KR20060030023A - 인간성장 호르몬의 글리코실화 변이체의 조성물 및 그변이체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

이 발명은 인간성장호르몬의 변이체에 관한 것으로,

그 변이체는 이들의 재조합 생성 폴리펩티드가 자연 발생하는 인간성장호르몬의 글리코실화 패턴과 현저하게 다른 글리코실 패턴을 갖도록, 새로 도입한 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위를 포함한다.

또, 본 발명은 상기 변이체의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 서열, 상기 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 서열로 이루어진 발현 카세트(cassettes), 상기 변이체를 발현하는 세포 및 상기 변이체의 생성방법에 관한 것이다.

더 나아가서, 본 발명은 상기 변이체로 조성하는 의약조성물과 상기 변이체의 사용방법에 관한 것이다.

인간성장호르몬, 변이체, 글리코실화, N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위, 폴리펩티드

Description

인간성장 호르몬의 글리코실화 변이체의 조성물 및 그 변이체의 제조방법{Compositions and methods for the Preparation of human Growth hormone glycosylation mutants}

이 발명은 인간성장호르몬의 글리코실화 변이체의 조성물 및 그 변이체의 제조방법에 관한 것이다.

인간성장호르몬(hGH)및 그 아고니스트(agonist)변이체는 특허문헌 USP4,658,021 및 USP5,633,352 명세서에서 기재된 재조합 단백질의 가족의 멤버이다.

이들의 재조합 생성 및 사용방법은 다음 특허문헌에 구체적으로 기재되어 있다: USP4,342,832;4,601,980;USP4,898,830 ;USP5,424,199 및 USP5,795,745.

인간성장 호르몬은 정상적인체성장과 발달의 조정에 대한 여러가지의 분야에 참여하여, 그 호르몬의 리셉터(receptors)와의 상호작용을 통하여, 이 22kDa 하수체 호르몬은 외형성장(체발달), 수유(lactation), 마크로파아지의 활성화와 인슐린 등의 당뇨병 발생 효과등 여러가지의 생물학적 효과를 조정한다.

아래의 참고문헌을 예시한다.

Chawla, Annu. Rev.Med, 34:519(1983) ;

Edwards 등, Science, 239:769(1988);

Isaksson 등, Annu. Rev.Physiol. 47:483(1985) ;

Thorner 및Vance, J.Clin.Invest., 82:745(1988) ;

Hugher 및 Friesen, Annu. Rev.Physiol.,47:469(1985).

특수 생리적 반응을 발생하는 글리코실화 및 비글리코실화된 펩티드의 투여는 의약기술에서 공지 되었다.

정제 hGH 와 재조합 hGH 는 hGH결핍에 의한 상태와 질환, 즉, 왜소증어린이를 치료하는데 사용하였다.

치료용 펩티드의 사용을 제한하는 주요인은 대부분 펩티드의 면역원의 특성에 있다.

어느 환자에 투여한 펩티드에 의한 면역원성 반응은 그 펩티드를 중화시킬 수 있고, 또 그 환자의 알레르기성 반응을 발생시킬 수 있다.

치료용 글리코펩티드의 다른 결핍에는 적량효력(또는 역가)과 신속한 클리어런스율(clearance rate)이 포함한다.

펩티드 치료에서 본래부터가 갖고 있는 문제점을 이 기술분야에서 인식하게 되어, 이 문제점을 해소할려는 여러가지의 방법을 연구하게 되었다.

예로서, 그 문제점을 해소할 수 있는 펩티드 치료방법을 마련하기 위하여 그펩티드 골격에 합성 폴리머를 결합하였다.

폴리(에틸렌글리콜)("PEG")은 하나의 예로서 폴리펩티드에 접합 또는 공액(conjugated)되어 있는 폴리머이다. 펩티드 치료를 유도하는 PEG의 사용으로, 그 펩티드의 면역원성이 감소하는 것으로 나타내었다.

예로서, 특허문헌 USP4,179,337(Davis등) 명세서에서는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜에 결합한 펩티드 호르몬과 효소등 비면역원성 폴리펩티드에 대하여 기재되어 있다.

폴리펩티드 1몰당 폴리머 10 ~ 100몰을 사용하여 최소 15%의 생리활성을 유지하였다. 또 순환시에 청소시간은 그 폴리펩티드의 PEG-콘주게이트(conjugate)의 크기를 증가시키므로 연장되었다.

상기 특허문헌(Davis등)에 기재된 방법은 화학적인 PEG화 방법이다.

펩티드의 화학적인 수식은 그 펩티드의 수식에 이용되는 화학적성질에 대한 비선택성에 기여하는 펩티드 활성의 바람직하지 않은 손실이 자주 발생한다.

예로서, 그 수식기가 수용성펩티드, 즉 PEG인 경우, 펩티드에 PEG와, 그 유도체를 결합하는 기본 방식은 펩티드 아미노산잔기에 의한 비특이성 결합이다.

수용성 폴리머와 인터류킨(interleukin)-2의 콘주게이트(conjugates)에 대한 연구(Fisch 등, Br.J.Haematolo, 82:654(1992)), 과립세포콜로니형성자극인자(satake-Ishikawa 등, Cell Struct. Funct., 17 : 157(1992)), 종양괴사인자(Tsutsumi 등, Br.J.Cancer, 71:963(1996)) 및 인간성장호르몬(Clark 등, J. Biol. Chem., 271 : 21969(1996)) 의 참고문헌에서는 이들 단백질의 화학적인 PEG화(PEGylation)가 펩티드의 생체내 수용체 결합활성을 저하 하는것으로 기재되었다.

대부분 화학적 PEG화 방법에서는 폴리(에틸렌글리콜)이 펩티드 골격상에서 반응성 잔기에 주로 임의로 비특이성 있게 부가된다.

치료용 펩티드의 제조에서는 특이성 있게 표지되고, 쉽게 특성화할 수 있으며, 주로 균질성 있는 생성물을 형성하는 유도체화 설계를 이용하는 것이 바람직하다.

특이성 있게 표지된 펩티드를 제조하는 바람직한 경로에서는 글리코실전이효소 등 효소를 사용하여 수식당 성분을 펩티드에 부가한다.

효소를 기재로한 합성에는 부위선택성과 입체선택성의 이점이 있다.

더욱이, 효소합성은 비보호된 기질을 사용하여 실시한다.

탄수화물(당질)의 합성에는 주요한 3가지 분류의 효소, 글리코실전이효소(즉, 시알릴전이효소, 올리고사카릴전이효소, N-아세틸글루코사미닐전이효소)와, 글리코시다아제가 사용된다.

또, 그 글리코시다아제는 엑소글리코시다아제(즉, β-글루코시다아제)와, 엔도글리코시다아제(즉, 엔도-A, 엔도-M)로 분류한다.

