。迄今为止，对于晚期和转移性眼部黑素瘤患者还没有有效的治疗选择，也没有FDA批准的护理标准。由于眼部黑素瘤(诸如葡萄膜黑素瘤)的生物学特性不同于皮肤黑素瘤，因此有必要开发治疗方法，开发特定的治疗方法和专门的管理方法(Yang等人(2018),Ther AdvMed Oncol.)。已评估了几种实验性治疗，包括免疫疗法、全身性化学疗法、各种激酶抑制剂疗法和肝脏定向疗法，但应答率低且生存期无总体改善。因此，对于一般的葡萄膜黑素瘤和眼部黑素瘤，医学上迫切需要新的和改进的治疗策略。
本公开至少部分基于半乳糖凝集素9的血清水平与实体癌诸如黑素瘤的发生、肿瘤负荷和/或转移状态有关这一令人惊讶的观察结果。因此，半乳糖凝集素9可用作用于诊断此类实体癌和/或评估癌症的肿瘤负荷和/或转移状态的可靠生物标志物。因此，本文提供了使用半乳糖凝集素9作为生物标志物(例如，半乳糖凝集素9的血液水平作为生物标志物)来诊断患有靶标实体癌(诸如眼部黑素瘤)的受试者(例如，人患者)的方法。本文还提供了使用半乳糖凝集素9作为生物标志物(例如，半乳糖凝集素9的血液水平作为生物标志物)来评估受试者的实体癌(诸如眼部黑素瘤)的肿瘤负荷、转移状态或预后状态的方法。还提供了治疗眼部黑素瘤的方法，所述方法包括施用抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，眼部黑素瘤是转移性的。在一些实施方案中，转移性肿瘤在肝脏中。在一些实施方案中，眼部黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，葡萄膜黑素瘤位于脉络膜、睫状体或虹膜中。在一些实施方案中，眼部黑素瘤是结膜黑素瘤。在一些实施方案中，葡萄膜或结膜黑素瘤是转移性的。
I.眼部黑素瘤的治疗
在一些方面，本文提供了使用抗半乳糖凝集素9抗体治疗受试者(例如，人患者)的眼部黑素瘤的方法。这样的患者可通过本文公开的任何诊断方法来鉴定，例如，患有具有高肿瘤负荷的癌症，或患有具有转移或有转移风险的癌症。
A.抗半乳糖凝集素9抗体
抗半乳糖凝集素9抗体可用作治疗与半乳糖凝集素9相关的疾病(例如，半乳糖凝集素9信号传导在其中起作用的疾病)的治疗剂。不受理论束缚，抗半乳糖凝集素9抗体可阻断半乳糖凝集素9介导的信号传导途径。例如，抗体可干扰半乳糖凝集素9与其结合配偶体(例如，Dectin-1、TIM-3或CD206)之间的相互作用，从而阻断由半乳糖凝集素9/配体相互作用触发的信号传导。或者或另外，抗半乳糖凝集素9抗体还可通过诱导阻断和/或细胞毒性例如针对表达半乳糖凝集素9的病理细胞的ADCC、CDC或ADCP来发挥其治疗作用。病理细胞是指直接或间接促成疾病的发生和/或发展的细胞。
本文公开的抗半乳糖凝集素9抗体能够抑制半乳糖凝集素9介导的信号传导(例如半乳糖凝集素9/Dectin-1或半乳糖凝集素9/Tim-3介导的信号传导途径)或通过例如ADCC消除表达半乳糖凝集素9的病理细胞。因此，本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体可用于抑制任何半乳糖凝集素9信号传导和/或消除半乳糖凝集素9阳性病理细胞，从而有益于治疗与半乳糖凝集素9相关的疾病，例如自身免疫性疾病、感染性病症、实体瘤和其他癌症、过敏性病症或血液系统病症，诸如血液系统恶性肿瘤。
抗体(复数形式可互换使用)是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，术语“抗体”，例如抗半乳糖凝集素9抗体，不仅包括完整的(例如，全长)多克隆或单克隆抗体，还包括其抗原结合片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、纳米抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体(例如抗半乳糖凝集素9抗体)包括任何类别的抗体，诸如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且该抗体不需要属于任何特定类别。取决于抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可指定为不同的类别。免疫球蛋白有五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
典型的抗体分子包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们通常参与抗原结合。VH和VL区域可以进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“CDR”)，散布着更保守的区域，称为“框架区”(“FR”)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。框架区和CDR的范围可以使用本领域已知的方法精确鉴定，例如通过Kabat定义、“Contact”编号方案、“IMGT”编号方案、“AHo”编号方案、Chothia定义、AbM定义、EU定义和/或接触定义，所有这些都是本领域众所周知的。参见，例如，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication第91-3242号，Chothia等人,(1989)Nature 342:877；Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948；Edelman等人,Proc Natl AcadSci U S A.1969年5月；63(1):78-85；Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Lefranc M P等人,Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77；以及Honegger A和Pluckthun A,J Mol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70)。另见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs)。
在一些实施方案中，本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体是全长抗体，其含有两条重链和两条轻链，每条链包括可变结构域和恒定结构域。或者，抗半乳糖凝集素9抗体可以是全长抗体的抗原结合片段。术语全长抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)保留功能的分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子，称为单链Fv(scFv)。参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883。
本文所述的任何抗体，例如抗半乳糖凝集素9抗体，可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是指同质抗体群，“多克隆抗体”是指异质抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或其制造方式。
在一些实例中，抗半乳糖凝集素9抗体是G9.2-17或其功能等同物。参考抗体G9.2-17是指能够结合人半乳糖凝集素9的抗体，并且包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ IDNO:8的轻链可变结构域，两者均提供在下文。表1中提供并在VH和VL序列中鉴定的CDR是基于Kabat方法。
表1.G9.2-17的重链和轻链CDR
VH：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPG KGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLR AEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)
VL：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGK APKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QSSTDPITFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8)
在一些实施方案中，用于本文公开的方法中的抗半乳糖凝集素9抗体是具有与参考抗体G9.2-17相同的重链互补决定区(CDR)和/或与参考抗体G9.2-17相同的轻链互补决定区的抗体。在一些实施方案中，用于本文公开的方法中的抗半乳糖凝集素9抗体可以是具有与参考抗体G9.2-17相同的重链可变区(VH)和/或相同的轻链可变区(VL)的抗体。具有相同VH和/或VL CDR的两种抗体意味着当通过相同方法(例如，本领域已知的Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、Contact方法或IMGT方法，参见，例如，bioinf.org.uk/abs/)确定时，它们的CDR是相同的。用于确定抗体CDR的示例性编号方案包括“Kabat”编号方案(Kabat等人(1991),第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)、“Chothia”编号方案(Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948)、“Contact”编号方案(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))、“IMGT”编号方案(Lefranc M P等人,Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77)和“AHo”编号方案(Honegger A和Pluckthun A,J Mol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70)。
在一些情况下，本文公开的抗半乳糖凝集素9抗体是参考抗体G9.2-17的功能变体。功能变体可以在结构上与参考抗体相似(例如，包含在如本文所公开的G9.2-17的一个或多个重链和/或轻链CDR中有限数量的氨基酸残基变异，或相对于如本文所公开的G9.2-17的重链和/或轻链CDR或G9.2-17的VH和/或VL的序列同一性)，具有基本相似的与人半乳糖凝集素9的结合亲和力(例如，具有同阶的KD值)。
在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体包含重链和轻链可变区，其中轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2和3所示的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别具有至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以及其中的任何增量)的序列同一性。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列与SEQ ID NO:4、5和6所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别具有至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以及其中的任何增量)的序列同一性。
两个氨基酸序列的“同一性百分比”是使用Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法，按照Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中的修改确定的。这样的算法被合并到Altschul等人J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在缺口时，可以利用缺口BLAST，如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在其他实施方案中，本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体含有包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3的VH，它们共同包含相对于参考抗体G9.2-17的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3的多至8个氨基酸残基变异(8、7、6、5、4、3、2或1个变异，包括添加、缺失和/或取代)。或者或另外，在一些实施方案中，本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体含有包含LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3的VL，它们共同包含相对于参考抗体G9.2-17的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3的多至8个氨基酸残基变异(8、7、6、5、4、3、2或1个变异，包括添加、缺失和/或取代)。
在一个实例中，氨基酸残基变异是保守氨基酸残基取代。如本文所用，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。变体可以根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法来制备，例如在编译此类方法的参考资料中找到，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等人编,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989，或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人编,John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。
例如，结合至半乳糖凝集素9的CRD1和/或CRD2区域的其他半乳糖凝集素9抗体描述于美国专利号10,344,091和WO 2019/084553中，所述专利各自的相关公开内容为了本文引用的主题和目的以引用的方式并入。
抗Gal9抗体，包括参考抗体G9.2-17，可以是如本文所公开的任何形式，例如全长抗体或Fab。在一些实施方案中，如本文所述的任何抗半乳糖凝集素9抗体中的任一个的重链还包含重链恒定区(CH)或其部分(例如，CH1、CH2、CH3或它们的组合)。重链恒定区可以是任何合适的来源，例如人、小鼠、大鼠或兔。在一个具体实例中，重链恒定区来自如本文所述的任何IgG亚家族的人IgG(γ重链)。
在一些实施方案中，本文所述抗体的重链恒定区包含恒定区(例如，SEQ ID NO:10、12、13、14、20和21)的单个结构域(例如，C H1、CH2或CH3)或单个结构域中任一者的组合。在一些实施方案中，本文所述抗体的轻链恒定区包含恒定区的单个结构域(例如，CL)。下文列出了示例性的轻链和重链序列。下文列出了示例性的轻链和重链序列。hIgG1 LALA序列包括两个突变(L234A和L235A (EU编号)，它们抑制FcgR结合)以及P329G突变(EU编号)以消除补体C1q结合，从而消除所有免疫效应子功能。hIgG4 Fab臂交换突变序列包括抑制Fab臂交换的突变(S228P；EU编号)。IL2信号序列(MYRMQLLSCI ALSLALVTNS；SEQ ID NO:9)可以位于可变区的N末端。它用于表达载体中，其在分泌过程中被切割，因此不在成熟的抗体分子中。成熟蛋白(分泌后)的重链以“EVQ”开头，轻链以“DIM”开头。示例性重链恒定区的氨基酸序列提供如下：
hIgG1重链恒定区(SEQ ID NO:10)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
hIgG1 LALA重链恒定区(SEQ ID NO:12)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
hIgG4重链恒定区(SEQ ID NO:13)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
hIgG4重链恒定区(SEQ ID NO:20)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
hIgG4突变重链恒定区(SEQ ID NO:14)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
hIgG4突变重链恒定区(SEQ ID NO:21)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
本文所用的术语“G9.2-17(Ig4)”是指作为IgG4分子的G9.2-17抗体。同样，术语“G9.2-17(Fab)”是指作为Fab分子的G9.2-17抗体。参考抗体G9.2-17的重链和轻链CDR提供于表1中(使用Kabat方法确定)。
在一些实施方案中，具有任何上述重链恒定区的抗半乳糖凝集素抗体与具有以下轻链恒定区的轻链配对：
轻链恒定区(SEQ ID NO:11)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
示例性全长抗半乳糖凝集素9抗体提供如下：
G9.2-17hIgG1重链(SEQ ID NO:16)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
G9.2-17hIgG1 LALA重链(SEQ ID NO:17)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
G9.2-17hIgG4重链(SEQ ID NO:18)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
G9.2-17hIgG4重链(SEQ ID NO:22)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
G9.2-17hIgG4 Fab臂交换突变重链(SEQ ID NO:19)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQM NSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
G9.2-17hIgG4 Fab臂交换突变重链(SEQ ID NO:23)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
任何上述重链可以与下文所示的(SEQ ID NO:15)的轻链配对：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSTDPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
本文公开的任何抗半乳糖凝集素9抗体可通过本领域已知的任何方法产生，所述方法包括但不限于重组技术。可以使用本领域已知的方法表征由此制备的抗半乳糖凝集素9抗体，由此检测和/或测量半乳糖凝集素9生物活性的降低、改善或中和。例如，在一些实施方案中，ELISA型测定适用于Dectin-1或TIM-3信号传导的半乳糖凝集素9抑制的定性或定量测量。
抗半乳糖凝集素9抗体的生物活性可以通过将候选抗体与半乳糖凝集素9一起孵育，并监测以下任何一个或多个特征来验证：(a)Dectin-1和半乳糖凝集素9之间的结合以及由结合介导的信号转导的抑制；(b)预防、改善或治疗如本文所述那些的实体瘤的任何方面；(c)阻断或减少Dectin-1的激活；(d)抑制(减少)半乳糖凝集素9的合成、产生或释放。或者，TIM-3可用于使用上述方案验证抗半乳糖凝集素9抗体的生物活性。或者，CD206可用于使用上述方案验证抗半乳糖凝集素9抗体的生物活性。
在一些实施方案中，例如通过测量外周和肿瘤内T细胞比率、T细胞激活或通过巨噬细胞分型来评估在受试者中的生物活性或疗效。确定抗半乳糖凝集素9抗体生物活性的其他测定包括测量CD8+和CD4+(常规)T细胞激活(在体外或体内测定中，例如通过测量炎性细胞因子水平，例如，IFNγ、TNFα、CD44、ICOS颗粒酶B、穿孔素、IL-2(上调)；CD26L和IL-10(下调))；测量巨噬细胞的重编程(体外或体内)，例如从M2到M1表型(例如，增加的MHCII、减少的CD206、增加的TNF-α和iNOS)，或者，可以评估ADCC的水平，例如，在体外测定中，如本文所述。
B.药物组合物
如本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体以及编码核酸或核酸组、包含它们的载体可以与药学上可接受的载体(赋形剂)混合以形成药物组合物用于治疗靶标疾病。“可接受”是指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)包括本领域众所周知的缓冲剂。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Areiamsand Wilkins,Ed.K.E.Hoover。
用于本发明方法的药物组合物可包含呈冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Areiams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖)；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠离子；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一些实例中，本文所述的药物组合物包含含有抗体(或编码核酸)的脂质体，其可通过本领域已知的方法制备，如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545中所描述的。具有延长循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556中。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用脂质组合物产生，该脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。脂质体通过限定孔径的过滤器挤出，以产生具有所需直径的脂质体。
在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体或编码核酸包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳剂中。此类技术是本领域已知的，参见例如Remington,TheScience and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing(2000)。
在其他实例中，本文所述的药物组合物可以以缓释形式配制。缓释制备剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透过性基质，所述基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯(sucrose acetate isobutyrate)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这易于通过例如经由无菌过滤膜过滤来实现。通常将治疗性治疗性抗体组合物组合物放到具有无菌进入端口的容器中，例如具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
本文所述的药物组合物可以是单位剂型，诸如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂，或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物诸如片剂，可以将主要活性成分与药物载体(例如，常规压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其他药用稀释剂(例如，水)混合以便形成含有本发明的化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预配制组合物。当提及作为均匀的这些预配制混合物时，意指所述活性成分被均匀地分散于整个组合物以使得可以容易地将所述组合物细分成同样有效的单位剂型诸如片剂、丸剂和胶囊。然后将该固体预配制组合物细分为含有0.1至约500mg本发明的活性成分的上述类型的单位剂型。新组合物的片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式混合以提供具有延长作用优势的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量组分，后者为在前者之上的包膜形式。这两种组分可以被肠溶层隔开，肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括多种聚合酸以及聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。合适的表面活性剂特别包括非离子试剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(polyoxyethylenesorbitan)(例如，TweenTM 20、40、60、80或85)和其他脱水山梨糖醇(例如，SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物方便地包含0.05％至5％的表面活性剂，并且可以是0.1％至2.5％。应当理解，如果需要，可以添加其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的载体。
合适的乳液可以使用市售的脂肪乳液制备，诸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM。活性成分可以溶解在预先混合的乳液组合物中，或者它可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成的乳液中。应当理解，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液通常含有多至20％的油，例如，5％与20％之间。脂肪乳液可包含0.1至1.0.im，特别是0.1至0.5.im的脂肪滴，并且具有5.5至8.0范围内的pH。
乳液组合物可以是通过将抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些。
用于吸入或吹入的药物组合物包括药学上可接受的水性或有机溶剂、或其混合物中的溶液和混悬剂、以及粉末。液体或固体组合物可含有如上所阐述合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物通过口腔或鼻呼吸途径施用以获得局部或全身作用。
在优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体雾化。雾化溶液可以直接从雾化装置呼吸，或者雾化装置可以连接到面罩、帐(tent)或间歇式正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的装置施用，优选经口或经鼻施用。
C.用抗半乳糖凝集素9抗体治疗眼部黑素瘤
任何抗半乳糖凝集素9抗体或包含所述抗体的药物组合物可用于治疗通过本文公开的方法诊断的癌症患者。
为了实施本文公开的治疗方法，可将有效量的本文公开的任何抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17或其功能等同物)施用至受试者。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体是G9.2-17。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体是具有与参考抗体G9.2-17相同的重链CDR序列和/或相同的轻链CDR序列的抗体。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体是具有与参考抗体G9.2-17相同的VH和VL序列的抗体。在一些实施方案中，这种抗体是IgG1分子(例如，具有如本文公开的那些的野生型IgG1恒定区或其突变体)。或者，抗体是IgG4分子(例如，具有如本文所述的那些的野生型IgG4恒定区或其突变体)。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ IDNO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ IDNO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区和包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在具体实例中，本文使用的抗半乳糖凝集素9抗体具有SEQ ID NO:19的重链和SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。
在一些实施方案中，待通过如本文所公开的方法治疗的患者可能患有转移性眼部黑素瘤。如本文所用，转移性实体瘤/癌症是指其中肿瘤/癌细胞从它们最初形成的位置到身体的另一部分的肿瘤/癌症。在转移中，癌细胞脱离原来的肿瘤，通过血液或淋巴系统移行，并在身体的其他器官或组织中形成新的肿瘤。如本文所用，复发性实体瘤是指在一段时间的治疗和改善后肿瘤/癌症或肿瘤/癌症的体征或症状的复发。如本文所用，难治性实体瘤是指对治疗无反应的肿瘤/癌症，包括在治疗开始时有抗性的肿瘤/癌症或对治疗有应答但在治疗期间变得有抗性的肿瘤/癌症。
如本文所用，肿瘤负荷是指受试者体内肿瘤的癌数量、大小或体积，算上所有疾病部位。可以使用本领域已知的方法测量肿瘤负荷，这些方法包括但不限于FDG正电子发射断层扫描(FDG-PET)、磁共振成像(MRI)和光学成像，包括生物发光成像(BLI)和荧光成像(FLI)。
可以通过常规医学检查，例如实验室检查、器官功能检查、基因检测、介入性程序(活检、手术)以及任何和所有相关成像方式来鉴定患有眼部黑素瘤的受试者。在一些实施方案中，待通过本文所述方法治疗的受试者是已经接受或正在接受抗癌疗法例如化学疗法、放射疗法、免疫疗法或手术的人癌症患者。
在一些实施方案中，受试者已经接受过先前的免疫调节抗肿瘤剂。此类免疫调节剂的非限制性实例包括但不限于抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗OX40、抗CD137等。在一些实施方案中，受试者通过治疗显示疾病进展。在其他实施方案中，受试者对治疗有抗性(从头的或获得的)。在一些实施方案中，这样的受试者被证明患有晚期恶性肿瘤(例如，无法手术或为转移性的)。或者或另外，在一些实施方案中，受试者没有可用的标准治疗选择或不适合标准治疗选择，标准治疗选择是指临床环境中常用的用于治疗相应实体瘤的疗法。
在一些情况下，受试者是具有相对于对照水平升高的半乳糖凝集素9水平的人患者。半乳糖凝集素9的水平可以是人患者中半乳糖凝集素9的血浆或血清水平。在其他实例中，半乳糖凝集素9的水平可以是细胞表面半乳糖凝集素9的水平，例如癌细胞上的半乳糖凝集素9的水平。在一个实例中，半乳糖凝集素9的水平可以是在患者来源的器官型肿瘤球状体(PDOT)中的癌细胞上表达的表面半乳糖凝集素9的水平，PDOT可以通过例如以下实施例中公开的方法来制备。对照水平可以指没有实体瘤的相同物种(例如，人)受试者的匹配样品中半乳糖凝集素9的水平。在一些实例中，对照水平代表健康受试者中半乳糖凝集素9的水平。另见上述公开内容。
在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体每2周施用一次持续一个周期，每2周施用一次持续两个周期，每2周施用一次持续3个周期，每2周施用一次持续4个周期，或每2周施用一次持续超过4个周期。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体每2周施用一次持续4个周期。在一些实施方案中，治疗持续时间为12-24个月或更长。在一些实施方案中，周期延续3个月至6个月、或6个月至12个月或12个月至24个月或更长的持续时间。在一些实施方案中，周期长度被修改，例如暂时或永久地修改为更长的持续时间，例如3周或4周。在一些实施方案中，该用途还包括向受试者施用如本文所述的免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1抗体，例如根据本文所述的方案进行施用。在一些实施方案中，实体瘤是眼部黑素瘤，例如葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，肿瘤是转移性肿瘤。
鉴于半乳糖凝集素9的促肿瘤作用是通过与免疫细胞的相互作用(例如，通过TIM-3、CD44和41BB与淋巴样细胞相互作用，以及通过dectin-1和CD206与巨噬细胞相互作用)介导的并且鉴于半乳糖凝集素9在大量肿瘤中表达，靶向半乳糖凝集素9，例如，使用半乳糖凝集素9结合抗体以抑制与其受体的相互作用提供了一种可应用于多种不同肿瘤类型的治疗方法。
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体，包括但不限于G9.2-17 IgG4。在一些实例中，本文公开的方法应用于患有眼部黑素瘤的人患者。在一些情况下，眼部黑素瘤患者可患有转移性癌症。在一些实例中，本文公开的方法应用于患有葡萄膜黑素瘤的人患者。
可以通过常规眼科检查来鉴定患有眼部癌症的受试者。葡萄膜黑素瘤常引起无痛性视力扭曲和其他非特异性视觉症状。UM的诊断主要依赖于临床检查和眼部超声检查(Luke等人,Cancer.2013；119(20):3687–3695)。在一些实施方案中，待通过本文所述方法治疗的受试者是已经接受或正在接受抗癌疗法例如化学疗法、放射疗法、免疫疗法或手术的人癌症患者。在一些实施方案中，受试者已经接受过先前的免疫调节抗肿瘤剂。此类免疫调节剂的非限制性实例包括但不限于抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗OX40、抗CD137等。在一些实施方案中，受试者通过治疗显示疾病进展。在其他实施方案中，受试者对治疗有抗性(从头的或获得的)。在一些实施方案中，这样的受试者被证明患有晚期恶性肿瘤(例如，无法手术或为转移性的)。或者或另外，在一些实施方案中，受试者没有可用的标准治疗选择或不适合标准治疗选择，标准治疗选择是指临床环境中常用的用于治疗相应实体瘤的疗法。
在一些情况下，受试者可以是患有难治性疾病，例如难治性眼部疾病，例如葡萄膜黑素瘤的人患者。如本文所用，“难治性”是指对治疗没有应答或变得对治疗有抗性的肿瘤。在一些情况下，受试者可以是患有复发性疾病，例如复发性眼部疾病，例如葡萄膜黑素瘤的人患者。如本文所用，“复发性”或“复发”是指在治疗改善(例如，部分或完全反应)的一段时间后复发或进展的肿瘤。
在一些实施方案中，待通过本文公开的方法治疗的人患者满足下文实施例10和17中公开的一项或多项纳入和排除标准。例如，人患者可年满18岁或更大；具有组织学证实的不可切除的转移性或无法手术的癌症(例如，没有标准治疗选择)，预期寿命>3个月，有近期存档的肿瘤样品可用于生物标志物分析(例如，通过IHC评估存档物种的半乳糖凝集素9肿瘤组织表达水平)；患有可测量的疾病，根据RECIST v1.1，具有东部肿瘤协作组(EasternCooperative Oncology Group，ECOG)行为状态0-1或卡氏评分(Karnofsky score)>70；没有可用的护理标准选择，具有MSI-H(高微卫星不稳定性和MSS(微卫星稳定)；在晚期/转移性环境中接受过至少一种全身性治疗线；具有足够的血液学和终末器官功能(定义在下文实施例1中)；已完成对脑转移(如果有)的治疗(参见下文实施例1)；在过去一个月内没有活动性感染的证据且没有严重感染；自最后一剂抗癌治疗后在第一次抗Gal-9抗体施用前至少有四(4)周或5个半衰期(以较短者为准)；如果适用，继续使用双膦酸盐治疗(唑仑膦酸)或狄诺塞麦用于骨转移。
或者或另外，适合本文公开的治疗的受试者可不具有以下一项或多项：诊断患有未知原发灶的转移性癌症；任何活动性不受控制的出血，以及具有出血体质的任何患者(例如，活动性消化性溃疡病)；在抗半乳糖凝集素9抗体施用的4周或5个半衰期内接受任何其他研究性剂；在抗半乳糖凝集素9抗体的第一剂量4周内接受放射疗法，对有限区域的姑息性放射疗法除外，例如用于治疗骨痛或局灶性疼痛肿瘤块；有真菌性肿瘤块；有活动性临床重度感染>2级NCI-CTCAE 5.0版；有症状性或活动性脑转移；有≥CTCAE 3级毒性(参见实施例1中的详细信息和例外情况)；有第二恶性肿瘤病史(参见实施例1中的例外情况)；有重度或不受控制的全身性疾病、充血性心力衰竭的证据；有重度不愈合伤口、活动性溃疡或未治疗的骨折；有不受控制的胸腔积液、心包积液或腹水，需要反复引流程序；患有未通过手术和/或放射得到明确治疗的脊髓压迫症。软脑膜疾病，活动性或先前治疗过的；患有严重的血管疾病；患有活动性自身免疫性病症(参见实施例1中的例外情况)；需要全身性免疫抑制治疗；有对广泛的镇痛干预(口服和/或贴剂)无反应的肿瘤相关的疼痛(>3级)；尽管使用了双膦酸盐，但仍有不受控制的高钙血症；有任何归因于先前检查点抑制剂疗法(CIT)的免疫相关4级不良事件的历史；接受器官移植；和/或正在接受透析；Child-Pugh评分≥7；患有在接受至少一种先前的全身性治疗线时出现进展的转移性肝细胞癌；拒绝或不耐受索拉非尼；或已接受过被认为无效、不能耐受或不合适的标准疗法，或没有有效的标准疗法可用。
或者或另外，通过本文公开的任何方法治疗的患者可满足下文实施例10和实施例17中公开的一项或多项患者纳入和排除标准。
在一些情况下，受试者是具有相对于对照水平升高的半乳糖凝集素9水平的人患者。半乳糖凝集素9的水平可以是人患者中半乳糖凝集素9的血浆或血清水平。在其他实例中，半乳糖凝集素9的水平可以是细胞表面半乳糖凝集素9的水平，例如癌细胞上的半乳糖凝集素9的水平。在一个实例中，半乳糖凝集素9的水平可以是在患者来源的器官型肿瘤球状体(PDOT)中的癌细胞上表达的表面半乳糖凝集素9的水平，PDOT可以通过例如以下实施例中公开的方法来制备。对照水平可以指没有实体瘤的相同物种(例如，人)受试者的匹配样品中半乳糖凝集素9的水平。在一些实例中，对照水平代表健康受试者中半乳糖凝集素9的水平。
为了鉴定这样的受试者，可以从疑似患有实体瘤的受试者获得合适的生物样品，并且可以分析生物样品以使用常规方法例如ELISA或FACS确定其中所含的半乳糖凝集素9(例如，游离的、细胞表面表达的或全部)的水平。在一些实施方案中，例如，如本文所述制备类器官培养物，并用于评估受试者中的半乳糖凝集素9水平。从作为类器官制备过程的一部分获得的某些级分中得到的单细胞也适用于评估受试者中的半乳糖凝集素9水平。在一些情况下，用于测量游离形式或在细胞表面表达的半乳糖凝集素9水平的测定涉及使用特异性结合半乳糖凝集素9(例如，特异性结合人半乳糖凝集素9)的抗体。本领域已知的任何抗半乳糖凝集素9抗体可以在上述任何测定中试验适用性，然后以常规方式用于此类测定中。在一些实施方案中，本文所述的抗体(例如，G9.2-17抗体)可用于诸如测定中。在一些实施方案中，抗体描述于美国专利号10,344,091和WO2019/084553中，所述专利各自的相关公开内容为了本文引用的目的和主题以引用的方式并入。在一些实例中，抗半乳糖凝集素9抗体是Fab分子。如本文所公开的用于确定半乳糖凝集素9水平的测定方法也在本公开的范围内。
可以通过合适的途径全身性或局部地将有效量的本文所述的药物组合物施用至需要治疗的受试者(例如，人)。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体通过静脉内施用，例如作为推注或通过一段时间内的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、关节内、滑膜内、鞘内、瘤内、口服、吸入或局部途径施用。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体通过眼内施用来施用。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体局部地施用至眼。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体通过玻璃体内注射来施用。在一个实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体通过静脉内输注施用至受试者。用于液体制剂的市售雾化器，包括喷射雾化器和超声雾化器可用于施用。液体制剂可直接雾化，冻干粉剂可复溶后雾化。或者，如本文所述的抗体可以使用碳氟化合物制剂和定量吸入器雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。
