TW201532611A - 醫藥組成物用以製備治療癌症藥物之用途 - Google Patents

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Ju-Ming Wang
Yu-Wei Hsiao
Jhih-Ying Chi
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Univ Nat Cheng Kung
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本發明係有關於一種醫藥組成物用以製備治療癌症藥物之用途，醫藥組成物包含一有效劑量之胺基酸序列及一或多種醫藥學上可接受之載劑，胺基酸序列係由SEQ ID NO：1所構成，用以治療或減緩哺乳動物中乳癌或肺癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生。

Description

醫藥組成物用以製備治療癌症藥物之用途
本發明係有關於一種醫藥組成物用以製備治療癌症藥物之用途，尤其係指包含一有效劑量之胺基酸序列SEQ ID NO：1及一或多種醫藥學上可接受之載劑之醫藥組成物，用以治療或減緩哺乳動物中癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生。
按，大部分癌症患者於手術治療後接受化療(chemotherapy)，然而，即使當化療結果被認為是成功的，癌症患者仍具有復發癌症或發展成抗藥性癌症之風險。具復發性癌症之患者，尤其有更高的風險得到具有對抗抗癌藥物藥性的癌症(anticancer drug-resistant cancer)，因為這些抗藥性癌症比原來的腫瘤擴散更快。最近研究指出，腫瘤轉移(metastasis)與化學抗性(chemoresistance)具有其關聯性，但其分子機制大多尚未清楚。各種亞型之基質細胞(stromal cells)係構成腫瘤微環境，其對於腫瘤發展、轉移與化學抗性扮演重要角色；有研究亦指出，腫瘤微環境提供腫瘤一個保護的利基，使腫瘤細胞得以逃脫和抵抗免疫細胞。因此，若能找出宿主和腫瘤之間的關鍵因素，將可提供學者設計更有效的治療方法以改善復發性癌症之擴散及癌症治療的結果。
PTX3係一長的穿透素蛋白(penetraxin)，其詳細作用機制尚待研究。在成骨細胞中，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)可藉由活化蛋白質激酶A(protein kinase A)而增加這種CEBPD轉錄因子(CCAAT/Enhancer binding protein delta，CEBPD)由細胞質移動至核內之現象，以增加類胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor，IGF-1)表現。CEBPD在發炎反應中大量表現，顯示其與其下游之標靶蛋白在發炎反應中扮演重要角色。而在星狀細胞中，CEBPD可活化PTX3蛋白質，進而抑制巨噬細胞對受損細胞之巨噬作用，此現象與阿茲海默症發生相關。故發明人先前文獻將PTX3相關調控機制與CEBPD之角色相連結(Sci Signal.2013 Jul 16；6(284)：ra59)，以研究PTX3於鼻咽癌之關聯性；根據研究顯示，PTX3蛋白具有促進鼻咽癌細胞移動與血管新生之能力以及抑制巨噬作用之能力，並且建立一個適合腫瘤生長的環境，而原核細胞的PTX3重組蛋白則具有抑制上述之促癌現象。因此，發明人認為PTX3有潛力當作抑制腫瘤的標靶基因；針對此一新穎發現並考量使用之方便性，意欲進一步發展一胺基酸序列以用於治療或減緩其他癌症如乳癌、肺癌之腫瘤生長及轉移。
現今本發明人發現一種包含一有效劑量之SEQ ID NO：1胺基酸序列，可藉由抑制PTX3對癌細胞生長、轉移與侵犯之促進以及血管新生之促進，用以治療或減緩哺乳動物之乳癌及肺癌。
為了達到上述實施目的，本發明一種醫藥組成物用以製備治療癌症藥物之用途，醫藥組成物包含一有效劑量之胺基酸序列及一或多種醫藥學上可接受之載劑，胺基酸序列係由SEQ ID NO：1所構成，用以治療或 減緩哺乳動物(可例如一人類病患)中癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生。
本發明亦揭示一種抑制PTX3治療乳癌或肺癌之胺基酸序列，其胺基酸序列係由SEQ ID NO：1所構成，用以治療或減緩哺乳動物中癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生。
本發明亦揭示一種抗體用以製備治療癌症藥物之用途，其係以一有效劑量之抗體投藥，以治療或減緩哺乳動物中癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生，其中，抗體係辨識一由SEQ ID NO：1所構成之胺基酸序列。
於本發明之一實施例中，癌症可例如為乳癌或肺癌，胺基酸序列係以一周三次投藥，其有效劑量可例如介於7.5~9mg/kg，用以治療或減緩哺乳動物中PTX3對癌細胞生長、轉移與侵犯之促進以及血管新生之促進。