이들 분류의 효소 각각은 계속하여 합성에 사용하여 탄수화물(당질)을 제조하였다. 일반적인 참고문헌으로 아래 문헌을 예시할 수 있다:

(Crout 등, Curr. opin. Chem. Biol. 2:98. 111(1998)

글리코실전이효소는 글리코펩티드상에서 올리고사카라이드를 수식하여 입체화학적 조정과 부위 화학적 조정이 우수한 특정 생성물을 생성한다.

글리코실전이효소를 사용하여 올리고사카라이드를 제조하며, 특히 포유동물세포내에서 생성된 글리코펩티드 상에서 말단 N-및 0-결합탄수화물(당질)을 수식한다.

예로서, 그 글리코펩티드의 말단 올리고사카라이드는 완전 시알릴화 하거나 푸코실화하여 더 안정성 있는 당구조체를 형성하며, 그 당구조체는 글리코펩티드의 약역학적 특성과 여러가지의 생물학적 특성을 향상시킨다.

예로서, β-1, 4-갈락토실전이효소를 사용하여 락토사민을 합성하였다.

참고문헌으로 탄수화물(당질)의 합성에 있어서 글리코실전이효소의 효용에 대한 도해(illustration) (Wong 등, J.org. Chem. 47:5416-5418(1982)) 를 예시할 수 있다.

더욱이, 다수의 합성처리공정에서는 α-시알릴전이효소를 사용하여 시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산에서 갈락토오스의 3-OH 또는 6-OH 로 시알산을 전이하였다(참고문헌:Kevin 등, Chem. Eur. J. 2:1359-1362(1996)).

푸코실전이효소는 합성경로에서 사용하여 구아노신-5'-디포스포푸코스에서 사카라이드 수용체의 소정의 히드록실로 푸코스 단위를 전이한다.

예로서, 다음 참고문헌(이치카와)에서는 클로닝한 푸코실전이효소에 의해 시알릴화된 락토사민의 푸코실화 처리를 포함하는 방법에 의해 시알릴류이스(sialyl Lewis)-X 를 제조하였다(참고문헌 : Ichikawa 등, J. Am. Chem. Soc. 114:9283-9298(1992)).

치료용 글리코콘주게이트(glycoconjugate) 합성의 최근 진행현황에 관한 토론에서는 다음 문헌을 예시하였다 : Koeller 등, Nature Biotechnology 18:835-841(2000) ; 특허문헌 USP5,876,980; 6,030,815,; 5,728,554; 5,922,577; WO/9831826.

또, 글리코시다아제를 사용하여 사카라이드를 제조한다.

글리코시다아제는 글리코사이드 결합의 가수분해를 정상적으로 촉진시킨다.

그러나, 적합한 조건하에서 글리코시다아제는 이 결합의 형성에 사용할 수 있다.

탄수화물(당질)합성에 사용된 모든 글리코시다아제는 엑소글리코시다아제이다; 그 글리코실 전이는 그 기질의 비감소말단(non-reducing terminus)에서 발생한다. 그 글리코시다아제는 물에 의해 차단하여 가수분해 생성물을 얻거나, 또는 수용체(acceptor)에 의해 차단하여 새로운 글리코시드 또는 글리코사카라이드를 얻는 글리코실-효소 중간 매개체에서 글리코실 도너(donor)를 흡수한다.

엑소글리코시드를 사용하는 경로(하나의 예로서)에는 β-만노시다아제의 작용에 의해 형성하기가 어려운 β- 만노시드 결합을 포함하여, 모든 N-결합글리코펩티드의 코어 트리사카라이드의 합성이 있다(Singh 등, Chem. Commun.993-994(1996)).

글리코시다아제를 사용하여 글리코사이드 결합을 형성하는 또 다른 예에서는 활성부위내에서 정상의 친핵성 아미노산이 비친핵성 아미노산으로 변화하는 변이 글리코시다아제를 제조하였다.

상기 변이효소는 글리코사이드 결합을 가수분해 하지 않으나, 그 결합을 형성한다. 그 변이 글리코시다아제는 α-글리코실 플루오라이드 도너(donor)와 글리코시드 수용체 분자를 사용하여 올리고사카라이드를 제조하는데 사용된다

(특허문헌 : Withers 등, USP 5,716,812).

그 변이 글리코시다아제는 유리올리고사카라이드를 형성하는데 유용하다. 그 러나, 이와 같은 효소가 글리코실화 또는 비글리코실화펩티드에 글리코실 도너를 부가할 수 있다는 것을 나타내나, 이들의 효소를 불활성글리코실도너와 함께 사용된 바 없다.

엔도글리코시다아제가 엑소글리코시다아제의 사용보다 덜 사용하나, 탄수화물(당질)을 제조하는데도 이용한다. 엔도글리코시다아제의 사용을 기초로한 방법은 모노사카라이드 보다 오히려 올리고사카라이드를 전이하는 이점이 있다.

올리고사카라이드 단편은 엔도-F, 엔도-M 등 엔도-β-N-아세틸글루사민을 사용하여 기질에 첨가하였다

[참고문헌:Wang 등, Tetrahedron Lett. 37:1975-1978);Haneda 등, Carbohydr. Res. 292:61-70(1996)].

탄수화물을 제조할 때 이들 효소의 사용 이외에, 위에서 설명한 효소는 글리코펩티드의 합성에 사용되었다.

리보뉴클레아제 B의 균질성글리코폼(glycoform)의 합성은 공지되었다(Witte k. 등, J. Am. Chem. Soc. 119:2114-2118(1997)).

리보뉴클레아제 B의 높은 만노오스코어는 글리코펩티드를 엔도글리코시다아제H 로 처리함으로써 개열 되었다.

그 개열은 2개의 코어 GlcNAc 잔기사이에서 특이하게 발생하였다.

다음으로, 그 테트라사카라이드 시알릴루이스-X는 β-1,4-갈락토실전이효소, α-2,3-시알릴전이효소 및 α-1,3-푸코실전이효소V를 차례로 사용함으로써 그 균질성 단백질에 잔류되어 있는 GlcNAc 고정부위상에서 효소에 의해 재형성 되었다.

각각 효소에 의해 촉진되는 스텝으로 처리하여 높고 우수한 수율을 얻었다.

화학적 합성구성요소와 효소에 의한 합성 구성요소를 혼합한 방법도 공지 되었다.

예로서, 야마모토 등 (참고문헌 : Yamamoto등, Carbohydr.Res.305:415-422(1998))은 엔도글리코시다아제를 사용하여 글리코펩티드, 글리코실화펩티드T 의 화학효소합성에 대해 보고 하였다.

그 N-아세틸글루코사미닐펩티드는 순화학적 수단에 의해 합성하였다. 그다음으로, 그 펩티드는 인간 트랜스페린글리코펩티드의 올리고사카라이드로 효소에 의해 합성하였따. 그 사카라이드 부분은 엔도-β-N-아세틸글루코사미다아제로 처리하여 그 펩티드에 부가하였다.