如本文所用，“有效量”是指单独或与一种或多种其他活性剂联合地赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些实施方案中，治疗效果是在肿瘤微环境中降低的半乳糖凝集素9活性和/或量/表达、降低的Dectin-1信号传导、降低的TIM-3信号传导、降低的CD206信号传导或增加的抗肿瘤免疫应答。增加的抗肿瘤应答的非限制性实例包括增加的效应T细胞的激活水平，或TAM从M2表型至M1表型的转换。在一些情况下，抗肿瘤应答包括增加的ADCC应答。确定一定量的抗体是否达到治疗效果对于本领域技术人员来说是显而易见的。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的特定疾患、疾患的严重度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别和体重)、治疗的持续时间、同步治疗的性质(如果有的话)、具体的施用途径以及健康从业者知识和专业知识范围内的类似因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且仅需常规实验即可解决。通常优选使用个别组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
经验考虑(诸如半衰期)通常有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的抗体(诸如人源化抗体或全人抗体)在一些情况下用于延长抗体的半衰期和防止抗体受到宿主免疫系统的攻击。施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且通常但不一定基于靶标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，抗体的持续连续释放制剂可能是合适的。用于实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。
在一个实例中，如本文所述的抗体的剂量在已经给予一次或多次抗体施用的个体中凭经验确定。向个体给予递增剂量的拮抗剂。为了评估拮抗剂的疗效，可以遵循疾病/病症的指标。
在一些情况下，如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17)可以以约1mg/kg至约3mg/kg、约3mg/kg至约4mg/kg、约4mg/kg至约8mg/kg、约8mg/kg至约12mg/kg、约12mg/kg至约16mg/kg、约16mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约24mg/kg、约24mg/kg至约28mg/kg、或约28mg/kg至约32mg/kg(例如、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、或约32mg/kg)的剂量每两至四周(例如，每两周、三周或四周)一次施用至受试者。
在一些情况下，如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17)可以以合适的剂量例如约1至约32mg/kg施用至受试者。实例包括1mg/kg至3mg/kg、3mg/kg至4mg/kg、4mg/kg至8mg/kg、8mg/kg至12mg/kg、12mg/kg至16mg/kg、16mg/kg至20mg/kg、20mg/kg至24mg/kg、24mg/kg至28mg/kg或28mg/kg至32mg/kg(例如，1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg或32mg/kg)或这些范围内的任何增量剂量。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以2mg/kg施用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以4mg/kg施用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以8mg/kg施用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以12mg/kg施用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以16mg/kg施用。在一些情况下，可以以合适的间隔或周期向受试者施用多剂量的抗半乳糖凝集素9抗体，例如每两至四周(例如，每两、三或四周)一次。治疗可以持续合适的时期，例如长达3个月、长达6个月或长达12个月或长达24个月。
在具体实施方案中，间隔或周期为2周。在一些实施方案中，方案为每2周一次持续一个周期，每2周一次持续两个周期，每2周一次持续三个周期，每2周一次持续四个周期，或每2周一次持续超过四个周期。在一些实施方案中，治疗为每2周一次持续1至3个月，每2周一次持续3至6个月，每2周一次持续6至12个月，或每2周一次持续12至24个月或更长时间。
在具体实施方案中，间隔或周期为3周。在一些实施方案中，方案为每3周一次持续一个周期，每3周一次持续两个周期，每3周一次持续三个周期，每3周一次持续四个周期，或每3周一次持续超过四个周期。在一些实施方案中，治疗为每3周一次持续1至3个月，每3周一次持续3至6个月，每3周一次持续6至12个月，或每3周一次持续12至24个月或更长时间。
在具体实施方案中，间隔或周期为4周或更多周。在一些实施方案中，方案为每4周或更多周一次持续一个周期，每4周或更多周一次持续两个周期，每4周或更多周一次持续三个周期，每4周或更多周一次持续四个周期，或每4个或更多周一次持续超过四个周期。在一些实施方案中，治疗为每4周或更多周一次持续1至3个月，每4周或更多周一次持续3至6个月，每4周或更多周一次持续6至12个月，或每4周或更多周一次持续12至24个月或更长时间。在一些实施方案中，治疗是在不同时间的治疗的组合，例如2周、3周、4周或超过4周的组合。在一些实施方案中，根据患者对治疗的应答来调整治疗间隔。在一些实施方案中，根据患者对治疗的应答来调整剂量。在一些实施方案中，剂量在治疗间隔之间改变。在一些实施方案中，可以暂时停止治疗。
在一些实例中，抗半乳糖凝集素9抗体以约3mg/kg的剂量通过静脉内输注每两周一次施用至患有如本文所公开的靶标实体瘤(例如，眼部黑素瘤，例如葡萄膜黑素瘤)的人患者。在其他实例中，抗半乳糖凝集素9抗体以约15mg/kg的剂量通过静脉内输注每两周一次施用至患有靶标实体瘤的人患者。
在一个实施方案中，如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17)每2周施用一次。在一个实施方案中，如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17)每2周静脉内施用一次，例如持续3个月。
术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这部分取决于该值是如何测量或确定的，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在可接受的标准偏差内。或者，“约”可以表示给定值的最多±20％，优选最多±10％，更优选最多±5％，更优选最多±1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示在值的一个数量级内，优选在值的2倍内。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”是隐含的，并且在此上下文中表示在特定值可接受的误差范围内。
在一些情况下，如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17)可以以1mg/kg至3mg/kg、3mg/kg至4mg/kg、4mg/kg至8mg/kg、8mg/kg至12mg/kg、12mg/kg至16mg/kg、16mg/kg至20mg/kg、20mg/kg至24mg/kg、24mg/kg至28mg/kg或28mg/kg至32mg/kg(例如，1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg或32mg/kg)的剂量每两至四周(例如，每两周、三周或四周)一次施用至受试者。
在一些情况下，如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17)可以以合适的剂量例如约1至约32mg/kg施用至受试者。实例包括1mg/kg至3mg/kg、3mg/kg至4mg/kg、4mg/kg至8mg/kg、8mg/kg至12mg/kg、12mg/kg至16mg/kg、16mg/kg至20mg/kg、20mg/kg至24mg/kg、24mg/kg至28mg/kg或28mg/kg至32mg/kg(例如，1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg或32mg/kg)或这些范围内的任何增量剂量。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以2mg/kg施用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以4mg/kg施用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以8mg/kg施用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以12mg/kg施用。在一些实施方案中，半乳糖凝集素9抗体以16mg/kg施用。在一些情况下，可以以合适的间隔或周期向受试者施用多剂量的抗半乳糖凝集素9抗体，例如每两至四周(例如，每两、三或四周)一次。治疗可以持续合适的时期，例如长达3个月、长达6个月或长达12个月或长达24个月。
在具体实施方案中，间隔或周期为2周。在一些实施方案中，方案为每2周一次持续一个周期，每2周一次持续两个周期，每2周一次持续三个周期，每2周一次持续四个周期，或每2周一次持续超过四个周期。在一些实施方案中，治疗为每2周一次持续1至3个月，每2周一次持续3至6个月，每2周一次持续6至12个月，或每2周一次持续12至24个月或更长时间。
在具体实施方案中，间隔或周期为3周。在一些实施方案中，方案为每3周一次持续一个周期，每3周一次持续两个周期，每3周一次持续三个周期，每3周一次持续四个周期，或每3周一次持续超过四个周期。在一些实施方案中，治疗为每3周一次持续1至3个月，每3周一次持续3至6个月，每3周一次持续6至12个月，或每3周一次持续12至24个月或更长时间。
在具体实施方案中，间隔或周期为4周或更多周。在一些实施方案中，方案为每4周或更多周一次持续一个周期，每4周或更多周一次持续两个周期，每4周或更多周一次持续三个周期，每4周或更多周一次持续四个周期，或每4个或更多周一次持续超过四个周期。在一些实施方案中，治疗为每4周或更多周一次持续1至3个月，每4周或更多周一次持续3至6个月，每4周或更多周一次持续6至12个月，或每4周或更多周一次持续12至24个月或更长时间。在一些实施方案中，治疗是在不同时间的治疗的组合，例如2周、3周、4周或超过4周的组合。在一些实施方案中，根据患者对治疗的应答来调整治疗间隔。在一些实施方案中，根据患者对治疗的应答来调整剂量。在一些实施方案中，剂量在治疗间隔之间改变。在一些实施方案中，可以暂时停止治疗。
在一些实例中，抗半乳糖凝集素9抗体以约3mg/kg的剂量通过静脉内输注每两周一次施用至患有如本文所公开的靶标实体瘤(例如，眼部黑素瘤，例如葡萄膜黑素瘤)的人患者。在其他实例中，抗半乳糖凝集素9抗体以约15mg/kg的剂量通过静脉内输注每两周一次施用至患有靶标实体瘤的人患者。
在一些实施方案中，与治疗前或对照受试者中的水平相比，本公开的方法使抗肿瘤活性(例如，随着时间的推移减少细胞增殖、肿瘤生长、肿瘤体积和/或肿瘤负荷或负载，或减少转移性病灶的数量)增加至少约10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，通过比较受试者在施用药物组合物之前和之后的细胞增殖、肿瘤生长和/或肿瘤体积来测量减少。在一些实施方案中，治疗或改善受试者癌症的方法允许癌症的一种或多种症状改善至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，在药物组合物施用之前、期间和之后，在生物样品诸如血液、血清、血浆、尿液、腹膜液和/或来自组织或器官的活检中测量受试者中的癌细胞和/或生物标志物。在一些实施方案中，方法包括施用本发明的组合物以将受试者的肿瘤体积、大小、负载或负荷降低至不可检测的大小，或降低至治疗前受试者的肿瘤体积、大小、负载或负荷的小于约1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％。在其他实施方案中，方法包括施用本发明的组合物以将受试者的细胞增殖率或肿瘤生长率降低至不可检测的速率，或降低至治疗前速率的小于约1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％。在其他实施方案中，方法包括施用本发明的组合物以将受试者的转移性病灶的发展或转移性病灶的数量或大小降低至不可检测的速率，或降低至治疗前速率的小于约1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％。
如本文所用，术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用或施用至患有靶标疾病或病症、疾病/病症的症状或对疾病/病症的倾向的受试者，目的是治愈、愈合、缓解、缓和、改变、补救、减轻、改善或影响病症、疾病或病症的症状或对疾病或病症的倾向。
减轻靶标疾病/病症包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重度或延长生存期。减轻疾病或延长生存期并不一定需要治愈结果。如本文所用，“延迟”靶标疾病或病症的发展是指推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以是不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或延迟疾病发作的方法是与不使用该方法相比，降低在给定时间范围内出现疾病的一种或多种症状的可能性和/或减轻在给定的时间范围内症状的程度的方法。此类比较通常基于临床研究，使用的受试者数量足以得出具有统计学意义的结果。
疾病的“发展”或“进展”是指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域众所周知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法检测的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，靶标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。根据待治疗的疾病类型或疾病部位，可以使用医学领域普通技术人员已知的常规方法向受试者施用药物组合物。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体可以通过静脉内输注施用至受试者。
可注射组合物可包含各种载体，诸如植物油、二甲基乙酰胺(dimethylactamide)、二甲基甲酰胺(dimethyformamide)、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过滴注法施用，由此注入含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5％右旋糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其他合适的赋形剂。抗体的肌肉内制剂，例如合适的可溶性盐形式的无菌制剂，可以溶解在药物赋形剂(诸如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液)中并施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体用作治疗本文公开的靶标癌症的单一疗法，即，在使用抗半乳糖凝集素9抗体的疗法同时没有其他抗癌疗法。
在其他实施方案中，治疗方法还包括向受试者施用检查点分子(例如PD-1)的抑制剂。PD-1抑制剂的实例包括抗PD-1抗体，诸如派姆单抗、纳武单抗和西米普利单抗。此类检查点抑制剂可以与根据本公开的抗半乳糖凝集素9抗体同时或依序(以任何顺序)施用。在一些实施方案中，检查点分子是PD-L1。PD-L1抑制剂的实例包括抗PD-L1抗体，诸如德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗和阿替利珠单抗。在一些实施方案中，检查点分子是CTLA-4。CTLA-4抑制剂的一个实例是抗CTLA-4抗体伊匹单抗。在一些实施方案中，抑制剂靶向选自CD40、GITR、LAG-3、OX40、TIGIT和TIM-3的检查点分子。
在一些实施方案中，提供了将抗半乳糖凝集素9抗体与检查点抑制剂同时施用的方法。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体在检查点抑制剂之前或之后施用。在一些实施方案中，全身性地施用检查点抑制剂。在一些实施方案中，局部地施用检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂通过静脉内施用，例如作为推注或通过一段时间内的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、关节内、滑膜内、鞘内、瘤内、口服、吸入或局部途径施用。在一个实施方案中，检查点抑制剂通过静脉内输注施用至受试者。
可以根据RECIST或更新的RECIST 1.1标准评估对治疗(例如，如本文所述的实体瘤的治疗)的应答，如下文实施例1和Eisenhower等人,New response evaluationcriteria in solid tumours:Revised RECIST guideline(1.1版)；European Journal OfCancer 45(2009)228–247(其内容以引用的方式整体并入本文)所述。
在一些实施方案中，例如，与治疗开始前的基线水平相比或与未接受治疗的对照组相比，治疗可以改善总体应答(例如，在3个月、6个月或12个月，或更晚的时间)。在一些实施方案中，治疗可导致完全应答、部分应答或稳定疾病(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。这种应答可以在一定时间段内是暂时的，或是永久的。在一些实施方案中，例如，与未接受治疗的对照组相比，治疗可以提高完全应答、部分应答或稳定疾病的可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。这种应答可以在一定时间段内是暂时的，或是永久的。在一些实施方案中，例如，与未接受治疗的对照组相比，治疗可以导致进展性疾病减轻或减弱(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。这种减弱可以是暂时的或永久的。
部分应答是与治疗开始前的基线水平相比，应答治疗的肿瘤大小或体内癌症程度(即肿瘤负荷)的减小。例如，根据RECIST应答标准，部分应答被定义为，以基线总直径为参考，靶标病灶的直径总和减少至少30％。进展性疾病是一种正在增长、扩散或恶化的疾病。例如，根据RECIST应答标准，进展性疾病包括其中观察到靶标病灶直径总和至少增加20％并且总和还必须显示至少5mm的绝对增加的疾病。此外，一个或多个新病灶的出现也被认为是进展。与治疗开始前的基线水平相比，在程度或严重度上既没有减少也没有增加的肿瘤被认为是稳定的疾病。例如，根据RECIST应答标准，以研究时的最小总直径作为参考，当既没有足够的收缩满足部分应答的条件，也没有足够的增加满足进展性疾病的条件时，出现稳定的疾病。
因此，在一些实施方案中，相对于治疗开始前的基线肿瘤大小，治疗可以永久地或在最短时间段内导致总体肿瘤大小的减小、肿瘤大小的维持(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。在一些实施方案中，例如，与未接受治疗的对照组相比，治疗可以永久地或在最短时间段内导致总体肿瘤大小的减小或肿瘤大小的维持的更大可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。肿瘤大小(例如肿瘤的直径)可以根据本领域已知的方法测量，包括根据特定的测量方案，例如如上文参考的Eisenhower等人所述的，结合各种软件工具从CT和MRI图像进行测量。因此，在一些实施方案中，在定期安排的再分期扫描(例如，有造影剂的CT、有造影剂的MRI、PET-CT(诊断性CT)和/或X射线)中测量肿瘤大小。在一些实施方案中，肿瘤大小的减小、肿瘤大小的维持是指靶标病灶的大小。在一些实施方案中，肿瘤大小的减小、肿瘤大小的维持是指非靶标病灶的大小。根据RECIST 1.1，当基线时存在超过一个可测量的病灶时，代表所有受累器官的最多总共五个病灶(和每个器官最多两个病灶)的所有病灶都应被鉴定为靶标病灶。包括病理性淋巴结在内的所有其他病灶(或疾病部位)都应被鉴定为非靶标病灶。
在一些实施方案中，与治疗开始前的基线水平相比，治疗可导致肿瘤负荷的减少或肿瘤负荷的维持(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。肿瘤负荷的减少可以在一定时间段内是暂时的，或是永久的。在一些实施方案中，例如，与未接受治疗的对照组相比，治疗可以永久地或在最短时间段内导致肿瘤负荷的减少或肿瘤负荷的维持的更大可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。如本文所用，肿瘤负荷是指受试者体内肿瘤的癌数量、大小或体积，算上所有疾病部位。可以使用本领域已知的方法测量肿瘤负荷，这些方法包括但不限于FDG正电子发射断层扫描(FDG-PET)、磁共振成像(MRI)和光学成像，包括生物发光成像(BLI)和荧光成像(FLI)。
在一些实施方案中，与未接受治疗的对照组相比，治疗可以导致直到疾病进展的时间或无进展生存期的增加(例如，如在治疗开始后3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。无进展生存期可以是永久的或是在一定时间段内的无进展生存期。在一些实施方案中，与未接受治疗的对照组相比，治疗可以导致无进展生存期的更大可能性(永久无进展生存期或在一定时间段内的无进展生存期，例如3、6或12个月，或例如，如在治疗开始后3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。无进展生存期(PFS)被定义为临床试验中从随机分配的时间例如从治疗开始到疾病进展或任何原因的死亡的时间。在一些实施方案中，治疗可以导致更久的生存或更大的生存可能性(例如在某个时间，例如在6或12个月)。
对治疗(例如，如本文所述的实体瘤的治疗)的应答可以根据iRECIST标准进行评估，如Seymour等人,iRECIST:guidelines for response criteria for use in trials；The Lancet,第18卷，2017年3月(其内容以引用的方式整体并入本文)中所述。iRECIST被开发用于特别地在癌症免疫治疗试验中使用修改的RECIST1.1标准，以确保一致的设计和数据收集，并可用作实体瘤测量的标准方法的指南，以及用于在使用免疫疗法的试验中使用的肿瘤大小客观变化的定义。iRECIST基于RECIST 1.1。使用iRECIST指定的应答具有前缀“i”(即免疫)，例如，“免疫”完全应答(iCR)或部分应答(iPR)，以及未确认的进展性疾病(iUPD)或确认的进展性疾病(iCPD)或稳定疾病(iSD)，以将它们与使用RECIST 1.1指定的应答区分开来，所有这些都在Seymour等人中定义。
因此，在一些实施方案中，与治疗开始前的疾病基线水平相比，治疗可以导致“免疫”完全应答(iCR)、部分应答(iPR)或稳定疾病(iSD)(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。“免疫”应答(例如iCR、iPR或iSD)的减少可以在一定时间段内是暂时的，或是永久的。在一些实施方案中，例如，与未接受治疗的对照组相比，治疗可以提高完全应答(iCR)、部分应答(iPR)或稳定疾病(iSD)的可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。在一些实施方案中，例如，与治疗开始前的基线相比，治疗可以导致未确认的进展性疾病(iUPD)或确认的进展性疾病(iCPD)的总体减少(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。iUPD或iCPD的减少可以在一定时间段内是暂时的，或是永久的。在一些实施方案中，例如，与未接受治疗的对照组相比，治疗可以导致未确认的进展性疾病(iUPD)或确认的进展性疾病(iCPD)的总体减少的更大可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。在一些实施方案中，与未接受治疗的对照组相比或与治疗开始前的基线相比，治疗可以导致根据iRECIST标准的新病灶的总体数量减少(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。病灶的减少可以在一定时间段内是暂时的，或是永久的。
对治疗的应答也可以通过血液和肿瘤中的免疫表型、细胞因子谱(血清)、血液(血清或血浆)中的可溶性半乳糖凝集素9水平、半乳糖凝集素9肿瘤组织表达水平和表达模式(通过免疫组织化学)(肿瘤、基质、免疫细胞)、肿瘤突变负荷(TMB)、PDL-1表达(例如，通过免疫组织化学)、错配修复状态或与疾病相关的肿瘤标志物中的一者或多者来表征(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。此类肿瘤标志物的非限制性实例包括Ca15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白。这些参数可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。
在一些实施方案中，治疗可以导致血液或肿瘤中免疫细胞和免疫细胞标志物水平的变化，例如，可导致免疫激活。可以使用本领域已知的方法(诸如多重流式细胞术和多重免疫组织化学)在患者血液和组织样品中测量此类变化。例如，一组表型和功能性PBMC免疫标志物可以在治疗开始之前的基线时和治疗期间的不同时间点进行评估。表2列出了可用于这些评估方法的标志物的非限制性实例。流式细胞术(FC)是一种分析细胞表型和功能的快速且信息量丰富的选择技术方法，并且在免疫表型监测中已获得突出地位。它允许表征复杂混合物(诸如血液)中的许多细胞亚群，包括稀有亚群，并代表了一种获取大量数据的快速方法。FC的优点是高速度、灵敏度和特异性。标准化的抗体小组和程序可用于分析和分类免疫细胞亚型。Multiplex IHC是一种强大的调查工具，它提供客观的定量数据，描述肿瘤免疫环境中的免疫亚群数量和位置，并允许在单个组织切片上评估多个标志物。计算机算法可用于从患者活检的整个幻灯片(slide)图像中量化基于IHC的生物标志物含量，将显色IHC方法和染色与数字病理学方法相结合。
表2.PBMC分型标志物
因此，在一些实施方案中，治疗导致免疫激活标志物(诸如表2中的那些)的调节，例如治疗导致以下一项或多项：(1)血浆或肿瘤组织中更多CD8细胞的增加，(2)血浆或肿瘤组织中T调节性细胞(Treg)的减少，(3)血浆或肿瘤组织中M1巨噬细胞的增加，和(4)血浆或肿瘤组织中MDSC的减少，以及(5)血浆或肿瘤组织中M2巨噬细胞的减少(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。在一些实施方案中，使用上述技术评估的或本领域已知的标志物选自CD4、CD8、CD14、CD11b/c和CD25。这些参数可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。
在一些实施方案中，如本文所述的治疗导致促炎和抗炎细胞因子的变化。在一些实施方案中，如本文所述的治疗导致以下一项或多项：(1)血浆或肿瘤组织中IFNγ水平的升高；(2)血浆或肿瘤组织中TNFα水平的升高；(3)血浆或肿瘤组织中IL-10水平的降低(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。这些参数可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。
在一些实施方案中，可在剂量前1次肿瘤活检和在可行时间进行的重复活检之间评估细胞因子或免疫细胞的变化。在一些实施方案中，可在两次重复活检之间评估细胞因子或免疫细胞的变化。在一些实施方案中，治疗导致血液(血清或血浆)中的可溶性半乳糖凝集素9水平或半乳糖凝集素9肿瘤组织表达水平和表达模式(通过免疫组织化学)(肿瘤、基质、免疫细胞)中的一者或多者的改变(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。在一些实施方案中，治疗导致血液(血清或血浆)中的可溶性半乳糖凝集素9水平或半乳糖凝集素9肿瘤组织表达水平和表达模式(通过免疫组织化学)(肿瘤、基质、免疫细胞)中的一者或多者的降低(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。这些半乳糖凝集素9水平可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。
在一些实施方案中，治疗导致PDL-1表达的变化，例如，如通过免疫组织化学评估的。在一些实施方案中，治疗导致与疾病相关的一种或多种肿瘤标志物的变化(增加或减少)(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。此类肿瘤标志物的非限制性实例包括Ca15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白。这些参数可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。
在一些实施方案中，与治疗开始前的基线相比或与未接受治疗的对照组相比，治疗导致改善的生活质量和症状控制(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。在一些实施方案中，可以在本文实施例1中描述的ECOG量表上测量改善。
在任何上述实施方案中，治疗可包括单独地或与检查点抑制剂疗法例如抗PD-1抗体联合地施用本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗受试者(包括人受试者)的眼部黑素瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ IDNO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，本公开提供了用于改善受试者(包括人受试者)中的总体应答(例如，根据RECIST 1.1.标准)(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。RECIST 1.1.标准可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。在一些实施方案中，本公开提供了用于实现完全应答、部分应答或稳定疾病(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。这些应答可以在一定时间段内是暂时的或是永久的，并且可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。
在一些实施方案中，例如，与未接受治疗的对照组相比，所述方法可以提高完全应答、部分应答或稳定疾病的可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的；并且是暂时的或永久的)。在一些实施方案中，本公开提供了例如与未接受治疗的对照组相比或与治疗开始前的基线相比，减弱疾病进展或减少进展性疾病(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。减弱或减少可以在一定时间段内是暂时的，或是永久的。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本公开提供了相对于治疗开始前受试者中的基线肿瘤大小，永久地或在最短时间段内减小或维持受试者(包括人受试者)中的肿瘤大小(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，本公开提供了例如与未接受治疗的对照组相比，永久地或在最短时间段内提高减小或维持受试者(包括人受试者)中的肿瘤大小的可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法。在一些实施方案中，本公开提供了与治疗开始前的基线水平相比或与未接受治疗的对照组相比，降低或维持受试者(包括人受试者)中的肿瘤负荷(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，本公开提供了例如与未接受治疗的对照组相比，增加降低或维持肿瘤负荷的可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。因此，在一些实施方案中，在定期安排的再分期扫描(例如，有造影剂的CT、有造影剂的MRI、PET-CT(诊断性CT)和/或X射线)中测量肿瘤大小和/或负荷。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，本公开提供了与未接受治疗的对照组相比，增加受试者(包括人受试者)的直到疾病进展的时间或增加无进展生存期(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。所述方法可以导致永久的无进展生存期或在一定时间段内的无进展生存期。在一些实施方案中，本公开提供了与未接受治疗的对照组相比，增加无进展生存期(永久的无进展生存期或在一定时间段内的无进展生存期)的可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本公开提供了用于改善受试者(包括人受试者)中的总体应答(iOR)(例如，根据iRECIST标准)(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，本公开提供了用于实现“免疫”完全应答(iCR)、部分应答(iPR)或稳定疾病(iSD)(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，方法可以提高“免疫”完全应答(iCR)、部分应答(iPR)或稳定疾病(iSD)的可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。在一些实施方案中，本公开提供了用于减缓疾病进展或减少进展性疾病例如减少未确认的进展性疾病(iUPD)或减少确认的进展性疾病(iCPD)(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。上述那些iRECIST标准中的任何一个都可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较，并且应答可以在一定时间段内是暂时的或是永久的。在一些实施方案中，本公开提供了例如与未接受治疗的对照组相比，增加受试者(包括人受试者)的未确认的进展性疾病(iUPD)或确认的进展性疾病(iCPD)的总体减少的可能性(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，本公开提供了用于根据iRECIST标准减少受试者(包括人受试者)中的新病灶数量(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。病灶数量的减少可以是相对于治疗开始前的基线水平，或可以是相对于未接受治疗的对照组，并且减少可以在一定时间段内是暂时的，或是永久的。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本公开提供了调节受试者中的免疫应答的方法。如本文所用，术语“免疫应答”包括受免疫细胞活性调节例如T细胞激活影响的T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。在本公开的一个实施方案中，免疫应答是T细胞介导的。如本文所用，术语“调节”意指改变或变化，并且包括上调和下调。例如，“调节免疫应答”意指改变或变化一种或多种免疫应答参数的状态。T细胞介导的免疫应答的示例性参数包括T细胞的水平(例如，效应T细胞的增加或减少)和T细胞激活的水平(例如，某些细胞因子产生的增加或减少)。B细胞介导的免疫应答的示例性参数包括B细胞水平的增加、B细胞激活和B细胞介导的抗体产生。
当免疫应答受到调节时，一些免疫应答参数可能会降低，而另一些可能会增加。例如，在一些情况下，调节免疫应答导致一种或多种免疫应答参数的增加(或上调)和一种或多种其他免疫应答参数的减少(或下调)，结果是免疫应答的总体增加，例如炎症免疫应答的总体增加。在另一个实例中，调节免疫应答导致一种或多种免疫应答参数的增加(或上调)和一种或多种其他免疫应答参数的减少(或下调)，结果是免疫应答的总体降低，例如炎症应答的总体降低。在一些实施方案中，总体免疫应答的增加即总体炎症免疫应答的增加由肿瘤重量、肿瘤大小或肿瘤负荷的减少或本文所述的任何RECIST或iRECIST标准确定。在一些实施方案中，总体免疫应答的增加由一种或多种促炎细胞因子(例如，包括两种或更多种、三种或更多种等或大多数促炎细胞因子)的增加的水平(一种或多种、两种或更多种等或大多数抗炎和/或免疫抑制细胞因子和/或一种或多种最强效的抗炎或免疫抑制细胞因子减少或保持不变)确定。在一些实施方案中，总体免疫应答的增加由一种或多种最强效的促炎细胞因子的增加的水平(一种或多种抗炎和/或免疫抑制细胞因子包括一种或多种最强效的细胞因子减少或保持不变)确定。在一些实施方案中，总体免疫应答的增加由一种或多种包括大多数免疫抑制和/或抗炎细胞因子的降低的水平(一种或多种或大多数促炎细胞因子包括例如最强效的促炎细胞因子的水平增加或保持不变)确定。在一些实施方案中，总体免疫应答的增加由一种或多种最强效的抗炎和/或免疫抑制细胞因子的增加的水平(一种或多种或大多数促炎细胞因子包括例如最强效的促炎细胞因子增加或保持不变)确定。在一些实施方案中，总体免疫应答的增加由上述任一项的组合确定。此外，一种类型的免疫应答参数的增加(或上调)可以导致另一种类型的免疫应答参数的相应减少(或下调)。例如，某些促炎细胞因子的产生的增加可以导致某些抗炎和/或免疫抑制细胞因子的下调，反之亦然。
在一些实施方案中，本公开提供了用于调节受试者(包括人受试者)中的免疫应答(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，本公开提供了例如与治疗开始前的基线水平相比或与未接受治疗的对照组相比，调节受试者(包括人受试者)的血液或肿瘤中免疫细胞和免疫细胞标志物(包括但不限于本文表2中描述的那些)的水平的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，调节的总体结果是促炎免疫细胞的上调和/或免疫抑制性免疫细胞的下调。在一些实施方案中，本公开提供了用于调节免疫细胞的水平的方法，其中所述调节包括以下一项或多项：(1)增加血浆或肿瘤组织中的CD8细胞，(2)减少血浆或肿瘤组织中的Treg，(3)增加血浆或肿瘤组织中的M1巨噬细胞和(4)减少血浆或肿瘤组织中的MDSC，以及(5)减少血浆或肿瘤组织中的M2巨噬细胞，并且其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，评估此类免疫细胞的水平的标志物包括但不限于CD4、CD8、CD14、CD11b/c和CD25。在一些实施方案中，本公开提供了例如与治疗开始前的基线水平相比或与未接受治疗的对照组相比，调节受试者(包括人受试者)的血液或肿瘤中促炎和免疫抑制细胞因子的水平(例如，如在3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，调节的总体结果是促炎细胞因子的上调和/或免疫抑制细胞因子的下调。