於本發明之一實施例中，醫藥組成物係以口服、注射、塗抹或貼片其中一方式投予至人類病患體內。
於本發明之一實施例中，載劑可包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料其中之一或兩者以上之混合。
藉此，含有SEQ ID NO：1之胺基酸序列或一可辨識SEQ ID NO：1之抗體，可藉由抑制PTX3對癌細胞生長、轉移與侵犯之促進以及血管新生之促進，以作為治療哺乳動物乳癌及肺癌之用途。
第一圖-A：原核生物來源pPTX3可抑制euPTX3所造成乳癌細胞(mMB231)之移動及侵犯。
第一圖-B：原核生物來源pPTX3可抑制euPTX3所造成抗藥性乳癌細胞(mMB231R)之移動及侵犯。
第一圖-C：重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制euPTX3所造成乳癌細胞之移動及侵犯。
第一圖-D：重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制euPTX3所造成抗藥性乳癌細胞之移動及侵犯。
第二圖-A：由coomassie blue染色顯示本發明之重組蛋白具有高純度。
第二圖-B：由anti-His tag方法證實本發明之重組蛋白具有高純度。
第三圖-A：euPTX3及pPTX3對於血管新生之影響。
第三圖-B：pPTX3可抑制euPTX3所造成之血管新生情形。
第四圖-A：euPTX3及pPTX3重組蛋白對於血管新生之影響。
第四圖-B：重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制euPTX3所造成之血管新生情形。
第五圖：不同巨噬細胞於抗藥性乳癌細胞CDDP處理之腫瘤體積變化，PTX3缺失之巨噬細胞(shP-M2M Φ)組別可有效抑制腫瘤體積增加。
第六圖-A：不同巨噬細胞於抗藥性乳癌細胞CDDP處理之 IVIS腫瘤影像示意圖。
第六圖-B：PTX3缺失之巨噬細胞(shP-M2M Φ)組別可有效抑制腫瘤重量增加。
第六圖-C：PTX3缺失之巨噬細胞(shP-M2M Φ)組別可有效抑制癌細胞轉移。
第七圖：pPTX3重組蛋白於小鼠乳癌細胞(4T1R)CDDP處理之腫瘤體積變化，重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制腫瘤體積增加情形。
第八圖-A：不同pPTX3重組蛋白於小鼠乳癌細胞CDDP處理之IVIS腫瘤影像示意圖。
第八圖-B：重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制腫瘤重量增加。
第八圖-C：重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制癌細胞轉移。
第九圖-A：重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制bFGF促進之血管新生情形。
第九圖-B：重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制VEGF促進之血管新生情形。
第十圖-A：原核生物來源pPTX3可抑制euPTX3所造成肺癌細胞(A549)之移動。
第十圖-B：原核生物來源pPTX3可抑制euPTX3所造成肺癌細胞之侵犯。
第十圖-C：重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制euPTX3所造成肺癌細胞之移動。
第十圖-D：重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C可顯著地抑制euPTX3所造成肺癌細胞之侵犯。
第十一圖-A：PTX3抗體可抑制euPTX3所造成乳癌細胞(MDA-MB231)之移動。
第十一圖-B：PTX3抗體可抑制euPTX3所造成乳癌細胞之侵犯。
第十一圖-C：PTX3抗體可抑制euPTX3所造成抗藥性乳癌細胞(MDA-MB231R)之移動。
第十一圖-D：PTX3抗體可抑制euPTX3所造成抗藥性乳癌細胞之侵犯。
第十二圖：PTX3抗體可專一性辨識重組蛋白pPTX3/FL和pPTX3/C。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明一種醫藥組成物用以製備治療癌症藥物之用途，醫藥組成物包含一有效劑量之胺基酸序列及一或多種醫藥學上可接受之載劑，胺基酸序列係由SEQ ID NO：1所構成，用以治療或減緩哺乳動物(最佳係為一人類病患)中PTX3對癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生之促進；其中癌 症最佳係為乳癌或肺癌，有效劑量最佳係介於7.5~9mg/kg之醫藥組成物係以口服、注射、塗抹或貼片其中一方式，以一周三次投予至人類病患體內。再者，載劑可例如為包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料其中之一或兩者以上之混合。