그 결과, 얻어진 글리코실화 펩티드는 상기 펩티드T와 N-아세틸글루코사미닐펩티드T와 비교할 때, 단백질 분해에 대한 저항성과 안정성이 높았다.

펩티드 구조를 리포터그룹(reporter groups)으로 수식하는 글리코실전이효소의 사용에 대하여 탐구하게 되었다.

예로서, 특허문헌 USP5,405,753(Brossmer등)명세서에서는 시알산의 형광표지된 시티딘모노포스페이트("CMP")유도체의 형성과, 시알릴전이효소활성과 세포표면, 글리코단백질 및 강글리오시드의 형광표지에 대한 아세이(assay)에서 형광글리코시드의 사용에 대하여 기재 되어 있다.

참고문헌(Gross등, Analyt. Biochem. 186:127(1990)) 에서는 동일한 아세이가 기재되어 있다.

특허문헌 USP5,432,059(Bean등)명세서에서는 글리코실화결핍단백질의 재글리코실화를 이용하는 글리코실화결핍무질서(disorders)에 대한 아세이가 기재되어 있다.

그 결핍 단백질은 형광표지된 CMP 글리코시드로 재글리코실화 한다. 각각의 형광시알산유도체는 시알산에서 정상적으로 아세틸화한 아민에서 또는 9-위치에서 형성성분과 치환된다.

그 형광시알산유도체를 사용하는 방법은 글리코실전이효소의 존재 또는 비글리코실화 또는 부적절한 글리코실화 글리코단백질에 대한 아세이이다.

상기 아세이는 생물기원 샘플에서 소량의 효소 또는 글리코단백질에 대하여 실시한다.

수식시알산을 사용하는 샘플규모 또는 공업적 규모에서 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드의 효소에 의한 유도체화에 대하여 공표된바 없다.

효소에 의한 방법은 또 글리코펩티드에서 글리코실잔기를 활성화 하고, 그다음 화학적 합성을 하는데 사용하였다.

그 글리코실잔기는 갈락토오스 옥시다아제를 사용하여 주로 활성화 한다. 그 가락토오스옥스다아제는 말단갈락토오스잔기를 그 상응하는 알데히드로 전환한다.

그 다음, 그알데히드는 아민함유 수식기에 결합한다.

예로서, 참고문헌(Casares등, Nature Biotech. 19:142(2001))에서는 독소루비신을 재조합 MHCII-펩티드키메라의 산화된 갈락토오스 잔기에 결합하는 구성에 대해서 기재되어 있다.

글리코실잔기는 또 수식하여 케톤기를 가진다.

예로서, 참고문헌(Mahal등, Science276:1125(1997)) 에서는 N-레불리노일만노사민("ManLev")의 제조에 대하여 기재되어 있으며, ManLev는 자연산 기재의 아세틸기에 의해 정상적으로 차지한 위치에서 케톤 기능성을 가진다.

세포를 Manlev로 처리함으로써, 케톤기를 세포표면에서 결합한다.

참고문헌을 예시하면 다음과 같다:

Saxon등, Science 287:2007(2000);

Hang등, J.Am.Chem.Soc123 : 1242(2001);

Yarema등, J.Biol.Chem.273 : 31168(1998);

Charter 등, Glycobiology 10 : 1049(2000).

탄수화물(당질)은 아스파라긴의 N-결합과, 세린 및 트레오닌의 무신타입(mucin type)O-결합이 재조합글리코단백질 치료에 가장 관련되어 있는 몇가지 방법중에서 글리코펩티드에 결합한다.

단백질의 글리코실화의 개시에 대한 결정적인 요소는 단백질의 영역과 배좌를 포함하는 다음 요소가 명백하게 그 역할을 다하여도 일차적으로 배열관계에 있다.

N-결합글리코실화는 공통배열 NXS/T (X는 아미노산이나 프롤린이다)에서 발생한다.

위에서 설명한 방법은 펩티드의 변형하지 않은 동족체의 약리활성을 실질적으로 가진 수식펩티드의 공업적인 양산 체제로 접근할 수 없다.

더욱이, 그 방법은 펩티드 또는 글리코펩티드에 수식당의 부위-특이성 접합(conjugation)에 대하여 허용하지 않는다.

그 방법은 비자연부위(non-natural site)에서 글리코실화 되거나 글리코접합(glycoconjugated)된 수식펩티드를 제조하는 수단을 제공하지 않는다.

이 발명은 새로 도입한 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위를 함유한 hGH변이체를 제공하여, 이들의 재조합 hGH변이체의 글리코실화 및/또는 글리코페질화(glycopegylation)의 융통성을 제공함으로써 상기 결점을 극복한 이들의 필요성에 응답할 수 있다.

더욱이, 이 발명은 수용성 폴리머, 치료성분, 생분자등의 수식그룹으로 N-또는 O-결합변이 hGH펩티드를 수식하여 공업적으로 실시할 수 있는 방법을 제공한다.

특히, 수식변이 hGH가 치료제 또는 진단제로서 사용하는데 향상할 수 있는 특성을 개량하는 방법에 관한 것이다.

첫째로, 이 발명은 변이인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 분리된 핵산을 제공한다.

그 변이 인간성장호르몬은 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않은 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위로 이루어진 것이다.

일부예에서, 그 야생형 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 를 가진다.

일부 바람직한 예에서 그 변이인간 성장호르몬에서는 아미노산서열 SEQ IDNO:3,5,6,7,8 또는 9를 포함한다.

둘째로, 이 발명은 변이 인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 즉 분리된 핵산으로 이루어진 발현 카세트 또는 세포를 제공한다.

그 변이 인간성장호르몬에는 야생형 인간성장호르몬에서 존재하지 않는 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위를 포함한다.

세째로, 이 발명은 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않는 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위를 포함하는 변이 인간성장호르몬을 제공한다.

일부예에서, 그 야생형인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2를 가진다.

일부 바람직한 예에서, 그 변이 인간성장호르몬은 아미노산서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어진 것이다.

네째로, 이 발명은 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않은 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위를 포함한 변이 인간성장호르몬를 생성하는 방법을 제공한다.

이 방법에는 변이 인간성장호르몬을 재조합 생성하는 스텝과, 새로운 글리코실화 부위에서 변이 인간성장호르몬을 글리코실화 하는 스텝을 포함한다.

일부예에서,그 야생형 인간성장호르몬은 아미노산서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2를 가진다.

일부 바람직한 예에서 그 변이 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어진 것이다.

다섯째로, 이 발명은 야생형 인간성장호르몬에서 존재하지 아니한 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위를 포함하는 변이 인간성장호르몬의 치료가능한 유효량을 가진 의약조성물을 제공한다.