在一些实施方案中，本公开提供了用于调节细胞因子细胞的水平的方法，其中所述调节包括以下一项或多项：(1)增加血浆或肿瘤组织中的IFNγ水平；(2)增加血浆或肿瘤组织中的TNFα水平；(3)降低血浆或肿瘤组织中的IL-10水平。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本公开提供了改变血液(血清或血浆)中的可溶性半乳糖凝集素9水平或半乳糖凝集素9肿瘤组织表达水平和表达模式(通过免疫组织化学)(肿瘤、基质、免疫细胞)中的一者或多者(例如，如在2周、4周、1个月、3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在所述方法的一些实施方案中，血液(血清或血浆)中的可溶性半乳糖凝集素9水平或半乳糖凝集素9肿瘤组织表达水平和表达模式(通过免疫组织化学)(肿瘤、基质、免疫细胞)中的一者或多者保持不变。在一些实施方案中，本文提供的方法降低血液(血清或血浆)中的可溶性半乳糖凝集素9水平或半乳糖凝集素9肿瘤组织表达水平和表达模式(通过免疫组织化学)(肿瘤、基质、免疫细胞)中的一者或多者(例如，如在2周、4周、1个月、3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)。半乳糖凝集素9水平可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。
在一些实施方案中，治疗导致PDL-1表达的改变，例如通过免疫组织化学。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本公开提供用于改变PD-L1表达(例如，如通过免疫组织化学评估的)(例如，如在2周、4周、1个月、3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在所述方法的一些实施方案中，PD-L1表达(例如，如通过免疫组织化学评估的)保持不变。PD-L1水平可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。在一些实施方案中，本文提供的方法降低PDL-1表达，例如，如通过免疫组织化学评估的。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。
在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约30mg/kg。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以0.2mg/kg至32mg/kg的剂量、任选地以1mg/kg至32mg/kg的剂量施用至人受试者。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以0.2mg/kg至16mg/kg的剂量施用至人受试者。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以0.2mg/kg、0.63mg/kg、2mg/kg、6.3mg/kg、10mg/kg、16mg/kg或32mg/kg的剂量施用至人受试者。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以0.5mg/kg至32mg/kg或2mg/kg至16mg/kg的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注或眼内例如玻璃体内注射。在一些实施方案中，抗体每周施用一次，例如通过静脉内输注或眼内例如玻璃体内注射。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约0.1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg和5mg/kg，例如用于玻璃体内注射。在一些实施方案中，抗体每月施用一次，例如通过静脉内输注或眼内例如玻璃体内注射。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本公开提供用于改变与疾病相关的一种或多种肿瘤标志物(增加或减少)(例如，如在2周、4周、1个月、3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在所述方法的一些实施方案中，与疾病相关的一种或多种肿瘤标志物(增加或减少)保持不变。此类肿瘤标志物的非限制性实例包括Ca15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白。肿瘤标志物的水平可以与治疗开始前的基线水平进行比较，或可以与未接受治疗的对照组进行比较。在一些实施方案中，本文提供的方法减少与疾病相关的一种或多种肿瘤标志物的发生。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本公开提供了用于改善受试者(包括人受试者)的生活质量和/或改善症状控制(例如，如在1个月、3个月、6个月或12个月或在更晚的时间测量的)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。与治疗开始前的基线相比或与未接受治疗的对照组相比，生活质量和症状控制得到改善。生活质量的改善可以在一定时间段内是暂时的，或是永久的。在一些实施方案中，可以在ECOG量表上测量改善。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，将本文所述的抗体(例如，G9.2-17)以足以使半乳糖凝集素9(和/或Dectin-1或TIM-3或CD206)在肿瘤中的免疫抑制性免疫细胞中的活性抑制至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)(在体内)的量施用至需要治疗的受试者。在其他实施方案中，以使半乳糖凝集素9(和/或Dectin-1或TIM-3或CD206)在肿瘤中的免疫抑制性免疫细胞中的活性水平降低至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)(与治疗前或对照受试者中的水平相比)的有效量施用本文所述的抗体(例如，G9.2-17)。在一些实施方案中，将本文所述的抗体(例如，G9.2-17)以足以使TAM中的M1样编程促进至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)(在体内)(与治疗前或对照受试者中的水平相比)的量施用至需要治疗的受试者。
根据待治疗的疾病类型或疾病部位，可以使用医学领域普通技术人员已知的常规方法向受试者施用药物组合物。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体可以通过静脉内输注施用至受试者。
在一些实施方案中，本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体用作治疗本文公开的靶标癌症的单一疗法，即，在使用抗半乳糖凝集素9抗体的疗法同时没有其他抗癌疗法。
D.联合疗法
在其他实施方案中，治疗方法还包括向受试者施用检查点分子(例如PD-1)的抑制剂。PD-1抑制剂的实例包括抗PD-1抗体，诸如派姆单抗、纳武单抗、替雷利珠单抗和西米普利单抗。此类检查点抑制剂可以与根据本公开的抗半乳糖凝集素9抗体同时或依序(以任何顺序)施用。在一些实施方案中，检查点分子是PD-L1。PD-L1抑制剂的实例包括抗PD-L1抗体，诸如德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗和阿替利珠单抗。在一些实施方案中，检查点分子是CTLA-4。CTLA-4抑制剂的一个实例是抗CTLA-4抗体伊匹单抗。在一些实施方案中，抑制剂靶向选自CD40、GITR、LAG-3、OX40、TIGIT和TIM-3的检查点分子。
在一些实施方案中，相对于单独包含检查点分子抑制剂(例如抗PD1，例如nivilumab)的方案，抗半乳糖凝集素9抗体改善总体应答，例如在3个月时。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是PD-1是纳武单抗，并且本文所述的方法包括每两周一次以240mg的剂量向受试者静脉内施用纳武单抗。
在一些实施方案中，结合PD-1的抗体使用固定剂量施用。在一些实施方案中，结合PD-1的抗体是纳武单抗，其每4周一次以480mg的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，结合PD-1的抗体是派姆单抗，其每3周一次以200mg的剂量施用。在一些实施方案中，结合PD-1的抗体是西米普利单抗。在一些实施方案中，结合PD-1的抗体是西米普利单抗。在一些实施方案中，本文所述的方法包括每3周一次以350mg的剂量向受试者静脉内施用西米普利单抗。在一些实施方案中，结合PD-1的抗体是替雷利珠单抗。在一些实施方案中，本文所述的方法包括每3周一次以200mg的剂量向受试者静脉内施用替雷利珠单抗。
在一些实施方案中，结合PD-L1的抗体使用固定剂量施用。在一些实施方案中，结合PD-L1的抗体是阿替利珠单抗。在一些实施方案中，本文所述的方法包括每3周一次以1200mg的剂量向受试者静脉内施用阿替利珠单抗。在一些实施方案中，结合PD-L1的抗体是阿维鲁单抗。在一些实施方案中，本文所述的方法包括每2周以10mg/kg的剂量向受试者静脉内施用阿维鲁单抗。在一些实施方案中，结合PD-1的抗体是德瓦鲁单抗。在一些实施方案中，本文所述的方法包括每4周以1500mg的剂量向受试者静脉内施用德瓦鲁单抗。
在具体实例中，本文公开的任何方法包括(i)向患有如本文所公开的靶标实体瘤(例如，眼部黑素瘤，例如葡萄膜黑素瘤)的人患者以约1至约32mg/kg(例如，约3mg/kg或约15mg/kg)的剂量每两周一次施用本文公开的任何抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17或具有SEQ ID NO:19的重链和SEQ ID NO:5的轻链的抗体)；以及(ii)向人患者施用有效量的抗PD-1抗体(例如，纳武单抗、派姆单抗、替雷利珠单抗或西米普利单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗和阿替利珠单抗)。在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区3(CDR3)和/或包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ IDNO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:7的重链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:19的重链。在一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO:15的轻链。在一些实施方案中，抗体是G9.2-17 IgG4。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至受试者，例如，该剂量可选自2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、12mg/kg和16mg/kg。在一些实施方案中，抗体每两周施用一次，例如通过静脉内输注。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体。在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。
当使用纳武单抗时，合适的给药方案可以是每4周一次约480mg。当使用派姆单抗时，合适的给药方案可以是每3周一次约200mg。当使用西米普利单抗时，合适的给药方案可以是每三周一次静脉内约350mg。当使用替雷利珠单抗时，合适的给药方案可以是每3周一次静脉内约200mg。或者，替雷利珠单抗可每6周一次以约400mg使用。在一些情况下，替雷利珠单抗可每4周一次以约300mg使用。在一些实施方案中，使用抗PD-L1抗体代替抗PD-1抗体。当使用阿替利珠单抗时，合适的给药方案可以是每3周一次静脉内约1200mg。当使用阿维鲁单抗时，合适的给药方案可以是每2周静脉内约10mg/kg。当使用德瓦鲁单抗时，合适的给药方案可以是每4周静脉内约1500mg。
不受理论束缚，据认为，通过抑制Dectin-1，抗半乳糖凝集素9抗体可重编程针对肿瘤细胞的免疫应答，方式为例如抑制浸润到肿瘤微环境的γδT细胞的活性，和/或通过例如激活CD4+和/或CD8+T细胞来增强针对肿瘤细胞的免疫监视。因此，预期抗半乳糖凝集素9抗体和免疫调节剂(诸如本文所述的那些)的联合使用将显著增强抗肿瘤疗效。
在一些实施方案中，本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体与另一种疗法联合施用。实例包括但不限于黑素瘤，包括近距离放射治疗、90钇微球内辐射、HDAC抑制剂(例如，伏立诺他(verinostat))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，恩曲替尼(entrectinib)、司美替尼(selumetinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、克唑替尼(crizotinib)等)、PAC-1(半胱天冬酶原激活化合物)或玻璃体内阿瓦斯汀(intravitral avastin)。在一些实施方案中，另外的疗法包括基于细胞的疗法(例如，TIL、CAR-T或树突状细胞的过继性T细胞转移)、癌症疫苗、自体肿瘤RNA疗法、隔离肝脏灌注或经皮肝脏灌注(PHP)。
本文所述的任何抗半乳糖凝集素9抗体可与其他类型的眼部黑素瘤疗法(诸如化学疗法、手术、放射、基因疗法)结合使用，或与其他类型的自身免疫性疾病疗法(诸如免疫抑制药物、激素替代疗法、输血、抗炎药和/或止痛药)等结合使用。此类疗法可以与根据本公开的免疫疗法同时或依序(以任何顺序)施用。
在一些实施方案中，本文提供了方法，其中抗半乳糖凝集素9抗体(例如抗体9.2-17或9.1-8mut13)与其他免疫调节治疗例如像检查点分子(例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG3、TIM3或A2aR)的抑制剂、共刺激受体(例如，DX40、GITR、CD137、CD40、CD27和ICOS)的激活剂和/或先天免疫细胞靶标(例如，KIR、NKG2A、CD96、TLR和IDO)的抑制剂相联合。
在一些实施方案中，提供了方法，其中抗半乳糖凝集素9抗体还可以与化学治疗剂共同施用，所述化学治疗剂包括烷化剂、蒽环类、细胞骨架破坏剂(紫杉烷)、埃博霉素、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物和前体类似物、肽抗生素、基于铂的剂、类维生素A、长春花生物碱及它们的衍生物。非限制性实例包括：(i)抗血管生成剂(例如，TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白1、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP1和TIMP2)、催乳素(16-Kd片段)、血管抑制素(纤溶酶原38-Kd片段)、内皮抑素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FLT-1受体、胎盘增殖蛋白相关蛋白，以及Carmeliet和Jain(2000)列出的那些)；(ii)VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，诸如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的抑制剂及它们的任何组合；以及(iii)化学治疗性化合物，例如像吉西他滨、达卡巴嗪、嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)、嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物诸如长春花生物碱(长春花碱、长春新碱和长春瑞滨)等、微管破坏剂诸如紫杉烷(紫杉醇、多西紫杉醇)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃博霉素和诺维滨、表鬼臼毒素(依托泊苷和替尼泊苷)、DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(cytoxan)、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲三聚氰胺奥沙利铂、异磷酰胺、美法仑、美氯霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、泰素、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素，诸如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其全身性地代谢L-天冬酰胺并除去没有能力合成其自身天冬酰胺的细胞)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，诸如氮芥(氮芥、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链佐星)、莠去津-达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢药，诸如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(诸如组织型纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗转移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如，TNP-470、染料木黄酮、贝伐珠单抗)和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、依尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、米托蒽醌、托泊替康和伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和半胱天冬酶激活剂；和染色质干扰物。
其他合适的联合疗法包括手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法(例如，RD、SERM和/或芳香酶抑制剂)、免疫疗法、补充和整体医学或它们的组合。实例包括但不限于阿贝西利(Abemaciclib)、Ado-曲妥珠单抗美坦辛(Ado-Trastuzumab Emtansine)Afinitor(依维莫司)、Afinitor Disperz(依维莫司)、阿培利司(Alpelisib)、阿那曲唑(Anastrozole)、阿可达(Aredia)(帕米膦酸二钠)、安美达锭(Arimidex)(阿那曲唑)、阿诺新(Aromasin)(依西美坦(Exemestane))、阿替利珠单抗、卡培他滨、环磷酰胺、多西紫杉醇、盐酸多柔比星、Ellence(盐酸表柔比星)、Enhertu(Fam-Trastuzumab Deruxtecan-nxki)、盐酸表柔比星、甲磺酸艾日布林、依维莫司、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、Fam-Trastuzumab Deruxtecan-nxki、法乐通(Fareston)(托瑞米芬(Toremifene))、Faslodex(氟维司群(Fulvestrant))、Femara(来曲唑(Letrozole))、氟尿嘧啶注射液、氟维司群、盐酸吉西他滨、健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Herceptin Hylecta(曲妥珠单抗和透明质酸酶-oysk)、赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗)、Ibrance(帕博西尼(Palbociclib))、伊沙匹隆(Ixabepilone)、Ixempra(伊沙匹隆)、Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗美坦辛)、Kisqali(瑞博西尼(Ribociclib))、二甲苯磺酸拉帕替尼、来曲唑(Letrozole)、Lynparza(奥拉帕尼)、醋酸甲地孕酮、甲氨蝶呤、马来酸来那替尼、Nerlynx(马来酸来那替尼)、奥拉帕尼、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、帕博西尼、帕米膦酸二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、Piqray(阿培利司)、瑞博西尼(Ribociclib)、甲苯磺酸他拉唑帕尼(Talazoparib Tosylate)、Talzenna(甲苯磺酸他拉唑帕尼)、柠檬酸他莫昔芬、泰素(紫杉醇)、泰索帝(多西紫杉醇)、Tecentriq(阿替利珠单抗)、噻替派、托瑞米芬、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗和透明质酸酶-oysk、Trexall(甲氨蝶呤)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Verzenio(阿贝西利)、硫酸长春碱、希罗达(Xeloda)(卡培他滨)和诺雷德(Zoladex)(醋酸戈舍瑞林)。在一些实例中，抗癌疗法涉及抗半乳糖凝集素9抗体。
在一些实施方案中，待与抗半乳糖凝集素9抗体共同使用的治疗剂可以是一种或多种受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂。实例包括但不限于达沙替尼、伊马替尼、尼罗替尼、普纳替尼和舒尼替尼。此类RTK抑制剂可以进一步与另外的治疗剂例如贝伐珠单抗、伊匹单抗或本领域已知或本文提供的其他检查点抑制剂组合。参见，例如，Sabbah等人,Cancers(2021),13:1685。
在一些实施方案中，提供了将抗半乳糖凝集素9抗体与检查点抑制剂同时施用的方法。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体在检查点抑制剂之前或之后施用。在一些实施方案中，全身性地施用检查点抑制剂。在一些实施方案中，局部地施用检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂通过静脉内施用，例如作为推注或通过一段时间内的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、关节内、滑膜内、鞘内、瘤内、口服、吸入或局部途径施用。在一个实施方案中，检查点抑制剂通过静脉内输注施用至受试者。
在本文所述的任何方法实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体可以(单独或与抗PD1抗体联合)每2周施用一次持续一个周期，每2周施用一次持续两个周期，每2周施用一次持续三个周期，每2周施用一次持续四个周期，或每2周施用一次持续超过四个周期。在一些实施方案中，治疗为1至3个月、3至6个月、6至12个月、12至24个月或更长。在一些实施方案中，治疗为每2周一次持续1至3个月，每2周一次持续3至6个月，每2周一次持续6至12个月，或每2周一次持续12至24个月或更长时间。
可以监测接受单独的或与如本文所公开的检查点抑制剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)或一种或多种化学治疗剂联合的本文公开的任何抗半乳糖凝集素9抗体(例如，G9.2-17)的治疗的受试者的不良作用(例如，重度不良作用)的发生。在下文实施例1中提供了要监测的示例性不良作用。如果观察到不良作用的发生，可以改变该受试者的治疗条件。例如，可以减少抗半乳糖凝集素9抗体的剂量和/或可以延长施用间隔。减少的适当性和程度可由合格的临床医生评估。在一个具体实例中，实施按照临床医生所评估的或至少30％的水平降低。如果需要，实施剂量水平-1的30％的再一次剂量减少(剂量水平-2)。或者或另外，可以减少检查点抑制剂的剂量和/或可以延长检查点抑制剂的施用间隔。在一些情况下(例如，发生危及生命的不良作用)，治疗可能会终止。
E.眼部黑素瘤动物模型
可在体内例如在动物模型中评价本文所述的半乳糖凝集素9抗体。可使用任何合适的眼部黑素瘤动物模型，例如，肿瘤同基因或异种移植小鼠模型(参见，例如，Richards等人,Pigment Cell Melanoma Res.2020年3月；33(2):264–278.)。抗半乳糖凝集素9抗体可全身性地或局部地施用至动物，例如通过口服施用(强饲法)、静脉内或皮下注射或通过瘤内注射，并且例如通过测量肿瘤体积来确定治疗效果。
将源自各种人癌细胞类型或患者肿瘤块的培养细胞植入小鼠组织部位已广泛用于几代癌症小鼠模型(异种移植模型)。在异种移植模型中，人肿瘤或细胞系被皮下或原位植入免疫受损的宿主动物(例如，裸鼠或SCID小鼠)以避免移植排斥。由于原始人肿瘤微环境未在此类模型中重现，因此可能无法在这些模型中准确测量靶向免疫调节剂的抗癌剂的活性，这使得具有完整免疫系统的小鼠模型更为可取。因此，将鼠癌细胞植入同基因免疫宿主(同种异体移植)中，可用于产生具有源自与给定小鼠品系相同的遗传背景的肿瘤组织的小鼠模型。在同基因模型中，宿主免疫系统是正常的，这可能更能代表肿瘤微环境的真实生活情况。将肿瘤细胞或癌细胞系皮下或原位植入同基因免疫活性宿主动物(例如，小鼠)中。Richards等人,Pigment Cell Melanoma Res.2020年3月；33(2):264–278描述了可用于免疫检查点基准测试的同基因小鼠模型中的代表性鼠肿瘤细胞系。选择细胞系用于同基因小鼠模型中。
可用于同基因小鼠模型中的小鼠品系的实例根据细胞系包括C57BL/6、FVB/N、Balb/c、C3H、HeJ、C3H/HeJ、NOD/ShiLT、A/J、129S1/SvlmJ、NOD。此外，据报道，有几种经进一步基因工程化的小鼠品系可在分子和组织学水平上模拟人肿瘤发生。这些基因工程化小鼠模型也为该领域提供了极好的工具，此外，源自在这些模型中开发的侵袭性肿瘤的癌细胞系也是同基因肿瘤模型的细胞系的良好资源。
最近，已经开发出“人源化”小鼠模型，其中免疫缺陷小鼠用人体免疫系统重建，这有助于克服与小鼠与人免疫系统之间的差异有关的问题，从而可以在体内研究人体免疫。结合IL2受体缺失和重度联合免疫缺陷突变(scid)的重度免疫缺陷小鼠(NOD-scidIL2Rgnull小鼠)缺乏成熟的T细胞、B细胞或功能性NK细胞，并且缺乏细胞因子信号传导。可以为这些小鼠植入人造血干细胞和外周血单核细胞。CD34+造血干细胞(hu-CD34)被注射到免疫缺陷小鼠中，导致人免疫细胞群体的多谱系植入，包括非常好的T细胞成熟和功能，可用于长期研究。该模型的研究跨度为12个月，功能性的人免疫系统显示T细胞依赖性炎症应答，对宿主没有供体细胞免疫反应性。患者来源的异种移植物可以很容易地植入这些模型中，并且在体内环境中研究的免疫调节剂的作用更能反映人肿瘤微环境(基于免疫细胞和非免疫细胞)(Baia等人,2015)。
示例性细胞系列于表3中。用于异种移植的示例性人细胞系列于表4中。表5列出了选定的患者来源的葡萄膜黑素瘤小鼠异种移植模型。表6列出了基因工程化的葡萄膜黑素瘤小鼠模型。表3至表6摘自Pigment Cell Melanoma Res.2020Mar；33(2):264–278)，并且可在其中找到参考文献。
表3.用于模拟葡萄膜黑素瘤的同基因小鼠皮肤黑素瘤模型(摘自Pigment CellMelanoma Res.2020年3月；33(2):264–278)
表4.(a)源自小鼠异种移植实验中使用的原发性肿瘤的人葡萄膜黑素瘤细胞系(b)源自小鼠异种移植实验中使用的转移灶的人葡萄膜黑素瘤细胞系
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表5.患者来源的葡萄膜黑素瘤小鼠异种移植模型
表6.基因工程化的葡萄膜黑素瘤小鼠模型
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II.使用半乳糖凝集素9作为生物标志物的癌症诊断或预后方法
在本文提供的一些方面，是通过测量从有需要的受试者获得的生物样品中的半乳糖凝集素9(Gal-9)水平来诊断和预后眼部黑素瘤的方法。半乳糖凝集素9水平可用作生物标志物，例如，用于将患者鉴定为患有靶标癌症，测量患者的肿瘤负荷，和/或评估癌症的转移状态。
如本文所用，“生物标志物”是指过程、事件或条件的独特生物或生物学衍生指标。在某些实施方案中，生物标志物是基因或基因产物(即，多肽)。
如本文所用，如本文所用的“预测性生物标志物”是指可在治疗之前用于估计对给定治疗剂或治疗剂类别的应答的可能性或可预测性的生物标志物。在某些实施方案中，治疗剂是抗半乳糖凝集素9免疫疗法，例如，如本文所公开的抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实例中，预测性生物标志物是血清或血浆半乳糖凝集素9水平。在其他实例中，预测性生物标志物是肿瘤中的半乳糖凝集素9水平和/或源自肿瘤的类器官培养物中的半乳糖凝集素9水平。在一些实施方案中，使用超过一种预测性生物标志物。在一些实施方案中，至少一种生物标志物与半乳糖凝集素9水平联合用作预测性生物标志物。在一些实施方案中，PD-L1水平与半乳糖凝集素9水平联合用作预测性生物标志物。在一些实施方案中，与半乳糖凝集素9水平联合使用的预测性生物标志物是血清或血浆PD-L1水平。在一些实施方案中，与半乳糖凝集素9水平联合使用的预测性生物标志物是肿瘤中的血清或血浆PD-L1水平和/或源自肿瘤的类器官培养物中的PD-L1水平。
A.用于测量半乳糖凝集素9的生物样品
本文公开的任何方法涉及在一个或多个合适的时间点从受试者(诸如人受试者)收集的一个或多个生物样品，用于测量半乳糖凝集素9水平。在一些实例中，受试者可以是疑似患有或有风险患有靶标癌症(例如眼部黑素瘤，例如葡萄膜黑素瘤)的人受试者。在一些实施方案中，眼部黑素瘤例如葡萄膜黑素瘤是转移性的。这样的患者可能没有接受过任何先前抗癌疗法。或者，患者可能没有接受过任何抗癌疗法。在一些情况下，患者之前可能已经接受过抗癌疗法，例如免疫疗法、检查点抑制剂疗法、化学疗法、放射疗法、手术以及它们的组合。
在一些实例中，生物样品可以是血液样品，诸如血清样品或血浆样品。在一些实施方案中，在脉络膜液、腹水、胸腔积液或脑脊液中测量半乳糖凝集素9水平。
在一些实例中，生物样品可以是血液样品，诸如血清样品或血浆样品。半乳糖凝集素9水平可指所述样品中半乳糖凝集素9的总量。或者，半乳糖凝集素9水平可指样品中循环的半乳糖凝集素9的量。在其他实例中，半乳糖凝集素9水平可指样品中细胞表面半乳糖凝集素9(例如，肿瘤细胞上的半乳糖凝集素9或免疫细胞上的半乳糖凝集素9)的量。在其他实例中，生物样品可以是组织样品，例如肿瘤组织样品。在一些具体实例中，组织样品是患者来源的类器官(PDO)样品。所述样品中的半乳糖凝集素9水平可指样品中半乳糖凝集素9的总量。在一些实例中，半乳糖凝集素9水平可指特定类型细胞(例如，肿瘤细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))上的半乳糖凝集素9的量。
在一些实施方案中，半乳糖凝集素9的水平是指生物样品中半乳糖凝集素9的蛋白质水平。在其他实施方案中，半乳糖凝集素9的水平是指生物样品中半乳糖凝集素9的信使RNA水平。
在一些实例中，在本文公开的生物样品中仅测量Gal-9水平。在其他实例中，除Gal-9的水平以外，还测量了PD-L1的水平。在一些实施方案中，在同一生物样品中测量Gal-9水平和PD-L1水平。例如，在一些实施方案中，在血清样品或血浆样品中测量Gal-9水平和PD-L1水平两者。例如，在一些实施方案中，在组织样品例如肿瘤组织样品或患者来源的类器官(PDO)样品中测量Gal-9水平和PD-L1水平两者。在一些实施方案中，在单独生物样品中测量Gal-9水平和PD-L1水平。例如，在一些实施方案中，在血清样品或血浆样品中测量Gal-9水平，并在组织样品(例如，肿瘤组织样品或患者来源的类器官(PDO)样品)中测量PD-L1，反之亦然。
可通过常规方法测量本文公开的任何生物样品中的半乳糖凝集素9水平。在一些情况下，半乳糖凝集素9的水平可通过免疫测定来测量，免疫测定是指通过使用抗体或抗原来确定靶分子的存在或浓度的生化测定。实例包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、计数免疫测定(CIA)、荧光免疫测定(FIA)和化学发光免疫测定(CLIA)。在一些情况下，流式细胞术可用于测量样品中的半乳糖凝集素9阳性细胞。在一些情况下，免疫组织化学可用于测量样品中的半乳糖凝集素9阳性细胞。可使用的其他新兴蛋白质分析技术在本领域中广为人知(参见例如，Powers和Palecek,Proteinanalytical assays for diagnosing,monitoring,and choosing treatment for cancerpatients J Healthc Eng.2012年12月；3(4):503–534)，并且包括质谱技术，诸如基质辅助激光解吸/电离和表面增强激光解吸/电离质谱。微型化可以使用本领域已知的技术来完成，例如使用微流体。例如，微流体与传统免疫测定(包括IHC、流式细胞术和ELISA)的结合可将抗体消耗降低几个数量级，并提供测定自动化的潜力。另外的测定工具包括纳米颗粒，例如聚苯乙烯珠、量子点、金颗粒或碳纳米管。
可根据本领域已知的方法，例如使用基于PCR的技术，测量半乳糖凝集素9核酸水平的水平，例如mRNA水平。
在一些实施方案中，测量在源自人患者(例如，源自人患者的血液或肿瘤)的细胞的表面上表达的半乳糖凝集素9的水平并与参考水平比较。在一些实施方案中，测量在源自相应患者(例如，源自活检、患者的肿瘤培养物，包括但不限于PDOT或血液样品)的癌症或免疫细胞(例如，巨噬细胞、α/βT细胞或γ/δT细胞)的表面上表达的半乳糖凝集素9，并与参考水平进行比较。
B.鉴定和诊断眼部黑素瘤患者癌症患者
在一些实施方案中，此处提供了一种用于诊断患者，例如，确定受试者(诸如人患者)中的靶标癌症(例如，眼部黑素瘤，例如葡萄膜黑素瘤)的发生、肿瘤负荷和/或转移风险/状态的方法。在一些实施方案中，眼部黑素瘤例如葡萄膜黑素瘤是转移性的。
在一些情况下，诊断是基于在从受试者(例如，人受试者)收集的生物样品(例如，本文公开的那些)中测量的半乳糖凝集素9的水平。在一些实施方案中，在患者的血清或血浆中测量半乳糖凝集素9水平。在一些实施方案中，在来自患者的组织样品中测量半乳糖凝集素9水平。
因此，在一些实例中，方法包括：(i)提供有需要的受试者(例如，人受试者)的生物样品，诸如血液样品(例如，血浆样品或血清样品)，(ii)测量血液样品中半乳糖凝集素9的水平，以及(iii)基于血液样品中半乳糖凝集素9的水平将受试者鉴定为患有癌症或有患癌症的风险。受试者的生物样品(例如，血液样品，诸如血清样品或血浆样品)中半乳糖凝集素9的水平相对于预定参考水平的升高可能表明该受试者患有癌症或有患癌症的风险。受试者的生物样品中半乳糖凝集素9的水平相对于对照升高也可能表明受试者是适合免疫疗法(诸如涉及Gal-9拮抗剂(例如，如本文所公开的那些抗Gal-9抗体)的免疫疗法)的眼部黑素瘤患者。
在上文公开的任何方法中，预定参考水平可表示来自同一物种的未患靶标癌症的对照受试者(例如，人受试者)的生物样品(例如，相同类型的生物样品，诸如血液样品)中的半乳糖凝集素9的水平。优选地，对照受试者未患任何类型的癌症。在一些实施方案中，预定参考水平是指预定参考值范围，该参考值表示同一物种的未患靶标癌症，优选地未患任何癌症的对照受试者(例如，人受试者)中的半乳糖凝集素9的水平。对照受试者可具有与受试者相匹配的生理特征，例如年龄、性别、种族背景等。因此，高于参考值的水平指示增加的水平。如果候选受试者(例如，人受试者)的生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于预定参考水平升高，则这表明候选受试者患有或有风险患有如本文所公开的那些靶标癌症。
在一些实施方案中，预定的参考水平可表示来自患有低肿瘤负荷的靶标癌症的对照患者的生物样品(例如，相同类型的生物样品，诸如血液样品)中的半乳糖凝集素9的水平。对照患者可具有与受试者相匹配的生理特征，例如年龄、性别、种族背景等。因此，高于参考值的水平指示增加的水平。如果候选受试者(例如，人受试者)的生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于预定参考水平升高，则这表明候选受试者患有如本文所公开的高肿瘤负荷的那些靶标癌症。如本文所用，肿瘤负荷是指受试者体内肿瘤的癌数量、大小或体积，算上所有疾病部位。当受试者通过本文公开的方法被鉴定为具有高肿瘤负荷时，受试者中的肿瘤负荷可以使用本领域已知的方法进行确认，这些方法包括但不限于FDG正电子发射断层扫描(FDG-PET)、磁共振成像(MRI)和光学成像，包括生物发光成像(BLI)和荧光成像(FLI)。
在一些实施方案中，预定的参考水平可表示来自患有无转移的靶标癌症的对照患者的生物样品(例如，相同类型的生物样品，诸如血液样品)中的半乳糖凝集素9的水平。对照患者可具有与受试者相匹配的生理特征，例如年龄、性别、种族背景等。因此，高于参考值的水平指示增加的水平。如果候选受试者(例如，人受试者)的生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于预定参考水平升高，则这表明候选受试者患有处于转移状态的靶标癌症。如本文所用，转移性实体瘤/癌症是指其中肿瘤/癌细胞从它们最初形成的位置到身体的另一部分的肿瘤/癌症。在转移中，癌细胞脱离原来的肿瘤，通过血液或淋巴系统移行，并在身体的其他器官或组织中形成新的肿瘤。
在一些实施方案中，当半乳糖凝集素9水平比预定参考水平高至少20％、高30％、高40％，例如，高至少50％、高至少80％(包括所列百分比之间的任何数字增量)，或高至少2倍时，可认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，当半乳糖凝集素9水平比预定参考水平高至少约20％、高30％、高40％，例如，高至少约50％、高至少约80％(包括所列百分比之间的任何数字增量)，或高至少约2倍时，可认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，当半乳糖凝集素9水平高至少2倍、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少6倍、高至少7倍、高至少8倍、高至少9倍、高至少10倍、高至少10倍至15倍、高至少15倍至20倍、高至少20倍至25倍，或高至少25倍至30倍(包括所列值之间的任何数字增量)时，可认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，当半乳糖凝集素9水平高至少约2倍、高至少约3倍、高至少约4倍、高至少约5倍、高至少约6倍、高至少约7倍、高至少约8倍、高至少约9倍、高至少约10倍、高至少约10倍至15倍、高至少约15倍至20倍、高至少约20倍至25倍，或高至少约25倍至30倍(包括所列值之间的任何数字增量)时，可认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。
在一些实施方案中，本文所述的诊断受试者和任选地治疗受试者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少2倍或高至少约2倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的诊断受试者和任选地治疗受试者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少2.5倍或高约2.5倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的诊断受试者和任选地治疗受试者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少4倍或高至少约4倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的诊断受试者和任选地治疗受试者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少20倍或高至少约20倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。