本發明一種抗體用以製備治療癌症藥物之用途，其係以一有效劑量之抗體投藥，以治療或減緩哺乳動物中癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生，其中，抗體係辨識一由SEQ ID NO：1所構成之胺基酸序列，最佳係用以治療或減緩一人類病患中PTX3對乳癌或肺癌細胞生長、轉移與侵犯之促進以及血管新生之促進。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
實施例一：PTX3對乳癌細胞移動與侵犯能力之影響分析
〈細胞移動能力分析〉
將3×104細胞數之人類乳癌細胞株(MDA-MB231或mMB231)或抗藥性乳癌細胞株cisplatin(CDDP)-resistant MDA-MB231(MDA-MB231R或mMB231R)接種於博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下層之間以聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將euPTX3(純化自小鼠骨髓瘤細胞，購自R&D system Inc.)或pPTX3(由大腸桿菌純化之重組蛋白質，購自Abcam)與不含血清之細胞培養基一起加入下 層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(購自Invitrogen)染色加以偵測之。細胞移動之能力(Migrated cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件至少重複三次。
〈細胞侵犯能力分析〉
將3×104細胞數之乳癌細胞株MDA-MB231或抗藥性乳癌細胞株MDA-MB231R接種於博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下層之間以基底膜基質塗覆之聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(matrigel(購自BD Bioscience)-coated polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將euPTX3或pPTX3與不含血清之細胞培養基一起加入下層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色加以偵測之。細胞侵犯之能力(invasive cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件至少重複三次。
結果如第一圖-A及第一圖-B所示，隨哺乳類動物來源之euPTX3濃度增加(1.25~2.5μg/ml)造成乳癌細胞株mMB231及抗藥性乳癌細胞株mMB231R之移動能力(migrated cell number)及侵犯能力(invasive cell number)上升，而隨原核生物(大腸桿菌)來源pPTX3濃度增加(7.5~9μg/ml)，可抑制euPTX3所造成之乳癌細胞(mMB231)及抗藥性乳癌細胞(mMB231R)之移動及侵犯。此結果顯示，原核生物來源pPTX3可抑制哺乳類動物來源之euPTX3所引起之乳癌細胞移動及侵犯。
進一步地，本發明人為了鑑定pPTX3具有抑制乳癌細胞移動及侵犯能力之功能性區域為何，利用各種pPTX3重組蛋白進行細胞移動能力及侵犯能力分析；其中，pPTX3重組蛋白係包括：全長pPTX3重組蛋白(pPTX3/FL，胺基酸序列18-381(如SEQ ID NO：2)，濃度225nM，係由實驗室製備)、N端pPTX3重組蛋白(pPTX3/N，胺基酸序列19-182(如SEQ ID NO：3)，係由實驗室製備)或C端pPTX3重組蛋白(pPTX3/C，胺基酸序列180-381(如SEQ ID NO：1)，係由實驗室製備)。
〈細胞移動能力分析〉
將3×104細胞數之乳癌細胞株mMB231或抗藥性乳癌細胞株mMB231R接種於博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下層之間以基底膜基質塗覆之聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(matrigel(購自BD Bioscience)-coated polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將全長pPTX3重組蛋白(pPTX3/FL)、N端pPTX3重組蛋白(pPTX3/N)或C端pPTX3重組蛋白(pPTX3/C)與不含血清之細胞培養基一起加入下層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色加以偵測之。細胞侵犯之能力(invasive cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件至少重複三次。