일부예에서, 그 아생형 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2를 가진다.

일부바람직한 예에서, 그 변이 인간성장호르몬은 아미노산서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어진다.

여섯째로, 이 발명은 피검자(subject)의 인간성장호르몬 결핍을 치료하는 방법을 제공한다.

이 방법에는 변이인간성장호르몬 결핍을 치료 또는 개선하는데 유료한 양의 변이 인간성장호르몬을 피검자에 투여하는 것을 포함한다.

이 방법에서 사용된 상기 변이 인간성장호르몬은 그 상응하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 아니한 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위로 이루어진다.

일부예에서, 그 상응하는 야생형 인간성장호르몬은 아미노산서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 가진다.

일부 바람직한 예에서, 그 변이 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어진다.

위에서 설명한 각각의 발명에서, 상기 변이 인간성장호르몬은 글리코실화 부위와 수식그룹 사이에서 글리코실결합기에 형성하는 글리코접합(glycocenjugation)에 의해 바람직하게 1개 이상의 수식그룹에 선택적으로 접합(conjugation)한다.

하나의 예로서 수식그룹에는 폴리(에틸렌글리콜)이 있다.

도 1은 GH-N(하수체유도hGH)와 GH-V(태반유도hGH)의 아미노산 서열을 나타낸다.

화살표는(GH-N)또는 자연산(GH-V)N-결합글리코실화 부위의 변이도입을 한 아미노산 위치를 나타낸 것이다.

도 2는 글리코실화한 GH-N 변이 hGH(Lys140~Asn140)와 그 수용체폴리펩티드의 결정구조체를 나타낸다.

도 3은 hGH N-결합글리칸 변이체를 생성하는 곤충세포와 포유동물세포에 대한 글리코PEG화(glycoPEGylation)설명도를 나타낸다.

도 4는 hGH O-결합글리칸변이체를 생성한 에쉬리키아콜리(Escherichia coli)의 글리코피질화(glycoPEGylation) 설명도를 나타낸다.

도 5는 글리코실화 부위를 도입하는 GH-N의 다른 변이체를 나타낸 것이다.

화살표는 글리코실화 부위를 도입할 수 있는 GH-N의 단백질 루프영역(loop region)을 표시한다.

도 6은 수하체유도hGH(GH-N)에 도입할 수 있는 6개의 다른 O-결합글리코실화 부위의 아미노산 서열을 나타낸다.

또, GH-N의 야생형 아미노산 서열은 비교용으로 나타낸 것이다.

화살표는 O-결합글리코실화가 발생하는 GH-N글리칸 변이체의 트레오닌잔기를 표시한다.

도 7은 아미노산 -3 ~ -1(prt)을 그 아미노 말단에서 삽입하여 194번 아미노산 hGH 폴리펩티드에서 얻어지는 hGH O-결합GH-N변이체 134(rtg)→tt 와 hGH O-결합 5' GH-N 변이체의 아미노산 서열을 표시한다.

도 8은 아미노산 -3 ~ -1(mvt)을 아미노 말단에서 삽입하여 194번 아미노산 hGH폴리펩티드에서 얻어지는 hGH O-결합 GH-N변이체 134(rtg)→ttg와 hGH O-결합 5' GH-N 변이체의 아미노산 서열을 표시한다.

도 9A는 성숙인간성장호르몬(GH-N)의 아미노산 서열(SEQ IDNO:1)을 표시한다.

도 9B는 성숙인간성장호르몬(GH-V)의 아미노산 서열(SEQ IDNO:2)을 표시한다.

도 9C는 인간성장호르몬 변이체 1의 아미노산 서열(SEQ IDNO:3)을 표시한다.

도 9D는 인간성장호르몬 변이체 2의 아미노산 서열(SEQ INDO:4)을 표시한다.

도 9E는 인간성장호르몬 변이체 3의 아미노산 서열(SEQ IDNO:5)을 표시한다.

도 9F는 인간성장호르몬 변이체 4의 아미노산 서열(SEQ IDNO:6)을 표시한다.

도 9G는 인간성장호르몬 변이체 5의 아미노산 서열(SEQ IDNO:7)을 표시한다.

도 9H는 인간성장호르몬 변이체 6의 아미노산 서열(SEQ IDNO:8)을 표시한다.

도 9I는 인간성장호르몬 변이체 7의 아미노산 서열(SEQ IDNO:9)을 표시한다.

정의

용어 "핵산" 또는 폴리뉴클레오티드" 는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 단가닥 또는 이중가닥 형태의 그 폴리머를 말한다.

특별한 한정이 없는 경우, 그 용어 핵산에는 자연발생하는 뉴클레오티드와 유사하게 대사작용을 하며, 그대조 핵산과 유사한 결합특성을 가진 자연뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산이 있다.

특별한 표시가 없으면, 소정의 핵산 서열에는 또 그 보존적 수식변이체(즉, 퇴화 코돈치환), 대립유전자, 오르토로그(orthologs), SNP 및 상보적 서열과 명백하게 표시된 서열이 포함된다.

구체적으로 말하면, 퇴화코돈 치환은 1개 이상 선택한(또는 전체) 코돈의 제 3 위치가 혼합염기 및/또는 디옥시이노신잔기로 치환된 서열을 생성함으로 얻을 수 있다(Batzer등, Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka 등, J. Biol. Chen.260:2605-2608(1985); Rossolini 등, Mol. Probes u:91-98(1994)).

상기 용어 핵산은 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 코딩한 mRNA로 서로 바꿔 사용한다.

용어 "유전자"(gene)는 폴리펩티드 사슬의 생성에 관련된 DNA의 세그멘트를 말한다.

그 유전자에는 코딩영역의 선후행하는 영역(리더 및 트레일러:leader and trailer)과 각 코딩 세그멘트(엑손)사이의 개재서열(인트론)을 포함한다.

핵산 또는 단백질에 적용할때, 용어 "분리"(isolated)는 핵산 또는 단백질이 자연상태에서 회합된 다른 세포성분에서 주로 유리되어 있는 것을 의미한다.

이것은 건조 또는 수용액 중에 있어도 균질 상태에 있는 것이 바람직하다.

순도와 균질성은 폴리아크릴아미드 겔 엉동 또는 고성능액체크로마토 그래피 등 분석화학기술을 사용하여 주로 결정한다.

제조할 때 존재한 주종(predominant species)인 단백질을 실질적으로 정제한다.

특히, 분리된 유전자는 유전자에 인접되고 관심있는 유전자 이외 단백질을 z코딩하는 오픈 리딩프레임(open reading frames)에서 분리한다.

용어 정제 "(purified)는 핵산 또는 단백질이 전자영동겔에서 기본적으로 1밴드(one band)에 생성되는 것을 의미한다.