在一些实施方案中，本文所述的鉴定癌症患者和任选地治疗癌症患者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少2倍或高至少约2倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的鉴定癌症患者和任选地治疗癌症患者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少2.5倍或高约2.5倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的鉴定癌症患者和任选地治疗癌症患者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少4倍或高至少约4倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的鉴定癌症患者和任选地治疗癌症患者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少20倍或高至少约20倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。
在一些实例中，本文公开的方法可包括(i)提供有需要的受试者(例如，人受试者)的活检样品，(ii)测量来自受试者的活检样品或源自受试者的生物样品(例如，患者来源的器官型肿瘤球状体(PDOT)，例如，如本文所述制备)的样品中的半乳糖凝集素9的水平，以及(iii)基于血液样品中半乳糖凝集素9的水平将受试者鉴定为患有癌症或有患癌症的风险。在一些实施方案中，受试者样品中升高的半乳糖凝集素9水平是相对于对照而言的，并且表明受试者患有癌症或有患癌症的风险。在一些实施方案中，对照是健康器官组织或未受同一受试者的癌症影响的器官的一部分。在一些实施方案中，对照是参考值或值范围。在一些实施方案中，对照源自健康受试者。在一些实施方案中，测量涉及确定半乳糖凝集素9蛋白质或基因表达的水平，例如mRNA水平。
在上文公开的任何方法中，对照可表示来自同一物种的未患眼部黑素瘤的对照受试者(例如，人受试者)的生物样品(例如，相同类型的生物样品，诸如血液样品)中的Gal-9的水平。优选地，对照受试者未患任何类型的癌症。在一些实施方案中，对照包括预定参考值或值范围，该参考值或值范围表示同一物种的未患眼部黑素瘤，优选地未患任何癌症的对照受试者(例如，人受试者)中的Gal-9的水平。对照受试者可具有与受试者相匹配的生理特征，例如年龄、性别、种族背景等。因此，高于参考值的水平指示增加的水平。
在一些实例中，本领域已知的一种或多种其他诊断检查可以与该方法结合使用以确认癌症的发生和/或风险。当受试者被鉴定为患有眼部黑素瘤或有患眼部黑素瘤的风险时，可以对所述患者应用合适的抗癌疗法。下文提供了用于治疗眼部黑素瘤的抗癌疗法的细节。
C.确定肿瘤负荷和肿瘤状态
在其他实施方案中，本文提供了用于确定眼部黑素瘤患者的肿瘤负荷或肿瘤状态的方法。所述方法可包括：(i)提供患有眼部黑素瘤的受试者(例如，人眼部黑素瘤患者)的生物样品(例如，血液样品，诸如血浆或血清样品，活检或活检来源的样品，例如PDOT或其他组织样品)，(ii)测量样品中半乳糖凝集素9的水平，以及(iii)基于样品中半乳糖凝集素9的水平确定受试者的肿瘤负荷或肿瘤状态。例如，受试者的生物样品中半乳糖凝集素9的水平相对于对照升高表明受试者具有高肿瘤负荷。在一些实例中，测量TIL上的Gal-9水平、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)上的Gal-9水平、肿瘤细胞上的Gal-9水平或两者。相对于对照，TIL和/或肿瘤细胞上较高的Gal-9水平可表明高肿瘤分级和/或高肿瘤细胞有丝分裂指数，这表明肿瘤细胞增殖。
在一些实例中，用于确定眼部黑素瘤患者的肿瘤负荷的方法可包括：(i)提供患有癌症的受试者的生物样品(例如，血浆或血清、活检或活检来源的样品，例如PDOT或其他组织样品)，(ii)使用抗半乳糖凝集素9抗体测量生物样品中半乳糖凝集素9的水平，以及(iii)基于生物样品中半乳糖凝集素9的水平确定受试者的肿瘤负荷，其中受试者的生物样品中半乳糖凝集素9的水平相对于对照升高表明受试者具有高肿瘤负荷。在一些实施方案中，测量TIL和/或肿瘤细胞上的gal-9水平。
在上文公开的用于确定肿瘤负荷或肿瘤状态的任何方法中，对照可表示来自同一物种的对照受试者或一组对照受试者(例如，人受试者)的生物样品(例如，相同类型的生物样品，诸如血液样品)中的Gal-9的水平。对照受试者可具有与受试者相匹配的生理特征，例如年龄、性别、种族背景等。在一些情况下，对照受试者未患眼部黑素瘤，优选地未患任何癌症。在其他情况下，对照受试者可以是如通过常规医疗实践确定的具有低肿瘤负荷的眼部黑素瘤患者。在其他实例中，对照可包括表示上文公开的任何对照受试者中的Gal-9水平的预定参考值或值范围。
在其他实例中，方法包括：(i)提供有需要的受试者(例如，人受试者)的生物样品，诸如血液样品(例如，血浆样品或血清样品)，(ii)测量血液样品中半乳糖凝集素9的水平，以及(iii)基于血液样品中半乳糖凝集素9的水平评估受试者的转移状态。受试者的生物样品(例如，血液样品，诸如血清样品或血浆样品)中半乳糖凝集素9的水平相对于预定参考水平的升高可能表明该受试者患有转移性眼部黑素瘤，例如转移性葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本文所述的确定癌症患者的肿瘤负荷或转移状态和任选地治疗癌症患者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少3倍或高至少约3倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的确定癌症患者的肿瘤负荷或转移状态和任选地治疗癌症患者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少4倍或高约4倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的确定癌症患者的肿瘤负荷或转移状态和任选地治疗癌症患者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少5倍或高至少约5倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的确定癌症患者的肿瘤负荷或转移状态和任选地治疗癌症患者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少6倍或高至少约6倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。
在其他实例中，方法包括：(i)提供有需要的受试者(例如，人受试者)的生物样品，诸如血液样品(例如，血浆样品或血清样品)，(ii)测量血液样品中半乳糖凝集素9的水平，以及(iii)基于血液样品中半乳糖凝集素9的水平评估受试者的肿瘤负荷。受试者的生物样品(例如，血液样品，诸如血清样品或血浆样品)中半乳糖凝集素9的水平相对于预定参考水平的升高可能表明该受试者具有高肿瘤负荷。
在一些实施方案中，本文所述的治疗患有癌症的受试者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少2倍或高至少约2倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的治疗患有癌症的受试者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少2.5倍或高约2.5倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的治疗患有癌症的受试者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少4倍或高至少约4倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。在一些实施方案中，本文所述的治疗患有癌症的受试者的方法包括步骤(iii)，其中当半乳糖凝集素9水平高至少20倍或高至少约20倍时，认为半乳糖凝集素9水平与预定参考水平相比升高。
在一些实例中，肿瘤组织样品中的Gal-9水平可用作确定眼部黑素瘤患者的肿瘤分级的生物标志物。在一些情况下，肿瘤分级可以用有丝分裂指数来表示，有丝分裂指数是表明癌细胞增殖水平的重要因素。相对于对照水平，在肿瘤组织样品中观察到的高Gal-9水平可以表明高肿瘤分级和/或高有丝分裂指数。在一些实例中，肿瘤组织样品中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的Gal-9水平可用作确定眼部黑素瘤患者的肿瘤分级或有丝分裂指数的生物标志物。相对于对照水平，在TIL上观察到的高Gal-9水平可以表明高肿瘤分级和/或高有丝分裂指数。对照水平可以是表示具有确定的肿瘤分级或有丝分裂指数水平的眼部黑素瘤患者中的Gal-9水平的预定值或值范围。在一些情况下，对照水平可以是相对于具有低分级肿瘤或低有丝分裂指数的患者区分具有高分级肿瘤或高有丝分裂指数的患者的Gal-9水平的截断值或值范围。高或低肿瘤分级和有丝分裂指数的水平是基于那些从业医师已知的医疗实践标准。
当需要时，可以结合本文公开的方法对受试者进行本领域已知的一种或多种另外的诊断测定以确认眼部黑素瘤患者的肿瘤负荷和/或肿瘤状态。
可以基于由此确定的肿瘤负荷和/或状态来选择合适的抗癌疗法(例如，包括使用Gal-9拮抗剂诸如抗Gal-9抗体)并将其应用于眼部黑素瘤患者。
在一些实例中，Gal-9用作本文公开的方法中的唯一生物标志物。在其他实例中，Gal-9与PD-L1结合使用。
在一些实例中，本领域已知的一种或多种其他诊断检查可以与该方法结合使用以确认癌症的发生、风险、肿瘤负荷和/或转移状态。当受试者被鉴定为患有靶标癌症或有患靶标癌症的风险时，可以对所述患者应用合适的抗癌疗法。当受试者被鉴定为患有具有高肿瘤负荷和/或转移(或有转移风险)的靶标癌症时，可以基于评估选择合适的抗癌疗法。下文提供了用于治疗任何靶标癌症的抗癌疗法的细节。
眼睛葡萄膜(虹膜、睫状体和脉络膜)内的黑色素细胞可引起葡萄膜黑素瘤。发生在虹膜的肿瘤被称为前葡萄膜黑素瘤，发生在睫状体和/或脉络膜的肿瘤被称为后葡萄膜黑素瘤。
因此，在一些实施方案中，癌症是眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性眼部黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是前葡萄膜黑素瘤或转移性前葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是后葡萄膜黑素瘤或转移性前葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，原发性肿瘤在葡萄膜中。在一些实施方案中，原发性肿瘤在虹膜、睫状体或脉络膜中。在一些实施方案中，转移性肿瘤在肝脏中。
D.评估对抗癌疗法的应答性
在其他实施方案中，本文提供了用于预测眼部黑素瘤患者对抗癌疗法诸如抗半乳糖凝集素9免疫疗法的应答性的方法。在一些实例中，方法可包括(i)在多个时间点确定来自接受抗癌疗法的眼部黑素瘤患者的多个生物样品(两个或更多个)中半乳糖凝集素9的水平，其中至少一个时间点在治疗前，至少一个时间点在治疗期间或之后；(ii)将较晚收集的生物样品中的Gal-9水平与较早采集的生物样品中的Gal-9水平进行比较。如果半乳糖凝集素9的水平在治疗后或治疗过程中下降，则表明患者对抗癌疗法有应答。在一些情况下，所述多个生物样品是血液样品，诸如血浆样品或血清样品。在其他情况下，所述多个生物样品是活检或活检来源的样品，例如PDOT或其他组织样品诸如肿瘤组织样品。
在一些实例中，多个生物样品包含在抗癌疗法的第一剂量之前收集的一个或多个第一生物样品(例如，包含抗半乳糖凝集素9抗体，诸如本文公开的那些)和在抗癌疗法的第一剂量之后收集的一个或多个第二生物样品。可以在抗癌疗法的第一剂量之前48小时内(例如，36小时内、24小时内、18小时内、12小时内或6小时内)收集第一生物样品中的至少一个。或者或另外，可以在第一剂量之后的合适时期内(例如，在第一剂量之后6小时、12小时、24小时、48小时或72小时内)和之后的合适时间点以合适的间隔(例如，每48小时、每72小时、每7天、每14天、每2周或每一个月)收集所述一个或多个第二生物样品。在一些实施方案中，间隔是每3个月一次、每6个月一次或一年一次。在一些实例中，可以给予患者多剂量的抗癌疗法诸如抗半乳糖凝集素9抗体。在这种情况下，可以在每次剂量后从患者收集生物样品(例如，血液样品)。从患者收集生物样品以评估治疗应答性的合适时间点的选择在从业医师的知识范围内。
可以使用常规方法或本文公开的方法，例如使用包含抗半乳糖凝集素9抗体的测定来测量每个生物样品中的Gal-9水平。与治疗之前收集的样品中的Gal-9水平相比，治疗之后收集的样品中Gal-9水平的下降表明对治疗的应答性。或者或另外，在治疗过程中Gal-9水平下降的趋势也表明对治疗的应答性。在一些实施方案中，本领域已知的其他诊断检查可以与本文公开的方法结合使用以确认抗癌疗法的治疗效果。
可以依赖有关抗癌疗法诸如抗半乳糖凝集素9抗体疗法的应答性的结果来确定对患者的治疗方法。例如，如果患者对抗癌疗法有应答，则可以继续这种疗法。因此，用于评估药物应答性的任何方法还可包括继续抗癌疗法，例如，向受试者施用有效量的抗半乳糖凝集素9抗体(例如，本文公开的那些)。在一些实例中，当观察到Gal-9下降的趋势时，可减少治疗的剂量和/或频率。
另一方面，如果患者对抗癌疗法无应答，则所述方法还可包括调整或修改应用于患者的治疗方案。例如，可增加治疗的剂量和/或频率，可应用另外的疗法，或者可将当前的抗癌疗法切换为不同的疗法。
在具体实例中，用于测量癌症患者对治疗的应答的方法可包括：(i)提供患有癌症的受试者的生物样品(例如，血浆、血清、活检或活检来源的样品，例如PDOT或其他组织样品)，(ii)测量生物样品中半乳糖凝集素9的水平，以及(iii)基于生物样品中半乳糖凝集素9的水平确定受试者对治疗的应答，其中相对于对照(例如，治疗之前从同一患者收集的生物样品中的Gal-9水平)受试者生物样品中半乳糖凝集素9的水平降低表明受试者对治疗有应答。在一些实施方案中，对照包括先前从受试者收集的生物样品。因此，在一些实施方案中，方法包括(i)提供患有癌症的受试者的第一生物样品，(ii)测量第一生物样品(例如，血浆、血清、活检或活检来源的样品，例如PDOT或其他组织样品)中半乳糖凝集素9的水平，(iii)在一段时间内施用一种或多种抗癌疗法，(iv)提供患有癌症的受试者的第二生物样品(例如，血浆、血清、活检或活检来源的样品，例如PDOT或其他组织)，(v)测量第二生物样品中半乳糖凝集素9的水平，以及(vi)基于第一生物样品与第二生物样品之间半乳糖凝集素9水平的差异确定受试者对治疗的应答，其中受试者的第二生物样品中半乳糖凝集素9的水平相对于第一生物样品降低表明受试者对治疗有应答。
在其他实例中，本文提供了用于在癌症患者中准备治疗方案的方法。在一些实施方案中，方法包括：(i)提供患有癌症的受试者的生物样品(例如，血浆、血清、活检或活检来源的样品，例如PDOT或其他组织样品)，(ii)测量生物样品中半乳糖凝集素9的水平，以及(iii)基于生物样品中半乳糖凝集素9的水平在受试者中准备治疗方案，其中治疗方案的积极性(例如剂量和/或剂量频率)与受试者生物样品中相对于对照的半乳糖凝集素9水平有关，因此生物样品中相对于对照的半乳糖凝集素9水平越高，治疗方案的积极性就越大。
在其他实例中，本文提供了用于预测癌症患者的治疗的成功程度的方法。在一些实施方案中，本文提供了用于预测癌症患者的抗半乳糖凝集素9免疫疗法治疗的成功程度的方法。因此，在一些实施方案中，方法包括(i)确定来自患者的生物样品(例如血浆、血清、活检或活检来源的样品，例如PDOT或其他组织)中半乳糖凝集素9的水平；(ii)将癌症患者的生物样品中的Gal-9水平与对照水平进行比较，其中癌症患者的生物样品中半乳糖凝集素9的水平相对于对照升高预示着癌症患者的治疗的成功程度较低。在一些实施方案中，测量TIL上的gal-9水平。在一些实施方案中，方法还包括(iii)治疗癌症患者。在一些实施方案中，治疗是抗半乳糖凝集素9免疫疗法。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体是本文提供的任何抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，对照水平对应于在健康受试者的血液或组织中观察到的水平。在一些实施方案中，对照水平对应于在患有癌症的受试者的肿瘤邻近健康组织中观察到的水平。在一些实施方案中，本领域已知的其他诊断检查与所述方法结合使用。
另外，本文提供了用于预测癌症患者的治疗的成功程度的方法。在一些实施方案中，本文提供了用于预测癌症患者的抗半乳糖凝集素9免疫疗法治疗的成功程度的方法。因此，在一些实施方案中，方法包括(i)使用抗半乳糖凝集素9抗体确定来自患者的生物样品(例如血浆、血清、活检或活检来源的样品，例如PDOT或组织)中半乳糖凝集素9的水平；(ii)将癌症患者的生物样品中的Gal-9水平与对照水平进行比较，其中癌症患者的生物样品中半乳糖凝集素9的水平相对于对照升高预示着癌症患者的治疗的成功程度较低。在一些实施方案中，测量TIL上的gal-9水平。在一些实施方案中，方法还包括(iii)治疗癌症患者。在一些实施方案中，治疗是抗半乳糖凝集素9免疫疗法。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体是本文提供的任何抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，对照水平对应于在健康受试者的血液或组织中观察到的水平。在一些实施方案中，对照水平对应于在患有癌症的受试者的肿瘤邻近健康组织中观察到的水平。在一些实施方案中，本领域已知的其他诊断检查与所述方法结合使用。
在一些实例中，Gal-9用作本文公开的方法中的唯一生物标志物。在其他实例中，Gal-9与PD-L1结合使用。
E.监测疾病进展
在一些实施方案中，本公开提供了使用Gal-9作为生物标志物监测眼部黑素瘤患者(例如，人患者)的疾病进展的方法。所述方法可包括在多个时间点从患者收集多个生物样品并测量生物样品中的Gal-9水平。如本文所用，多个意指至少两个。本文公开的任何生物样品均可从患者收集。实例包括血液样品，诸如血清样品或血浆样品，或活检和活检来源的样品，诸如肿瘤组织样品或PDOT样品。Gal-9的水平可以通过常规方法或本文公开的方法例如免疫测定来测量。可以基于所测量的Gal-9水平随时间的变化来确定疾病进展。例如，Gal-9水平随时间增加可能表明疾病进展，而Gal-9水平随时间下降可能表明疾病有所改善。
基于通过本文公开的任何方法确定的疾病进展状态，可以选择合适的治疗方案，这在从业医师的知识范围内。因此，在一些实施方案中，方法还可包括基于所确定的受试者眼部黑素瘤的进展选择抗癌疗法，并将所述抗癌疗法应用于受试者以治疗癌症。在一些实例中，抗癌疗法可包括抗半乳糖凝集素9抗体，诸如本文公开的那些。当需要时，可在本文公开的方法中进行一种或多种另外的诊断测定以确认患者的癌症状态。
在一些实例中，Gal-9用作本文公开的方法中的唯一生物标志物。在其他实例中，Gal-9与PD-L1结合使用。
F.确定生存率
在另一方面，本文提供了用于预测癌症患者的生存率和/或无癌生存时间长度的方法。因此，在一些实施方案中，方法包括(i)确定来自癌症患者的生物样品(例如血浆、血清、活检或活检来源的样品，例如PDOT或其他组织)中半乳糖凝集素9的水平；(ii)将癌症患者的生物样品中的Gal-9水平与对照水平进行比较，其中癌症患者的生物样品中半乳糖凝集素9的水平相对于对照升高预示着癌症患者的生存率较低和/或无癌生存时间较短。在一些实施方案中，测量TIL上的gal-9水平。在一些实施方案中，方法还包括(iii)治疗癌症患者。在一些实施方案中，治疗是抗半乳糖凝集素9免疫疗法。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体是本文提供的任何抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，步骤(i)中的癌症患者患有癌症。在一些实施方案中，步骤(i)中的癌症患者患有癌症并且正在为所述癌症接受治疗。在一些实施方案中，步骤(i)中的癌症患者在确定Gal-9水平时是无癌的。在一些实施方案中，对照水平对应于在健康受试者的血液或组织中观察到的水平。在一些实施方案中，对照水平对应于在患有癌症的受试者的肿瘤邻近健康组织中观察到的水平。在一些实施方案中，本领域已知的其他诊断检查与所述方法结合使用。
在另一方面，本文提供了用于预测癌症患者的生存率或无癌生存时间长度的方法。因此，在一些实施方案中，方法包括(i)使用抗半乳糖凝集素9抗体确定来自患者的生物样品(例如血浆、血清、活检或活检来源的样品，例如PDOT或组织)中半乳糖凝集素9的水平；(ii)将癌症患者的生物样品中的Gal-9水平与对照水平进行比较，其中癌症患者的生物样品中半乳糖凝集素9的水平相对于对照升高预示着癌症患者的生存率较低和/或无癌生存时间较短。在一些实施方案中，测量TIL上的gal-9水平。在一些实施方案中，方法还包括(iii)治疗癌症患者。在一些实施方案中，治疗是抗半乳糖凝集素9免疫疗法。在一些实施方案中，抗半乳糖凝集素9抗体是本文提供的任何抗半乳糖凝集素9抗体。在一些实施方案中，步骤(i)中的癌症患者患有癌症。在一些实施方案中，步骤(i)中的癌症患者患有癌症并且正在为所述癌症接受治疗。在一些实施方案中，步骤(i)中的癌症患者在确定Gal-9水平时是无癌的。
在一些实施方案中，对照水平对应于在健康受试者的血液或组织中观察到的水平。在一些实施方案中，对照水平对应于在患有癌症的受试者的肿瘤邻近健康组织中观察到的水平。在一些实施方案中，本领域已知的其他诊断检查与所述方法结合使用。
在一些实施方案中，本公开的特征在于一种用于评估癌症患者(例如，眼部黑素瘤患者)的生存率的方法，所述方法包括：(i)从人癌症患者获得肿瘤组织样品(例如，眼部肿瘤样品)；(ii)确定肿瘤样品中PD-L1的存在；(iii)测量肿瘤样品中半乳糖凝集素9的水平；以及(iv)基于肿瘤样品中PD-L1的存在和半乳糖凝集素9的水平评估癌症患者的生存率。
生存率是指癌症患者(例如，眼部黑素瘤患者)在诊断后存活给定时间段(例如，5年内)的可能性。生存率可作为评估治疗标准的标尺。本文公开的生存率可以是五年无病生存率(DFS_5)、五年眼部黑素瘤特异性生存率(OCSS_5)或五年无远处转移生存率(DMFS_5)。
DFS_5率是指在特定治疗后5年内远离癌症的可能性。DFS_5率差表明眼部黑素瘤患者在诊断后或治疗后5年内远离癌症的可能性较低。另一方面，具有良好DFS_5率的患者表明该患者在诊断后或治疗后五年内远离癌症的可能性更高。
OCSS_5率是指在诊断后或治疗后5年内幸存于眼部黑素瘤的可能性。OCOCSS_5率差表明眼部黑素瘤患者在诊断后或治疗后5年内幸存于眼部黑素瘤的可能性较低。另一方面，具有良好OCSS_5率的患者表明该患者在诊断后或治疗后五年内幸存于眼部黑素瘤的可能性更高。
DMFS_5率是指在诊断后或治疗后五年内，无癌症从原发肿瘤扩散到远处器官或远处淋巴结(远处转移)的可能性。DMFS_5率差表明眼部黑素瘤患者在诊断后或治疗后5年内无远处转移的可能性较低。另一方面，具有良好DMFS_5率的患者表明该患者在诊断后或治疗后五年内无远处转移的可能性更高。在一些情况下，生存率是五年眼部黑素瘤特异性生存率(OCSS_5)。
用于评估生存率的对照水平可以是表示具有确定的生存率的眼部黑素瘤患者中的Gal-9水平的预定值或值范围。在一些情况下，对照水平可以是相对于具有良好生存率的患者区分具有差生存率的患者的Gal-9水平的截断值或值范围。可以根据那些从业医师已知的医疗实践标准来确定良好或差生存率。
评估眼部黑素瘤患者的潜在生存率将有助于确定对患者的适当治疗。例如，当眼部黑素瘤患者被确定为生存率较差时，可以选择更积极的治疗(例如，涉及多种治疗剂或多种类型的治疗，或高剂量的治疗剂)来治疗该患者。
III.用于癌症治疗或诊断的试剂盒
本公开还提供了用于本文公开的任何治疗、诊断和/或预后方法的试剂盒。
诊断/预后试剂盒
在一些实施方案中，本文公开的试剂盒包括一种或多种用于测量生物样品中半乳糖凝集素9水平的剂。此类剂可以是对半乳糖凝集素9具有特异性的抗体。或者，剂可以是用于测量生物样品中半乳糖凝集素9的mRNA水平的核酸。试剂盒还可包括用于收集和处理生物样品的试剂或装置，以及任选的用于放置生物样品的容器。在一些实例中，试剂盒还可包括一种或多种用于治疗眼部黑素瘤的治疗剂，例如本文所公开的任何抗半乳糖凝集素9抗体。
本文公开的任何试剂盒可包含一个或多个容器，所述一个或多个容器用于放置一种或多种检测剂和任选的试剂和/或治疗剂。在一些实施方案中，试剂盒可以包括根据本文所述的任何方法使用的说明。所包括的说明可以包括对收集生物样品、处理此类生物样品以及测量此类生物样品中的Gal-9水平的描述。另外，所包括的说明还可包括对根据本文公开的任何方法鉴定眼部黑素瘤患者、确定其肿瘤负荷和/或肿瘤状态、疾病进展水平、对当前治疗的应答性和/或潜在生存率的描述。此外，说明可包括对选择合适的治疗以及如何将所述治疗应用于患者的描述。本文公开的试剂盒中提供的说明通常是标签或包装插页上的书面说明(例如，试剂盒中包含的纸页)，但机器可读的说明(例如，携带在磁或光存储盘上的说明)也是可以接受的。
本文公开的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。任何试剂盒可任选地提供附加组分，诸如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。
用于治疗眼部黑素瘤的试剂盒
在其他实施方案中，本文公开的试剂盒可包括一个或多个容器，所述一个或多个容器包含抗半乳糖凝集素9抗体，例如本文所述的任何抗体，以及待与抗半乳糖凝集素9抗体共同使用的任选的第二治疗剂(例如，检查点抑制剂，诸如本文所公开的抗PD-1抗体)或化学治疗剂，其也在本文中描述。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括根据本文所述的任何方法使用的说明。所包括的说明可以包括对施用抗半乳糖凝集素9抗体和任选的第二治疗剂以治疗、延迟发作或减轻如本文所述的那些靶标疾病的描述。在一些实施方案中，试剂盒还包括基于鉴定个体是否患有靶标疾病(例如，应用如本文所述的诊断方法)来选择适合治疗的个体的描述。在其他实施方案中，说明包括向有患靶标疾病风险的个体施用抗体的描述。
与抗半乳糖凝集素9抗体的使用相关的说明通常包括有关预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明通常是标签或包装插页上的书面说明(例如，试剂盒中包含的纸页)，但机器可读的说明(例如，携带在磁或光存储盘上的说明)也是可以接受的。
标签或包装插页表明该组合物用于治疗、延迟发作和/或减轻本文公开的靶标肿瘤。在一些实施方案中，提供了用于实践本文所述的任何方法的说明。
本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还设想了与特定装置(诸如吸入器、鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置(诸如微型泵))结合使用的包装。在一些实施方案中，试剂盒具有无菌进入端口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些实施方案中，容器还具有无菌进入端口(例如容器是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的抗半乳糖凝集素9抗体。
试剂盒可任选地提供附加组分，诸如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。在一些实施方案中，本发明提供包含上述试剂盒的内容物的物品。
一般技术
除非另有指示，否则本发明的实施采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在以下文献中有充分的解释，诸如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Current Protocolsin Immunology(J.E.Coligan等人编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编,OxfordUniversity Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)。
无需进一步阐述，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大限度地利用本发明。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。为了本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物均以引用的方式并入。
实施例
实施例1.评估肿瘤活检来源的类器官级分中半乳糖凝集素9的表达
活检来源的类器官可用作评估原发肿瘤中半乳糖凝集素9水平的代用指标。因此，试验了评估单细胞或类器官级分中半乳糖凝集素9水平的能力。
从代表性的胰腺腺癌和结直肠癌接收活检并如下处理。将手术切除的人肿瘤样本新鲜接收在冰上的DMEM培养基中，并在10cm的培养皿中切碎。将切碎的肿瘤重悬于含有100U/mL IV型胶原酶的DMEM+10％ FBS中以获得球状体。将部分消化的样品沉淀，然后重悬于新鲜的DMEM+10％ FBS中，并在100mm和40mm过滤器上过滤以产生S1(>100mm)、S2(40-100mm)和S3(<40mm)球状体级分，随后将这些级分保存在超低附着组织培养板中。
将S2级分用胰蛋白酶消化15分钟以产生单细胞。对于流式细胞术制备，将S2和S3级分中的细胞沉淀重悬，并在Fc受体阻断(#422301；BioLegend,San Diego,CA)后通过将细胞与针对人CD45(HI30)、CD3(UCHT1)、CD11b(M1/70)、Epcam(9C4)和Gal9(9M1-3；均来自Biolegend)或Gal9 G9.2-17Fab或Fab同种型的荧光缀合mAb一起孵育来进行细胞标记。使用僵尸黄(BioLegend)将死细胞排除在分析之外。在Attune NxT流式细胞仪(ThermoScientific)上进行流式细胞术。使用FlowJo v.10.1(Treestar,Ashland,OR)分析数据。
结果显示在图1A至图1F、图2A至图2F和图3A至图3F中，表明在S2单细胞和S3类器官级分中通过Gal9 G9.2-17Fab检测到的半乳糖凝集素9水平相关。因此，S2单细胞和S3类器官均可用于评估源自肿瘤活检的类器官中的半乳糖凝集素9水平。
另外，如上文所述处理胰腺腺癌(PDA)、结直肠癌(CRC)和肝细胞癌(HCC)肿瘤。下表指示S2单细胞和S3类器官均可用于评估源自肿瘤活检的类器官中的半乳糖凝集素9水平。
表7.EPCAM+肿瘤细胞上的Gal9表达
半乳糖凝集素9充当癌症相关免疫抑制的有效介质，并在肿瘤相关巨噬细胞以及肿瘤内免疫抑制性γδT细胞上表达。表7显示了如在S2单细胞和S3类器官中看到的巨噬细胞上的半乳糖凝集素9表达，并且表8显示了如在S2单细胞和S3类器官中看到的T细胞上的半乳糖凝集素9表达。表9显示了如通过δ1Fab和Fab同种型检测到的在S2单细胞和S3类器官中T细胞受体δ1链的表达。
表8.CD11b+骨髓细胞上的半乳糖凝集素9表达
表9.CD3+T细胞上的半乳糖凝集素9表达
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以上结果表明，与健康对照相比，在患者血液/组织样品中检测到高半乳糖凝集素9水平。对PDOT的分析显示肿瘤、骨髓和T细胞上的高半乳糖凝集素9水平，这表明半乳糖凝集素9是很有前途的疾病特异性靶标。另外，测量肿瘤中的半乳糖凝集素9水平可构成确定可能对抗半乳糖凝集素9疗法有应答的癌症患者群体的手段。
实施例2.用于细胞分析的患者来源的器官型肿瘤球状体(PDOT)的制备
活检来源的类器官可以作为一种有用的措施来评估治疗剂刺激免疫应答的能力。因此，将上文前述实施例1中描述的用于离体培养的S2级分用抗半乳糖凝集素9抗体G9.2-17进行处理，并制备用于免疫分析。
在加入10×PBS和酚红并使用NaOH调节pH值后，将S2级分的等分试样沉淀并以2.5mg/mL的浓度重悬于I型大鼠尾胶原(Corning)中。使用PANPEHA Whatman纸(Sigma-Aldrich)确认pH值为7.0-7.5。然后将球状体-胶原混合物注射到如Jenkins等人,CancerDiscov.2018年2月；8(2):196-215；Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade UsingOrganotypic Tumor Spheroids(其内容以引用的方式整体并入本文)所述的3-D微流体培养装置的中心凝胶区域。在37℃下30分钟后，使含有患者来源的器官型肿瘤球状体(PDOT)的胶原水凝胶与含有或不含抗半乳糖凝集素9单克隆抗体G9.2-17的培养基水合。然后将PDOT在37℃下培养3天。
将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中，并将1x106个细胞首先用僵尸黄(BioLegend)染色以排除死细胞。在活力染色后，将细胞与抗CD16/CD32 mAb(eBiosciences,San Diego,CA)一起孵育以阻断FcγRIII/II，随后用1μg荧光缀合的细胞外mAb进行抗体染色。使用固定/透化溶液试剂盒(eBiosciences)对细胞因子和转录因子进行细胞内染色。有用的人流式细胞术抗体包括CD45(HI30)、CD3(UCHT1)、CD4(A161A1)、CD8(HIT8a)、CD44(BJ18)、TNFα(MAb11)、IFNγ(4S.B3)和Epcam(9C4)；均来自Biolegend。在LSR-II流式细胞仪(BDBiosciences)上进行流式细胞术。使用FlowJo v.10.1(Treestar,Ashland,OR)分析数据。
实施例3.评估癌症患者的血浆和血清中的半乳糖凝集素9水平
评估患者样品中的血浆和血清半乳糖凝集素9水平，并与健康志愿者进行比较。从10名健康对照者和10名无法手术的癌症患者的外周静脉途径中抽取血液(10ml)。从每个血液样品中提取血清和血浆。将血液收集于标准EDTA管PicoKineTM ELISA；目录号：EK1113，基本上根据制造商的说明来使用。单个值的结果列于表10和表11中。
表10.患者样品
表11.健康志愿者样品
样品编号 血清 血浆
对照1 536.4 611.97
对照2 476.43 592.58
对照3 612.66 651.43
对照4 269.75 414.41
对照5 460.26 602.28
对照6 206.66 405.8
对照7 385.88 439.85
对照8 525.283 654.2
对照9 711.047 718.68
对照10 296.85 349.09
平均值 448.122 544.029
上述结果表明，与健康对照相比，在癌症患者(例如，乳腺癌患者、黑素瘤患者、卵巢癌患者、睾丸癌患者和肉瘤患者)的血浆和血清样品中检测到高半乳糖凝集素9水平。
使用上述相同程序对大量健康对照(19名对照)和受试者(18名胰腺癌受试者、20名非小细胞肺癌(NSCLC)受试者和12名结直肠癌受试者)进行血清测量的后续研究示于图4中。简单地说，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量患者血清中的半乳糖凝集素9水平(括号中为样品量)。使用人半乳糖凝集素9PicoKine ELISA试剂盒(Bolster BiologicalTechnology)以夹心形式运行ELISA。将患者血清半乳糖凝集素9水平与健康人血清对照进行比较。通过非配对学生t检验进行统计分析。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)结果显示癌症患者血清中的半乳糖凝集素9水平显著增加。表12提供了单个患者样品的值，并且表13提供了平均值。
表12.健康对照和癌症患者的半乳糖凝集素9血液水平
表13.相对于健康对照，癌症患者的平均半乳糖凝集素9血液水平
健康对照 胰腺癌 NSCLC 结直肠癌
平均值(pg/ml) 18148 43135 40440 42492.08333
标准偏差 5968.8331 22139.526 14767.5495 28964.95828
SEM 1369.3442 5218.336262 3302.124452 8361.46323
P值 3.46372E-05 0.001238666
患有各种肿瘤负荷的胰腺癌的患者的半乳糖凝集素9血清水平提供于下表14中：
表14.半乳糖凝集素9血清水平与肿瘤负荷的相关性
实施例4.评估癌症患者的血浆和血清中的半乳糖凝集素9水平
评估转移性葡萄膜黑素瘤患者样品中的血浆和血清半乳糖凝集素9水平，并与健康志愿者进行比较。从10名健康对照者和10名转移性葡萄膜黑素瘤癌症患者的外周静脉途径中抽取血液(1ml-10ml)。从每个血液样品中提取血清和血浆。将血液收集于标准EDTA管PicoKineTM ELISA；目录号：EK1113，基本上根据制造商的说明来使用。
实施例5使用免疫组织化学分析评估半乳糖凝集素9表达和定位
使用石蜡包埋的活检来源的肿瘤样品评估使用免疫组织化学分析确定肿瘤中半乳糖凝集素9表达水平的能力。
简单来说，将载玻片脱蜡(二甲苯：2X 3分钟；无水酒精：2X 3分钟，甲醇：1X3分钟)并在冷自来水中冲洗。对于抗原修复，将柠檬酸盐缓冲液(pH 6)在水浴中预热至100C，并将载玻片在柠檬酸盐缓冲液中孵育5分钟。将载玻片在室温下冷却约10分钟，然后放入流水中。在PBS中清洗载玻片，在切片周围画一个纸笔圆圈，并将切片在封闭缓冲液(DAKO-过氧化物酶封闭溶液-S2023)中孵育5分钟。加入无血清阻断剂(Novocastra无血清蛋白阻断剂)，然后用PBS冲洗掉。一抗(Sigma，抗半乳糖凝集素9克隆1G3)在DAKO-S2022稀释剂中以1:2000稀释使用，切片在4C下孵育过夜。用PBS洗涤载玻片，然后在室温下与二抗(抗小鼠)一起孵育45分钟。将载玻片洗涤并用ABC VECTOR STAIN染色(45分钟)，用PBS洗涤，用DAB(1ml稳定DAB缓冲液+1滴DAB)染色5分钟，然后在流水中洗涤。加入苏木精保持1分钟，然后应用70％ ETOH+1％ HCL以避免过度染色。将载玻片在流水中放置2-3分钟，然后浸入水中，然后浸入无水酒精中，然后浸入二甲苯中，各自2次30秒。捕获盖玻片和图像。化学疗法治疗的结直肠癌和结直肠癌肝转移灶中的半乳糖凝集素9染色示于图5A和图5B中。半乳糖凝集素9阴性胆管癌的结果示于图5C中。
实施例6：使用免疫组织化学分析评估转移性葡萄膜黑素瘤中的半乳糖凝集素9表达和定位
如上文所述制备来自葡萄膜黑素瘤肝转移灶的样品，并评估载玻片的半乳糖凝集素9水平。
实施例7：在免疫活性小鼠的B16F10黑素瘤同基因肿瘤模型中评价Gal-9抗体
在黑素瘤免疫活性小鼠的B16F10同基因小鼠模型中评价Gal-9抗体G9.2-17。向研究前动物(雌性C57BL/6，6-8周龄(Charles River Labs))的左侧腹单侧皮下植入于100μlPBS中的5e5个B16.F10。在植入后2-3天开始，记录每个实验的研究前肿瘤体积。当肿瘤达到50-100mm3(优选为50-75mm3)的平均肿瘤体积时，将动物按肿瘤体积匹配到治疗组或对照组(n＝8)以用于给药并在第0天开始给药。在第0天和第4天向动物静脉内给药。表15总结了用于试验抗Gal9 G9.2-17 IgG1和抗Gal9 G9.2-17 IgG2的研究设计。
表15.抗Gal9 IgG2
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每周三次获取肿瘤体积并对动物称重。研究终点设定在当对照组(无约束的)的平均肿瘤体积达到1500mm3时。在研究达到终点的当天获取最终肿瘤体积。在研究达到终点的当天(第10天)获取最终体重。肿瘤体积示于表30和图31中。
实施例8：在免疫活性小鼠的同基因黑素瘤模型中评价Gal-9抗体
在免疫活性小鼠的同基因黑素瘤模型中评价Gal-9抗体G9.2-17和G9.1-8m13。
实验设计
使研究前动物(雌性C57BL/6，6-8周龄(Charles River Labs))适应环境3天，然后向左侧腹单侧皮下植入重悬于100μl PBS中的5e5个B16.F10(黑素瘤细胞系)。在植入后2-3天开始，记录每个实验的研究前肿瘤体积。当肿瘤达到50-100mm3(优选为50-75mm3)的平均肿瘤体积时，将动物按肿瘤体积匹配到治疗组或对照组以用于给药并在第0天开始给药。表16总结了用于试验抗Gal9 IgG1的研究设计。
