CN107118271A - 可用于富集人l1cam蛋白的抗原多肽和单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可用于富集人L1CAM蛋白的抗原多肽和单克隆抗体。本发明采用设计多肽抗原免疫，巧妙的抗体筛选设计，以一种非常简单的方式就获得具有与16周左右的人胎脑悬浮液免疫原获得的具有富集人L1CAM蛋白相同功能活性的抗体，而且有些抗体还可以用于WB方式识别人L1CAM的各种形式蛋白的生物学功能。

Description

可用于富集人L1CAM蛋白的抗原多肽和单克隆抗体

技术领域

本发明涉及一种可用于富集人L1CAM蛋白的抗原多肽和单克隆抗体。

背景技术

现有的能够富集人L1CAM(神经细胞黏附分子L1)蛋白的抗体，抗原是来源于16周人胎脑悬浮液，对于一般的抗体生产和研发公司来说，要想得到同样来源的抗原是很难的，而且用16周左右的人胎脑悬浮液免疫后，后期的单抗的筛选方法比较复杂，而且筛选难度很大，成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于富集人L1CAM蛋白的抗原多肽和单克隆抗体。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种可用于富集人L1CAM蛋白的抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种可用于富集人L1CAM蛋白的抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种可用于富集人L1CAM蛋白的单克隆抗体，包括以下步骤的方法制备：

A、将抗原多肽偶联到KLH蛋白上；

B、将偶联好的多肽-KHL偶联物通过sepdexG250进行纯化；

C、纯化后免疫小鼠，之后进行细胞融合；

D、对融合后的细胞进行筛选；

E、将筛选的细胞株进行亚克隆，挑选单克隆细胞，并对表达的抗体进行生物学活性验证；

F、对生物活性验证过的细胞株进行抗体制备。

作为优选方式，所述步骤C中，免疫小鼠，按照80ug/只/次的剂量进行皮下注射免疫，共免疫四次，每次免疫的时间间隔为2周，初次免疫用完全佐剂，随后的3次免疫用不完全佐剂，免疫结束后，采集免疫小鼠血清进行抗体的免疫效价以及生物学功能监测，选择最合适的小鼠进行最终的加强免疫，加强免疫为不用任何佐剂，直接按照50ug剂量进行小鼠腹腔免疫。

本发明涉及两条多肽，CD-17(CREGSQRKHSKRHIHKD)和CY-17(CNQSSYTQWDLQPDTDY)。我们对L1CAM进行蛋白结构进行分析，利用相关抗原设计软件对L1CAM蛋白进行抗原表位设计，最终从L1CAM截取了REGSQRKHSKRHIHKD和NQSSYTQWDLQPDTDY肽段，为了便于偶联载体蛋白，在肽段的前面加上半胱氨酸(C).

其中CD-17是人鼠同源的序列，可以用鼠标本代替人标本来检测抗体的活性，本实验中用鼠的脑组织裂解液来验证了CD-17的几个抗体对人L1CAM蛋白WB检测阳性的可能性，确定了我们筛选的CD-17抗原产生的单克隆抗体具有良好的WB检测功能.我们通过两个多肽的免疫，获得最终分别获得了针对CD-17和CY-17的单克隆抗体，其中针对CD-17多肽的单克隆抗体不但可以用来富集L1CAM蛋白，还可以用于L1CAM蛋白的WB检测。针对CY-17多肽的单克隆抗体仅仅可以用来富集L1CAM蛋白。

抗体筛选方法以及活性验证的设计：在筛选方法中，我们巧妙的实验设计节省了筛选成本，绕过了筛选过程的最大障碍。

常规富集痕量蛋白的方法是，用蛋白对应的具有IP生物活性的抗体偶联在磁珠上，然后用这个磁珠分散在样品血浆或者裂解液中，通过抗原抗体的相互作用，形成磁珠-抗体-抗原复合物，然后在一定磁场的作用下，磁珠-抗体-抗原复合物被收集起来，然后洗脱下抗原，就完成了抗原富集。

我们小鼠免疫后，要确定那只小鼠产生的抗体具有类似的IP生物活性功能，不可能将小鼠的血浆抗体偶联到磁珠上，一方面是小鼠血浆中，除了很少量的我们抗原刺激产生的目标抗体外，还有小鼠本身的IgG以及其他复杂的蛋白成分，这么多无效的成分偶连的磁珠，是不能实现富集抗原的目的。如果我们先把小鼠血清中的有效目的抗体纯化出来再偶联，也不现实，因为一般从小鼠采集的小鼠血样有20ul血清，纯化出的目的抗体量也不能用来偶联磁珠来富集抗原，而且购买磁珠自己偶联成本太高，我们要监测的样本量也相对比较大(4个项目，20只小鼠)。