특히, 이것은 핵산 또는 단백질이 최소 85%, 바람직하게는 최소 95%, 가장바람직하게는 최소 99% 순수한 것을 의미한다.

용어 "아미노산" 은 자연적으로 발생하는 아미노산 및 합성아미노산과, 아미노산 유사체와 자연발생하는 아미노산과 기능이 유사한 아미노산의태체(amino acid mimetics)를 말한다.

자연발생하는 아미노산에는 유전암호(genetic code)에 의해 코딩된 아미노산과, 후수식된 아미노산, 즉 히드록시프롤린, α-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이 있다..

아미노산 유사체는 자연 발생하는 아미노산과 기본적으로 동일한 화학구조를 가진 화합물을 말한다. 즉, 하나의 수소, 하나의 카르복실기, 하나의 아미노기 및 하나의 R기(즉 호모세린, 노르류신, 메티오닌술폭시드, 메티오닌메틸술포늄)에 결합하는 하나의 탄소이다.

이와같은 유사체는 수식R기(즉, 노르류신) 또는 수식펩티드 골격을 가지나, 자연발생하는 아미노산과 기본이 동일한 화학구조를 보유한다.

"아미노산의태체" 는 아미노산의 일반적인 화학구조가 다르나 자연발생하는 아미노산과 기능이 유사한 구조를 가진 화학적 화합물을 말한다.

폴리펩티드사슬에 비자연아미노산 유도체 또는 유사체를 부위가 특이성 있게 결합하도록 하는 여러가지의 공지방법이 있다(참고문헌: WO 02/086075).

아미노산은 통상적으로 공지된 3글자 부호에 의해, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명칭 제정위원회가 추천한 1글자 부호에 의해 여기서 나타낸 것을 말한다.

동일하게, 뉴클레오티드는 통상적으로 허용되는 단글자 코드로 나타낸 것을 말한다.

"보전적 수식변이체" 는 아미노산과 핵산서열에 적용한다.

소정의 핵산서열에 대하여, "보전적 수식변이체" 는 동일한 또는 기본적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 이들의 핵산, 또는 기본적으로 동일한 서열에, 하나의 아미노산 서열을 코딩하지 않는 아미노산을 말한다.

그 유전암호의 축중 또는 퇴화(degeneracy)때문에, 다수의 기능이 동일한 핵산은 주어진 단백질을 코딩한다. 예로서, 코돈 GCA, GOC, GOG 및 GUC의 모두가 아미노산 알라닌을 코딩한다.

이와같이, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 그 코돈은 코딩된 폴리펩티드의 변경없이 기술된 그 상응하는 코돈중 어느 코돈에 변경할 수 있다.

이와같은 핵산변이는 "잠재성 변이"(silent variations)로서, 그 잠재성 변이는 보존적 수식변이의 1종이다.

폴리펩티드를 코딩하는 여기서 설명한 모든 핵산서열은 핵산의 가능성 있는 모든 잠재성 변이를 기술한 것이다.

핵산에서 각 코돈(일반적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG와, 트립토판에 대하여 일반적으로 유일한 코돈인 TGG는 제외함)이 수식되어 기능적으로 동일한 분자를 얻을수 있다는 것은 통상의 기술자에 의해 알 수 있다.

따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 잠재성 변이는 각각 설명한 서열에서 절대적이다.

아미노산 서열에 있어서, 코딩한 서열에서 소량 %의 아미노산 또는 단일 아미노산을 변경, 부가 또는 결실하는 단백질 서열, 또는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드의 개별치환, 결실 또는 부가는 "보존적 수식변이형" 으로, 그 변경결과 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로, 치환된다는 것을 이 분야 기술자는 이해하고 있다.

기능적으로 유사한 아미노산을 나타낸 보존적 치환 표(tables)는 이 분야기술에서 공지되었다.

이와같은 보존적 수식변이종은 이 발명의 다형변이체, 종간 상동체 및 대립유전자를 포함하며, 한정된 것은 아니다.

다음 8개의 그룹은 각각 서로간에 대하여 보존적 치환을 하는 아미노산을 포함한다;

1) 알라닌(A), 글리신(G) ;

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(B) ;

3) 아스파르긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 라이신(K) ;

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V) ;

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 서린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(참고문헌:Creighton, Proteins(1984))

여기서 사용하는 아미노산은 통상적으로 알려진 3글자 부호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명칭 제정위원회가 추천하는 1글자 부호를 참조한다.

동일하게, 뉴클레오티드도 통상적으로 허용되는 단일글자 코드를 참조한다.

이 특허출원에서, 아미노산 잔기는 이들의 상대위치에 따라 비수식 야생형 폴리펩티드서열에서 번호 1을 붙친 가장 좌측잔기에서 번호를 붙친다.

여기서 사용한 "근접 프롤린잔기"(proximate a proline residue)는 프롤린잔기에서 이탈된 아미노산 약 10개 이하, 바람직하게는 프롤린잔기에서 이탈된 아미노산 약 9,8,7,6 또는 5개 이하, 더 바람직하게는 프롤린잔기에서 이탈된 아미노산 약 4,3,2 또는 1개 이하인 아미노산을 말한다.

"근접프롤린잔기" 의 아미노산을 프롤린잔기의 C-또는 N-말단측에 있다.

"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" 은 여기서 서로 바꿔가면서 사용되어, 아미노산잔기의 폴리머를 말한다.

위 3가지 용어 모두가 아미노산 폴리머에 적용되어, 그 중에서 1개 이상의 아미노산잔기가 상응하는 자연발생 아미노산의 인공적인 화학적 의태(mimetic)이며, 또 자연 발생하는 아미노산 폴리머와 비자연 발생하는 아미산 폴리머에 적용된다.

여기서 사용되는 상기 용어들은 전장(full-length)단백질을 포함하여 어느 길이를 가진 아미노산 사슬을 포함하며, 그 아미노산잔기는 펩티드 공유결합에 의해 연결된다.

N-또는 O-결합글리코실화 부위를 야생형 인간성장호르몬에 추가 도입하는 것과 관련하여 사용되는 용어 "변이하는"(mutating) 또는 "변이"(mutation)은 야생형 인간 성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아생형 인간성장호르몬의 아미노산 서열에서 각각 화학적 수단, 효소수단 또는 다른 수단에 의해 뉴클레오티드 또는 아미노산잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 말한다.

여기서, 그 얻어진 인간성장 호르몬의 아미노산 서열은 그 상용하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않은 최소 하나의 N-또는 O-결합글리코실화 부위를 구성하도록 한 것이다.

아미노산 치환의 경우, 보존적 치환과 비보존적 치환을 사용하여 새로운 N-또는 O-결합글리코실화 부위를 포함한 hGH 변이체를 형성한다.

새로운 N-또는 O-결합글리코실화 부위를 도입하는 변이부위는 폴리펩티드에서 어느 장소라도 위치할 수 있다.