〈細胞侵犯能力分析〉
將3×104細胞數之乳癌細胞株mMB231或抗藥性乳癌細胞株mMB231R接種於博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下層之間 以基底膜基質塗覆之聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(matrigel(購自BD Bioscience)-coated polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將euPTX3與各種pPTX3重組蛋白：全長pPTX3重組蛋白(pPTX3/FL)、N端pPTX3重組蛋白(pPTX3/N)或C端pPTX3重組蛋白(pPTX3/C)與不含血清之細胞培養基一起加入下層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色加以偵測之。細胞侵犯之能力(invasive cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件至少重複三次。
結果如第一圖-C及第一圖-D所示，euPTX會造成乳癌細胞(mMB231)及抗藥性乳癌細胞(mMB231R)之移動能力(migrated cell number)及侵犯能力(invasive cell number)上升，pPTX3/FL和pPTX3/C而非pPTX3/N可顯著地抑制euPTX3所造成之乳癌細胞(mMB231)及抗藥性乳癌細胞(mMB231R)之移動及侵犯。此結果顯示，pPTX3具有抑制乳癌細胞移動及侵犯能力之功能性區域為C端pPTX3區域，其胺基酸序列為180-381(如SEQ ID NO：1)。
此外，本發明亦藉由coomassie blue(第二圖-A)染色以及anti-His tag(第二圖-B)方法證實本發明之重組蛋白係具有高純度。
實施例二：PTX3對乳癌細胞血管新生能力之影響分析
2×104細胞數之人類臍静脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)生長於預先塗覆基底膜基質之細胞培養盤皿(pre-coated matrigel plate)中，使用之培養基為含有不同含量euPTX3(1.25或2.5μg/ml)及pPTX3(7.5或9μg/ml)之不含血清之ECM細胞培養基(購自 ScienCell)。培養12小時後，以4%的多聚甲醛固定實驗用的細胞以進行血管生成形態(tube-formation morphology)之觀察。利用計算整個視野下內皮細胞網絡分岔之間交叉的數量(numbers of intersection nodes)以量化血管狀的結構形成之程度。每一項實驗條件至少重複三次。
結果如第三圖-A及第三圖-B所示，euPTX3濃度增加(1.25~2.5μg/ml)會造成細胞血管新生能力上升，而隨著pPTX3濃度增加(7.5~9μg/ml)，可抑制euPTX3所造成血管新生之促進。此結果顯示，原核生物來源pPTX3可抑制哺乳類動物來源之euPTX3所引起之乳癌細胞移動及侵犯。
再者，將2×104細胞數之人類臍静脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)生長於預先塗覆基底膜基質之細胞培養盤皿(pre-coated matrigel plate)中，使用之培養基為含有euPTX3(2.5μg/ml)與各種pPTX3重組蛋白：全長pPTX3重組蛋白(pPTX3/FL)、N端pPTX3重組蛋白(pPTX3/N)或C端pPTX3重組蛋白(pPTX3/C)之不含血清之ECM細胞培養基(購自ScienCell)。培養12小時後，以4%的多聚甲醛固定實驗用的細胞以進行血管生成形態(tube-formation morphology)之觀察。利用計算整個視野下內皮細胞網絡分岔之間交叉的數量(numbers of intersection nodes)以量化血管狀的結構形成之程度。每一項實驗條件至少重複三次。
結果如第四圖-A及第四圖-B所示，euPTX3會造成細胞血管新生能力上升，pPTX3/FL和pPTX3/C而非pPTX3/N可顯著地抑制euPTX3所造成血管新生之促進。此結果顯示，pPTX3具有抑制細胞血管新生能力之功能性區域為C端pPTX3區域(序列如SEQ ID NO：1)。
實施例三：PTX3對腫瘤生長和轉移之影響分析
由於經12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA，購自Sigma)活化處理之人類單核球細胞(THP-1 cells)具有腫瘤相關巨噬細胞之特徵，為了製作M2-like THP-1巨噬細胞，先將人類單核球細胞(THP-1 cells)以320nM之PMA處理6小時，再將人類單核球細胞以PMA外加20ng/ml IL-4(PeproTech)及20ng/ml IL-13(PeproTech)處理18小時，已得到M2-like THP-1巨噬細胞(shC-M2M Φ)或PTX3-losing M2-like THP-1巨噬細胞(shP-M2M Φ)進行以下實驗。