表16.抗Gal9 IgG1(B16F10)试验条件
每周三次获取肿瘤体积。在研究达到终点的那天获取最终肿瘤体积。如果发现动物垂死，则获取最终肿瘤体积。动物每周称重三次。在研究达到终点的当天或如果发现动物垂死，则称取最终体重。向与第0天相比表现出≥10％的体重减轻的动物随意提供任何动物在持续7天的时间内表现出>20％的净体重减轻，或者如果小鼠与第0天相比表现出>30％的净体重减轻，则认为其垂死并将其安乐死。研究终点设定在当对照组(无约束的)的平均肿瘤体积达到1500mm3时。如果这发生在第28天之前，则对治疗组和个体小鼠给药用并测量直至第28天。如果到第28天对照组(无约束的)的平均肿瘤体积未达到1500mm3，则所有动物的终点是在对照组(无约束的)的平均肿瘤体积达到1500mm3直到60天的最大值时。从每组的所有动物收集血液。对于血液收集，在异氟醚吸入诱导的深度麻醉下，通过心脏穿刺将尽可能多的血液收集到K2EDTA管(400ul)和血清分离管(剩余的)中。将收集到K2EDTA管中的血液置于湿冰上，直到用于执行免疫小组流(immune panel flow)，如表17所示。
表17.流式细胞术小组1
允许收集到血清分离管中的血液在室温下凝结至少15分钟。将样品在室温下以3500离心10分钟。将所得血清分离，转移到独特标记的透明聚丙烯管中，并立即在干冰上冷冻或在设置保持为-80℃的冰箱中冷冻，直至运送用于桥接ADA测定(一周内运送)。
如下收集所有动物的肿瘤。将大小为小于400mm3的肿瘤快速冷冻，置于干冰上，并储存在-80C直至用于RT-qPCR分析。对于大小为400-500mm3的肿瘤，将整个肿瘤收集到MACS培养基中以用于流式细胞术小组(Flow Panel)(如下表18所示)。对于大于500mm3的肿瘤，将一小块(约50mm3)快速冷冻，置于干冰上，并储存在-80C以用于RT-qPCR，并将剩余的肿瘤收集在MACS培养基中以用于流式细胞术(如表18所示)。对于流式细胞术，将肿瘤置于MACS培养基中并储存在湿冰上直至处理。所进行的流式细胞术分析的总结示于表19中。
表18.流式细胞术小组2
抗体描述 缀合物 克隆 供应商
mCD3 FITC 17A2 BioLegend
mCD4 APC-Fire 750 RM4-4 BioLegend
mγδ BV605 GL3 BioLegend
mCD8 APC-R700 53-6.7 BioLegend
mCD69 BV421 H1.2F3 BioLegend
mCD11b APC M1/70 BioLegend
mCD45 BV510 30-F11 BioLegend
Live Dead 7AAD - BioLegend
mCD62L PE-Cy7 MEL-14 BioLegend
mPD-1 BV711 29F.1A12 BioLegend
mCTLA4 PE UC10-4B9 BioLegend
mNk1.1 BV786 PK136 BioLegend
将所有动物的脾、肝脏、结肠、肺、心脏和肾脏在10％中性缓冲福尔马林(NBF)中保留18-24小时，转移到70％乙醇中并在室温下储存。将福尔马林固定的样品以石蜡包埋。
表20.抗Gal9 IgG2试验条件
每周三次通过CT扫描获取肿瘤体积并对动物称重。研究终点设定在当对照组(无约束的)的平均肿瘤体积达到1,500mm3时。在研究达到终点的当天获取最终肿瘤体积。在研究达到终点的当天获取最终体重。
进行CT扫描以监测和评估肿瘤体积。在注射造影剂后4小时进行显微CT扫描(Inveon Micro-CT,Siemens,Germany)。造影剂(ExiTron nano 12000,Miltenyi Biotec,Germany)是一种用于小鼠肝脏CT成像的碱土基纳米颗粒造影剂。静脉内注射后，该剂被网状内皮系统的细胞(包括称为库普弗细胞的肝脏内的巨噬细胞)吸收。通过侧尾静脉向小鼠注射100μl剂(每只小鼠，25-30g体重)。
在预定的处死时间从小鼠收集PDX来源的肿瘤块。使用以下公式计算肿瘤体积：体积＝(W2×L)/2，其中W是最短直径，并且L是最长直径。用无菌PBS清洗切除的肿瘤。将一部分肿瘤切成1mm的立方体，用于植入接受者小鼠的肝脏。剩余的肿瘤用于肿瘤特征分析和冷冻保存。
如先前实施例所述进行炎症标志物的流式细胞术。
实施例9：在免疫活性小鼠的异种移植葡萄膜黑素瘤肿瘤模型中评价Gal-9抗体
如Kageyama等人(J Transl Med.2017；15:145)所述在免疫活性小鼠的原位肝患者来源的异种移植(PDX)转移性葡萄膜黑素瘤模型中评价Gal-9抗体G9.2-17。
简单来说，在肝脏转移性葡萄膜黑素瘤患者手术或活检后获得肿瘤样本。将肿瘤块用无菌PBS清洗并切成1mm的立方体用于植入小鼠肝脏。肿瘤样本的获取和肿瘤植入在2小时内进行。
八周龄的雄性和雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠(例如，可从Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME,USA获得)用于肿瘤注射或植入肝脏。对于肿瘤注射或植入，每只小鼠用3％异氟醚诱导麻醉，用2％异氟醚维持麻醉。
对于剖腹手术，将小鼠仰卧位置于加热垫上。在左肋下区域做一个1cm的皮肤切口，随后在腹膜做一个1cm的切口以暴露肝脏。使用棉签，将左肝叶移出体外，并置于无纺布吸附性布片上进行植入。使用11号锋利手术刀(AD Surgical,Sunnyvale,CA,USA)平行于肝脏表面水平切开肝脏，在薄壁组织中形成一个口袋，不切割任何主要血管。将肿瘤块植入口袋中。然后用可吸收止血材料(SURGICEL,Johnson and Johnson,New Brunswick,NJ,USA)封闭切口部位以减少出血。手术植入后，将肝脏返回体内，腹部切口用5-0聚二恶烷酮可吸收线(AD Surgical,Sunnyvale,CA,USA)分2层闭合。
肿瘤植入后3、4或8周或当肿瘤如通过CT扫描所测量达到例如50-100mm3的平均肿瘤体积时，将研究前NSG小鼠动物按肿瘤体积匹配到治疗组或对照组(n＝10)以用于给药并在第0天开始给药。在第0天和第4天向动物静脉内给药。表21总结了用于试验抗Gal9G9.2-17 IgG1的研究设计。
表21.抗Gal9 IgG1试验条件
每周三次通过CT扫描获取肿瘤体积并对动物称重。研究终点设定在当对照组(无约束的)的平均肿瘤体积达到1,500mm3时。在研究达到终点的当天获取最终肿瘤体积。在研究达到终点的当天获取最终体重。
进行CT扫描以监测和评估肿瘤体积。在注射造影剂后4小时进行显微CT扫描(Inveon Micro-CT,Siemens,Germany)。造影剂(ExiTron nano 12000,Miltenyi Biotec,Germany)是一种用于小鼠肝脏CT成像的碱土基纳米颗粒造影剂。静脉内注射后，该剂被网状内皮系统的细胞(包括称为库普弗细胞的肝脏内的巨噬细胞)吸收。通过侧尾静脉向小鼠注射100μl剂(每只小鼠，25-30g体重)。
在预定的处死时间从小鼠收集PDX来源的肿瘤块。使用以下公式计算肿瘤体积：体积＝(W2×L)/2，其中W是最短直径，并且L是最长直径。用无菌PBS清洗切除的肿瘤。将一部分肿瘤切成1mm的立方体，用于植入接受者小鼠的肝脏。剩余的肿瘤用于肿瘤特征分析和冷冻保存。
如先前实施例所述进行炎症标志物的流式细胞术。
实施例10.在眼部黑素瘤患者中单独地或与抗PD1抗体联合使用抗半乳糖凝集素9单克隆抗体的研究
半乳糖凝集素9是一种被许多实体瘤(包括胰腺癌、结直肠癌和肝细胞癌)过度表达的分子。此外，半乳糖凝集素9在肿瘤相关巨噬细胞以及肿瘤内免疫抑制性γδT细胞上表达，从而充当癌症相关免疫抑制的有效介质。如本文所述，已经开发了靶向半乳糖凝集素9的单克隆抗体(例如，G9.2-17，IgG4)。数据表明，G9.2-17在原位KPC模型中使胰腺肿瘤生长停滞50％，并将KPC动物的生存期延长了多于一倍。不希望受理论束缚，据认为抗半乳糖凝集素9抗体将M2表型逆转至M1表型，促进肿瘤内CD8+T细胞激活。此外，已发现抗体G9.2-17(IgG4)(具有SEQ ID NO:19的重链和SEQ ID NO:15的轻链)与抗PD1协同作用。
此外，临床前概念验证数据表明G9.2-17(IgG4)(又名G9.2-17IgG4)在原位((LSL-Kras(G12D/±)；LSL-Trp53(R172H/+)；Pdx-1-Cre)-胰腺导管腺癌)KPC模型和Bl6F10黑素瘤皮下模型中作为单一剂使胰腺肿瘤生长减少多至50％。阻断半乳糖凝集素9还延长KPC动物的生存期。从机制上讲，靶向半乳糖凝集素9促进肿瘤内效应T细胞激活。有迹象表明G9.2-17抗体与抗PD-1在体内存在协同作用。也就是说，在Bl6F10黑素瘤模型中，相对于单独用任一单一剂治疗的组，在用抗半乳糖凝集素9抗体和抗PD-1治疗的组中观察到肿瘤内CD8+T细胞显著增加。在非GLP毒性研究中，G9.2-17(IgG4)在啮齿类动物中的多至(包括)100mg/kg和在猴中的多至(包括)300mg/kg的剂量下在啮齿类动物和食蟹猴中是安全的。
本研究的目的是确定在患有眼部黑素瘤(诸如转移性眼部黑素瘤)的受试者中在三个月治疗后的安全性、耐受性、最大耐受剂量或最大施用剂量(MTD)和客观肿瘤应答。该研究还检查了无进展生存期(PFS)、按照RESIST的应答持续时间、疾病稳定性、在3、6和12个月时存活的受试者的比例以及药代动力学(PK)和药效学(PD)参数。受试者经受治疗前和治疗后活检，以及研究前和研究期间每8周一次的PET-CT成像。此外，还检查了免疫学终点诸如外周和肿瘤内T细胞比率、T细胞激活、巨噬细胞分型和半乳糖凝集素9血清水平。该研究在主研究方案下进行，并且研究持续12-24个月。
本研究还旨在评价最大耐受剂量(或最大施用剂量)的安全性和耐受性、PK、PD、免疫原性、疗效应答结果、患者生存率和其他探索性参数。
主要目标包括安全性、耐受性、最大耐受剂量(MTD)、3个月时的客观肿瘤应答(ORR)。次要目标包括无进展生存期(PFS)、按照RECIST 1.1的应答持续时间、疾病稳定性、在3、6和12个月时的存活比例以及药代动力学(PK)和药效学(PD)参数。
受试者、疾病以及所有临床和安全性数据以平均值、中位数或比例描述性地呈现，并使用适当的方差度量(例如，95％置信区间范围)。Waterfall和Swimmers图用于以图形方式呈现每个疾病部位内每个研究臂的受试者的ORR和应答持续时间，如下所述。还进行了探索性相关分析，以鉴定可能与ORR相关的潜在生物标志物。所有统计分析均使用SAS 9.2版(SAS,Cary,NC)进行。
本研究包括G9.2-17(IgG4)的单一疗法以及G9.2-17与检查点抑制剂(诸如批准的抗PD-1/PD-L1抗体(例如，纳武单抗)或研究性抗PD-1/PD-L1抗体)的组合。参见以下实施例。在一些实施例中，G9.2-17的剂量范围可以是每两周一次约0.2mg/kg至16mg/kg或更高剂量水平。在其他实施例中，G9.2-17的剂量范围可以是每两周一次约3mg/kg至15mg/kg。通过静脉内输注施用抗体。
表22中总结了研究目标、持续时间和研究群体。
表22.研究概述
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研究设计
患者群体：在3+3剂量递增第1阶段(下文公开)中的所有转移者，然后在眼部黑素瘤(例如在第1阶段中捕获作用模式和/或早期疗效信号的肿瘤类型)中扩展。
第1阶段
将使用连续重评估方法(CRM)(O'Quigley等人(1990))进行剂量探索研究，CRM是一种根据过去的试验数据告知应如何针对下一个患者群组调整抗Gal9抗体的剂量的基于模型的设计。当抗半乳糖凝集素9抗体作为单一剂施用时，研究的第1阶段是3+3剂量探索和安全性。
使用单参数功效模型来描述G9.2-17(IgG4)的剂量与观察到剂量限制性毒性(DLT)的概率之间的关系。DLT被定义为临床上显著的非血液学不良事件或异常实验室值，评估为与转移性肿瘤疾病进展、间发疾病或伴随用药无关，并且与研究药物有关且发生在研究的第一周期内，符合以下任何一项标准：
1.任何持续时间的所有4级非血液毒性
2.所有3级非血液毒性。例外情况如下：
-不需要住院或TPN支持，并且可以在48小时内通过支持性护理管理到<2级的3级恶心、呕吐和腹泻。
-在24小时内校正为<2级的3级电解质异常。
DLT时期＝一(1)个周期，即在每个周期的第1天和第15天的两次剂量的抗Gal9抗体。
●AE/CTAE和SAE的发生率和严重度，包括实验室参数、生命体征和ECG的临床显著变化
●DLT、PK和PD的发生率
●血浆PK参数(例如，AUC0-24h、Cmax、Tmax、估计的半衰期)；血清浓度相对时间曲线
●客观应答率(完全应答和部分应答)和临床获益率(客观应答和稳定疾病3个月或更长时间)；无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)、疾病控制率(DCR)
血液和肿瘤免疫分型、半乳糖凝集素9血清、血浆水平，以及肿瘤、间质、免疫细胞的组织表达水平和表达模式、应答时间(TTR)和其他生物标志物分析、CT(PET)成像/其他临床指示成像方式。
OBD是DLT的估计概率小于或等于25％的靶标毒性水平(TTL)的最大剂量。一次向两例患者给药，最大可用样品量为24。作为安全预防措施，在每次剂量递增时，只有在每个群组的第一例患者已接受抗Gal9抗体治疗并且治疗后至少7天过去后，才将纳入和治疗新患者。
剂量范围显示在下表23中并且抗体每两周(Q2W)静脉内施用一次。
表23：按群组给药
A如果前3例患者均未经历剂量限制性毒性(DLT)，则另外3例患者接受下一个更高剂量水平的治疗。然而，如果这三例患者中有一例具有DLT，则另外3例患者接受相同剂量水平的治疗。剂量递增一直持续到3至6例患者的群组中至少有2例患者经历DLT。第II阶段的剂量是刚好低于表现出毒性的水平的剂量。
B当≤1例患者有应答时，对应的试验臂终止
剂量递增遵循修正的斐波那契数列，其中剂量增加先前的第一剂量的100％，然后增加前次剂量的67％、50％、40％和30％。如果前三例患者均未经历剂量限制性毒性(DLT)，则另外三例受试者接受次高剂量水平的治疗。或者，如果这三例受试者中有一例具有DLT，则另外三例受试者接受相同剂量水平的治疗。剂量递增一直持续到三至六例患者的群组中至少有两例患者经历DLT。
在替代设计中，当连续六例患者接受相同剂量且该剂量将被鉴定为OBD时，将完成第1阶段。在CRM设计中总共要评价5个剂量水平。
1.剂量水平1＝2mg/kg
2.剂量水平2＝4mg/kg
3.剂量水平3＝8mg/kg
4.剂量水平4＝12mg/kg
5.剂量水平5＝16mg/kg
6.给药方案：Q2W
7.施用途径：静脉内(IV)
施用途径：静脉内(IV)
第2阶段
该研究的第2阶段是Simon的两阶段优化设计。该研究调查了抗半乳糖凝集素9抗体的单独使用(研究的单剂臂)和与纳武单抗的结合使用(每两周一次施用的240mg固定剂量；研究的IO联合臂)。所使用的抗半乳糖凝集素9抗体的剂量低于在I期阶段发现的表现出毒性的水平。
在一些情况下，抗Gal9抗体将作为单一剂进行试验。或者，将抗Gal9抗体与批准的抗PD-1mAb(例如，纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗或替雷利珠单抗)联合进行试验。
最佳的两阶段设计用于检验ORR≤5％的零假设相对ORR≥15％的替代(单剂臂内)。在第一阶段对23例患者进行药物试验后，如果≤1例患者有应答，则终止对应的试验臂。如果试验继续进行到Simon优化设计的第二部分，则每个单剂臂中总共招募56例患者。如果应答患者总数≤5，则摈弃该臂内的药物。如果≥6例患者在3个月时有ORR，则激活该臂的扩展群组。上述方法适用于研究的单剂臂。
对于IO联合臂，G9.2-17 IgG4的起始剂量比第1部分中确定的RP2D剂量水平(RP2D–1)低一个剂量。为了确保患者安全性，申办方计划了安全试运行，其中前8例患者接受联合用药，并且只有≤2例患者出现DLT(低于25％的TTL)时，该臂才会继续。如果3例或更多患者出现DLT，G9.2-17 IgG4的剂量将根据临床医生的评估减少一个减少水平或至少减少30％(剂量水平-1)。如果需要，允许进行剂量水平-1的30％的再一次剂量减少(剂量水平-2)。不允许进一步减少剂量。仅当研究者评估正在获得临床益处并且可在剂量减少条件下继续获得临床益处时，才允许将剂量减少至剂量水平-1和-2。
对于抗PD-1mAb联合臂，最优的两阶段设计也用于检验ORR≤10％的零假设相对ORR≥25％的替代。在第一阶段对18例患者进行联合用药试验后，如果≤2例患者有应答，则终止对应的试验臂。如果试验继续进行到Simon优化设计的第二部分，则每个联合臂中总共招募43例患者。如果应答患者总数≤7，则摈弃该臂内的联合。如果≥8例患者在3个月时有ORR，则激活该臂的扩展群组。
第3阶段
第3阶段包括在已检测到早期疗效信号的情况下对群组的扩展。如果在六个试验臂之一内鉴定到可归因于肿瘤类型的有希望的疗效信号，则启动扩展群组以确认该发现。每个扩展臂的样品量是基于第2阶段中确定的点估计值，结合ORR周围95％置信区间(95％CI)的预定精度水平确定的。
本研究分析了治疗前和治疗后活检样品，例如，按照临床指示对研究前和Q6/8W的PET-CT进行成像。PK、PD、免疫学终点包括外周和肿瘤内T细胞比率、T细胞激活、巨噬细胞分型、半乳糖凝集素9血清水平和半乳糖凝集素9组织表达水平。
剂量和施用
在第1部分和第2部分中，每两周(Q2W)通过静脉内(IV)输注施用G9.2-17 IgG4，直至出现疾病进展、不可接受的毒性或撤回同意书。如果患者正在经历临床益处，则根据研究者的判断并与研究医学监查员讨论后，经历剂量限制性毒性的受试者可以恢复G9.2-17IgG4施用。可执行30％或50％的剂量减少，或者根据研究者的临床判断并经医学监查员和申办方同意。剂量减少30％将被视为剂量水平-1。对先前剂量水平的30％或50％的下一次剂量减少视为剂量水平-2。不允许超过两次这样的剂量减少。
第1部分：受试者根据CRM设计接受单独的G9.2-17 IgG4。
第2部分：受试者接受作为单一剂的G9.2-17 IgG4的RP2D或G9.2-17 IgG4与抗PD-1的组合(使用第1部分中确定的RP2D)。但是，在联合臂的情况下，前8例患者接受给药，并且如果≤2例患者出现DLT(低于30％的靶标毒性水平(TTL))，则继续该臂。如果超过3例患者发生被确定为与G9.2-17 IgG4相关且与联合使用的药物/方案无关的DLT，则G9.2-17 IgG4的剂量将降低至RP2D-1剂量水平(G9.2-17IgG4的30％剂量减少或根据临床医生的评估)。
研究目标和研究群体
有关研究目标和研究群体参见上文表22。
患者纳入标准：
1.书面知情同意书(心智健全、有理解能力且愿意签署知情同意书)
2.年龄>18岁的男性或未怀孕女性
3.组织学证实的不可切除的转移性癌症。患有可切除的疾病的患者被排除在外。
4.由研究者判断能够遵守研究方案
5.预期寿命>3个月
6.东部肿瘤协作组(ECOG)行为状态0-1(表24)
7.有近期存档的肿瘤样品可用于生物标志物分析。必须提供自获得活检样本以来所接受的治疗的信息。研究者的判断将用于确定存档样本本身是否可接受。
8.如果可用，应记录根据第5点中的纳入标准通过IHC对存档样本评估的半乳糖凝集素9肿瘤组织表达水平。
9.患者能够并愿意经受治疗前和治疗中/治疗后活检。根据研究者的判断，计划的活检不应使患者暴露于显著增加的并发症风险。尽一切努力在重复活检中对同一病灶进行活检。
10.根据RECIST v1.1，可测量的疾病。请注意，拟进行活检的病灶不应是靶标病灶。
11.根据研究者判断预期生存期>3个月
12.对于第1部分：没有可用的护理标准选择，或患者拒绝了可用和指示的护理标准治疗，或不符合可用和指示的护理标准治疗。对于第2部分：扩展群组-在转移性癌症环境中接受至少一种全身性治疗线，以及未接受过含吉西他滨的方案或距离使用含吉西他滨的方案的治疗至少6个月的患者。CCR和CCA扩展群组-在转移性环境中接受至少一种先前治疗线。
13.允许在研究期之前或期间接种COVID-19疫苗。必须记录有关疫苗接种的时间和类型的信息。
14.东部肿瘤协作组(ECOG)行为状态0-1/卡氏评分>70(请尽可能记录两者)
15.MSI-H和MSS患者将被允许进入研究的第1部分(第1阶段)
16.充分的血液学和终末器官功能，由在研究药物治疗的第一剂量前28天内和研究药物的任何连续剂量前72小时内获得的以下实验室结果定义：第1部分中的中性粒细胞计数≥1x109/L，血小板计数≥100x109/L，HCC≥50x109/L。在前一周未输血的情况下血红蛋白≥9g/dL，肌酐≤1.5ULN，肌酐清除率≥30mL/min，AST(SGOT)≤3X ULN(当存在HCC或肝转移时≤5 x ULN)，ALT(SGPT)≤3 X ULN(当存在HCC或肝转移时，≤5 x ULN)，胆红素≤1.5X ULN(患有已知吉尔伯特病的患者的胆红素可≤3.0×ULN)，白蛋白≥3.0g/dL，INR和PTT≤1.5×ULN；淀粉酶和脂肪酶≤1.5×ULN。
●如果先前诊断出脑转移灶，则必须在筛选前4周或更长时间完成脑部疾病治疗，无论是手术还是放射治疗，或者在研究开始前至少3个月脑部疾病稳定。在这种情况下，需要进行脑部MRI以证明目前没有进展性脑转移灶的证据，并且没有新的脑部疾病和/或软脑膜疾病，
●患者必须在研究开始前至少28天停止使用类固醇治疗脑转移灶。
17.研究开始前4周内无活动性感染的证据且无严重感染
18.有生育能力的女性必须在开始治疗前72小时内具有阴性妊娠试验。对于有生育能力的女性：同意在治疗期间和最后一次研究治疗后至少180天内保持禁欲(避免异性性交)或使用导致每年<1％的失败率的避孕方法。如果女性处于月经初潮后、未达到绝经后状态(≥12个连续月的闭经且除更年期以外没有确定的原因)且未接受手术绝育(切除卵巢和/或子宫)，则她具有生育潜力。每年<1％的失败率的避孕方法的实例包括双侧输卵管结扎、男性绝育、抑制排卵的激素避孕药、释放激素的宫内节育器和宫内铜节育器。应根据临床试验的持续时间以及患者的偏好和惯常生活方式来评价性禁欲的可靠性。定期禁欲(例如，日历(calendar)、排卵、症状热(symptom-thermal)或排卵后方法)和体外排精(withdrawal)是不可接受的避孕方法。有生育能力的男性在研究期间必须采用有效的避孕方法，除非存在不孕症的记录。
19.自最后一剂抗癌治疗后在第一次G9.2-17 IgG4施用前有四(4)周或5个半衰期(以较短者为准)
20.对于在C1D1之前已经稳定至少6个月的骨转移，允许继续使用双膦酸盐治疗(唑仑膦酸)或狄诺塞麦。
21.允许胆道或胃出口梗阻，前提是通过内窥镜、手术或介入手段有效引流
22.允许胰腺、胆道或肠瘘，前提是它们通过适当的非感染和通畅的引流进行控制(如果有任何引流或支架在原位，需要在研究开始前确认通畅)
附加标准，仅适用于第1部分：
23.患者：
a)已经接受过至少一种先前的转移性疾病全身性治疗线，或
b)肿瘤类型没有可用的护理标准选择。
附加标准，仅适用于第2部分：
24.扩展群组：一线转移性患者，未接受过含吉西他滨的方案，或距离先前在新辅助或辅助/局部晚期环境中使用含吉西他滨的方案的治疗至少3个月。
25.扩展群组-在转移性环境中接受至少一种先前治疗线的患者。
表24.ECOG行为状态*
●发表于Am J Clin Oncol：Oken MM、Creech RH、Tormey DC等人Toxicity andresponse criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group.Am J ClinOncol.1982；5:649-655。
患者排除标准：
1.被诊断患有不明原发灶的转移性癌症的患者
2.不愿意或不能遵守方案要求
3.以前或现在的违禁药物成瘾(医用和娱乐用大麻/大麻二酚(CBD)/四氢大麻酚(THC)不被视为“违禁”)
4.临床显著的、活动性不受控制的出血，以及任何具有出血体质(例如，活动性消化性溃疡病)的患者。允许防治性或治疗性使用抗凝剂。
5.孕期或哺乳期女性
6.在研究的第1周期、第1天之前施用药物的4周或5个半衰期(以较短者为准)内接受任何其他研究性剂或参与涉及用于治疗实体瘤的另一种研究性剂的任何其他临床试验或自同意日起4周内接受其他研究性治疗或大手术，或在预期研究开始后4周内进行计划的手术(包括牙科手术)。
7.在研究药物的第一剂量后4周内接受放射疗法，但对有限区域的姑息性放射疗法除外，例如用于治疗骨痛或局灶性疼痛肿瘤块，且不危及应答评估所需的可测量病灶(RECIST v1.1)。
8.具有真菌性肿瘤块的患者
9.无远处器官转移性沉积的局部晚期眼部黑素瘤患者。
10.由于先前的癌症治疗，≥CTCAE 3级毒性(脱发和白癜风除外)。使用先前的检查点抑制剂的4级免疫介导的毒性。2级或3级肺炎或导致免疫疗法治疗中断的任何其他3级检查点抑制剂相关毒性。允许出现低级(<3级)毒性，诸如先前治疗引起的神经病变、可控制的电解质异常和淋巴细胞减少症、脱发和白癜风。
11.二次恶性肿瘤病史，但先前超过五年以治愈性意图治疗且未复发或复发可能性低的患者除外(例如非黑色素性皮肤癌、原位宫颈癌、早期(或局限性)前列腺癌或浅表性膀胱癌)
12.活动性脑或软脑膜转移。脑转移患者符合条件，前提是他们在确定性治疗后至少4周内表现出临床和放射影像学稳定的疾病(SD)，并且在研究药物的第一剂量前至少4周内未使用类固醇(>10mg/天的泼尼松或等效物)
13.重度或不受控制的全身性疾病、充血性心力衰竭>纽约心脏协会(NYHA)2级、6个月内心肌梗塞(MI)的证据，或在研究者看来使患者参与试验不合需要的实验室发现
14.研究者认为严重危及患者安全或损害G9.2-17 IgG4毒性评估的解释的任何医疗状况
15.严重的不愈合伤口、活动性溃疡或未经治疗的骨折
16.不受控制的胸腔积液、心包积液或腹水，需要反复引流手术。出于本研究的目的，“复发”定义为在过去30天内进行了≥3次引流。
17.对嵌合或人源化抗体或融合蛋白有重度变应、过敏或其他超敏反应史
18.在第1周期第1天的6个月内发生重大血管疾病(例如，需要手术修复的主动脉瘤或近期动脉血栓形成)
19.在第1周期天之前2或3个月内有肺栓塞、中风或短暂性脑缺血发作史
20.在第1周期第1天之前6个月内有腹瘘或胃肠穿孔史
21.活动性自身免疫性病症(I型糖尿病、仅需要激素替代治疗的甲状腺功能减退症、白癜风、银屑病或脱发除外)
22.需要全身性免疫抑制治疗，包括但不限于(环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、沙利度胺和抗肿瘤坏死因子[抗TNF]剂)。已接受或正在接受急性、低剂量、全身性免疫抑制剂药物(例如，地塞米松或泼尼松龙)的患者可以入组。替代疗法(例如，用于肾上腺或垂体功能不全的甲状腺素、胰岛素、生理性皮质类固醇替代疗法((例如，≤10mg/天的泼尼松等效物))不被视为全身性治疗的形式。允许使用吸入性皮质类固醇和盐皮质激素(例如，氟氢可的松)、局部类固醇、鼻内类固醇、关节内类固醇和眼科类固醇。
23.重度肿瘤相关疼痛(≥3级，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)v.5.0)，对广泛镇痛干预(口服和/或贴剂)无应答
24.不受控制的高钙血症，尽管使用了双磷酸盐
25.任何其他疾病、代谢功能障碍、体格检查发现或临床实验室发现，使得合理怀疑患有禁止使用研究性药物或可能影响结果的解释或使患者处于治疗并发症的高风险的疾病或疾患
26.接受器官移植
27.正在经历透析
28.对于纳入纳武单抗联合群组的患者，在任何先前的治疗线中均未暴露于任何抗PD-1或抗PD-L1剂。另外，诊断为dMMR/MSI-H的患者被排除在外。
29.对于第1部分，对于患有转移性去势抵抗性前列腺癌的患者，允许继续进行激素雄激素剥夺疗法。
研究评估
评估时间表在给药前筛选(其可发生在治疗开始之前长达4周)之后分为2周周期。研究评估包括由合格的医师、从业者或医师助理进行的医学和体格检查。采集的医学史包括肿瘤史、放射治疗史、手术史、当前和过去用药史。评估包括再分期扫描(有造影剂的CT、有造影剂的MRI、PET-CT(诊断性CT)和/或X射线)。
评估还包括肿瘤活检(从第1剂量前开始并在可行的情况下重复活检)，这取决于扫描。或者，可以在给药前使用存档组织。
按肿瘤类型的相关肿瘤标志物，例如Ca15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白等，在每个周期给药前进行评估(治疗6个月后可减少至每3个周期进行评估，按照与再分期扫描相同的时间表)，视情况而定。评估还包括生命体征、ECOG、不良事件、血细胞计数、血液化学、凝液(凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(PTT)、活化部分凝血活酶时间(APTT))、血液和肿瘤生物标志物分析(免疫分型、细胞因子测量)和尿液分析(比重、蛋白质、白细胞酯酶、葡萄糖、酮、尿胆素原、亚硝酸盐、WBC、RBC和pH值)。血清化学包括葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、HgbA1c、血尿素氮、CPK、TSH、fT4、脂肪酶、淀粉酶、PTH、睾酮、雌二醇、催乳素、FSH、LH、CRP。
有造影剂的CT是再分期扫描的优选方式(如果考虑到疾病位置，CT不可行或不合适，则MRI、PET-CT和/或其他成像方式代替CT扫描或补充CT扫描)。每6至8周+/-1周进行评估，如果在过去4至6周内未进行评估，则在治疗结束时进行评估。
收集患者的血液样品用于常规临床实验室检查，包括血液学和血清化学。
血液化学包括以下：葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK、TSH、fT4、PTH、雌二醇、催乳素、睾酮、FSH、LH、γ谷氨酰转移酶(γGT)、血红蛋白A1c(HgbA1c)(仅当有1型或2型糖尿病史时)、脂肪酶、淀粉酶、游离皮质醇(在规定访视时另外包括)。
(A)按访视的评估
下面的评估时间表的表(表25)提供了待在筛选期(多至28天)、治疗期(以28天周期表示)、治疗结束/提前终止期、IMAR随访和长期随访期进行的评估的清单。
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在COVID-19大流行期间，许多政府要求公民保持社交距离，并建议更多弱势群体进行自我隔离。这些类型的限制可能会影响按原计划进行这项临床研究的能力。可以调整计划的研究中心访视，以便研究可以在大流行期间安全地继续进行。批准的可能的修改可包括：
●访视和/或研究程序延期
●以打电话/视频通话代替
●以家庭访视代替
●在替代临床地点进行访视
●由研究团队以外的医疗保健提供者执行访视
●访视和/或研究程序完全取消。
(B)筛选期(第-28天与第-1天之间)
以下程序必须在开始治疗后4周内进行：
研究程序和检查
●书面知情同意书
●核实患者资格的纳入和排除标准
●患者人口统计数据
●医学史
●既往和伴随用药
●ECHO/多门采集扫描(MUGA)
●12导联ECG(使用Fridericia公式校正的QT间期[QTcF])
●体格检查-在具有稳定且预先治疗过的脑转移患者中进行神经系统检查
●ECOG行为状态
●生命体征
●肿瘤成像评估(有或无造影剂的计算机断层扫描[CT]或磁共振成像(MRI)；或正电子发射断层扫描(PET)-CT；优选有造影剂的CT)
临床实验室
●妊娠试验，适用于有生育能力的妇女(WOCBP)
●血液学
●血清化学
●促甲状腺激素(TSH)、游离T4或甲状腺素(fT4)、血清脂肪酶、淀粉酶、甲状旁腺激素(PTH)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、游离皮质醇
●凝血
●尿液分析
药效学和药代动力学
●肿瘤活检
■如果认为活检对患者有风险，则可以省略该程序。
■如果活检不可用，研究中心将尽一切努力获得作为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块可得的存档肿瘤组织样品。可接受的存档样品包括过去五年内通过核心针活检或切除手术获得的样品。
●dMMR-MSI-H状态(如果之前未确定患者的MMR和MSI状态，则必须在当地实验室进行检查)
●组织中的TMB仅适用于第2部分G9.2-17 IgG4+抗PD1抗体组合臂
●肿瘤类型相关生物标志物
(C)治疗期
每个治疗周期的持续时间为28天。参见评估时间表的表。对于在治疗期间确诊的COVID-19感染，
每个周期第1天(CXD1；第2周期开始±2天)的治疗程序
在每个治疗周期的第1天执行以下程序。
研究程序和检查
●伴随用药
●AE
●12导联ECG(QTcF)
●体格检查
●ECOG行为状态
●生命体征
临床实验室
●WOCBP妊娠试验
●血液学
●血清化学
●TSH、fT4、脂肪酶、淀粉酶、PTH、FSH、LH、游离皮质醇
●凝血
●尿液分析
PK/PD评估
●PD血液采样
●PK血液采样
●ADA血液采样
●肿瘤类型相关生物标志物
研究药物施用
●仅在所有给药前评估和程序完成后才施用。另外，从第3周期的第1天开始，将每8周进行以下评估：
●肿瘤成像评估(有或无造影剂的CT或MRI；或PET-CT；优选有造影剂的CT)此外，从第4周期的第1天开始，将每3个月进行以下评估：
●ECHO/MUGA
第1周期和第3周期第2天和第8天(CXD2±1天和CXD8±1天)的治疗程序
研究程序和检查
●伴随用药
●AE
PK/PD评估
●PD血液采样
●PK血液采样
每个周期第15天(第1周期CXD15±1天，第2周期开始±2天)的治疗程序
将在每个治疗周期的第15天执行以下程序。
研究程序和检查
●伴随用药
●AE
●体格检查
●ECOG行为状态
●生命体征
临床实验室
●血液学
●血清化学
●凝血
●尿液分析
PK/PD评估
●仅在C1D15和C3D15进行PD血液采样
●仅在C1D15和C3D15进行PK血液采样
●肿瘤类型相关生物标志物
●C3D15±7天肿瘤活检(仅第3周期；如果认为对患者来说风险太大，可能会被取消)
研究药物施用
●仅在所有给药前评估和程序完成后才施用。
第4周期之后的另外治疗
第4周期之后的治疗周期可以按照评估时间表的表中的指示重复。如果患者正在经历临床益处，即使在放射学进展的情况下，患者也可以继续治疗。
治疗结束或提前终止程序
以下程序在最后一次给药后30天(±3天)进行，包括提前停止治疗的患者。
研究程序和检查
●伴随用药
●AE
●体格检查
●ECOG
●生命体征
●肿瘤成像评估：如果在上次扫描后>8周研究结束，则进行确认扫描。
临床实验室
●WOCBP妊娠试验
●血液学
●血清化学
●TSH、fT4、脂肪酶、淀粉酶、PTH、FSH、LH、游离皮质醇
●凝血
●尿液分析
PD评估
●PD血液采样
●ADA血液采样
●肿瘤类型相关生物标志物
IMAR 90天随访
在第2部分中接受纳武单抗或替雷利珠单抗联合治疗的所有患者必须在第90±7天返回进行安全性随访，以便评价任何可能的延迟IMAR。访视将包括以下内容：
研究程序和检查
●AE
●体格检查
●生命体征
临床实验室
●血液学
●血清化学
●TSH、fT4、脂肪酶、淀粉酶、PTH、FSH、LH、游离皮质醇
●凝血
●尿液分析
长期随访
一旦患者完成治疗期，对于因疾病进展以外的原因而停止治疗且未接受额外全身性抗癌治疗的患者，在患者进行治疗结束/提前终止访视后，每3个月进行一次随访，持续长达2年。对于因疾病进展以外的原因而停止治疗且未接受额外全身性抗癌治疗的患者，将在可能的情况下继续进行肿瘤成像评估。
将至少每3个月收集一次生存数据以及在疾病进展后开始的任何新抗癌治疗的信息。可以更频繁地收集生存数据，以支持数据清理或监管提交工作。
(D)疗效评估
评估时间表的表中提供了所有疗效评估的计划时间点。
研究性产品、剂量和施用
研究干预施用
所有患者将每2周通过IV输注接受G9.2-17 IgG4，直至出现疾病进展、不可接受的毒性或撤回同意书。
在第1部分中，根据CRM设计，患者将接受单独的G9.2-17 IgG4，剂量从0.2mg/kg开始依次递增。
在第2部分中，患者将接受作为单一剂的G9.2-17 IgG4的RP2D(如在第1部分中确定)或G9.2-17 IgG4 RP2D-1与检查点抑制剂(诸如纳武单抗或替雷利珠单抗，基于每种眼部黑素瘤类型)的组合。
有关每项研究干预的概要描述参见下表26。在第1部分中经历DLT的患者将不恢复治疗。在第2部分中经历DLT的患者将中断治疗。如果他们正在经历临床益处，他们的治疗可能会以相同或减少剂量的G9.2-17 IgG4恢复。
表26研究干预的概要特征
IMP：研究性医药产品，IV：静脉内，mAb：单克隆抗体，RP2D：建议的2期剂量；RP2D-1：紧接在RP2D之前的群组中的剂量水平
剂量修改
是否继续使用G9.2-17 IgG4的下一个剂量水平的决定将基于在先前剂量水平下至少2例患者中获得的安全性、耐受性和初步PK数据做出。
还可以基于获得的PK数据调整给药方案。
详细的剂量修改说明如下(本文公开)：
由G9.2-17 IgG4引起的免疫介导的不良反应(IMAR)的管理
由G9.2-17 IGG4+纳武单抗或替雷利珠单抗联合治疗引起的免疫介导的不良反应(IMAR)的管理
针对AE(IMAR除外)的(纳武单抗)的建议剂量修改
G9.2-17 IGG4的建议剂量修改(针对DLT窗口外的AE且IMAR除外)
剂量施用
如遇到输注相关反应，中断输注，且如有临床指征，施用相关药物(例如，抗组胺药、止吐药、类固醇、退热药、β受体阻断剂等)。如果认为恢复输注是适当的，则以较慢的输注速率恢复。
对于同一患者的后续周期，按照临床指示需要应用适当的术前药物(抗组胺药、止吐药、类固醇、退热药、β受体阻断剂等)并考虑采用较慢的输注速率。
剂量延迟
如果发生可能与一种或多种研究药物相关的任何具有临床意义的≥3级的AE，将与医学监查员讨论然后再继续给药。对于≥3级的AE，可能需要剂量延迟。
剂量递减
第1部分
CRM设计将指导剂量递增和递减。在CRM设计中总共将评价6个剂量水平：
●剂量递增群组1＝0.2mg/kg
●剂量递增群组2＝0.63mg/kg
●剂量递增群组3＝2mg/kg
●剂量递增群组4＝6.3mg/kg
●剂量递增群组5＝10mg/kg
●剂量递增群组6＝16mg/kg
在每个2例患者群组之后，CRM模型将建议对下一个2例患者群组增加到下一个剂量水平，保持相同剂量水平或减少到前一个剂量水平。
剂量减少
任何正在接受DLT评价的患者(在28天DLT窗口内)都不允许减少剂量。如果需要减少剂量，研究干预将按如下方式施用：
对于第1部分和第2部分使用单独的G9.2-17 IGG4的患者：仅当评估正在获得临床益处并且可在剂量减少条件下继续获得临床益处时才允许减少剂量，有关建议剂量修改以及IMAR或其他AE管理参见下表。参见下文表27和表28。
表27.G9.2-17 IgG4的建议剂量修改(DLT窗口外的AE且IMAR除外)
表28.由G9.2-17 IgG4引起的免疫介导的不良反应(IMAR)的管理
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纳武单抗
纳武单抗是一种程序性死亡受体1(PD-1)阻断抗体，适用于治疗多种肿瘤类型。在28天的周期中，每2周以240mg在30分钟内作为静脉内输注施用(除非另有指导)。根据FDA标签，纳武单抗施用没有禁忌症。纳武单抗AE根据其发生频率呈现在下文表33至表34中。
针对与纳武单抗施用有关的特定AE的剂量修改
下文提供了基于特定AE的纳武单抗修改建议。对于甲状腺功能减退症或甲状腺功能亢进症，没有纳武单抗建议剂量修改。
针对AE(IMAR除外)的纳武单抗建议剂量修改提供于下表29中：
表29.纳武单抗的建议剂量修改
/>
*根据NCI CTCAE V4对毒性进行分级。
a)当不良反应改善至0级或1级时恢复治疗，来源：OPDIVO Highlights ofPrescribing Information，2019年4月修订。
针对IMAR的剂量修改
如果发生IMAR，请参见本文提供的关于G9.2-17 IgG4、纳武单抗的剂量管理的指南。
表30根据频率报告的纳武单抗的不良事件(非IMAR相关)
来源：第6.1节，OPDIVO包装插页
表31视为IMAR报告的纳武单抗的不良事件*
由G9.2-17 IgG4和纳武单抗的组合引起的IMAR的管理指南提供于下表35中：
表32.由G9.2-17 IgG4+纳武单抗联合治疗引起的免疫介导的不良反应(IMAR)的管理
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来源：纳武单抗Highlights of Prescribing Information,
2019年4月修订。
替雷利珠单抗
替雷利珠单抗是一种抑制PD-1的mAb药物，正在开发用于治疗癌症。替雷利珠单抗配制在带橡胶塞的一次性玻璃小瓶(20R玻璃，USP I型)中，用于IV注射，在10mL缓冲等渗溶液中总共含有100mg替雷利珠单抗mAb。替雷利珠单抗在28天的周期中每4周以300mg在大约30分钟内作为静脉内输注施用(除非另有指导)。