인간성장호르몬 변이체의 대표적인 아미노산 서열은 SEQ IDNO:3-9로 나타낸다.

이와같이 이 발명의 "변이 인간성장호르몬" 은 최소 1개의 변이 아미노산잔기로 이루어진다.

반면에, 코딩서열을 수식하여 변이인간성장호르몬을 생성하는 야생형 인간성장호르몬은 이 출원에서 "상응하는 야생형 인간성장호르몬" 이라고 말한다.

예로서, SEQ IDNO:1 은 아미노산 서열 SEQ IDNOs : 3-9를 가진 변이인간성장호르몬에 대하여 그 상응하는 야생형 인간성장호르몬의 아미노산 서열이다.

여기서 사용되는 용어 "유효량" 은 어느 물질을 투여하여 치료효과를 내는 양을 말한다.

그 치료효과에는 질병/상태의 증상과 관련된 합병증의 진행에 대하여 검출가능범위까지 예방, 교정 및 억제하는 것은 포함한다.

그 정밀한 양은 치료목적에 따라 좌우되며, 공지기술을 사용하는 이 분야에서 이 분야 기술자에 의해 알 수 있다.

아래에 참고문헌을 예시한다;

Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992);Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999);and Pickar,Dosage Calculations(1999)).

여기서 사용되는 용어 "수식당"(modified sugar)은 이 발명의 처리과정(process)에서 아미노산또펩티드의 글리코실잔기에 효소에 의해 부가되는 자연적으로 또는 비자연적으로 발생하는 탄수화물을 말한다.

그 수식당은 다수의 효소기질에서 선택되며, 그 효소기질에는 당뉴클레오티 드(모노, 디 및 트리포스페이트),활성화당(즉, 글리코실할라이드, 글리코실메실레이트)및 활성화도, 뉴클레오티드도 아닌당에 포함되며, 한정된 것은 아니다.

그 "수식당" 은 "수식그룹"(modified group)으로 공유결합에 의해 기능적 작용을 한다.

유용한 수식그룹에는 수용성폴리머, 치료성분, 진단성분, 바이오분자 등이 포함되며, 한정된 것은 아니다.

그 수식그룹은 자연발생하는 탄수화물 또는 비수식탄수화물이 바람직하지 않다.

수식그룹으로 기능적 작용을 하는 위치(locus)는, 그 "수식당" 이 펩티드에 효소에 의한 부가가 되도록 선택한다.

용어 "수용성" 은 수중에서 검출할 수 있는 용해도를 가진 성분을 말한다.

물 용해도를 검출/정량 측정하는 방법은 이 기술에서 공지된 것이다.

대표적인 수용성 폴리머에는 펩티드, 사카라이드, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카르복실산)등을 포함한다.

펩티드는 단순아미노산, 즉 폴리(라이신)으로 이루어진 혼합서열을 가진다.

대표적인 폴리사카라이드에는 폴리(시알산)이 있다.

대표적인 폴리(에테르)에는 폴리(에틸렌글리콜), 즉 m-PEG가 있다.

폴리(에틸렌이민)은 대표적으로 폴리아민이 있으며, 폴리(아크릴)산은 대표적으로 폴리(카르복실산)이 있다.

그 수용성 폴리머의 폴리머 골격(backbone)은 폴리(에틸렌글리콜)(즉, PEG) 이다.

그러나, 다른 관련된 폴리머도 이 발명의 실시에서 사용하는데 적합하며, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌글리콜)의 사용이 포함되고 여기에서 한정되는 것은 아니다.

용어 PEG에는 알콕시 PEG, 그 작용성 PEG, 다수암을 가진(multiarmed)PEG,포오크형상(forked)PEG, 분기(branched)PEG, 현수(Pendent)PEG(즉, PEG 또는 폴리머 골격에 현수된 1개 이상의 작용기를 가진 관련폴리머)또는 분해가능한 결합을 가진 PEG를 포함하여, PEG 형태중 어느 하나의 폴리(에틸렌글리콜)을 포함한다.

폴리머 골격은 선상 또는 분기상(branched)이다.

분기상 폴리머 골격은 일반적으로 이 기술분야에서 공지되었다.

주로, 분기상 폴리머는 중심분기코어 성분과 그 중심분기코어 성분에 결합된 다수의 선상폴리머 사슬을 가진다.

PEG는 글리세롤, 펜타에리트리톨 및 소르비톨 등 여러가지의 폴리올에 에틸렌옥사이드를 부가시켜 제조할 수 있는 분기형상으로 통상사용된다.

그 중심분기성분은 또 라이신등 수개의 아미노산에서 유도할 수 있다.

그 분기폴리(에틸렌글리콜)은 일반형태에서 R(-PEG-OH).Sub.m(여기서, R은 글리세롤 또는 펜타에리트리롤 등 코어성분을 나타내며, m은 암(arms)의 수를 나타낸다)로 나타낼 수 있다.

여기서 참고로 인용한 USP5,932,462 명세서에서 기재된 PEG 분자등 다암(multi-armed)PEG 분자는 폴리머 골격으로 사용할 수도 있다.

다수의 다른 폴리머는 이 발명에 적합하다.

비펩티드이며 수용성이고 2~약 300개의 말단을 가진 폴리머 골격은 특히 이발명에서 유용하다.

적합한 폴리머의 예로는 다른 폴리머(알킬렌글리콜)[폴리(프로필렌글리콜)("PPG")등], 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜 등의 코폴리머, 폴리(옥시에틸화폴리올),폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시프로필메타아크릴아미드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린)(여기서 참고로 인용한 USP5,629,384 명세서에서 기재된 것) 및 코폴리머, 테르폴리머 및 그 혼합물이 포함되며, 한정된 것은 아니다.

그 폴리머 골격의 각 사슬의 분자량이 변동되나, 이것은 주로 약 100Da ~ 약 100,000Da 이며, 약 6,000Da ~ 약 80,000Da 에서 분자량이 자주 변동된다.

환자에 펩티드 약제를 투여시 여기서 사용되는 용어 "커어브 아래에서의 영역"("AUC") 은 O(zero)에서 무한대까지 시간의 함수로서 환자의 시스템 순환에서 약제의 농도를 설명하는 커어브 아래의 전체 영역을 의미한다.

펩티드 약제를 환자에 투여할 때 여기서 사용되는 용어 "반감기" 또는 "t1/2" 은 환자에서 약제의 플라즈마 농도가 1/2로 감소하는 필요시간을 말한다.

이 기술분야에서 공지된 다중클리어런스메카니즘(multiple clearance mechanisms), 재분산 및 다른 메카니즘에 따라 좌우되는 펩티드 약제와 관련된 반감기는 1종 이상이 있다.