〈異種移植(Xenograft)動物實驗〉
六周周齡之雌性NOD-SCID小鼠係購自國立成功大學動物中心(NCKU Laboratory Animal Center)。在mCherry螢光標的之抗藥性乳癌細胞株(mCherry fluorescent CDDP-resistant MDA-MB-231 cells，mMB231R)異種移植實驗中，係將1×106之mMB231R細胞與5×105 M2-like THP-1巨噬細胞(M2-like THP-1 macrophage，shC-M2M Φ)或PTX3缺失M2-like THP-1巨噬細胞(PTX3-losing M2-like THP-1 macrophage，shP-M2M Φ)皮下接種至NOD-SCID小鼠的背部後側；2周之後，將M2-like THP-1巨噬細胞(shC)以及PTX3-losing M2-like THP-1巨噬細胞(shP)共分成四組，各組分別為有(+)或無(-)每周注射3次1.5mg/kg之CDDP(溶於1%(w/v)DMSO)。動物接種乳癌細胞5周之後犧牲，取得動物之脾臟(spleen)、腎臟(kidneys)、肺臟(lung)及肝臟(liver)，測量腫瘤重量(tumor weight)並利用IVIS光譜成像系統(IVIS Spectrum Imaging System 200，Caliper)確定癌細胞之轉移活性(metastatic activity)(如第六圖-A)以測量肺組織轉移瘤塊之數目(number of metastatic nodules per lung)。腫瘤大小係藉由外部測徑器量測並利用下述標準公式計算腫瘤體積(tumor volume，v)：v=(w x l 2)x 0.52，其中，w為腫瘤寬度，l為腫瘤長度。每一項實驗條件至少重複三次。
請參閱第五圖，具有抗藥性之乳癌細胞株(mMB231R+shC-M2M Φ組)經由CDDP處理之後(mMB231R+shC-M2M Φ+CDDP組)，會促進腫瘤體積(tumor volume)增加；相較於mMB231R+shP-M2M Φ組別之腫瘤體積，mMB231R+shC-M2M Φ組別之腫瘤生長較快；再者，CDDP處理之後，mMB231R+shC-M2M Φ+CDDP組別之腫瘤體積較mMB231R+shP-M2M Φ+CDDP大且發展速度較快，由此可知，PTX-3會促進CDDP引起抗藥性乳癌細胞株(mMB231R)的腫瘤增生情形。
請參閱第六圖-B，接種抗藥性乳癌細胞(mMB231R)與shC-M2M Φ之組別在CDDP處理後腫瘤重量(tumor weight)明顯增加，但接種抗藥性乳癌細胞與shP-M2M Φ之組別可抑制此癌細胞轉移現象。再者，如第六圖-C所示，接種抗藥性乳癌細胞與shC-M2M Φ之組別在CDDP處理後增強乳癌細胞轉移活性，而接種抗藥性乳癌細胞與shP-M2M Φ之組別可抑制此現象。由此可知，PTX3缺失可削弱腫瘤生長和轉移情形。
〈同種移植(Allograft)動物實驗〉
本實驗係利用六周周齡之BALB/c小鼠進行研究。在mCherry螢光標的之小鼠抗CDDP藥性乳癌細胞株(mCherry fluorescent CDDP-resistant m4T1 cells，4T1R)同種移植實驗中，係將1×106之小鼠抗藥性乳癌細胞株(4T1R)皮下接種至BALB/c小鼠的背部後側；2周之後，將小鼠分成2大組，分別每周注射3次1.5mg/kg之CDDP(溶於1%(w/v)DMSO)或注射DMSO。接著，再將重組蛋白pPTX3/FL(9mg/kg)或pPTX3/C(9mg/kg)以每週三次皮下 注射至小鼠腫瘤。動物接種乳癌細胞6周之後犧牲，取得動物之脾臟(spleen)、腎臟(kidneys)、肺臟(lung)及肝臟(liver)，測量腫瘤重量(tumor weight)並利用IVIS光譜成像系統(IVIS Spectrum Imaging System 200，Caliper)確定癌細胞之轉移活性(metastatic activity)(如第八圖-A)以測量肺組織轉移瘤塊之數目(number of metastatic nodules per lung)。腫瘤大小係藉由外部測徑器量測並利用下述標準公式計算腫瘤體積(tumor volume，v)：v=(w x l 2)x 0.52，其中，w為腫瘤寬度，l為腫瘤長度。每一項實驗條件至少重複三次。
請參閱第七圖，具有抗藥性小鼠乳癌細胞株(4T1R)經由CDDP處理(4T1R+CDDP組)會促進腫瘤體積(tumor volume)增加及發展速度，而4T1R經由CDDP以及重組蛋白pPTX3/FL(4T1R+CDDP+FL組)或pPTX3/C處理之組別(4T1R+CDDP+C組)，可顯著地抑制小鼠腫瘤生長。由此可知，利用重組蛋白pPTX3/FL或pPTX3/C可抑制PTX3對於抗藥性乳癌細胞(4T1R)腫瘤生成之促進。