替雷利珠单抗的活性成分是一种针对PD-1的人源化IgG4变体mAb，以高特异性和亲和力(KD＝0.15nM)与人PD-1的ECD结合。替雷利珠单抗的赋形剂包括：柠檬酸钠二水合物、柠檬酸一水合物、L-组氨酸盐酸盐一水合物、L-组氨酸、海藻糖二水合物、聚山梨酯-20和WFI。替雷利珠单抗竞争性地阻断PD-L1和PD-L2的结合，抑制PD-1介导的负信号传导，并在基于细胞的体外测定中增强T细胞中的功能活性。另外，替雷利珠单抗在几种人癌症同种异体异种移植模型和人PD-1转基因小鼠模型中显示出抗肿瘤活性。
通过体外测定，IgG4变体抗体对FcγRIIIA和C1q具有非常低的结合亲和力，表明在人体内具有较低或不具有ADCC和CDC效应。与天然IgG4抗体不同，通过体外测定替雷利珠单抗没有可观察到的Fab臂交换活性，预测该抗体在体内是稳定的，不太可能形成双特异性抗体。
在各种晚期实体瘤中，替雷利珠单抗暴露与疗效之间的暴露-反应(E-R)关系支持300mg Q4W方案。预计300mg Q4W方案在安全性或疗效结果方面与200mg Q3W方案没有临床差异。
替雷利珠单抗的安全特性与治疗相关的3级或以上毒性发生率相对较低的药物的治疗类别一致。
替雷利珠单抗AE根据其发生频率呈现在下表33中。表34中总结了可能与IMAR相关的已报告AE。
当与G9.2-17 IgG4联合给予时，有关替雷利珠单抗相关IMAR的剂量修改和管理，请参见表35。表36涉及非IMAR相关AE的管理。
表33.根据频率报告的替雷利珠单抗的不良事件(非IMAR相关)
/>
通过破坏PD-1介导的信号传导，替雷利珠单抗可恢复抗肿瘤免疫并阻止肿瘤生长的进展。这种免疫系统活性的恢复可能导致涉及一个或多个身体系统的免疫相关不良反应，在极少数情况下可能危及生命或致命。虽然这些事件通常在使用替雷利珠单抗治疗期间变得明显，但它们也可能在停止替雷利珠单抗治疗后发生。
表34.视为IMAR报告的替雷利珠单抗的不良事件*
/>
剂量修改
在第1部分中，是否继续使用G9.2-17 IgG4的下一个剂量水平的决定将基于在先前剂量水平下至少2例患者中获得的安全性、耐受性和初步PK数据做出。
还可以基于获得的PK数据调整给药方案。详细的剂量修改说明提供于下文表35至表36中。有关由G9.2-17 IgG4引起的IMAR的管理和建议剂量修改，另见上文表27和表28。
表35：由G9.2-17 IgG4+替雷利珠单抗联合治疗引起的免疫介导的不良反应(IMAR)的管理
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/>
对于联合臂中发生的非IMAR、血液学和非血液学AE，根据因果关系评估：
○如果是G9.2-17 IgG4相关，请遵循G9.2-17 IgG4的AE管理说明
○如果是联合药剂相关(替雷利珠单抗)，请遵循表36中针对替雷利珠单抗的管理说明。
表36：针对AE(IMAR除外)的替雷利珠单抗的建议剂量修改
*根据NCI CTCAE V5对毒性进行分级。
伴随疗法
参与者在入选时正在接受的或在研究期间接受的任何药物或疫苗(包括非处方药或处方药、消遣性药物、维生素和/或草药补充剂)必须连同以下信息一起记录：
●使用原因
●施用日期，包括开始和结束日期
●剂量信息，包括剂量和频率
准许药物
允许使用以下伴随用药：
●接受联合治疗方案的患者的任何护理标准术前用药。
●对于在治疗(C1D1)之前已经稳定至少6个月的骨转移，继续使用双膦酸盐治疗(例如，唑仑膦酸)或狄诺塞麦，
●吸入性皮质类固醇和盐皮质激素(例如，氟氢可的松)、局部类固醇、鼻内类固醇、关节内类固醇和眼科类固醇
●防治性或治疗性使用抗凝剂
●允许在研究期之前或期间接种COVID-19、普通流感和/或其他常见临床所需适应症(例如破伤风、肺炎球菌、HBV等)的疫苗。必须记录疫苗接种的时间和类型。
违禁药物
在本研究中不允许使用以下药物：
●为任何适应症伴随施用其他研究剂，G9.2-17 IGG4除外
●全身性免疫抑制治疗，包括但不限于环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、沙利度胺和抗TNF剂。但是，允许患者服用急性、低剂量的全身性免疫抑制药物(例如，≤10mg/天的泼尼松或等效物)。
●替代疗法(例如，用于肾上腺或垂体功能不全的甲状腺素、胰岛素、生理性皮质类固醇替代疗法[例如，≤10mg/天的泼尼松等效物])不被视为全身性治疗的形式。
研究程序和评价
●AE/CTAE和SAE的发生率和严重度，包括实验室参数、生命体征和ECG的临床显著变化
●DLT、PK和PD的发生率
●血浆PK参数(例如，AUC0-24h、Gm.、Tmax、估计的半衰期)；血清浓度相对时间曲线
●客观应答率(完全应答和部分应答)(ORR)和临床获益率(客观应答和稳定疾病3个月或更长时间)；无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)、疾病控制率(DCR)
●血液和肿瘤免疫分型、半乳糖凝集素9血清、血浆水平，以及肿瘤、间质、免疫细胞的组织表达水平和表达模式、应答时间(TTR)和其他生物标志物分析、CT(PET)成像、其他临床相关成像。
安全性监查
由医学监查员执行常规安全性监查。安全性监查(包括PK的分析)将由安全性监查委员会(SMC)进行，该委员会由主要研究者(和必要时的合作研究者)和申办方代表以及研究指定的医学监查员组成。其他研究者和研究团队成员将根据需要参与审查。这项开放标签研究不使用独立数据监察委员会。
在第1阶段，剂量递增阶段，在对每个群组的第1周期进行审查后，将剂量递增进行至下一个群组。由SMC使用安全性和可用的PK数据来评估每个群组中所有患者的剂量限制性毒性(DLT)。作为安全预防措施，在剂量递增期间，只有在每个群组的第一例患者已接受抗Gal9抗体治疗并且治疗后过去至少7天，才纳入和治疗新患者。在第1周期完成后，对每例患者进行选择DLT安全性分析。
剂量限制性毒性(DLT)被定义为临床上显著的血液学或非血液学不良事件或异常实验室值，评估为与转移性肿瘤疾病进展、间发疾病或伴随用药无关，并且与研究药物有关且发生在研究的第一周期内，符合以下任何一项标准：
1.任何持续时间的所有4级血液学和非血液毒性
2.所有3级血液学和非血液毒性。例外情况如下：
a.不需要住院或TPN支持，并且可以在48小时内通过支持性护理管理到≤2级的3级恶心、呕吐和腹泻。
b.在24小时内校正为≤2级的3级电解质异常。
其他3级无症状实验室异常DLT时期＝一(1)个周期，即在每个周期的第1天和第15天的两次剂量的G9.2-17 IgG4。
患者通常应维持研究治疗，直至有确认的放射影像学进展。如果患者有放射影像学进展但没有明确的临床进展并且没有开始替代治疗，则患者可继续接受研究治疗，由研究者自行决定。然而，如果患者有明确的临床进展而没有放射影像学进展，则停止研究治疗，并向患者建议可用的治疗选择。
如果发生严重或危及生命的免疫相关不良反应(IMAR)或提示开始全身性类固醇治疗，则应暂停批准的检查点抑制剂和G9.2-17IgG4，但特定例外情况(例如，临床稳定患者的某些内分泌病)可描述于批准的产品标签中。
如果方案建议在(a)暂停批准的检查点抑制剂或(b)针对IMAR开始全身性类固醇治疗的情况下继续使用实验药物，则提供足够的理由来支持这种方法的安全性。
如果将剂量减少用于AE管理，允许两次剂量减少。每次减少剂量时减少基线剂量的30％。仅当研究者评估正在获得临床益处并且可继续获得临床益处时，才寻求剂量减少。
治疗引发的不良事件(TEAE)将被定义为在研究药物的第一剂量时或之后发生的事件。将使用国际医学用语词典(MedDRA)编码词典编码AE。TEAE、严重或CTC 3或4级TEAE以及与治疗相关的TEAE将按治疗组按系统器官类别和首选术语进行总体总结。这些将总结事件的数量以及具有给定事件的患者的人数和百分比。此外，将按最大严重度提供具有TEAE的患者的人数和百分比。将提供在任一治疗组中至少5％的患者中出现的按系统器官类别和首选术语的所有TEAE的总结。
可能、大概或肯定与一种或多种研究药物相关的任何≥3级的AE将在继续给药前与医学监查员讨论，但以下例外情况不需要与医学监查员讨论：
●持续<72小时的局部注射部位反应，包括疼痛、发红、肿胀、硬结或瘙痒
●持续<72小时的发烧、肌痛、头痛或疲劳的全身性注射反应
如果研究者认为适当(在与医学监查员讨论后)，对于≥3级不良事件可能需要延迟剂量，直至毒性消退(至1级或更低)。
在方案的第2部分，如果一例或多例患者出现DLT，G9.2-17 IgG4的剂量将减少至比建议的2期剂量(RP2D)低1个剂量。
一旦患者完成治疗期，每3个月进行一次总生存期随访，持续长达2年。对于因临床进展而退出的患者，在可能的情况下继续进行放射学评估。
以下程序将在第59天或最后一次给药后30天进行，包括提前停止治疗的患者。
●再分期扫描(有造影剂的CT、MRI、PET-CT或X射线)-如果在最后一个周期后>6至8周研究结束距离且间隔较短，则由研究者决定重复。
●相关肿瘤标志物，例如Ca15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白等，将在每个周期给药前进行评估(治疗6个月后可减少至每3个周期进行评估，按照与再分期扫描相同的时间表)，视情况而定
●12导联ECG
●体格检查
●ECOG
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期)
●不良事件
●妊娠试验，如果是女性
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK、TSH、fT4、PTH、雌二醇、催乳素、睾酮、FSH、LH、γ谷氨酰转移酶(γGT)、血红蛋白A1c(HgbA1c)(仅当有1型或2型糖尿病史时)、脂肪酶、淀粉酶、游离皮质醇(在规定访视时另外包括))
●血液学-差分全血细胞计数、血小板、血红蛋白
●凝血(PT、PTT、APTT、INR、CRP和肌钙蛋白)
●尿液分析
●PD血液–生物标志物分析
●PK血液样品
药代动力学评估
如果可能，将针对G9.2-17 IgG4计算以下血清PK参数：
●AUC0-336h
●Cmax
●Tmax
●t1/2
●血清浓度相对时间曲线
将在评估时间表的表中规定的每个时间点收集大约5mL的血液样品并处理成血清。
第1周期和第3周期第1天
●给药前
●输注结束(EOI)时
●EOI后2小时(±30分钟)
●EOI后4小时(±30分钟)
第1周期和第3周期第15天
●给药前
●在EOI时
第1周期和第3周期第2天和第8天(非给药日)
●访视期间的任何时间点
第2周期和第4周期第1天
●给药前
●在EOI时
第4周期以后每2个周期的第1天(即，C6D1、C8D1等)：
●给药前
●在EOI时
如果应中断研究药物的剂量，将在恢复给药后收集额外的PK和安全性评估；在中断期间可执行额外的PK评估。如果减少研究药物的剂量，将在减少的剂量施用前(给药前2小时内)和开始减少的研究药物剂量后2至4小时收集额外的PK评估。如果有临床指征，可进行额外的PK和其他血液评估。
浓度将使用经过验证的测定来确定。至少需要两份50μL的血清等分试样来测定总G9.2-17 IgG4浓度。至少需要两份100μL的血清等分试样来测定游离和部分游离G9.2-17IgG4浓度以及第三份等分试样中的残留血清。为分析G9.2-17 IgG4血浆浓度而收集的样品也可用于评价与研究期间或之后出现的问题相关的安全性或有效性方面。
不会对这些血液样品进行遗传分析。在将采集血液样品用于确定G9.2-17 IgG4的PD、ADA、安全性实验室的访视中，可以使用足够体积的一份样品。PD生物标志物在本研究中进行了评价，并在本文中进行了描述。
药效学生物标志物
评估时间表的表中提供了生物标志物评估的计划时间点。治疗6个月后，采样可减少至每3个周期一次。为其他生物标志物研究收集生物样品也是本研究的一部分。需要以下用于生物标志物研究的样品，并将如评估时间表的表中所规定从本研究的所有参与者处收集。
●血液样品，在研究药物施用前收集(给药前约15mL)
●肿瘤活检(组织样品)
将检查样品的PD生物标志物(通过流式细胞术、ELISA、IHC或多重分型)，以使用经过验证的测定评价它们与观察到的对G9.2-17IgG4的临床应答的关联。
本研究计划评估以下生物标志物：
●肿瘤标志物(血液)：根据肿瘤类型按照需要，在每个周期给药前待评估的CA15-3、CA-125、癌胚抗原(CEA)、CA19-9、S100、甲胎蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白片段21(CYFRA-21)。治疗6个月后可减少至每3个周期，视情况遵循与肿瘤成像评估相同的时间表。
●PBMC表型(血液)：例如，CD3、CD4、CD8、CD45RO、叉头盒蛋白P3(FOXP3)、CD11B、CD14、CD15、CD16、CD33、CD68、人白细胞抗原(HLA)DR、CD163、精氨酸酶1、颗粒酶B、KI67、PD-1、PD-L1、泛细胞角蛋白(PAN-CK)
●细胞因子(血液)：例如，干扰素γ(IFN-γ)、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-1b、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MIP-1a、IL-17a、IL-5、TGF-β
●血液和肿瘤组织中的Gal-9
●PD-L1(组织)
●错配修复状态(组织)
●肿瘤突变负荷(TMB)
免疫原性评估
将根据评估时间表的表从所有参与者收集血液样品(大约3mL)并处理成血清。另外，还应在治疗结束/提前终止访视时从停止研究干预或退出研究的患者收集血清样品。
第1周期至第4周期第1天
●给药前
第4周期以后每2个周期的第1天(即，C6D1、C8D1等)：
●给药前
将获得至少两份各500μL的血清，第三管中有残留血清。将筛选血清样品中与G9.2-17 IgG4(ADA)结合的抗体，并报告确认阳性样品的滴度。可进行其他分析以验证针对G9.2-17 IgG4的抗体的稳定性和/或进一步表征G9.2-17 IgG4的免疫原性。
针对G9.2-17 IgG4的抗体的检测和表征将使用经过验证的测定方法进行。还将对为检测针对研究干预的抗体而收集的所有样品评价G9.2-17 IgG4血清浓度，以便能够解释抗体数据。可进一步表征和/或评价抗体中和研究干预活性的能力。
其他评估
人口统计数据
在筛选时，将收集患者人口统计数据。这些数据包括年龄、性别、种族和民族。
医学史
医学史将包括肿瘤史、手术/移植史、放射治疗史以及COVID-19史和检查。
●个人医学史，包括先前治疗/手术、任何原位植入物或过去植入物的记录、先前和/或当前使用医疗器械、伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期、剂量修改(如果有的话)和原因)、先前存在的症状和AE)，基于家族史和患者最了解的完整家族史的有风险的遗传性疾病
●过去12个月内进行的任何牙科治疗的记录
●对于先前切除过肿瘤的患者，记录原发性肿瘤的定位位置。
●排便习惯/典型频率和一致性
●记录任何饮食要求或偏好(例如，实行特定饮食方案：间歇性禁食、生酮饮食等)
●记录过去和现在的过敏情况(过敏原、严重度)
先前和伴随用药
在每次预定访视时，将记录每例患者的先前和伴随用药，包括疫苗和辅助治疗/补充剂。
肿瘤成像评估
将使用有或无造影剂的CT或MRI进行肿瘤评估；将进行PET-CT。有造影剂的CT是优选方式(考虑到疾病位置，如果CT不可行或不合适，用MRI、PET-CT或其他成像方式代替或补充CT扫描)。评估应至少包括胸部/腹部/骨盆，并且应包括基于患者的肿瘤类型和/或病史所示的其他解剖区域。成像扫描必须去识别化，并以原始格式作为患者研究文件的一部分存档。
在研究中，根据SoA每8周±7天(即，C3D1、C5D1、C7D1、C9D1等)进行评估，如果在过去4-6周内未进行评估，则在治疗结束时进行评估。如果有临床指征，可更频繁地进行评估。仅针对第2部分，如果在扫描中看到客观应答，将在4周(+7天)后进行确认扫描。在确认扫描后，将从确认扫描之日起以每8周(±7天)的频率恢复预定扫描。
肿瘤活检
收集治疗前和治疗中活检。筛选期间将收集治疗前活检。如果根据纳入标准中概述的原因无法获得治疗前活检，并且患者已加入研究，则将从原发性肿瘤和/或转移性沉积物中收集该患者的存档肿瘤组织样本。当前或研究开始前5年内从原发性肿瘤病灶或转移性沉积物获得的切除或核心活检(FFPE组织块或福尔马林中的新鲜组织)。如果原发性组织和转移性组织均可用，则将优先使用转移性沉积物组织。如果组织获取前后接受的治疗信息可用，则也将收集这些信息。
治疗中的活检安排在C3D15±7天，并且应该仅在第3周期的肿瘤成像扫描之后进行。如果无法在方案规定的时间范围内进行该程序，则可允许使用替代方案，但必须与研究负责人/医学监查员讨论。一般认为多种临床因素可能会导致难以获得足够的样本。决定在治疗中不完成活检应与医学监查员讨论。
ECHO/MUGA
将在评估时间表的表中指示的时间点获得ECHO和/或MUGA。如果有临床指征，应每3个月重复一次该评估。
RECIST肿瘤评估标准
在基线肿瘤评估中，肿瘤病灶/淋巴结被分类为可测量或不可测量，其中根据测量平面中的最长直径记录可测量的肿瘤病灶(病理性淋巴结除外，其在最短轴上测量)。当基线时存在超过一个可测量的病灶时，代表所有受累器官的最多总共五个病灶(和每个器官最多两个病灶)的所有病灶都应被鉴定为靶标病灶。基于大小来选择靶标病灶(具有最长直径的病灶)。计算所有靶标病灶的直径总和并将其报告为基线总直径。
包括病理性淋巴结在内的所有其他病灶(或疾病部位)都应被鉴定为非靶标病灶，并且也在基线时记录。无需测量，这些病灶按‘存在’、‘不存在’或‘明确进展’进行跟踪。
疾病应答(完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定疾病(SD)和进展性疾病(PD))按照以下概述进行评估。
疾病应答测量允许计算总体疾病控制率(DCR)(包括CR、PR和SD)、客观应答率(ORR)(包括CR和PR)、无进展生存期(PFS)和进展时间(TTP)。
实体瘤应答评价标准(RECIST)指南
根据RECIST 1.1的总体应答源自基于肿瘤负荷的时间点应答评估，如下所示。
靶标病灶的评价：
●完全应答(CR)：所有靶标病灶消失。任何病理性淋巴结(无论是靶标淋巴结还是非靶标淋巴结)的短轴必须缩小到<10mm。
●部分应答(PR)：以基线总直径为参考，靶标病灶的直径总和减少至少30％。
●进展性疾病(PD)：以研究中的最小总和为参考，靶标病灶的直径总和增加至少20％(如果基线总和在研究中最小，则这包括基线总和)。除20％的相对增加以外，总和还必须证明至少5mm的绝对增加。(注释：一个或多个新病灶的出现也被认为是进展)。
●稳定疾病(SD)：以研究时的最小总直径作为参考，既没有足够的收缩满足PR的条件，也没有足够的增加满足PD的条件。
非靶标病灶的评价：
●完全应答(CR)：所有非靶标病灶消失和肿瘤标志物水平的正常化。所有淋巴结的大小必须是非病理性的(<10mm短轴)。
●非CR/非PD：一个或多个非靶标病灶持续存在和/或肿瘤标志物水平维持在正常范围之上。
●进展性疾病(PD)：现有非靶标病灶的明确进展。(注释：一个或多个新病灶的出现也被认为是进展)。
不同时间点的疾病应答量度将允许计算以下内容：
●疾病控制率(DCR)，定义为达到CR、PR和SD的患者的百分比。
●客观应答率(ORR)，定义为肿瘤大小缩小到预定量(肿瘤收缩≥30％)的患者的比例。
●无进展生存期(PFS)，定义为从研究药物治疗开始到疾病进展(肿瘤生长≥30％)的时间。
●应答持续时间(DoR)，定义为肿瘤继续对治疗有应答而不发生癌症生长或扩散的时间长度。
●总生存期(OS)被定义为从研究药物治疗开始到因任何原因死亡的时间。
表37.基线时患有可测量疾病的患者的总体时间点应答的评价
靶标病灶 非靶标病灶 新病灶 总体应答
CR CR 否 CR
CR 非CR/非PD 否 PR
CR NE 否 PR
PR 非PD或NE 否 PR
SD 非PD或NE 否 SD
未全部评价 非PD 否 NE
进展性疾病 任何 是或否 进展性疾病
任何 进展性疾病 是或否 进展性疾病
任何 任何 是 进展性疾病
CR：完全应答，非PD：非进展性疾病，PR：部分应答，SD：稳定疾病，NE：不可评价
*当靶标病灶显示SD/PR而非靶标病灶的某些子集不可评价时，必须谨慎决定是将此时间点的总体应答称为SD/PR还是NE。这是基于不可评价的病灶(如果它们显示生长)是否会在所见的其他病灶应答的背景下引起进展性疾病的总体应答。如果不可评价的非靶标病灶占总体疾病负荷的很大比例，则适当的时间点应答是NE。
研究药物和其他干预
研究干预被定义为意图根据研究方案施用于/用于研究参与者的任何研究性剂、市场产品、安慰剂或医疗器械。
不良事件
定义
不良事件(AE)
AE在ICH GCP指南中定义为“施用药物产品的患者或临床研究患者发生的任何不利的医学事件，且不一定与该治疗有因果关系”。在本研究中对AE的此定义进行了扩展，以包括从患者签署知情同意书的时间至研究性药物开始使用的时间的任何此类事件(例如，体征、症状或诊断)的发生或先前存在的医疗状况的恶化。恶化表明先前存在的医疗状况(例如，糖尿病、偏头痛、痛风、高血压等)的严重度、频率或疾患持续时间增加，或者与明显更差的结果相关。
严重不良事件(SAE)
SAE被定义为以下AE：
●导致死亡；
●危及生命(使患者面临直接死亡风险)；
●需要住院或延长现有住院时间；
符合“严重”定义的住院治疗是指任何住院患者入院，其包括至少在医疗保健机构过夜。住院病人入院不包括：康复设施、临终关怀设施、专业护理设施、疗养院、常规急诊室进入、当天手术(作为门诊/日间/非住院手术)或社会入院(例如，患者没有睡觉的地方)。
●导致持续或严重的失能/丧失能力；或
●先天性异常/出生缺陷
●如果根据适当的医疗判断，可能不会导致死亡、危及生命或需要住院的重要医疗事件可能会危害患者并且可能需要医疗或手术干预以防止出现在该定义中所列结果之一时，则该事件可被视为SAE。此类医疗事件的实例包括需要在急诊室或家中进行强化治疗的过敏反应和过敏性支气管痉挛、血液恶液质或抽搐，但不会导致住院治疗。
相关性
对于所有AE，应获得足够的信息以确定AE的因果关系(例如，研究药物或其他疾病)。将按以下定义评估AE与研究治疗的关系：
●不相关：任何不符合研究药物施用的合理时间顺序、且可能由患者的临床状态或施用于患者的其他治疗模式产生的事件。
●不太可能相关：任何不符合研究药物施用的合理时间顺序、或可能由患者的临床状态或施用于患者的其他治疗模式产生的事件。
●可能相关：符合研究药物施用的合理时间顺序、或符合对可疑药物的已知应答模式、且无法通过患者临床状态的已知特征或施用于患者的其他治疗模式合理解释的任何反应。
●相关：符合研究药物施用的合理时间顺序，且符合对可疑药物的已知应答模式，且随着再次挑战而复发，和/或通过停止药物或减少剂量而改善的任何反应。
不良事件管理
在研究药物的第一剂量的施用之前不记录AE。将记录在研究药物施用后开始的AE或在研究药物施用后恶化的与医学史相关的症状。应跟踪AE，直至它们消退、恢复至基线或被确定为稳定或慢性疾患。收集所有SAE，直至研究药物最后一次给药后30天。
免疫介导的不良反应
纳武单抗的免疫介导的不良反应(IMAR)在包装插页的警告和注意事项部分中有标识。所指出的具体IMAR是：
●免疫介导的肺炎
●免疫介导的结肠炎
●免疫介导的内分泌病
●免疫介导的肾炎和肾功能障碍
●免疫介导的皮肤不良反应
●免疫介导的脑炎
●输注反应
●同种异体HSCT的并发症
●胚胎-胎儿毒性
监测计划旨在限制联合药物开发期间发生的IMAR的严重度和持续时间，并包括：在预定访视中进行体格检查、生命体征、安全性实验室评估(包括血液学、生物化学)，在新的给药周期的每个第1天(给药前)评估内分泌功能，评估凝血状态和尿液分析。评估时间表还包括每三个月评估一次射血分数并执行常规ECG。
下文提供了管理这些IMAR的说明(针对单独的G9.2-17 IgG4(表C)，以及针对G9.2-17 IgG4+纳武单抗联合治疗(表A2))。
不良事件管理的剂量减少程序
如果在本研究的第2部分中将剂量减少用于AE管理，允许两次各为50％的剂量减少。
作为AE和SAE的临床实验室异常和其他异常评估
如果被判断为临床显著的异常实验室发现(例如，临床化学、血液学和尿液分析)或其他异常评估(例如，ECG或生命体征)符合AE或SAE的定义，则将被记录为AE和SAE。在研究期间检测到或在筛选时存在且在研究开始后显著恶化的临床显著的异常实验室发现或其他异常评估将被报告为AE或SAE。然而，临床显著的异常实验室发现或其他异常评估与正在研究的疾病相关(除非被判断为比患者状况预期更严重)或者在研究开始时就存在或检测到且没有恶化，将不被报告为AE或SAE。
可重复在临床上显著偏离先前测量值的实验室测量。如果有必要，应进行比方案中规定的额外或更频繁的检查，以提供足够的AE记录和AE解析。
统计考虑
当最后一例患者完成最后一次访视时，研究将完成。在最后一例患者发生主要终点事件后，数据库将被锁定以进行主要分析。研究完成后将进行最终研究分析。
统计假设
当前的研究旨在通过评估DLT来确定G9.2-17 IGG4的MTD(第1部分)，随后使用Simon的两阶段优化设计评估三种疾病类型中的药物活性(单独的或联合的)。第2部分的研究假设详述如下。
G9.2-17 IGG4单剂治疗臂
●零假设：ORR-3为≤5％
●备择假设：ORR-3为≥15％。
G9.2-17 IGG4+纳武单抗联合治疗臂
●零假设：ORR-3为≤10％
●备择假设：ORR-3为≥25％。
样品量确定
第1部分
本研究的第1部分(剂量递增阶段)将使用CRM(O'Quigley等人,1990)建立G9.2-17IgG4的DLT、OBD/MTD和RP2D，CRM是一种根据过去的试验数据告知应如何针对下一个患者群组调整G9.2-17IgG4的剂量的基于模型的设计。
具有1000次迭代的试验模拟分析表明，将需要平均大约20例患者来确定OBD/MTD，OBD/MTD是DLT的估计概率小于或等于25％的TTL的最大剂量。一旦确定了OBD/MTD，就可以再招募6例患者，以牢固确立G9.2-17 IgG4在gal-9阳性肿瘤患者中的安全特性。
因此，预计本研究的第1部分的总样品量为26例患者。在筛选失败和退出的情况下，将更换患者，直至确定MTD。
第2部分
本研究的第2部分(群组扩展阶段)将采用Simon的两阶段优化设计来确立G9.2-17IgG4在眼部黑素瘤患者中的安全性和有效性。大约223例患者将在第2部分接受治疗，其中约93例将在Simon阶段I接受治疗，约130例将在Simon阶段II接受治疗。
单剂治疗臂
据估计，在Simon阶段I，每个单剂治疗臂需要大约23例患者来否决ORR-3≤5％的零假设，并继续进行至Simon的阶段II。
如果试验进行到Simon优化设计的阶段II，大约33例患者将在每个单剂臂中接受额外治疗，以检验ORR-3≥15％的备择假设。如果不满足备择假设，则相应的臂将停止。
抗PD1联合治疗臂
据估计，在Simon阶段I，每个联合治疗臂需要大约18例患者来否决ORR-3≤10％的零假设，并继续进行至Simon的阶段II。
如果试验进行到Simon优化设计的阶段II，大约25例患者将在每个联合臂中接受额外治疗，以检验ORR-3≥25％的备择假设。如果不满足备择假设，则相应的臂将停止。
对于接受联合治疗的所有患者，可以在同一天施用治疗。应在抗半乳糖凝集素9抗体之前施用抗PD-1抗体。如果出于任何原因无法完成当天施用，则应在给药的第一天施用抗PD-1方案，并在随后的一天施用抗半乳糖凝集素9抗体。
分析集
除非另外规定，否则意向治疗(ITT)群体将被定义为接受至少一次剂量的研究药物的那些患者。将对ITT执行主要疗效分析。将针对ITT执行患者分布。
疗效群体将被定义为ITT中的所有患者，并且具有至少一项可测量的ORR-3或PFS-6评估。该群体将用于敏感性分析。
符合方案(PP)群体将被定义为接受至少一个完整周期的G9.2-17IgG4并且没有重大方案偏差的任何患者。
安全性群体(SAF)将被定义为接受至少一次剂量的研究药物的所有患者。将对SAF执行安全性分析。
PK/PD群体将被定义为接受至少一个完整周期的G9.2-17 IgG4的那些患者。
统计分析
统计分析计划(SAP)将在数据库锁定之前完成，它将包括本节中描述的统计分析的更多技术性和详细描述。本节是对最重要终点(包括主要终点和关键次要终点)的计划统计分析的总结。
一般考虑
除非另外规定，否则所有连续终点将使用描述性统计(包括患者人数(n)、平均值、标准偏差、中位数、最小值和最大值)进行总结。所有分类终点将使用频率和百分比(95％CI)进行总结。筛选测量值将是首次研究治疗日当天或之前的最后一个值。PFS和OS的生存曲线将从治疗开始之日起通过Kaplan-Meier方法生成，但在试验的任何部分将不进行研究组之间的比较分析。Waterfall和Swimmers图将用于以图形方式呈现在第2部分中评价的每种肿瘤类型内每个研究臂中所有患者的ORR和DoR。所有统计分析将使用9.2版(SAS,Cary,NC)进行。
主要终点
安全性分析–第1部分和第2部分
除非另外规定，否则将对SAF进行所有安全性分析。
不良事件
治疗引发的不良事件(TEAE)将被定义为在研究药物的第一剂量时或之后发生的事件。将使用MedDRA编码词典编码AE。TEAE、严重或CTCAE 3级或4级TEAE以及与治疗相关的TEAE将按治疗组按系统器官类别和首选术语进行总体总结。这些将总结事件的数量以及具有给定事件的患者的人数和百分比。此外，将按最大严重度提供具有TEAE的患者的人数和百分比。将提供在任一治疗组中≥5％的患者中出现的按系统器官类别和首选术语的所有TEAE的总结。将总结DLT、OBD/MTD和RP2D。
实验室评估
所有基于实验室的数据将以所有值的列表以及被判断为临床显著的异常结果的列表形式呈现，这些结果也将报告为AE。将按访视和治疗组提供所有观察到的发现和自基线筛选实验室评价的变化的数值总结，包括化学、血液学和尿液分析结果。没有计划进行推论比较。
生命体征
将按时间点和治疗组提供所有观察到的发现和自基线筛选生命体征的变化的数值总结，包括血压、心率、呼吸频率和体温。没有计划对生命体征进行推论分析。
ECG、ECHO/MUGA和体格检查
体格检查数据和变化将作为列表呈现。ECG结果将以列表的形式呈现，并基于临床显著异常的发生率按治疗组和访视进行总结。没有计划进行跨治疗组的推论比较。
主要疗效分析-第2部分
疾病应答根据RECIST v1.1进行评估，并将针对ITT、PP和疗效群体进行描述性总结。主要疗效终点是：
●ORR-3
●PFS-6
次要终点
药代动力学、药效学和免疫原性
PK、PD和免疫原性将在第1部分和第2部分中针对PK/PD群体进行描述性总结。
次要疗效分析-第2部分
疾病应答(ORR、PFS、DCR、DoR和OS)根据RECIST v1.1进行评估，并将针对ITT、PP和疗效群体进行描述性总结。
探索性终点
对探索性终点的分析将在SAP中详细说明。
其他分析
其他未特别提及的收集数据将在患者列表中呈现。
分布、人口统计数据、基线特征和医学史
将总结分布信息，包括入组患者人数、筛选失败人数、接受治疗的患者人数以及因原因退出的患者人数。人口统计数据、基线特征和医学史将针对ITT和PP按治疗组和整体使用描述性统计进行总结。
先前和伴随用药
服用先前和伴随用药的患者的人数和百分比将针对ITT和PP按治疗组和整体进行总结。
实施例11.抗半乳糖凝集素9抗体保护T细胞避免半乳糖凝集素9介导的调亡
为了研究抗半乳糖凝集素9抗体G9.2-17的作用，进行了细胞凋亡测定以确定T细胞是否因细胞凋亡过程或其他机制而死亡。
简单来说，将MOLM-13(人白血病)细胞在补充有10％ FBS、2mM L-谷氨酰胺、10mMHEPES、1mM丙酮酸钠、4.5g/L葡萄糖和1.5g/L碳酸氢钠的RPMI培养基中在37℃、5％ CO2下培养。然后将细胞转移到无血清RPMI培养基中，并以2.5e6个细胞/mL的浓度悬浮在无血清培养基中。将细胞以2e5个细胞/孔的密度(每孔80μL细胞悬液)接种到组织培养级96孔板的孔中。将单克隆抗半乳糖凝集素9抗体或匹配的同种型添加到每个孔中，并在37℃、5％CO2下孵育30分钟。孵育后，加入重组全长人半乳糖凝集素9(R&D Systems2045-GA，在PBS中稀释)至终浓度为200nM。将细胞在37℃、5％ CO2下孵育16小时。然后用膜联蛋白V-488和碘化丙啶(PI)染色细胞，之后通过流式细胞术进行分析。每个条件一式三份进行。PI对活细胞和凋亡细胞是不可渗透的，但会用红色荧光染色死细胞，与细胞中的核酸紧密结合。在缓冲液中用Alexa488膜联蛋白V和PI对细胞群体进行染色后，凋亡细胞显示绿色荧光，死细胞显示红色和绿色荧光，活细胞显示很少或没有荧光。使用具有用于激发的488nm氩离子激光线的流式细胞仪区分细胞。然后在FlowJo软件上进行分析。膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)阳性细胞的级分被绘制为图7中使用的抗体浓度的函数。如图7所示，用抗Gal9抗体处理的凋亡T细胞的水平远低于用人IgG4同种型对照抗体处理的T细胞，表明抗半乳糖凝集素9抗体G9.2-17保护T细胞避免半乳糖凝集素9介导的细胞凋亡。
实施例12：抗Gal9抗体G9.2-17的体外和体内表征
如下所公开的进行体内和体外药效学和药理学研究以及安全药理学。使用用于小鼠研究的抗半乳糖凝集素9mAb G9.2-17的IgG1型式进行体内研究，其基于这样一个事实，即该抗体被开发为具有与G9.2-17完全相同的VH和VL链且因此具有完全相同的结合表位，和如同G9.2-17的相同的交叉反应特性以及跨物种的结合亲和力和相同的功能特性。
体外研究
G9.2-17具有多物种交叉反应性(人、小鼠、大鼠、食蟹猴)，如在体外评估的具有等效的<1nmol结合亲和力。参见，例如，PCT/US2020/024767，其相关公开内容为了本文引用的主题和目的以引用的方式并入。G9.2-17不与半乳糖凝集素9蛋白的CRD1结构域交叉反应。它具有出色的稳定性和纯化特征，并且与灵长类动物中存在的任何其他半乳糖凝集素蛋白没有交叉反应性。
下表38总结了体外药理学研究的结果。
表38.体外主要药效学
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/>
/>
/>
了解作用机制的研究包括ADCC/ADCP(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性/抗体依赖性细胞吞噬作用)和阻断功能评估。如对人IgG4mAb所预期的，G9.2-17不介导ADCC或ADCP(图8A)。这是针对作为阳性对照的G9.2-17的IgG1人对应物(其介导ADCC和ADCP)进行试验的，如所预期的(图8B)。
此外，在竞争结合ELISA测定中评价了G9.2-17的阻断功能。G9.2-17有效阻断半乳糖凝集素9CRD2结构域与其结合配偶体CD206人重组蛋白的结合，证实了G9.2-17的预期作用模式，即阻断半乳糖凝集素9活性。此外，我们优化了MOLM-13T细胞凋亡测定，其中G9.2-17有效地将细胞从由半乳糖凝集素9蛋白处理引起的细胞凋亡中拯救出来(用半乳糖凝集素9处理导致约50％的细胞凋亡，用半乳糖凝集素9+G9.2-17处理导致约10％的细胞凋亡)。
已经进行了进一步广泛的体外表征以比较G9.2-17与小鼠IgG1G9.2-17mAb的结合和功能特征，后者包含与G9.2-17完全相同的CDR结构域，因此具有相同的结合表位，即CRD2半乳糖凝集素9结构域。mIgG1 G9.2-17被开发用于小鼠同基因药理学疗效研究，以避免与G9.2-17本身的免疫原性的任何潜在发生。mIgG1 G9.2-17具有等效的<1nmol跨物种亲和力，以及相同的与人癌细胞系CRL-2134的基于细胞的结合亲和力。mIgG1 G9.2-17在MOLM-13T细胞凋亡测定中产生的数据与G9.2-17本身等同。
体内药理学
体内测定包括使用克隆到IgG1小鼠骨架的小鼠mAb-G9.2-17结合表位(用于动物疗效研究的G9.2-17替代mAb)进行的同基因小鼠模型，该表位共有G9.2-17的交叉应答性和结合亲和力特征。
试验的同基因小鼠模型是：
●原位胰腺腺癌(KPC)小鼠模型(单一剂和与抗PD-1的组合)：肿瘤体积评估和流式细胞术；
●皮下黑素瘤B16F10模型(单一剂和与抗PD-1的组合)：肿瘤体积评估和流式细胞术。
●皮下MC38模型(单一剂和与抗PD-1的组合)：肿瘤体积评估
此外，用G9.2-17处理的离体的患者来源的肿瘤培养物(类器官)将用于探索G9.2-17的作用机制。
从机制上讲，发现G9.2-17具有阻断活性而不是ADCC/ADCP活性。观察到半乳糖凝集素9与其结合受体(诸如免疫抑制巨噬细胞上的CD206)的相互作用的阻断。在功能上，体内研究表明，在用G9.2-17mIgG1替代抗体治疗的多个同基因模型(原位胰腺KPC肿瘤生长和皮下黑素瘤B16F10模型)中，肿瘤生长减少。在用单剂抗半乳糖凝集素9mAb和与抗PD-1的组合治疗的小鼠肿瘤中，G9.2-17重新激活效应T细胞并降低免疫抑制细胞因子的水平。与抗PD-1mAb的组合研究表明，效应T细胞的肿瘤内存在更高，支持组合方法的临床试验。重要的是，G9.2-17的机制效应已在患者来源的肿瘤培养物中得到研究和证明(Jenkins等人,2018)(从原发性和转移性部位切除肿瘤)，其中G9.2-17诱导可重复且稳健的T细胞再激活，表明逆转了半乳糖凝集素9强加的肿瘤内离体免疫抑制。
为了评估联合抗PD-1和抗半乳糖凝集素9mAb的相关性，用单剂抗PD-1和抗半乳糖凝集素9以及组合治疗皮下黑素瘤B16模型。在联合臂中，效应T细胞的肿瘤内存在得到增强。
相较于抗半乳糖凝集素9mIgG1 200μg，在使用抗半乳糖凝集素9mIgG1 200μg+抗PD-1的治疗中观察到细胞毒性T细胞(CD8)水平显著增加(p<0.01)，并且相较于单独的抗PD-1，在抗半乳糖凝集素9IgG1 200μg+抗PD-1之间观察到水平显著增加(p<0.001)。这样的结果表明，抗Gal9抗体和抗PD-1抗体的组合有望达到优异的治疗效果。
下表39总结了体内药理学研究的结果。
表39.体内主要药效学
/>
此外，对使用G9.2-17 IgG1小鼠mAb(又名G9.2-17mIgG)、抗PD1抗体或G9.2-17IgG1小鼠mAb和抗PD1抗体的组合治疗的肿瘤免疫应答在本文所述的B16F10皮下同基因模型中进行了研究(结果如图6A至图6B所示)。
实施例13.具有1周和3周给药后观察期的雄性Sprague Dawley大鼠中的非GLP单剂量、范围探索静脉内毒性研究
本研究评价了在对Sprague Dawley大鼠进行单次静脉内推注施用，随后在第8天和第22天进行1周(终末期)和3周(恢复期)尸检后G9.2-17IgG4的解剖学终点。所有动物均存活至预定的尸检。在本研究的终末期或恢复期尸检动物中，没有试验物品相关的宏观发现、器官重量变化或微观发现。
这项非GLP探索性、单剂量、范围探索、静脉内毒性研究的目的是鉴定和表征在对Sprague Dawley大鼠进行2分钟的静脉内推注施用，随后1周(终末)和3周(恢复)给药后观察期后G9.2-17 IgG4的急性毒性。
这项非GLP单剂量毒性研究在24只Sprague Dawley雄性大鼠中进行，以确定G9.2-17 IgG4的毒代动力学和潜在毒性。在第1天通过缓慢推注静脉内注射至少2分钟向动物施用媒介物或10mg/kg、30mg/kg或70mg/kg G9.2-17 IgG4，随后是给药后1周(终末，第8天)或3周(恢复，第22天)的时期。研究终点包括死亡率、临床观察、体重和食物消耗、临床病理学(血液学、凝血、临床化学和尿液分析)、毒代动力学参数、ADA评价和解剖病理学(大体尸检、器官重量和组织病理学)。实验设计的总结提供于下表40中。
表40.实验设计
a在第8天终末期尸检时对3只动物/性别/组实施安乐死；其余3只动物/性别/组在第22天恢复期尸检时实施安乐死。
b媒介物是制剂缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0±0.05)。
在第8天或第22天对所有存活的动物进行尸检。进行完整的尸检并收集器官重量。在终末期和恢复期对所有动物的器官进行称重。对显微评价所需的组织进行修剪、常规处理、石蜡包埋以及用苏木精和伊红染色。
在本研究过程中没有意外死亡。所有动物均存活至终末期或恢复期尸检。注意到的组织学变化被认为是偶然的发现或与实验操作的某些方面而非试验物品的施用有关。在这些偶然性组织改变的发生率、严重度或组织学特征方面没有试验物品相关的改变。在临床观察、体重、食物消耗、临床病理学或解剖病理学中没有注意到G9.2-17 IgG4相关的发现。总之，对Sprague Dawley大鼠进行10、30和70mg/kg G9.2-17 IgG4的单次静脉内施用是可以耐受的，没有不良发现。因此，在本研究的条件下，NOEL为70mg/kg。
实施例14.具有3周给药后观察期的食蟹猴中的G9.2-17 IgG4的非GLP单剂量、范围探索静脉内输注毒性研究
在8只食蟹猴中进行这项非GLP单剂量毒性研究，以鉴定和表征G9.2-17 IgG4的急性毒性。通过30分钟静脉内(IV)输注向动物(1只雄性[M]/1只雌性[F]/组)施用媒介物或30mg/kg、100mg/kg或200mg/kg G9.2-17 IgG4，随后是3周的给药后观察期。研究终点包括：死亡率、临床观察、体重和定性食物消耗；临床病理学(血液学、凝血、临床化学、免疫分型和白细胞亚群上的半乳糖凝集素9表达，以及细胞因子分析)；毒代动力学参数；用于可能的抗药抗体评价(ADA)的血清收集；和可溶性半乳糖凝集素9分析；和解剖病理学(大体尸检、器官重量和组织病理学)。