我们的巧妙设计的能帮助我们在细胞融合前，就能得知那些小鼠产生的多抗抗体可以直接能富集人的L1CAM蛋白，准确的选定待融合阳性实验小鼠，在后续单克隆抗体的筛选过程中，也能在早期确定哪些些单克隆抗体具备我们想要的生物学功能的，从而有目的的选择一些有价值的细胞进行亚克隆，提高工作效率，降低成本。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明所采用的多肽抗原，合成简单，成本较低，很容易获得，本发明所涉及的抗体筛选方法，设计巧妙，避免了人血浆中的IgG对筛选的影响。

本发明采用设计多肽抗原免疫，巧妙的抗体筛选设计，以一种非常简单的方式就获得具有与16周左右的人胎脑悬浮液免疫原获得的具有富集人L1CAM蛋白相同功能活性的抗体，而且有些抗体还可以用于WB方式识别人L1CAM的各种形式蛋白的生物学功能。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1是本发明实施例2 DNAStar软件分析结果图；

图2是本发明实施例2检测一结果图；

图3是本发明实施例2检测二结果图；

图4是本发明实施例2检测三结果图；

图5是本发明实施例2检测四结果图。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1：

L1CAM蛋白的抗原表位分析：利用DNAStar软件，通过分析蛋白各区段的抗原性、表面暴露性、亲水性、以及柔性，确定L1CAM的1071-1086位氨基酸REGSQRKHSKRHIHKD和第854-869位氨基酸REGSQRKHSKRHIHKD两段各16个氨基酸作为合成的氨基酸序列，为方便偶联到载体上，在两段多肽的N端各加上半胱氨酸(Cys)得到(C)NQSSYTQWDLQPDTDY，(C)REGSQRKHSKRHIHKD根据多肽首尾字母以及多肽数目分别命名为CY-17和CD-17。

多肽的合成，自动合成仪合成并纯化；将两段合成的多肽采用EDC偶联方法与载体蛋白KLH偶联，形成CY-17-KLH和CD-17-KLH偶联物，然后在PH7.4的PBS里透析换液。

抗体制备方法以及流程：

1、纯后将与佐剂乳化好的CD-17-KLH和CY-17-KLH按照80ug/只/次的剂量进行皮下注射免疫，共免疫四次，每次免疫的时间间隔为2周，初次免疫用完全佐剂，随后的3次免疫用不完全佐剂，免疫结束后，采集免疫小鼠血清进行抗体的免疫效价以及生物学功能检测。选择血清效价高又满足生物学活性要求的小鼠进行最终的加强免疫，加强免疫为不用任何佐剂，直接按照50ug剂量进行小鼠腹腔免疫。三天后进行细胞融合。

2、对融合后的细胞进行筛选，并对筛选到的阳性克隆进行生物活性检测，看能否很好的与人新鲜血浆中的L1CAM进行很好的结合。

3、将具有良好生物学功能的细胞株进行亚克隆，多次亚克隆后，挑选单克隆细胞，并对表达的抗体进行生物学活性验证。

4、对生物活性验证过的细胞株进行抗体制备，并再次进行活性验证，以确保所生产抗体的质量。

实施例2：

利用DNAStar软件分析L1CAM胞外区蛋白序列的相关区域的抗原性、表面暴露性、亲水性、以及柔性，确定L1CAM的1071-1086位氨基酸REGSQRKHSKRHIHKD和第854-869位氨基酸REGSQRKHSKRHIHKD两段各16个氨基酸作为合成的氨基酸序列，附图1所示。

免疫后采集小鼠血清，进行效价检测，结果如下:

具有生物活性的单抗细胞株筛选，用细胞培养上清进行生物活性检测：

检测一，WB，上样样品：鼠脑组织列解液，一抗为细胞培养上清，二抗：羊抗鼠-HRP 1：5000，箭头位置表示目的条带位置，。

检测二，IP-WB，上样样品：细胞培养上清富集的人血清的L1CAM，一抗为抗人L1CAM抗体1:2000，二抗：羊抗鼠-HRP 1：5000，其中阳性对照为5ug可以富集人血清的L1CAM的商业化抗体体富集的人血清的L1CAM，商业化抗体来自abcam，([UJ127](ab3200))。