請參閱第八圖-B，接種抗藥性小鼠乳癌細胞株(4T1R)組別在CDDP處理(黑色柱狀圖)後腫瘤重量(tumor weight)明顯增加，但接種4T1R細胞與重組蛋白pPTX3/FL(FL)或pPTX3/C(C)處理之組別可顯著地抑制此現象。再者，如第八圖-C所示，接種4T1R細胞在CDDP處理後會增強乳癌細胞轉移活性，而接種4T1R細胞與重組蛋白pPTX3/FL(FL)或pPTX3/C(C)處理之組別可抑制此癌細胞轉移現象。由此可知，利用重組蛋白pPTX3/FL或pPTX3/C可抑制PTX3對於抗藥性乳癌細胞(4T1R)腫瘤轉移之促進。
〈Matrigel plug assay〉
本實驗係藉由將含有促進血管新生物質的基質膠(matrigel) 注入小鼠體內後結塊，觀察其血管長入基質膠的情形，以判定血管新生的效果。首先，皮下接種含有重組蛋白pPTX3/FL或pPTX3/C之450μl基質膠(BD Biosciences)至Cebpd+/+(wild-type)小鼠，基質膠亦含有800ng/ml bFGF(Peprotech)(如第九圖-A所示)或150ng/ml VEGF-165(GFH44；Cell guidance systems)(如第九圖-B所示)以及100μg/ml硫酸肝素(heparin sulfate)；五天後，將動物犧牲並取出基質膠栓(matrigel plugs)。利用套組(Drakin's reagent kit；D5941；Sigma)與分光光度計測量血紅素含量(hemoglobin content)以定量功能性血管之生成。
結果請參閱第九圖-A及第九圖-B，僅含有bFGF或VEGF(不含pPTX3)之組別血管生成較多，而在加入pPTX3/FL(FL)或pPTX3/C(C)之組別血管生成情形明顯地降低。由此可知，利用重組蛋白pPTX3/FL或pPTX3/C可有效抑制血管新生作用。
實施例四：PTX3對肺癌細胞移動與侵犯能力之影響分析
〈細胞移動能力分析〉
將3×104細胞數之人類肺癌細胞株(A549 cells)接種於博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下層之間以聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將euPTX3(純化自小鼠骨髓瘤細胞，購自R&D system Inc.)或pPTX3(由大腸桿菌純化之重組蛋白質，購自Abcam)與不含血清之細胞培養基一起加入下層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(購自Invitrogen)染色加以偵測之。細胞移動 之能力(Migrated cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件至少重複三次。
〈細胞侵犯能力分析〉
將3×104細胞數之人類肺癌細胞株(A549 cells)接種於博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下層之間以基底膜基質塗覆之聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(matrigel(購自BD Bioscience)-coated polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將euPTX3或pPTX3與不含血清之細胞培養基一起加入下層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色加以偵測之。細胞侵犯之能力(invasive cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件至少重複三次。
結果如第十圖-A及第十圖-B所示，隨哺乳類動物來源之euPTX3濃度增加(1.25~2.5μg/ml)造成人類肺癌細胞株(A549)之移動能力(migrated cell number)及侵犯能力(invasive cell number)上升，而隨原核生物(大腸桿菌)來源pPTX3濃度增加(7.5~9μg/ml)，可抑制肺癌細胞之移動及侵犯。此結果顯示，原核生物來源pPTX3可抑制哺乳類動物來源之euPTX3所引起之肺癌細胞移動及侵犯。
進一步地，本發明人亦利用各種pPTX3重組蛋白進行以下細胞移動能力及侵犯能力分析。
〈細胞移動能力分析〉