통상적으로 알파 및 베타 반감기는 그 알파상이 재분산과 관련되어 있고, 베 타상이 클리어런스와 관련되도록 규정한다.

그러나, 대부분, 혈액흐름(blood streams)에 한정되어 있는 단백질 약제와 연관하여 볼 때 최소 2종의 클리언스 반감기가 있다.

일부 글리코실화펩티드에 있어서, 신속한 베타상클리언스는 마크로파아지 또는 말단 갈락토오스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 만노오스 또는 푸코오스를 인식하는 내피세포에서 리셉터에 의해 매개(중개)할 수 있다.

더 느린 베타상클리언스는 유효반경< 2nm(약 68kl), 및/또는 조직내에서 특정 또는 비특정 흡수 및 대사를 가진 분자에 대한 신사구체여과(renal glomerular filtration)에 의해 발생한다.

글리코 PEG화는 말단당(즉, 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민)을 캐핑(capping)함으로써 이들의 당을 인식하는 리셉터에 의해 신속한 알파상 글리어런스를 블록킹한다.

이것은 또 유효반경을 더 크게 하여 분산용량과 조직흡수를 감소시킴으로써 그 후 베타상(late beta phase)을 연장한다.

이와같이, 알파상 및 베타상 반감기에 대한 글리코PEG화의 정밀한 충격은 이 기술분야에서 공지된 바와 같이 글리코실화의 크기, 상태와 다른 파라미터에 따라 변동한다.

"반감기" 에 대한 더 구체적인 설명은 다음 문헌에서 기재되어 있다[Pharmaceutical Biotechnology(1997,DFA Crommeliu and RD Sindelar,eds. Harwood Publishers, Amsterdam, pp.101-120)].

[0058]

여기서 사용되는 용어 "글리코콘주게이션"(glycoconjugation)은 폴리펩티드, 즉 이 발명의 변이 인간성장호르몬의 아미노산 또는 글리코실잔기에 수식당종의 효소에 의해 매개된 접합(conjugation)을 말한다.

"글리코콘주게이션" 의 아속(subgenus)은 "글리콜-PEG화" 이며, 이 글리콜 PEG화에서 수식당의 수식그룹에는 폴리(에틸렌글리콜) 및 알킬유도체(즉, m-PEG)또는 그 반응성 유도체(즉, H2N-PEG, HOOC-PEG)가 있다.

용어 "대규모" 및 "공업상규모" 은 서로 교환하여 사용되며, 단일 반응 주기가 완료될 때 글리코콘주게이트로서 최소 약 250mg, 바람직하게는 최소 약500mg, 더 바람직하게는 최소 약 1gr을 생산한 반응주기를 말한다.

여기서 사용되는 용어 "글리코실결합기" 는 수식그룹(즉, PEG성분, 치료성분, 바이오분자)이 공유결합을 하는 글리코실잔기를 말한다;

그 글리코실결합기는 그 수식그룹을 콘주게이트의 잔부(remainder)에 결합한다.

이 발명의 방법에서 "글리코실결합기" 는 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드에 공유결합을 함으로써, 그 펩티드상에서의 아미노산 및/또는 글리코실잔기에 작용제(agent)를 결합한다.

"글리코실결합기" 는 일반적으로 그 펩티드의 아미노산 및/또는 글리코실잔기에 "수식당" 은 효소에 의한 결합에 의해 "수식당" 으로부터 유도된다.

그 글리코실결합기는 수식그룹-수식당카세트를 형성할 때 분해되는 사카라이 드 유도 구조체이거나 (즉, 산화→ 쉬프염기형성→ 환원), 또는 그 글리코실결합기는 무손상 결합기(intact)이다.

"무손상글리코실결합기" 는 수식그룹을 콘주게이트의 잔부에 결합하는 사카라이드 모노머가 소듐메타퍼아이오데이트에 의해 분해, 즉 산화되지 않는 글리코실성분에서 유도된 결합기를 말한다.

이 발명의 "무손상글리코실결합기" 는 모(Parent)사카라이드 구조에서 1개 이상의 글리코실 단위의 부가 또는 제거에 의해 자연적으로 발생하는 올리고사카라이드에서 유도할 수 있다.

여기서 사용되는 용어 "표적설정성분"(targeting moiety)은 생체의 특정 조직 또는 영역(부위)에 선택적으로 위치하는 종(species)을 말한다.

그 위치설정은 분자결정기의 특정인식, 표적설정제 또는 콘주게이트의 분자크기, 이온상호작용, 소수성상호작용등에 의해 결정된다.

소정의 조직 또는 영역에 하나의 작용제의 표적을 정하는 다른 메카니즘은 이 분야기술자에 의해 공지되었다.

대표적인 표적설정 성분에는 항체, 항체단편, 트랜스페린, HS-글리코단백질, 응집인자, 혈청단백질, β-글리코단백질, G-CsF, GM-CSF, M-CSF, EPO 등이 있다.

여기서 사용되는 "치료성분" 은 치료에 유용한 작용제를 의미하며, 항생물질, 항염증제, 항종양약제, 사이토톡신 및 방사성 작용제가 포함되나, 한정된 것은 아니다.

"치료성분" 에는 생활성제의 전구약물(prodrugs), 1종 이상의 치료성분이 캐 리어에 결합되어 있는 구축물, 즉 다가형성제를 포함한다.

치료성분에는 또 단백질과 단백질을 포함한 구축물을 포함한다.

대표적인 단백질에는 에리트로포이에틴(EPO),그라눌로사이트클로니스티뮬레이팅팩터(GCSF), 그라눌로사이트마크로파아지콜로니스티뮬레이팅팩터(GMCSF), 인터페론(즉, 인터페론 -α,-β,-r), 인터뉴킨(즉, 인터뉴킨 Ⅱ), 혈청단백질(즉, 팩터 Ⅶ,Ⅶa,Ⅷ,Ⅸ,Ⅹ), 인간코리오닉고나도트로핀(HCG), 폴리클스티뮬레이팅 호르몬(FSH) 및 루테니징 호르몬(LH) 및 항체융합단백질(즉, 종양네크로시스팩터 리셉터((TNFG)/Fc 도메인융합단백질))이 있다.

여기서 사용되는 "항종양약제(항암제)" 는 암과 대항하는데 유용한 작용제를 의미하며, 사이토톡신(cytotoxins) 및 항대사제, 알킬레이팅제, 안트라사이클린, 항생물질, 항분열제(antimitotic agents), 프로카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나아제, 코르티코스테로이드, 인터페론 및 방사성작용제 등의 작용제가 포함되며, 한정된 것은 아니다.

또, 용어 "항암제" 의 범위내에는 항종양활성, 즉 TNF-α 를 가진 펩티드의 콘주게이트를 포함한다.

콘주게이트에는 이 발명의 치료단백질과 글리코단백질 사이에서 생성된 콘주게이트를 포함하며, 한정된 것은 아니다.