检测三，IP-WB，上样样品：细胞培养上清富集的人血清的L1CAM，一抗为抗人L1CAM抗体1:2000，二抗：羊抗鼠-HRP 1：5000。

CY-17和CD-17阳性克隆所生产抗体的生物活性功能验证：

检测四，IP-WB，上样样品：、CY-17和CD-17各个阳性克隆所生产抗体和阳性对照抗体(PC)各5ug富集人血清的L1CAM，一抗为抗人L1CAM抗体1:2000，二抗：羊抗鼠-HRP 1：5000，阳性对照抗体来自abcam([UJ127](ab3200))。

从抗体的活性验证的结果来看，我们CY-17和CD-17两条多肽所获得的多个单克隆抗体均具有和知名生物公司Abcam的商业化抗体相同的生物学功能。

实施例3：

1、用ProteinA beads吸附抗L1CAM的IgG:

A在免疫血清检测阶段:用ProteinA beads吸附少量(5ul)免疫鼠血清抗体4h，形成Protein A-IgG复合物(这里Protein A只结合IgG抗体，包括我们抗原刺激出来的IgG，但不会结合血清中的其他蛋白成分)。

B在细胞株筛选阶段，用ProteinA beads吸附细胞培养上清，形成Protein A-IgG复合物，由于培养上清中的培养上清的IgG浓度很低，所以我们用ProteinA beads吸附1ml细胞培养上清。

C在抗体验证阶段，我们用ProteinA beads吸附5ug抗体。

各个阶段，我们在用ProteinA beads吸附抗L1CAM的IgG过程中，均做了阳性对照实验，以来自abcam([UJ127](ab3200))的抗L1CAM抗体作为阳性对照抗体，用来吸附L1CAM。

2、用过量的ProteinA beads预选吸附处理新鲜人血浆，尽可能的去除人血浆中的IgG，排除人血浆中的人IgG对整个实验的干扰。

3、用步骤1所述的ProteinA beads-IgG复合物来吸附步骤2预吸附处理新鲜人血浆的L1CAM蛋白，4度过夜吸附。

4、用预冷的PBS洗涤Protein A beads-IgG-L1CAM复合物3次，然后将洗涤过的Protein A beads-IgG-L1CAM复合物加上等体积的2XSDS变性buffer，95度煮沸5min。

5、将煮沸后的样品5000rpm离心5min，吸取上清，进行电泳，然后进行WB检测，利用L1CAM蛋白的WB检测抗体作为一抗，配合相应的二抗。

序 列 表

<110> 四川百利药业有限责任公司

<120>一种可用于富集人L1CAM蛋白的单克隆抗体及其制备方法

<160> 2

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Arg Glu Gly Ser Gln Arg Lys His Ser Lys Arg His Ile His Lys Asp

1 5 10 15

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Asn Gln Ser Ser Tyr Thr Gln Trp Asp Leu Gln Pro Asp Thr Asp Tyr

1 5 10 15

Claims (4)

1.一种可用于富集人L1CAM蛋白的抗原多肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种可用于富集人L1CAM蛋白的抗原多肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种可用于富集人L1CAM蛋白的单克隆抗体，其特征在于，包括以下步骤的方法制备：

A、将抗原多肽偶联到KLH蛋白上；

B、将偶联好的多肽-KHL偶联物通过sepdexG250进行纯化；

C、纯化后免疫小鼠，之后进行细胞融合；

D、对融合后的细胞进行筛选；

E、将筛选的细胞株进行亚克隆，挑选单克隆细胞，并对表达的抗体进行生物学活性验证；

F、对生物活性验证过的细胞株进行抗体制备。

4.根据权利要求3所述的一种可用于富集人L1CAM蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述步骤C中，免疫小鼠，按照80ug/只/次的剂量进行皮下注射免疫，共免疫四次，每次免疫的时间间隔为2周，初次免疫用完全佐剂，随后的3次免疫用不完全佐剂，免疫结束后，采集免疫小鼠血清进行抗体的免疫效价以及生物学功能监测，选择最合适的小鼠进行最终的加强免疫，加强免疫为不用任何佐剂，直接按照50ug剂量进行小鼠腹腔免疫。