將3×104細胞數之人類肺癌細胞株(A549 cells)接種於博登細 胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下層之間以聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將全長pPTX3重組蛋白(pPTX3/FL，胺基酸序列18-381(如SEQ ID NO：2)，濃度225nM，係由實驗室製備)、N端pPTX3重組蛋白(pPTX3/N，胺基酸序列19-182(如SEQ ID NO：3)，係由實驗室製備)或C端pPTX3重組蛋白(pPTX3/C，胺基酸序列180-381(如SEQ ID NO：1)，係由實驗室製備)與不含血清之細胞培養基一起加入下層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(購自Invitrogen)染色加以偵測之。細胞移動之能力(Migrated cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件至少重複三次。
〈細胞侵犯能力分析〉
將3×104細胞數之人類肺癌細胞株(A549 cells)接種於博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下層之間以基底膜基質塗覆之聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(matrigel(購自BD Bioscience)-coated polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將euPTX3與各種pPTX3重組蛋白：全長pPTX3重組蛋白(pPTX3/FL)、N端pPTX3重組蛋白(pPTX3/N)或C端pPTX3重組蛋白(pPTX3/C)與不含血清之細胞培養基一起加入下層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色加以偵測之。細胞侵犯之能力(invasive cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件 至少重複三次。
結果如第十圖-C及第十圖-D所示，euPTX會造成人類肺癌細胞株(A549)之移動能力(migrated cell number)及侵犯能力(invasive cell number)上升，pPTX3/FL和pPTX3/C而非pPTX3/N可顯著地抑制euPTX3所造成人類肺癌細胞之移動及侵犯。此結果顯示，pPTX3具有抑制肺癌細胞移動及侵犯能力之功能性區域為C端pPTX3區域(SEQ ID NO：1)。
實施例五：PTX3抗體對乳癌細胞移動與侵犯能力之影響分析
〈細胞移動能力分析〉
將3×104細胞數之人類乳癌細胞株MDA-MB231或抗藥性乳癌細胞株cisplatin(CDDP)-resistant MDA-MB231(MDA-MB231R)接種於博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下層之間以聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將euPTX3(純化自小鼠骨髓瘤細胞，購自R&D system Inc.)或PTX3抗體(例如ab90807，購自Abcam)與不含血清之細胞培養基一起加入下層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(購自Invitrogen)染色加以偵測之。細胞移動之能力(Migrated cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件至少重複三次。
〈細胞侵犯能力分析〉
將3×104細胞數之乳癌細胞株MDA-MB231或抗藥性乳癌細胞株MDA-MB231R接種於博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層，而上和下 層之間以基底膜基質塗覆之聚對苯二甲酸乙二酯薄膜(matrigel-coated polyethelene terephthalate membrane)分隔，細胞培養三小時。將上層使用之細胞培養基替換成不含血清之細胞培養基，並且將euPTX3或PTX3抗體(例如ab90807，購自Abcam)與不含血清之細胞培養基一起加入下層。在培養24小時後，位於下層之移動的細胞可藉由4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色加以偵測之。細胞侵犯之能力(invasive cell number)利用相對於控制組之螢光數值百分比加以計算，每一項實驗條件至少重複三次。
結果如第十一圖-A~第十一圖-D所示，隨哺乳類動物來源之euPTX3濃度增加(1.25~2.5μg/ml)造成乳癌細胞株MDA-MB231及抗藥性乳癌細胞株MDA-MB231R之移動能力(migrated cell number)及侵犯能力(invasive cell number)上升，而隨PTX3抗體(α PTX3 Ab)濃度增加(1~2μg/ml)，可抑制euPTX3所造成之乳癌細胞(MDA-MB231)及抗藥性乳癌細胞(MDA-MB231R)之移動及侵犯。此結果顯示，PTX3抗體可抑制哺乳類動物來源之euPTX3所引起之乳癌細胞移動及侵犯。
再者，如第十二圖所示，本實驗具有抑制乳癌細胞移動及侵犯之PTX3抗體(α PTX3 Ab)係可專一性辨識C端pPTX3區域(pPTX3/C，由胺基酸序列SEQ ID NO：1構成)。