在临床观察、体重、食物消耗、临床病理学(血液学、临床化学、凝血或细胞因子分析)、免疫分型、白细胞亚群上的半乳糖凝集素9表达、可溶性半乳糖凝集素9或解剖病理学上没有注意到G9.2-17IgG4相关的发现。
总之，对食蟹猴进行30、100和200mg/kg G9.2-17 IgG4的单次静脉内输注施用是可以耐受的，没有不良发现。因此，在本研究的条件下，未观察到的不良反应水平(NOAEL)为200mg/kg，这是评价的最高剂量水平。研究设计显示在表41中。
表41.实验设计
a在第1组至第3组施用后1周向第4组施用。
在研究期间，通过经皮置于隐静脉中的导管通过IV输注持续30分钟施用一次媒介物和试验物品。剂量水平为30、100和200mg/kg，并以20mL/kg的剂量体积施用。对照组以与治疗组相同的方式接受媒介物。
在给药期间将动物置于吊索约束装置中。媒介物或试验物品基于最近的体重并使用输液泵和无菌一次性注射器进行施用。给药注射器填充有适当体积的媒介物或试验物品(20mL/kg，额外2mL)。在给药完成时，将动物从输注系统中移出。在每次输注开始和结束之前记录每个给药注射器的重量以确定剂量问责。
详细的临床观察
将动物从笼子中移出，并在第1天在输注开始(SOI)后1小时和4.5小时对每只动物进行详细的临床检查，此后在研究期间每天进行一次。将动物从笼子中移出，并在第1天在输注开始(SOI)后1小时和4.5小时对每只动物进行详细的临床检查，此后在研究期间每天进行一次。在转移时、随机化前、第-1天和研究期间每周测量并记录所有动物的体重。
在所有动物预试验时以及在第1天(给药前)、第3天、第8天和第21天进行临床病理学评价(血液学、凝血和临床化学)。在SOI后30分钟(输注结束后立即)和4.5、8.5、24.5和72.5小时(相对于第1天)收集用于测定血液学参数和外周血淋巴细胞和细胞因子分析样品的额外样品。收集并保存骨髓涂片。
通过股静脉从所有动物收集血液样品(大约0.5mL)，用于测定试验物品的血清浓度(参见表42)(对于偏差，参见附录1)。动物在血液收集前不禁食，符合用于临床病理学收集的禁食的间隔除外。
表42.生物分析样品收集时间表
X＝收集样品。
a：仅分析第1组动物的SOI后0.583小时时间点的试验物品内容物。可根据研究负责人的判断分析额外的时间点。
为了进行处理，将血液样品收集在无添加剂无障碍微管中，并在收集后1小时内在受控室温下离心。将所得血清分成2个大致相等的等分试样置于预先标记的冷冻管中。在收集后2小时内将所有等分试样在-60℃至-90℃下冷冻储存。
在预定的尸检时对所有被安乐死的动物进行死后研究评价。
在兽医病理学家批准的程序下进行尸检。仔细检查动物的外部异常，包括可触及的肿块。从腹侧中线切口反射皮肤，并识别任何皮下肿块并与死前发现相关联。检查腹腔、胸腔和颅腔是否有异常。取出器官，进行检查，并在需要时置于固定液中。除眼(包括视神经)和睾丸外，将所有指定的组织固定在中性缓冲福尔马林(NBF)中。将眼(包括视神经)和睾丸置于改良的戴维森固定液中，然后转移至70％乙醇中保持长达三天，之后最终置于NBF中。福尔马林通过气管注入肺部。从所有动物收集完整的组织和器官。
在预定的尸检时记录所有动物的体重和方案指定的器官重量，并计算适当的器官重量比(相对于体重和脑重量)。成对的器官一起称重。收集甲状腺和甲状旁腺的总重。
结果
所有动物均存活至第22天的预定尸检。在经治疗的动物中没有注意到试验物品相关的临床或兽医结果。在治疗期或恢复期中，在经治疗的动物中没有观察到试验物品相关的对体重的影响。在任何时间间隔的任何剂量水平下，在任一性别中均没有G9.2-17 IgG4相关的对血液学终点的影响。
在任何时间间隔的任何剂量水平下，在任一性别中均没有G9.2-17 IgG4相关的对凝血时间(即，活化部分凝血活酶时间[APTT]和凝血酶原时间)或纤维蛋白原浓度的影响。个别凝血值之间的所有波动都被认为是偶发的，与生物学和程序相关的变化一致，和/或在幅度上可忽略不计，并且与G9.2-17 IgG4施用无关。
在任何时间间隔的任何剂量水平下，在任一性别中均没有G9.2-17 IgG4相关的对临床化学终点的影响。个别临床化学值之间的所有波动都被认为是偶发的，与生物学和程序相关的变化一致，和/或在幅度上可忽略不计，并且与G9.2-17 IgG4施用无关。
在任何时间间隔的任何剂量水平下，在任一性别中均没有G9.2-17 IgG4相关的对细胞因子终点的影响。个别细胞因子值之间的所有波动都被认为是偶发的，与生物学和程序相关的变化一致，和/或在幅度上可忽略不计，并且与G9.2-17 IgG4施用无关。
对大体尸检结果的审查显示没有被认为与试验物品相关的发现。没有被认为与试验物品相关的器官重量变化。没有试验物品相关的变化。
总之，对食蟹猴进行30、100和200mg/kg G9.2-17 IgG4的单次静脉内输注施用是可以耐受的，没有不良发现。因此，在本研究的条件下，未观察到的不良反应水平(NOAEL)为200mg/kg，这是评价的最高剂量水平。
将动物从笼子中移出，并在第1天在输注开始(SOI)后1小时和4.5小时对每只动物进行详细的临床检查，此后在研究期间每天进行一次。
实施例15：食蟹猴中G9.2-17的静脉内输注研究
本研究的目的是进一步表征食蟹猴中在每周一次的30分钟静脉内(IV)输注持续5周后试验物品G9.2-17(与半乳糖凝集素9结合的hIgG4单克隆抗体)的毒性和毒代动力学，并评价3周恢复期后到的任何变化的可逆性、进展或延迟出现。
实验设计
表43总结了研究设计。
表43.实验设计
a基于最近的实际体重测量结果。
将研究中使用的动物(食蟹猴)按照标准、按体重、随机化程序(旨在实现相似组平均体重)分配到研究组。雄性和雌性分别随机化。分配给研究的动物的体重在每一性别平均体重的±20％以内。
将缺乏G9.2-17(“媒介物”)或包含G9.2-17(“试验物品”)的制剂在研究期间每周一次通过30分钟IV输注施用至动物，持续5周(第1天、第8天、第15天、第22天和第29天)。剂量水平为0、100和300mg/kg/剂量并以10mL/kg的剂量体积施用。对照动物组以与治疗组相同的方式接受媒介物。通过经皮放置的导管经隐静脉施用剂量，并且每次给药使用新的无菌一次性注射器。在毒代动力学样品收集日(第1天、第15天和第29天)在给药前和给药结束时测量并记录剂量问责，以确保施用±10％的靶标剂量。个别剂量基于最近的体重。标记最后一次给药部位用于在终末期和恢复期尸检时收集。所有剂量均在试验物品制备后8小时内施用。
对动物进行生存期程序、和测量，如下例示。
对所有动物进行心电图检查。在记录心电图(ECG)之前，尽可能小心避免引起动物过度兴奋，以尽量减少这些测量中的极端波动或伪影。以50mm/s记录标准ECG(10导联)。使用合适的导联，测量RR、PR和QT间期以及QRS持续时间并确定心率。使用基于Bazett(1920)描述的方法的程序计算校正的QT(QTc)间期。所有描记均由咨询兽医心脏病专家评价和报告。
为了帮助连续性和可靠性，由两个独立的评级者针对所有场合进行功能性观察试验组合(FOB)评价，其由详细的家笼和开放区域神经行为评价组成(Gauvin和Baird，2008)。每个技术人员就每个家笼和笼外评分对猴子独立评分(不相互分享结果)，然后在试验完成后评估个体评分与他们的合作伙伴的评分是否一致。在给药前(在第-9天或第8天)对每只动物进行FOB评价以建立基线差异，并在第1天和第15天输注开始起2至4小时，以及在终末期和恢复期尸检之前进行FOB评价。包括但不限于评价活动水平、姿势、流泪、流涎、震颤、抽搐、自发收缩、刻板行为、面部肌肉运动、眼睑闭合、瞳孔反应、对刺激(视觉、听觉和食物)的反应、体温、Chaddock和Babinski反射、本体感觉、轻瘫、共济失调、测距不准和坡度评估、运动和步态。
测量并记录每只动物的血压，包括收缩压、舒张压和平均动脉压。使用具有20mmHg内的平均动脉压(MAP)的三个读数报告血压测量值。
按照试验设施SOP通过目测评估按动物/收集间隔测量和记录每只动物的呼吸频率3次。3次收集的平均值为报告值。
以预定的时间间隔对所有动物进行临床病理学评价(例如，免疫分型和细胞因子评价)。收集并保存骨髓涂片。通过股静脉从所有动物收集血液样品(大约0.5mL)，用于测定试验物品的血清浓度。动物在血液收集前不禁食，符合用于临床病理学收集的禁食的间隔除外。在研究结束时(第36天或第50天)，将动物安乐死并收集组织用于组织学处理和显微镜评价。
如下评价可溶性半乳糖凝集素9。在第1天、第8天、第15天和第29天给药前和输注开始起24小时以及在终末期和/或恢复期尸检之前，经股静脉内从所有动物收集血液样品(大约1mL)，用于测定血清的可溶性半乳糖凝集素9。动物在血液收集前不禁食，符合用于临床病理学收集的禁食的间隔除外。
如下处理可溶性半乳糖凝集素9样品。将血液样品收集在无添加剂无障碍管中，允许其在环境温度下凝结，并在环境温度下离心。将所得血清分成2个等分试样(100μL在等分试样1中，其余在等分试样2中)置于预先标记的冷冻管中。在收集后2小时内将所有等分试样在干冰上快速冷冻，并在-60℃至90℃下冷冻储存。
报告的表格中显示的所有结果都是使用非四舍五入的值根据原始数据四舍五入程序计算得出的，并且可能无法从所提供的单个数据中准确再现。
结果
●死亡率
所有动物都存活至第36天的预定终末期尸检和第50天的恢复期尸检。
●详细的临床和兽医观察
在治疗期或恢复期中，在经治疗的动物中没有注意到试验物品相关的临床或兽医观察结果。
●功能性观察试验组合
在治疗期或恢复期中，在经治疗的动物中没有注意到试验物品相关的FOB观察结果。
●体重和体重增加
在治疗期或恢复期中，在经治疗的动物中没有注意到试验物品相关的对体重和体重增加的影响。
●眼科检查
在治疗期或恢复期中，在经治疗的动物中没有注意到试验物品相关的对眼科检查的影响。
●血压值
在治疗期或恢复期中，在经治疗的动物中没有注意到试验物品相关的对血压值的影响。
●呼吸频率值
在治疗期或恢复期中，在经治疗的动物中没有注意到试验物品相关的对呼吸频率值的影响。
●心电学
在治疗期或恢复期中，在经治疗的动物中没有注意到试验物品相关的对心电图评价的影响。
●血液学
在任何时间点的任何剂量水平下，在任一性别中均没有G9.2-17相关的对血液学参数的影响。
●凝血
在任何时间点的任何剂量水平下，在任一性别中均没有G9.2-17相关的对凝血参数的影响。
●临床化学
在任何时间点的任何剂量水平下，在任一性别中均没有G9.2-17相关的对临床化学参数的影响。
●尿液分析
在13周中间期，在任何剂量水平下任一性别的尿液分析参数之中均未观察到G9.2-17相关的改变。
●细胞因子
在任何剂量水平或时间点均未观察到G9.2-17相关的对细胞因子的明确影响。
●外周血白细胞分析(PBLA)
在任何时间点的任何剂量水平下，在任一性别中均没有G9.2-17相关的对PBLA终点的影响。
●生物分析、半乳糖凝集素9和毒代动力学评价
在剂量施用后，在来自所有G9.2-17给药的动物的所有食蟹猴样品中，G9.2-17是可定量的。在对照食蟹猴样品中未检测到可测量的G9.2-17量。在来自所有动物的所有食蟹猴样品中，可溶性半乳糖凝集素9是可定量的。在第1天从大多数G9.2-17治疗的动物以及在第1天和第29天从对照动物给药前获得的所有血清样品中，G9.2-17血清浓度低于生物分析定量限(LLOQ<0.04ug/mL)。
●大体病理学和器官重量
在主要研究或恢复期动物中没有明确的试验物品相关的宏观观察结果。对于主要研究或恢复期动物，也没有试验物品相关的器官重量变化。
●组织病理学
没有明确的试验物品相关的显微观察结果。
总之，对食蟹猴进行100和300mg/kg G9.2-17的每周一次静脉内输注施用持续5周是可以耐受的，没有不良发现。
实施例16：Sprague Dawley大鼠中G9.2-17的静脉内输注研究
本研究的目的是评价G9.2-17(针对半乳糖凝集素9的IgG4人单克隆抗体)的潜在毒性，该抗体通过静脉内注射连续4周每周一次施用至Sprague Dawley大鼠，随后是3周给药后恢复期。另外，确定了G9.2-17的毒代动力学特征。
实验设计
表44总结了研究设计。
表44：研究设计
a个别剂量体积是根据最近的体重计算的。
b SSD动物：3只动物/性别/组用于TK收集，仅在第1天单次剂量施用后。
将一百八十六只动物(Sprague Dawley大鼠)按体重随机分配到治疗组。在第1天、第8天、第15天、第22天和第29天以0、100和300mg/kg的剂量水平在尾静脉中通过单次IV注射施用对照物品/媒介物、用于试验物品的制剂缓冲液和试验物品G9.2-17。在第1天以100和300mg/kg的剂量水平向分配到SSD亚组的动物施用试验物品一次。
从环境适应的第二天开始，每天早上在清洁房间前进行一次临床观察。每天进行两次死亡率检查以评估一般动物健康状况。每周一次称量容器中的食物供应量和剩余量来估计食物消耗。平均克(g)/动物/天是从每周的食物消耗计算的。在随机化之前、在第-1天、然后在整个研究期间每周一次以及在每次尸检当天测量体重。在第1天、第35天和第49天在剂量施用后大约24小时记录SSB动物的功能性观察试验组合(FOB)观察结果。使用代谢笼收集尿液过夜。在第36天和第50天获得样品。
在包括用于血清化学的样本的每个系列收集之前，动物禁食过夜。在这些情况下，相关的临床病理学评价来自禁食的动物。血液是从受约束的清醒动物的颈静脉内或麻醉动物的腔静脉内收集的(在终末时)。
在研究的生存期检查期间评估的参数包括临床观察、食物消耗、体重、功能性观察试验组合。在选定的时间点收集血液样品用于临床病理学(血液学、凝血和血清化学)分析。收集尿液样品用于尿液分析。还在选定的时间点收集血液样品用于毒代动力学(TK)、免疫原性(例如，抗药抗体或ADA)和细胞因子分析。在第36天和第50天对动物进行尸检。在每次尸检时，记录大体观察结果和器官重量，并收集组织用于显微镜检查。
结果
生存期检查
死亡率：在研究期间没有注意到该动物的异常临床观察结果或体重变化。
临床观察：在研究期间没有注意到G9.2-17相关的临床观察结果。
食物消耗/体重：在研究期间没有注意到G9.2-17相关的食物消耗、体重或体重增加方面的变化。
临床病理学：在临床病理学参数中没有注意到G9.2-17相关的变化。
细胞因子分析：没有G9.2-17相关的IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-10和/或TNF-α、MCP-1和MIP-1b的血清浓度方面的变化。
大体病理学：没有G9.2-17相关的大体观察结果。此外，没有G9.2-17相关的绝对或相对器官重量方面的变化。
组织病理学：没有G9.2-17相关的组织学发现。
总之，每周一次对Sprague Dawley大鼠进行总共5个剂量的静脉内G9.2-17施用是通常良好耐受的。没有G9.2-17相关的临床观察、食物消耗、体重、FOB参数、临床病理学、细胞因子、大体观察或器官重量方面的变化。
实施例17：患有眼部黑素瘤的受试者中单独的和与化学疗法组合的G9.2-17(IgG4)的安全性、药代动力学和抗肿瘤活性的研究
半乳糖凝集素9是一种被许多实体瘤(包括胰腺癌、结直肠癌和肝细胞癌)过度表达的分子。此外，半乳糖凝集素9在肿瘤相关巨噬细胞以及肿瘤内免疫抑制性γδT细胞上表达，从而充当癌症相关免疫抑制的有效介质。如本文所述，已经开发了靶向半乳糖凝集素9的单克隆抗体(例如，G9.2-17)。数据表明，G9.2-17在原位KPC模型中使胰腺肿瘤生长停滞50％，并将KPC动物的生存期延长了多于一倍。另外，在动物研究中，抗半乳糖凝集素9抗体显示出与化学治疗剂具有治疗协同作用的信号。
本研究的目的是确定在患有眼部黑素瘤(诸如转移性眼部黑素瘤)的受试者中在12至24个月治疗后的安全性、耐受性、最大耐受剂量(MTD)和客观肿瘤应答。该研究还检查了无进展生存期(PFS)、按照RESIST的应答持续时间、疾病稳定性、存活的受试者的比例以及药代动力学(PK)和药效学(PD)参数。受试者经受治疗前和治疗后活检，以及研究前和研究期间每8周一次的PET-CT成像。此外，还检查了免疫学终点诸如外周和肿瘤内T细胞比率、T细胞激活、巨噬细胞分型、血清中的细胞因子谱、肿瘤免疫组织化学和半乳糖凝集素9血清水平。该研究在主研究方案下进行，并且研究持续12-24个月。
受试者、疾病以及所有临床和安全性数据以平均值、中位数或比例描述性地呈现，并使用适当的方差度量(例如，95％置信区间范围)。Waterfall和Swimmers图用于以图形方式呈现每个疾病部位内每个研究臂的受试者的ORR和应答持续时间，如下所述。还进行了探索性相关分析，以鉴定可能与ORR相关的潜在生物标志物。所有统计分析均使用SAS 9.2版(SAS,Cary,NC)进行。
(A)研究设计
基于小鼠模型KPC004数据，当前估计的最低预期药理活性剂量(PAD)为2mg/kg，其中50mcg/小鼠(2mg/kg；人体等效剂量HED＝0.16mg/kg)被确立为活性剂量。替代模型在200或400mcg/小鼠剂量范围(8-16mg/kg；HED＝0.65-1.3mg/kg)是活性的。
下表45显示了建议的临床起始剂量水平，该剂量水平取决于在100和200mg/kgG9.2-17建议剂量水平下符合重复GLP给药毒性研究的结果。估计的起始剂量使用未观察到的不良作用水平(NOAEL)的1/10或最高非严重毒性剂量(HNSTD)的1/6作为起始点，然后将该剂量(mg/kg)转换为HED(mg/kg)。
表45.建议的临床起始剂量
本研究包括G9.2-17(IgG4)的单一疗法和包括G9.2-17和吉西他滨/Abraxane((用于注射用悬液的紫杉醇蛋白结合颗粒；结合白蛋白)的联合疗法。该研究分为两部分：第1部分(1a期)和第2部分(1b期)。
第1部分
该研究的第1部分是使用连续重评估方法(CRM)(O’Quigley等人,1990)的剂量探索研究，CRM是一种根据过去的试验数据告知应如何针对下一个患者群组调整G9.2-17的剂量的基于模型的设计。一次向两例患者给予单独的G9.2-17，最大可用样品量为24。患者每2周接受5种剂量水平，直至出现疾病进展、不可接受的毒性，或形成剂量限制性毒性(DLT)而退出研究。剂量水平是：
●剂量水平1＝2mg/kg；
●剂量水平2＝4mg/kg；
●剂量水平3＝8mg/kg；
●剂量水平4＝12mg/kg；和
●剂量水平5＝16mg/kg。
或者，剂量水平是：
●剂量递增群组1＝0.2mg/kg
●剂量递增群组2＝0.63mg/kg
●剂量递增群组3＝2mg/kg
●剂量递增群组4＝6.3mg/kg
●剂量递增群组5＝10mg/kg
●剂量递增群组6＝16mg/kg
给药方案是通过静脉内(IV)施用每两周(Q2W)一次。需要时可采取多至25％的剂量减少。
作为安全预防措施，在每次剂量递增时，只有在每个群组的第一例患者已接受G9.2-17治疗并且治疗后过去至少7天后，才纳入和治疗新患者。第1部分在连续六例患者接受相同剂量且该剂量被鉴定为最佳生物剂量(OBD)后完成。
第2部分
该研究的第2部分是Simon的两阶段优化设计。该研究调查了单独使用G9.2-17(该研究的单剂臂)以及与吉西他滨/Abraxane结合使用。所使用的抗半乳糖凝集素9抗体的剂量低于在第1部分发现的表现出毒性的水平。
最佳的两阶段设计用于检验ORR≤5％的零假设相对ORR≥15％的替代(单剂臂内)。在第一阶段对23例患者进行药物试验后，如果≤1例患者有应答，则终止对应的试验臂。如果试验继续进行到Simon优化设计的第二部分，则每个单剂臂中总共招募56例患者。如果应答患者总数≤5，则摈弃该臂内的研究性药物。如果≥6例患者在3个月时有ORR，则激活该臂的扩展群组。上述方法适用于研究的单剂臂。
G9.2-17和吉西他滨/Abraxane的联合治疗
在患有眼部黑素瘤(例如，转移性)的患者中评价G9.2-17和吉西他滨/Abraxane的联合治疗。本研究的主要目标是6个月时的无进展生存期(PFS)。次要目标包括以下各项的改善：客观应答率(ORR)、6个月和12个月时的疾病控制率(DCR)、6个月和12个月时的患者生存率、应答时间、按照RECIST 1.1标准的应答持续时间和深度、安全性和耐受性。在联合臂的情况下，施用的G9.2-17的起始剂量比第1部分中鉴定的OBD(例如，第1部分中鉴定的RP2D剂量水平)低一个剂量。吉西他滨/Abraxane的剂量遵循FDA批准的标签上的剂量，并且可以根据方案特定的副作用(如果有)进行调整(例如，2周加停药1周)。如果3例或更多患者出现DLT，则逐步减少G9.2-17的剂量以不超过剂量3的量，除非低剂量继续提供临床益处。
在由眼部黑素瘤(例如，转移性)患者组成的患者群组中，主要疗效终点是6个月时的PFS。在使用吉西他滨/Abraxane的一线转移性环境中，据报告6个月PFS为50％(Von Hoff等人,2013)。在第一阶段对前11例患者试验G9.2-17/化学疗法组合后，如果6例或更少患者表现出PFS≥6个月，则终止试验。在试验的第二阶段，研究了总共25例患者。如果PFS≥6个月的应答患者的总数≤16，则摈弃该研究臂。
在已检测到早期疗效信号的情况下实施群组的扩展。一旦在五个试验臂之一内鉴定到可归因于肿瘤类型的有希望的疗效信号，启动扩展群组以确认该发现。每个扩展臂的样品量是基于第2部分确定的点估计值，结合ORR/患者生存率周围95％置信区间(95％ CI)的预定精度水平确定的。
第3部分
第3部分包括在已检测到早期疗效信号的情况下对群组的扩展。如果在试验臂之一内鉴定到可归因于肿瘤类型的有希望的疗效信号，则启动扩展群组以确认该发现。每个扩展臂的样品量是基于第2部分确定的点估计值，结合ORR周围95％置信区间(95％ CI)的预定精度水平确定的。
研究持续时间为12-24个月。
(B)患者群体
患有复发性/难治性转移性癌症(无论肿瘤类型如何)的患者有资格参与使用如O’Quigley(1990)描述的连续重评估方法(CRM)进行的剂量探索研究。设想在第1部分中捕获作用模式和/或早期疗效信号的眼部黑素瘤中进行扩展。在眼部黑素瘤中也考虑扩展。
第1部分和第2部分的患者纳入和排除标准相同。
患者纳入标准：
1.书面知情同意书
2.年龄≥18岁的男性或未怀孕女性
3.组织学证实的不可切除的转移性癌症(腺癌和鳞状细胞癌)
4.能够遵守研究方案
5.预期寿命>3个月
6.有近期存档的肿瘤样品(在5年内获得)可用于生物标志物分析。
7.患者能够并愿意经受治疗前和治疗中/治疗后活检。
8.根据RECIST v1.1，可测量的疾病。请注意，活检的病灶不应是靶标病灶。
9.预期生存期>3个月
10.对于第1部分：没有可用的护理标准选择，或患者拒绝了可用和指示的护理标准治疗，或不符合可用和指示的护理标准治疗。对于第2部分：扩展群组-在转移性癌症环境中接受至少一种全身性治疗线，以及未接受过含吉西他滨的方案或距离使用含吉西他滨的方案的治疗至少6个月的患者。CCR和CCA扩展群组-在转移性环境中接受至少一种先前治疗线。
11.允许在研究期之前或期间接种COVID-19疫苗。必须记录有关疫苗接种的时间和类型的信息。
12.东部肿瘤协作组(ECOG)行为状态0-1/卡氏评分>70。
13.研究的第1部分允许具有高微卫星不稳定性(MSI-H)和微卫星稳定性(MSS)的患者。
14.充分的血液学和终末器官功能，定义为：第1部分中的中性粒细胞计数≥1x109/L，血小板计数≥100x109/L，HCC≥50x109/L；在前一周未输血的情况下血红蛋白≥8.5g/dL，肌酐≤1.5ULN，AST(SGOT)≤3 x ULN(当存在HCC或肝转移时≤5 x ULN)，ALT(SGPT)≤3 x ULN(当存在HCC或肝转移时，≤5 x ULN)，胆红素≤1.5x ULN(患有已知吉尔伯特病的患者的胆红素可≤3.0 x ULN)，白蛋白≥3.0g/dL，INR和PTT≤1.5 x ULN；淀粉酶和脂肪酶≤1.5x ULN
15.研究开始前4周内无活动性感染或需要肠胃外抗生素的感染的证据且无严重感染。
16.有生育能力的女性必须在进入研究前具有阴性妊娠试验。
17.有生育能力的女性和有具有生育能力的伴侣的男性必须愿意在试验期间和治疗完成后的三个月内采取高效的避孕措施
18.自最后一剂抗癌治疗后在第一次G9.2-17施用前有四(4)周或5个半衰期(以较短者为准)
19.对于在C1D1之前已经稳定至少6个月的骨转移，允许继续使用双膦酸盐治疗(唑仑膦酸)或狄诺塞麦。
20.对于CCR和CCA扩展群组，在转移性环境中需要接受至少一种先前治疗线。
21.对于第1部分：肝细胞癌在接受至少一种先前的全身性治疗线(包括索拉非尼、乐伐替尼、纳武单抗、阿替利珠单抗和贝伐珠单抗)时进展，或者在接受标准治疗(包括手术和/或局部区域治疗)时出现进展后不能耐受或拒绝索拉非尼治疗，或者标准疗法被认为无效、不能耐受或不合适，或者没有有效的标准疗法可用。
22.允许胆道或胃出口梗阻，前提是通过内窥镜、手术或介入手段有效引流。
23.允许胰腺、胆道或肠瘘，前提是它们通过适当的非感染和通畅的引流进行控制(如果有任何引流或支架在原位，需要在研究开始前确认通畅)。
患者排除标准：
1.被诊断患有不明原发灶的转移性癌症的患者。
2.不愿意或不能遵守方案要求的患者
3.以前或现在的违禁药物成瘾(医用和娱乐用大麻/CBD/THC不被视为“违禁”)
4.临床显著的、活动性不受控制的出血，以及任何具有出血体质(例如，活动性消化性溃疡病)的患者。允许防治性或治疗性使用抗凝剂。
5.哺乳期女性
6.在研究给药前4周内或施用药物的5个半衰期(以较短者为准)内接受任何其他研究性剂或参与涉及用于治疗实体瘤的另一种研究性剂的任何其他临床试验。
7.在研究药物的第一剂量后4周内接受放射疗法，但对有限区域的姑息性放射疗法除外，例如用于治疗骨痛或局灶性疼痛肿瘤块。
8.具有真菌性肿瘤块的患者
9.患有局部晚期眼部黑素瘤的患者
10.由于先前的癌症治疗，≥CTCAE 3级毒性(脱发和白癜风除外)。使用先前的检查点抑制剂的4级免疫介导的毒性。2级或3级肺炎或导致免疫疗法治疗中断的任何其他3级检查点抑制剂相关毒性。允许出现低级(<3级)毒性，诸如先前治疗引起的神经病变、可控制的电解质异常和淋巴细胞减少症。
11.二次恶性肿瘤病史，但先前超过五年以治愈性意图治疗且未复发或复发可能性低的患者除外(例如非黑色素性皮肤癌、原位宫颈癌、前列腺癌或浅表性膀胱癌)
12.重度或不受控制的全身性疾病、充血性心力衰竭>纽约心脏协会(NYHA)2级、6个月内心肌梗塞(MI)的证据，或在研究者看来使患者参与试验不合需要的实验室发现
13.研究者认为严重危及患者安全或损害G9.2-17毒性评估的解释的任何医疗状况
14.严重的不愈合伤口、活动性溃疡或未经治疗的骨折
15.不受控制的胸腔积液、心包积液或腹水，需要反复引流手术
16.对嵌合或人源化抗体或融合蛋白有重度变应、过敏或其他超敏反应史
17.在第1周期第1天的6个月内发生重大血管疾病(例如，需要手术修复的主动脉瘤或近期动脉血栓形成)
18.在第1周期第1天之前3个月内有肺栓塞、中风或短暂性脑缺血发作史
19.在第1周期第1天之前6个月内有腹瘘或胃肠穿孔史
20.活动性自身免疫性病症(I型糖尿病、仅需要激素替代治疗的甲状腺功能减退症、白癜风、银屑病或脱发除外)
21.需要全身性免疫抑制治疗，包括但不限于环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、沙利度胺和抗肿瘤坏死因子[抗TNF]剂。已接受或正在接受急性、低剂量、全身性免疫抑制剂药物(例如，地塞米松4mg)的患者可以入组。替代疗法(例如，用于肾上腺或垂体功能不全的甲状腺素、胰岛素、生理性皮质类固醇替代疗法[例如，≤10mg/天的泼尼松等效物])不被视为全身性治疗的形式。允许使用吸入性皮质类固醇和盐皮质激素(例如，氟氢可的松)、局部类固醇、鼻内类固醇、关节内类固醇和眼科类固醇。
23.肿瘤相关疼痛(>3级)，对广泛镇痛干预(口服和/或贴剂)无应答。
24.不受控制的高钙血症，尽管使用了双磷酸盐
25.任何其他疾病、代谢功能障碍、体格检查发现或临床实验室发现，使得合理怀疑患有禁止使用研究性药物或可能影响结果的解释或使患者处于治疗并发症的高风险的疾病或疾患
26.接受器官移植
27.正在经受透析
28.对于第1部分，对于患有转移性去势抵抗性胰腺癌(pancreatic cancer)的受试者，允许继续进行激素雄激素剥夺疗法。
如果出现以下一种或多种情况，患者应停止治疗：
●怀孕
●无法控制的毒性
●在综合评估放射影像学数据、活检结果和临床状态后，由研究者确定的归因于疾病进展的症状恶化。
●与G9.2-17相关的不能耐受的毒性，包括研究者根据个体患者对治疗的潜在应答和事件的严重度确定为不可接受的irAE的发展
●如果患者继续接受研究治疗，可能危及患者安全的任何医疗状况
●使用另一种非方案抗癌疗法
(C)目标
第1部分(1a期)
主要目标：安全性、耐受性、最佳生物剂量(OBD)或最大施用剂量(MAD)、建议的2期剂量(RP2D)
次要目标：药代动力学(PK)、药效学(PD)参数、免疫原性
探索性目标：第1部分的探索性终点，以及下列探索性终点：客观应答率(ORR)、疾病控制率(DCR)、无进展生存期(PFS)、3个月(对于第1部分)、6个月和12个月(对于第1部分和第2部分)时的患者生存率。
第2部分
主要目标：6个月时的客观应答率(ORR)或无进展生存期(PFS)
次要目标：客观应答率(ORR)、无进展生存期(PFS)、疾病控制率(DCR)(例如，6个月和12个月时)、按照RECIST 1.1的应答持续时间和深度、6个月和12个月时的患者生存率、应答时间、安全性和耐受性
所有研究部分的探索性终点：
iRECIST标准、从血液和肿瘤的免疫分型、细胞因子谱(血清)、血液(血清或血浆)中的可溶性半乳糖凝集素9水平、半乳糖凝集素9肿瘤组织表达水平和表达模式(通过免疫组织化学)(肿瘤、基质、免疫细胞)、肿瘤突变负荷(TMB)、PDL-1表达(通过免疫组织化学)、错配修复状态、与疾病相关的肿瘤标志物、ctDNA以及这些参数与应答的相关性。应答时间(TTR)。生活质量和症状控制。
(D)研究程序
(i)评估时间表
评估时间表在给药前1个周期1次筛选(其可发生在治疗开始之前长达4周)之后分为4周周期。表33列出了给药前筛选评估和检查，并说明了在治疗周期内进行的评估和检查。在每个周期内允许任选的访视(如果有医学指征)，在此期间可进行任何研究评估。
(ii)筛选和评估程序
以下程序(概述于表33.评估时间表)必须在开始治疗后4周内进行：
●书面知情同意书
●核实纳入和排除标准
●先前COVID-19感染记录和最新的RT PCR和/或SARS CoV2IgG/IgM检测结果(如果执行)
●记录患者接种COVID-19疫苗(如果有且可用)的意向
●记录季节性流感的疫苗接种状态
●肿瘤成像评估，优选有或无造影剂的CT，如果需要基于研究者的判断进行有或无造影剂的MRI，如果需要基于研究者的判断进行PET-CT(诊断性CT)
●肿瘤活检(第一次给药前和重复活检)–根据扫描安排
●对于通过免疫组织化学预筛选评估半乳糖凝集素9表达，可使用存档的肿瘤组织(如果可用)，前提是它是在5年的时间范围内获得的，并且组织获取后施用的治疗的详细信息是已知且有记录的。这不是入选的先决条件，研究者将尽可能提供存档样本。
●按肿瘤类型的相关肿瘤标志物，例如CA15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白等，将在每个周期给药前进行评估(治疗6个月后可减少至每3个周期进行评估，按照与再分期扫描相同的时间表)，视情况而定。
●患者人口统计数据
●个人医学史，包括先前治疗/手术、任何原位植入物或过去植入物的记录、先前和/或当前使用医疗器械、伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期、剂量修改(如果有的话)和原因)、先前存在的症状和不良事件)，基于家族史和患者最了解的完整家族史的有风险的遗传性疾病
●先前获得的任何和所有其他检测结果(下一代和/或全外显子组测序结果、循环肿瘤DNA检测、种系测序结果、DPD检测结果、G6PD检测结果、Oncotype Dx和/或Endopredict检测结果、共有分子亚型(CMS)分类、DXA扫描(如果可用)。这些不是入选的先决条件。
●在过去12个月内进行的任何牙科手术/根管或眼科手术的记录
●下颌骨或上颌骨坏死史
●任何先前需要静脉内抗生素和/或抗真菌剂、port-a-cath替换的port-a-cath感染史。
●如果根据研究者的评估认为患者脱水，允许并在任何周期给药之前建议口服和/或静脉内补液。研究者可决定在给药当天进行BUN检查以指导决策。
●体格检查和视觉体征记录
●ECHO，射血分数(EF)
●12导联ECG
●任何瘢痕疙瘩疤痕的部位和状态/尺寸的记录
●在具有稳定且预先治疗过的脑转移患者中进行神经系统检查
●记录任何饮食要求或偏好(例如，实行特定饮食方案：间歇性禁食、生酮饮食等)
●补充剂的使用(当前和过去12个月)、使用类型持续时间、剂量和频率
●ECOG和/或卡氏状态
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●妊娠试验，如果是育龄女性。如果有双侧输卵管-卵巢切除术和/或子宫切除术的既往史则不需要，但记录这些手术程序。
●过去和/或当前的过敏(过敏原、严重度)
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)、TSH、fT4、脂肪酶、淀粉酶、PTH、FSH、LH、CRP和/或肌钙蛋白：
●凝血(PT、PTT、APTT)
●尿液分析
●PD血液–生物标志物分析
●PD肿瘤–治疗前活检的生物标志物分析
(iii)研究中程序
确保每次抽血时进行PD血液生物标志物分析；在研究前和研究中/研究后活检中进行肿瘤生物标志物分析。筛查过程必须涉及并记录神经系统检查。任何>2级irAE将被转交给相关专家并相应记录。irAE的管理将根据免疫治疗相关毒性管理(NCCN指南1.2020版)进行。在研究中治疗期间进行的研究相关程序和评估如下和表46(评估时间表)详述。
对于在治疗期间诊断出的COVID-19感染，研究者和申办方将遵循FDA指南和当地政策，研究者应联系医学监查员以讨论最佳行动方案。
第1周期程序
(a)第1周期第1天程序
完成所有先前的筛选和基线程序后，将在第1天进行以下程序。
●12导联ECG
●体格检查
●ECOG
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重和/或BSA)
●伴随用药(名称、适应证、剂量、途径、开始和结束日期、任何和所有剂量修改、其时间安排和原因)
●不良事件
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●C1D1的7天内的所有：血液化学(葡萄糖、Hgb A1c(如果有DM1或DM2史)、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)-空腹葡萄糖仅在有临床指征的情况下才会在给药前进行。TSH、fT4、脂肪酶、淀粉酶、PTH、FSH、LH、CRP、肌钙蛋白
●相关肿瘤标志物，例如CA15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白等，将在每个周期给药前进行评估(治疗6个月后可减少至每3个周期进行评估，按照与再分期扫描相同的时间表)，视情况而定
●凝血(PT、PTT、APTT)
●尿液分析(包括蛋白质和培养/抗菌谱)
●PD血液-生物标志物分析(可溶性半乳糖凝集素9，来自治疗前活检和免疫分型的半乳糖凝集素9的组织IHC)
●如表46中注释的时间点的PK血液样品。
(b)第1周期第2天程序
将在第1周期的第2天进行以下程序。
●伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期)
●不良事件
●PD血液–生物标志物分析
●PK血液样品
(c)第1周期第4天程序
将在第1周期的第4天进行以下程序。
●伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期)
●不良事件
●PD血液–生物标志物分析
●PK血液样品
(d)第1周期第7天程序
在第1周期的第7天进行以下程序。
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●伴随用药
●不良事件
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)
●PD肿瘤–生物标志物分析
●PK血液样品
(e)第1周期第15天程序
在第1周期的第15天进行以下程序。
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)ECOG
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●不良事件
●PD血液–生物标志物分析
●PK血液样品
第2周期程序
(a)第2周期第1天程序
在第2周期的第1天进行以下程序。
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)、TSH、fT4
●相关肿瘤标志物，例如CA15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白等，将在每个周期给药前进行评估(治疗6个月后可减少至每3个周期进行评估，按照与再分期扫描相同的时间表)，视情况而定。
●体格检查
●不良事件
●ECOG
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●PK血液样品
●PD血液–生物标志物分析
●伴随用药(名称、适应证、剂量、途径、开始和结束日期、任何和所有剂量修改、其时间安排和原因)
(b)第2周期第7天程序
将在第2周期的第7天进行以下程序。
●12导联ECG
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期)
●不良事件
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)
●PD血液–生物标志物分析
●PK血液样品
●妊娠试验，如果是育龄且卵巢和子宫在原位的女性
(c)第2周期第15天程序
在第2周期的第15天进行以下程序。
●再分期扫描(有造影剂的CT、MRI、PET-CT或X射线)–可在研究药物施用开始后6至8周进行，安排为额外的单独访视
●肿瘤活检-3/+12天，如果可行并安排为单独访视/可与扫描同时进行，因为可能需要成像引导以促进获得组织样品(不应对靶标病灶进行活检)
●PD肿瘤-生物标志物分析
●ECOG
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●不良事件
●PK血液样品
●PD血液–生物标志物分析
第3周期程序
(a)第3周期第1天程序
在第3周期的第1天进行以下程序。
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)、TSH、fT4
●相关肿瘤标志物，例如CA15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白等，将在每个周期给药前进行评估(治疗6个月后可减少至每3个周期进行评估，按照与再分期扫描相同的时间表)，视情况而定。
●体格检查
●ECOG
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期)
●不良事件
●PD血液–生物标志物分析
●PK血液样品
●妊娠试验，如果是育龄女性
(b)第3周期第7天程序
在第3周期的第7天进行以下程序。
●ECHO
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期)
●不良事件
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)
●PD血液–生物标志物分析
●PK血液样品
(c)第3周期第15天程序
在第3周期的第15天进行以下程序。
●ECOG
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●不良事件
●PK血液样品
●PD血液–生物标志物分析
第4周期及以后的程序
(a)第4周期第1天程序
在第4周期的第1天进行以下程序。
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)、TSH、fT4、脂肪酶、淀粉酶、PTH、肌钙蛋白、FSH、LH、CRP
●再分期扫描(有造影剂的CT、MRI、PET-CT或X射线)–可在研究药物施用开始后6至8周进行
●相关肿瘤标志物，例如CA15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白等，将在每个周期给药前进行评估(治疗6个月后可减少至每3个周期进行评估，按照与再分期扫描相同的时间表)，视情况而定
●体格检查
●ECOG
●不良事件
●PK血液样品
●PD血液–生物标志物分析
●妊娠试验，如果是育龄女性
(b)第4周期，第7天程序(与C3 D7相同)
将在第4周期的第7天进行以下程序
(c)第4周期，第15天程序(与C3D15相同)
将在第4周期的第15天进行以下程序。
(iv)研究结束或提前终止程序
以下程序在第59天或最后一次给药后30天进行，包括提前停止治疗的患者。
●再分期扫描(优选有或无造影剂的CT，有或无造影剂的MRI，如果研究者需要进行PET-CT)–如果在最后一个周期后>6至8周研究结束且间隔更短，则由研究者决定重复