綜上所述，PTX3有助於乳癌或肺癌細胞的生長、移動、侵犯，以及血管新生等作用，因此本發明人建立針對PTX3為主的治療技術，其中主要係產生可抑制PTX3功能的合成胜肽鏈或小分子藥物，例如本發明以一有效劑量之SEQ ID NO：1胺基酸序列可有效抑制PTX3對於腫瘤發展之 促進；故上述胺基酸序列(SEQ ID NO：1)輔以一或多種醫藥學上可接受之載劑，將可應用於作為治療乳癌、抗CDDP藥性乳癌、及肺癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生之醫藥組成物，進而達到抗腫瘤生長及抑制轉移之目的。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明可藉由抑制PTX3(euPTX3)對乳癌或肺癌細胞移動與侵犯之促進、以及血管新生之促進，進而治療乳癌或肺癌；再者，本發明之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)亦可有效抑制PTX3對抗藥性乳癌細胞移動與侵犯之促進、以及血管新生之促進，故亦可用以治療抗藥性乳癌。
2.本發明可藉由製備重組蛋白之方式大量表現與純化之，以利於產業之應用。
綜上所述，本發明之醫藥組成物用以製備治療癌症藥物之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
<110> 國立成功大學
<120> 醫藥組成物用以製備治療癌症藥物之用途
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> pPTX3/C重組蛋白
<400> 1
<210> 2
<211> 364
<212> PRT
<213> Artifiacl sequence
<223> pPTX3/FL重組蛋白
<400> 2
<210> 3
<211> 164
<212> PRT
<213> Artifiacl sequence
<223> pPTX3/N重組蛋白
<400> 3

Claims (14)

  1. 一種醫藥組成物用以製備治療癌症藥物之用途，該醫藥組成物包含一有效劑量之胺基酸序列及一或多種醫藥學上可接受之載劑，該胺基酸序列係由SEQ ID NO：1所構成，用以治療或減緩哺乳動物中癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該癌症係乳癌或肺癌。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該胺基酸序列係用以治療或減緩哺乳動物中PTX3對癌細胞生長、轉移與侵犯之促進以及血管新生之促進。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物係以一周三次投藥，其有效劑量係介於7.5~9mg/kg。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該哺乳動物係一人類病患。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該醫藥組成物係以口服、注射、塗抹或貼片其中一方式投予至該人類病患體內。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該載劑包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料其中之一或兩者以上之混合。
  8. 一種抑制PTX3治療乳癌或肺癌之胺基酸序列，其胺基酸序列係由SEQ ID NO：1所構成，用以治療或減緩哺乳動物中癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之胺基酸序列，其中該胺基酸序列係用以治療或減緩哺乳動物中PTX3對癌細胞生長、轉移與侵犯之促進以及血管新生之促進。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之胺基酸序列，其中該哺乳動物係一人類病患。
  11. 一種抗體用以製備治療癌症藥物之用途，其係以一有效劑量之該抗體投藥，以治療或減緩哺乳動物中癌細胞生長、轉移與侵犯以及血管新生，其中，該抗體係辨識一由SEQ ID NO：1所構成之胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該癌症係乳癌或肺癌。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該抗體係用以治療或減緩哺乳動物中PTX3對癌細胞生長、轉移與侵犯之促進以及血管新生之促進。
  14. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該哺乳動物係一人類。
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