●相关肿瘤标志物，例如Ca15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白等，将在每个周期给药前进行评估(治疗6个月后可减少至每3个周期进行评估，按照与再分期扫描相同的时间表)，视情况而定
●12导联ECG
●体格检查
●ECOG
●仰卧5分钟后的生命体征(体温、HR、BP、RR，包括体重)
●伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期)
●不良事件
●妊娠试验，如果是女性且卵巢和子宫在原位
●差分全血细胞计数(CBC)、血小板、血红蛋白
●血液化学(葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、血尿素氮、CPK)、TSH、fT4、PTH、雌二醇、催乳素、睾酮、FSH、LH
●凝血(PT、PTT)
●尿液分析
●PD血液–生物标志物分析
●PK血液样品
(v)长期随访
一旦患者完成治疗期，将每3个月进行一次总生存期随访，持续长达2年。对于因临床进展而退出的患者，将在可能的情况下继续进行放射学评估。
将大约每3个月收集一次生存数据以及在疾病进展后开始的任何新抗癌治疗的信息。随访可通过电话访谈或病例回顾进行，并报告于病例报告表上。在随访期间，在事件发现或通告24小时内收集并报告被认为与研究治疗相关的死亡(无论其因果关系如何)和严重不良事件。
(vi)研究评估
(a)体格检查
医学和体格检查必须由合格的医师、执业护士或医师助理进行，并且应包括在筛选、治疗期间和研究结束时对全身系统进行全面审查。体格检查包括乳房检查(如果有临床指征)以及生命体征-体温、心率(HR)、血压(BP)、呼吸频率(RR)，在仰卧位休息5分钟后测量。还将测量和记录患者体重。
(b)医学史
医学史包括肿瘤史、放射治疗史、手术史、当前和过去用药史。
●个人医学史，包括先前治疗/手术、任何原位植入物或过去植入物的记录、先前和/或当前使用医疗器械、伴随用药(名称、适应症、剂量、途径、开始和结束日期、剂量修改(如果有的话)和原因)、先前存在的症状和不良事件)，基于家族史和患者最了解的完整家族史的有风险的遗传性疾病
●先前获得的任何和所有其他检测结果(下一代和/或全外显子组测序结果、循环肿瘤游离DNA检测、种系测序结果、DPD检测结果、G6PD检测结果、Oncotype Dx和/或Endopredict检测结果)
●过去12个月内进行的任何牙科治疗的记录
●任何瘢痕疙瘩疤痕的部位和状态/尺寸的记录
●对于先前已切除过胰腺腺癌的患者，记录原发性肿瘤是否位于胰头、胰体或胰尾。
●排便习惯/典型频率和一致性
(c)临床实验室评价
根据评估时间表，收集患者的血液样品用于常规临床实验室检测。临床实验室参数将在现场的当地实验室进行分析。待完成的实验室评估将包括血液学和血清化学，定义如下：
●血清化学：包括葡萄糖、总蛋白、白蛋白、电解质[钠、钾、氯化物、总CO2]、钙、磷、镁、尿酸、胆红素(总胆红素、直接胆红素)、SGPT(ALT)或SGOT(AST)、碱性磷酸酶、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、HgbA1c、血尿素氮、CPK、TSH、fT4、脂肪酶、淀粉酶、PTH、睾酮、雌二醇、催乳素、FSH、LH和CRP。在C1D1、C2D1、C3D1、C4D1和其他天数(只有在有临床指征的情况下)给药前进行空腹葡萄糖。
●血液学：包括差分全血细胞计数、血小板和血红蛋白
●凝血：包括凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(PTT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)
●生物标志物分析(PD血液)：包括患者血清/血浆中的半乳糖凝集素9水平、外周血免疫分型、细胞因子测量。
●药代动力学(PK)血液采样：如果研究者确定应中断研究药物的剂量，则在研究药物给药前(给药2小时内)和给药后4小时+/-30分钟收集额外的PK和安全性评估。由于COVID-19限制无法在给药后容纳患者超过2小时的中心将仅在给药后2小时时提供样品。
如果施用因任何原因中断然后恢复，则可根据研究者的判断在中断期间进行额外的PK评估。如果在恢复施用后减少研究药物的剂量，则将在恢复施用前和给药完成后2小时+/-15分钟收集额外的PK评估。如果有临床指征，则可根据研究者的判断进行额外的PK和其他血液评估。
在可能的情况下，在停止研究的患者最后一次研究药物施用后长达4周，可大约每7至14天获得血液用于额外的PK或PD评估。将在给药前、给药完成后2小时+/-15分钟和研究药物施用后4小时(+/-15分钟)收集血液用于PK评估。
(d)尿液分析
将收集患者的尿液样品进行常规尿液分析。尿液分析包括颜色、外观和比重试纸、蛋白质、白细胞酯酶、葡萄糖、酮、尿胆素原、亚硝酸盐、WBC、RBC和pH值，以及筛选时的尿液培养。
(e)心电图(ECG)
将评价来自12导联心电图的以下参数：心率、PR间期、QRS持续时间、QT间期和QTcF间期。
(f)肿瘤成像评估
有造影剂的CT是优选方式(考虑到疾病的位置，如果CT不可行或不合适，用MRI、PET-CT和/或其他成像方式代替或补充CT扫描)。评估应至少包括颈部/胸部/腹部/骨盆，并且应包括基于患者的肿瘤类型和病史所示的其他解剖区域。成像扫描必须去识别化，并以原始DICOM格式作为患者研究文件的一部分存档。虽然获得的扫描类型由研究者判断是否适合疾病，但在研究期间应使用相同的方法。每6至8周+/-1周进行评估，如果在过去4至6周内未进行评估，则在治疗结束时进行评估。
(g)肿瘤活检
收集治疗前和治疗中/治疗后活检。在第1次剂量施用之前收集治疗前活检。治疗中活检可在第1周期后活检可行的任何治疗日收集。优选的下一次活检将在第一次研究中扫描之前。如果无法在方案规定的时间范围内进行该程序，则可允许使用替代方案，但必须与研究负责人/医学监查员讨论。一般认为多种临床因素可能会导致难以获得足够的样本。决定在治疗中不完成活检应与医学监查员讨论。
(h)肿瘤标志物
探索性标志物，例如CA15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白等，将在每个周期给药前进行评估(治疗6个月后可减少至每3个周期进行评估，按照与再分期扫描相同的时间表)，视情况而定。
(i)不良事件
将记录研究药物施用后开始或恶化的不良事件(AE)。应跟踪AE，直至消退至基线、稳定或被视为不可逆。必须从患者书面同意之日起至给药停止或患者参与研究停止后30天(如果最后一次预定访视发生在较晚的时间)收集所有严重AE(SAE)。
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(E)安全性评估
所有观察到的或主动提供的不良事件，无论治疗组或与研究药物的因果关系如何，都将记录于病例报告表(CRF)的不良事件页上。不良事件将使用MedDRA编码系统进行编码，并且所有AE将根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)不良事件通用术语标准5.0版(NCI-CTCAE)[NCI,2017]进行分级。
不良事件
不良事件在国际协调委员会(International Conference on Harmonisation，ICH)药品临床试验管理规范指南中定义为“施用药物产品的患者或临床研究受试者发生的任何不利的医学事件，且不一定与该治疗有因果关系”。
本研究中对不良事件的此定义进行了扩展，以包括从受试者签署知情同意书的时间至研究性药物开始使用的时间的任何此类事件(例如，体征、症状或诊断)的发生或先前存在的医疗状况的恶化。恶化表明先前存在的医疗状况(例如，糖尿病、偏头痛、痛风、高血压等)的严重度、频率或疾患持续时间增加，或者与明显更差的结果相关。
对于所有不良事件，研究者必须寻求并获得足够的信息，以确定不良事件的结果并评估其是否符合分类为严重不良事件的标准，进而需要立即通知申办方或其指定代表。对于所有不良事件，研究者应获得足够的信息以确定不良事件的因果关系。研究者需要评估因果关系。对于与研究性产品有因果关系的不良事件，需要研究者进行随访，直至事件消退或稳定在研究者和申办方临床监查员或其指定代表可接受的水平。
严重不良事件
严重不良事件(SAE)被定义为以下不良事件：
●导致死亡；
●危及生命(使受试者面临直接死亡风险)；
●需要住院或延长现有住院时间；
●导致持续或严重的失能/丧失能力；或
●先天性异常/出生缺陷
如果根据适当的医疗判断，可能不会导致死亡、危及生命或需要住院的重要医疗事件可能会危害患者并且可能需要医疗或手术干预以防止出现在该定义中所列结果之一时，则该事件可被视为SAE。此类医疗事件的实例包括需要在急诊室或家中进行强化治疗的过敏性支气管痉挛、血液恶液质或抽搐，但不会导致住院治疗。符合“严重”定义的住院治疗是指任何住院患者入院，其包括至少在医疗保健机构过夜。
住院病人入院不包括：康复设施、临终关怀设施、专业护理设施、疗养院、常规急诊室进入、当天手术(作为门诊/日间/非住院手术)或社会入院(例如，受试者没有睡觉的地方)。
安全性将由合格的医师、医师助理或护理人员在整个研究过程中进行评估。用于评价安全性的测量包括病史、体格检查、生命体征、临床实验室检查、尿液分析、12导联ECG和AE监测。
可重复在临床上显著偏离先前测量值的实验室测量(由研究者确定)。如果有必要，应进行比方案中规定的额外或更频繁的检查，以提供足够的AE记录和AE解析。
对于所有不良事件，研究者应获得足够的信息以确定不良事件的因果关系(例如，研究药物或其他疾病)。按以下定义评估不良事件与研究治疗的关系：
不相关：任何不符合研究药物施用的合理时间顺序、且可能由患者的临床状态或施用于患者的其他治疗模式产生的事件。
不太可能：任何不符合研究药物施用的合理时间顺序、或可能由患者的临床状态或施用于患者的其他治疗模式产生的事件。
可能：符合研究药物施用的合理时间顺序、或符合对可疑药物的已知应答模式、且无法通过患者临床状态的已知特征或施用于患者的其他治疗模式合理解释的任何反应。
相关：符合研究药物施用的合理时间顺序，且符合对可疑药物的已知应答模式，且随着再次挑战而复发，和/或通过停止药物或减少剂量而改善的任何反应。
(a)不良事件管理的剂量减少程序
如果将剂量减少用于AE管理，允许两次剂量减少。每次减少剂量时减少基线剂量的30％。当预期临床益处并可能继续获得时，会寻求减少剂量。
(b)停止研究治疗的标准
患者通常应维持研究治疗，直至有确认的放射影像学进展。如果患者有放射影像学进展但没有明确的临床进展并且没有开始替代治疗，则患者可继续接受研究治疗，由研究者自行决定。然而，如果患者有明确的临床进展而没有放射影像学进展，则应停止研究治疗，并向患者建议可用的治疗选择。
(c)持续的安全性审查
如果发生严重或危及生命的免疫相关不良反应(IMAR)或提示开始全身性类固醇治疗，则应暂停G9.2-17，但可能允许特定例外情况(例如，临床稳定患者的某些内分泌病)。提供详细的监测计划，意在限制在联合药物开发过程中发生的IMAR的严重度和持续时间。
在每个28天周期第1天、第8天和第15天，以125mg/m2在30至40分钟以静脉内给予Abraxane。吉西他滨紧接Abraxane之后在每个28天周期第1天、第8天和第15天施用。基于患者潜在不良事件的发展，可进行以下一项或多项：
●轻度肝损伤患者无需调整。
●如果AST>10 x ULN或胆红素>5 x ULN，暂停Abraxane。
●减少中度至重度肝损伤患者中的起始剂量。
●基于重度血液、神经、皮肤或胃肠毒性，可能需要剂量减少或停止。
禁忌证：
●中性粒细胞计数<1,500个细胞/mm3
●对Abraxane的重度超敏反应。已知对吉西他滨有超敏性的患者。
下表47提供了关于Abraxane和吉西他滨的建议剂量和减少剂量的示例性指导。另见Abraxane monograph:Abraxis BioScience,LLC.Highlights of PrescribingInformation[Internet].Summit(NJ):Celgene Corporation；2019年12月[2020年5月7日引用]。
表47.肝损伤患者中建议的Abraxane起始剂量
a胆红素水平高于正常值上限的患者被排除在胰腺癌或肺癌的临床试验之外。
考虑到外渗的可能性，建议在药物施用过程中密切监测输注部位是否有可能的浸润。按照指示将Abraxane的输注限制在30分钟，可降低输注相关反应的可能性。
(d)识别潜在的安全性问题
剂量限制性毒性(DLT)时期：一(1)个周期。
一个周期包括C1D1(第1周期第1天)和C1D15(第1周期第15天)。
监测计划
在第1部分，剂量递增阶段，在对每个群组的第1周期进行审查后，将剂量递增进行至下一个群组。将由SMC使用安全性和可用的PK数据来评估每个群组中所有患者的DLT。作为安全预防措施，在剂量递增期间，只有在每个群组的第一例患者已接受G9.2-17治疗并且治疗后过去至少7-14天，才将纳入和治疗新患者。在第1周期完成后，将对每例患者进行选择DLT安全性分析。在扩展阶段期间，将由SMC监测毒性，SMC将在每次剂量递增之前召开会议审查累计毒性率。SMC会议的频率随着毒性率的增加而增加。SMC有权在任何时间建议终止或更改本临床研究的研究设计，包括但不限于试验中间剂量水平或启动间歇给药方案。
(e)剂量限制性毒性标准
剂量限制性毒性(DLT)被定义为临床上显著的非血液学不良事件或异常实验室值，评估为与转移性肿瘤疾病进展、间发疾病或伴随用药无关，并且与研究药物有关且发生在研究的第一周期内，符合以下任何一项标准：
●任何持续时间的所有4级非血液毒性
●所有3级非血液毒性。例外情况是：
○不需要住院或TPN支持，并且可以在48小时内通过支持性护理管理到≤2级的3级恶心、呕吐和腹泻。
○在24小时内校正为≤2级的3级电解质异常。
○其他3级无症状实验室异常
DLT周期包括一(1)个周期，即，四(4)周。一个周期包括在第1天和第15天(C1D1和C1D15；分别为第1周期第1天和第1周期第15天)施用G9.2-17。
(f)剂量延迟和减少
可能、大概或肯定与一种或多种研究药物相关的任何≥3级的AE将在继续给药前与医学监查员讨论，但以下例外情况不需要与医学监查员讨论：
●持续<72小时的局部注射部位反应，包括疼痛、发红、肿胀、硬结或瘙痒
●持续<72小时的发烧、肌痛、头痛或疲劳的全身性注射反应
如果研究者认为适当(在与医学监查员讨论后)，对于≥3级不良事件可能需要延迟剂量，直至毒性消退(至1级或更低)。
在方案的第2部分，如果3例或超过3例或多例患者出现DLT，G9.2-17的剂量将减少至比建议的2期剂量(RP2D)低1个剂量
(F)RECIST肿瘤评估标准
在基线肿瘤评估中，肿瘤病灶/淋巴结将被分类为可测量或不可测量，其中根据测量平面中的最长直径记录可测量的肿瘤病灶(病理性淋巴结除外，其在最短轴上测量)。当基线时存在超过一个可测量的病灶时，代表所有受累器官的最多总共五个病灶(和每个器官最多两个病灶)的所有病灶都应被鉴定为靶标病灶。应基于大小来选择靶标病灶(具有最长直径的病灶)。将计算所有靶标病灶的直径总和并将其报告为基线总直径。
包括病理性淋巴结在内的所有其他病灶(或疾病部位)都应被鉴定为非靶标病灶，并且也应在基线时记录。无需测量，这些病灶应按‘存在’、‘不存在’或‘明确进展’进行跟踪。
疾病应答(完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定疾病(SD)和进展性疾病(PD))将按照附录4中的概述进行评估。
疾病应答测量将允许计算总体疾病控制率(DCR)(包括CR、PR和SD)、客观应答率(ORR)(包括CR和PR)、无进展生存期(PFS)和进展时间(TTP)。
(G)患者完成或退出
患者完成
第1部分–剂量探索：
患者将每2周接受5种剂量水平之一的研究药物，直至出现疾病进展、不可接受的毒性，或形成剂量限制性毒性(DLT)而退出研究。
将向两例患者给药，最大可用样品量为24。只有接到SMC的批准时才开始剂量递增。在每次剂量递增时，只有在前一个群组中的2例患者已接受G9.2-17治疗并且治疗后过去至少7天，才纳入和治疗新患者。
当连续六例患者接受相同剂量且该剂量将被鉴定为OBD时，将完成第1部分。
第2部分–肿瘤类型特异性治疗：
眼部黑素瘤(例如，转移性PDAC)患者的扩展群组将需要G9.2-17和吉西他滨/Abraxane的联合治疗。研究的完成将取决于3个月时的患者应答和12个月时的应答患者生存率。
第2部分–扩展：
如果在五个试验臂之一内鉴定到可归因于肿瘤类型的有希望的疗效信号，则将启动扩展群组以确认该发现。完成将如第2部分所述。
停止研究治疗
由于以下任何原因，可能会在完成研究治疗之前使患者停止：
●剂量限制性毒性-定义为临床上显著的非血液学不良事件或异常实验室值，评估为与转移性肿瘤疾病进展、间发疾病或伴随用药无关，并且与研究药物有关且发生在研究的第一周期内，符合以下任何一项标准：
○任何持续时间的所有4级非血液毒性
○所有3级非血液毒性。例外情况如下：
■不需要住院或TPN支持，并且可以在48小时内通过支持性护理管理到≤2级的3级恶心、呕吐和腹泻。
■在24小时内校正为≤2级的3级电解质异常。
●根据RESIST标准的进展性疾病或在更早时间点的显著临床进展(如果研究者判断为符合患者的最佳利益)
妨碍进一步施用治疗的间发疾病
等效方案
从以上描述中，本领域技术人员可容易地确定本发明的基本特征，并且在不背离本发明精神和范围的前提下，可对本发明做各种变化和修改以使其适应于各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求范围内。
尽管本文已描述和说明了若干发明实施方案，但是本领域普通技术人员很容易想到用于执行本文所述功能和/或获得结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化和/或修改被认为是在本文所述发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置都意在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置取决于使用发明教导的具体应用。本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或能够确定本文所述具体发明实施方案的许多等效方案。因此，应当理解，前述实施方案仅以示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，可以不同于具体描述和要求保护的方式实施发明实施方案。本公开的发明实施方案针对本文所述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包括在本公开的发明范围内。
如本文所定义和使用的所有定义，应理解为优先于字典定义、以引用的方式并入的文件中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均以引用的方式并入每一个所引用的主题，在某些情况下，可涵盖整个文件。
除非有相反的明确指示，否则如本文在说明书和权利要求中所用，不定冠词“一种/一个(a)”和“一种/一个(an)”，应当被理解为意指“至少一个/一种”。
如本文在说明书和权利要求中所用，短语“和/或”应当被理解为意指所连接的元素的“任一个或两者”，即元素在一些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在。利用“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式来解释，即所连接的元素的“一个或多个”。除通过“和/或”从句具体标识的元素外，还可任选地存在其他元素，无论与具体标识的那些元素相关还是无关。因此，作为非限定性实例，对“A和/或B”的提及，当与开放性措辞诸如“包含/包括”结合使用时，在一个实施方案中可仅指A(任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中可仅指B(任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中，可指A和B(任选地包括其他元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求中所用，“或”应当被理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分开各项时，“或”或“和/或”应当被理解为是包含性的，即包含至少一个，但也包括多个元素或元素列表中的多于一个，以及任选地，包括另外未列出的项。只有明确地指明相反的术语，诸如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或当用于权利要求中时的“由……组成”将指包含多个元素或元素列表中的恰好一个元素。一般地，如本文所用的术语“或”应当仅在冠有排他性的术语诸如“任一”、“……之一”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”时被解释为表示排他性选择(即，“一个或另一个但非两个”)。“基本上由……组成”，当用于权利要求中时，应当具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本文在说明书和权利要求中所用，关于一个或多个元素的列表的短语“至少一个”应当被理解为意指选自元素列表中的任一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表内具体列出的每一和每个元素的至少一个并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许可任选地存在除短语“至少一个”所指的元素列表内具体标识的元素外的元素，无论与那些具体标识的元素相关还是不相关。因此，作为非限定性实例，“A和B的至少一个”(或，等同地，“A或B的至少一个”，或等同地，“A和/或B的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个(任选地包括多于一个)A而无B存在(且任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括多于一个)B而无A存在(且任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括多于一个)A和至少一个(任选地包括多于一个)B(且任选地包括其他元素)；等等。
还应当理解，除非有相反的明确指示，否则在包括多于一个步骤或行为的本文要求保护的任何方法方法的步骤或行为的顺序不一定限定于叙述所述方法的步骤或行为的顺序。
序列表
<110> 普尔泰克健康有限公司(Puretech Health LLC)
<120> 抗半乳糖凝集素9抗体及其在治疗眼部黑素瘤中的用途
<130> 112174-0168-NP001WO1
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 63/105,772
<151> 2020-10-26
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
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<223> 合成
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Gly
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<223> 合成
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<223> 合成
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr Trp Ser Tyr Pro Ser Trp Trp Pro Tyr Arg Gly Met Asp
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<223> 合成
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<220>
<223> 合成
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 11
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 12
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 13
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 14
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Thr Asp Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Ser Tyr Pro Ser Trp Trp Pro Tyr Arg Gly Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 17
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr Trp Ser Tyr Pro Ser Trp Trp Pro Tyr Arg Gly Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 18
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Ser Tyr Pro Ser Trp Trp Pro Tyr Arg Gly Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 19
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Ser Tyr Pro Ser Trp Trp Pro Tyr Arg Gly Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 20
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
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290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 21
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 22
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Ser Tyr Pro Ser Trp Trp Pro Tyr Arg Gly Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450
<210> 23
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Ser Tyr Pro Ser Trp Trp Pro Tyr Arg Gly Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450

Claims (54)

1.一种用于治疗人受试者的表达半乳糖凝集素9的实体瘤的方法，所述方法包括向有需要的人受试者施用有效量的包含结合半乳糖凝集素9的抗体(抗半乳糖凝集素9抗体)的药物组合物，
其中所述抗体包含(a)重链可变区(VH)，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区2(CDR2)和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区3(CDR3)；以及(b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:1所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:2所示的轻链CDR2和如SEQ ID NO:3所示的轻链CDR3，并且
其中所述实体瘤是眼部黑素瘤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体是全长抗体、其抗原结合片段，或单链可变片段(scFv)。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体是全长抗体，所述全长抗体是IgG分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述抗体是IgG1或IgG4抗体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:14所示的重链恒定区和/或如SEQ ID NO:11所示的轻链恒定区。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述抗半乳糖凝集素9抗体含有包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述抗体是G9.2-17IgG4。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述眼部黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述眼部黑素瘤是转移性的。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中将所述抗半乳糖凝集素9抗体以约0.2mg/kg至约32mg/kg的剂量、任选地以约1mg/kg至约32mg/kg的剂量施用至所述人受试者。
12.如权利要求11所述的方法，其中将所述抗半乳糖凝集素9抗体以约0.2mg/kg至约16mg/kg的剂量施用至所述人受试者。
13.如权利要求12所述的方法，其中将所述抗半乳糖凝集素9抗体以约0.2mg/kg、约0.63mg/kg、约2mg/kg、约6.3mg/kg、约10mg/kg或约16mg/kg的剂量施用至所述人受试者。
14.如权利要求11所述的方法，其中将所述抗半乳糖凝集素9抗体以约0.5mg/kg至约32mg/kg或约2mg/kg至约16mg/kg的剂量施用至所述受试者。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中将所述抗半乳糖凝集素9抗体每两周一次施用至所述人受试者。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中将所述抗半乳糖凝集素9抗体通过静脉内输注施用至所述受试者。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述人受试者没有接受与所述抗半乳糖凝集素9抗体同时进行的其他抗癌疗法。
18.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述人受试者施用有效量的检查点抑制剂。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、替雷利珠单抗或西米普利单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗和阿替利珠单抗。
21.如权利要求20所述的方法，其中结合PD-1的抗体是纳武单抗，所述纳武单抗以每两周一次约240mg的剂量施用至所述受试者；或者其中结合PD-1的抗体是替雷利珠单抗，所述替雷利珠单抗以每3周一次约200mg或每六周一次约400mg的剂量、任选地以每4周一次约300mg的剂量施用至所述受试者。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂通过静脉内输注施用。
23.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用化学疗法。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述化学疗法包括抗代谢物、微管抑制剂或它们的组合。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述抗代谢物是吉西他滨和/或所述微管抑制剂是紫杉醇。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述紫杉醇是蛋白质结合的紫杉醇，所述蛋白质结合的紫杉醇优选地是纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇。
27.如权利要求25或权利要求26所述的方法，其中将所述紫杉醇以125mg/m2静脉内施用至所述受试者。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中将所述吉西他滨以1000mg/m2施用至所述受试者。
29.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述方法包括一个或多个周期，每个周期有28天，并且其中在每个周期中，在第1天和第15天将所述抗半乳糖凝集素9抗体施用至所述人受试者并且在第1天、第8天和第15天将所述吉西他滨和紫杉醇施用至所述人受试者。
30.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述人受试者已经历过一种或多种先前抗癌疗法。
31.如权利要求33所述的方法，其中所述一种或多种先前抗癌疗法包括化学疗法、免疫疗法、放射疗法、涉及生物制剂的疗法或它们的组合。
32.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述人受试者经过所述一种或多种先前抗癌疗法已有疾病进展，或者对所述一种或多种先前疗法具有抗性。
33.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述受试者是具有相对于对照值升高的半乳糖凝集素9水平的人患者。
34.如权利要求36所述的方法，其中所述人患者具有相对于所述对照值升高的血清或血浆半乳糖凝集素9水平。
35.如权利要求37所述的方法，其中所述人患者具有表达半乳糖凝集素9的癌细胞和/或免疫细胞。
36.如权利要求38所述的方法，其中所述癌细胞和/或所述免疫细胞在源自所述人患者的肿瘤类器官中。
37.如权利要求1-39中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述人受试者中一种或多种不良作用的发生。
38.如权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种不良作用包括肝损伤、血液毒性、神经毒性、皮肤毒性、胃肠毒性或它们的组合。
39.如权利要求40或权利要求41所述的方法，所述方法还包括当在所述人受试者中观察到不良作用时，减少所述抗半乳糖凝集素9抗体的剂量，任选地减少所述检查点抑制剂的剂量、所述化学疗法的剂量或它们的组合。
40.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中在所述治疗之前、期间和/或之后检查所述人受试者的以下特征中的一项或多项：
(g)来自所述受试者的肿瘤活检样品中的一种或多种肿瘤标志物，任选地其中所述一种或多种肿瘤标志物包括CA15-3、CA-125、CEA、CA19-9、S100、甲胎蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和/或细胞角蛋白片段21(CYFRA-21)；
(h)细胞因子谱，其任选地包括干扰素γ(IFN-γ)、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-1b、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MIP-1a、IL-17a、IL-5和/或TGF-β；和
(i)半乳糖凝集素9水平，任选地是在血液和/或肿瘤组织中的半乳糖凝集素9水平；
(j)PD-L1水平，任选地是在组织中的PD-L1水平；
(k)错配修复状态，任选地是在组织中的错配修复状态，以及
(l)肿瘤突变负荷(TMB)。
41.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述眼部黑素瘤是位于脉络膜、睫状体或虹膜的葡萄膜黑素瘤。
42.一种用于鉴定眼部黑素瘤患者并且任选地治疗所述患者的方法，所述方法包括：
(i)提供疑似患有眼部黑素瘤的受试者的生物样品，
(ii)测量所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平，以及
(iii)基于所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平将所述受试者鉴定为患有所述眼部黑素瘤或有患所述眼部黑素瘤的风险，其中所述受试者的所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于预定参考水平升高表明所述受试者患有所述眼部黑素瘤或有患所述眼部黑素瘤的风险。
43.一种用于确定患有眼部黑素瘤的患者的肿瘤负荷或转移状态并且任选地治疗所述患者的方法，所述方法包括：
(i)提供患有眼部黑素瘤的患者的生物样品，
(ii)测量所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平，以及
(iii)基于所述血液样品中的半乳糖凝集素9水平确定所述患者的肿瘤负荷，其中所述受试者的所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于预定参考水平升高表明所述受试者具有高肿瘤负荷。
44.如权利要求45或权利要求46所述的方法，其中所述方法还包括：进行一种或多种另外的诊断测定以确认所述癌症的发生或所述癌症的肿瘤负荷。
45.一种用于评估受试者的眼部黑素瘤的进展并且任选地治疗所述受试者的方法，所述方法包括：
(v)在第一时间点提供患有眼部黑素瘤的受试者的第一生物样品；
(vi)在第二时间点提供所述受试者的第二生物样品，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后；
(vii)测量所述第一生物样品和所述第二生物样品中的半乳糖凝集素9水平；以及
(viii)基于所述第一生物样品和所述第二生物样品中的Gal-9水平确定所述受试者的眼部黑素瘤的进展，其中所述第二生物样品中的Gal-9水平相对于所述第一生物样品中的Gal-9水平升高表明所述受试者的眼部黑素瘤进展。
46.如权利要求45-48中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述患者进行所述眼部黑素瘤的治疗。
47.如权利要求49所述的方法，其中所述眼部黑素瘤的治疗如权利要求1-44中任一项中所述。
48.一种用于确定患有眼部黑素瘤的受试者对治疗的应答并且任选地修改所述治疗的方法，所述方法包括：
(iv)提供正在接受包括抗癌疗法的治疗的眼部黑素瘤患者的多个生物样品，其中所述多个生物样品至少包括在所述抗癌疗法的第一剂量之前收集的第一生物样品和在所述抗癌疗法的第一剂量之后收集的第二生物样品；
(v)测量所述生物样品中的半乳糖凝集素9水平；以及
(vi)基于所述第一生物样品中的Gal-9水平与所述第二生物样品中的Gal-9水平之间的差异确定所述患者对所述抗癌疗法的应答；其中所述第二生物样品中的Gal-9水平相对于所述第一生物样品降低表明所述受试者对所述抗癌疗法有应答。
49.如权利要求51所述的方法，其中所述方法包括所述抗癌疗法的多次剂量并且所述多个生物样品包括在所述抗癌疗法的第一剂量之前收集的第一生物样品和各自在所述抗癌疗法的一个剂量之后收集的多个第二生物样品，并且其中较晚收集的生物样品中的半乳糖凝集素9水平相对于较早收集的生物样品中的半乳糖凝集素9水平降低表明所述患者对所述治疗有应答。
50.如权利要求51或权利要求52所述的方法，其中所述方法还包括基于在步骤(iii)中确定的所述患者对所述抗癌疗法的应答来修改所述抗癌疗法，其中所述修改选自由以下组成的组：(i)增加或减少所述抗癌疗法的剂量，(ii)终止所述抗癌疗法，(iii)增加或减少所述抗癌疗法的频率，以及(iv)增加或减少所述抗癌疗法的持续时间。
51.如权利要求52或权利要求53所述的方法，其中所述抗癌疗法如权利要求1-44中任一项所述。
52.如权利要求45-54中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液样品，所述血液样品任选地是血清样品或血浆样品。
53.如权利要求45-55中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
54.如权利要求45-56中任一项所述的方法，其中通过免疫测定测量半乳糖凝集素9的水平。
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