대표적인 콘주게이트에는 PSGL-1 과 TNF-α 사이에 생성된 콘주게이트가 있다.

여기서 사용되는 "시토톡신 또는 시토톡신제" 는 세포에 해로운 처리제를 의 미한다.

예로는 탁솔, 시토칼라신B, 그라미시딘D, 에티듐브로미드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신D, 1-디히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드스, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 푸루마이신 및 그 유사체 또는 상동체가 있다.

다른 톡신에는 예로서 리신, CC-1065 및 유사체, 두오카르마이신이 있다.

또 다른 톡신에는 디프테리아톡신 및 뱀독(즉, 코브라독)이 있다.

여기서 사용되는 "방사성제" 에는 종양을 진단또는 파괴하는데 효과적인 방사성 동위원소를 포함한다.

예로는 인듐-111, 코발트-60이 있다.

또, 우라늄, 라듐 및 토륨등 자연에서 발생하는 방사성원소(이들의 원소는 주로 방사성 동위원소의 혼합물을 나타냄)는 방사성제의 적합한 예이다.

금속이온은 주로 유기킬레이팅 성분과 킬레이팅한다.

대부분의 유용한 킬레이팅기, 크라운에테르, 크립탠드 등은 이 기술분야에서 공지되어 있으며, 이 발명의 화합물에 결합되어 있다(즉, EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA 등과, DTPP, EDTP, HDTP, NTP 등 이들의 포스포네이트유사체).

예로서 아래의 참고문헌을 예시할 수 있다;

Pit등, "The Design of chelating Agents for the Treatment of Iron overoad" In, Inorganic chemistry in Biology and Medicine;

Martell, Ed.;American Chemical society, Washington, D.C.,1980;PP.279-312;

Lindoy, The Chemistry of Macrocyclic ligand Complexes; Cambridige univusity Press, Cambridge; 1989, Dugas, Bio organic Chcmistry;

Springer-Verlag, New York,1989,and 여기에서 포함된 참고문헌.

또, 다른분자에 킬레이팅제, 크라운에테르 및 시클로덱스트린을 결합하도록 하는 여러가지의 루트를 이 기술분야의 기술자에 의해 이용할 수 있다.

참고문헌으로는 다음의 문헌을 예시할 수 있다;

Meares et al.,"Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides." In,MODIFICATION OF PROTEINS:FOOD,NUTRITIONAL,AND

PHARMACOLOGICAL ASPECTS;" Feeney,et al.,Eds.,American Chemical Society, Washington,D.C.,1982,pp.370-387;Kasina et al.,Bioconjugate Chem.,9:108-117(1998);

Song et al.,Bioconjugate Chem.,8:249-255(1997).

여기서 사용되는 "의약적으로 허용할 수 있는 캐리어" 에는 콘주게이트와 배합할 때 콘주게이트의 활성을 가지며 피검자의 면역계와 비반응성인 기재를 포함한다.

예로는 포스페이트 버퍼식염용액, 물, 오일/물에멀젼 등 에멀젼 및 여러가지 타입의 습윤제 등의 일반 의약용 캐리어를 포함하나 한정된 것은 아니다.

다른 캐리어에는 또 멸균용액, 코팅정제를 포함하는 정제와 캡슐을 포함한 다. 주로 이와같은 캐리어에는 전분, 밀크, 당, 일정한 타입의 클레이(점토)등 부형제, 젤라틴, 스테아린산 또는 그염, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 탈크, 식물성유지, 검, 글리콜 또는 기타 공지된 부형제를 포함한다.

이와같은 캐리어에는 또 플라보(flavor)와 칼라첨가제 또는 기타성분을 포함한다.

이와같은 캐리어로 이루어진 조성물은 잘 알려진 통상의 방법에 의해 조제한다.

여기에 사용되는 용어 "투여" 은 피검자에 경구투여, 흡입, 좌약투여, 국부접촉투여, 정맥내투여, 복강내투여, 근육내투여, 병소내투여, 비강내 또는 피하투여, 또는 서방디바이스(slow-release device), 즉 소형삼투압 펌프의 이식하는 것을 말한다.

어느 경로에 의한 투여에는 비경구투여와 경점액(transmucosal)투여(즉, 입,코, 질(Vaginal), 직장, 또는 경피)를 포함한다.

비경구투여에는 즉 정맥내투여, 근육내투여, 세동맥내투여, 피부내투여, 피하투여, 복강내투여, 심실내투여 및 두개내(intracranial)투여가 있다.

더욱이, 종양치료, 즉 아폽토시스(apoptosis)유발을 위하여 주사할 경우 종양 및/또는 그 종양을 둘러싼 조직내에 직접 투여한다.

투여의 다른 형식(mode)에는 리포솜제제, 정맥내주입, 경피패치 등의 사용이 포함된다.

용어 "분리" 는 재료를 생성하는데 사용되는 성분에서 주로 또는 거의 유리 된 재료를 말한다.

이 발명의 펩티드 콘주게이트에서, 용어 "분리" 는 펩티드 콘주게이트를 조제 하는데 사용된 혼합물 중의 재료를 정상적으로 수반하는 성분에서 거의 또는 주로 유리되는 재료를 말한다.

"분리" 와 "순수(순도)" 는 혼용하여 사용한다.

주로, 이 발명의 분리된 펩티드콘주게이트는 하나의 범위로서 바람직하게 나타낸 순도레벨을 가진다.

그 펩티드콘주게이트의 순도범위의 하한단은 약 60%, 약 70% 또는 약 80% 이고, 순도범위의 상한단은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.

그 펩티드콘주게이트가 순도 약 90% 이상인 경우, 이들의 순도는 또 범위로서 바람직하게 나타낸다.

순도범위의 하한단이 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98% 이다.

순도범위의 상한단은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%이다.

순도는 종래기술에서 인식되는 분석방법(즉, 은염색겔, 폴리아크릴아미드겔 영동, HPLC 또는 동일수단)에 의해 결정한다.

여기서 사용되는 집단(Population)의 주요한 각 멤버는 이 발명의 펩티드콘주게이트의 집단 특징을 설명한 것으로, 펩티드에 부가한 선택 %의 수식당을 그 펩티드상에서 다중의 동일한 악셉터 부위에 부가한다.

"그 집단의 주요한 막멤버" 는 수식당에 접합된 펩티드상에서 부위의 "상동성" 을 말하며,

이 발명의 콘주게이트를 말한다.

이들의 콘주게이트는 최소 약 80% 가 상동성이며, 바람직하게는 최소 약 90% 가 상동성이고, 더 바람직하게는 최소 약 95% 가 상동성이다.

"상동성" 은 그 수식당이 접합된 한 집단의 악셉터 성분에 대하여 구조적인 일치를 말한다.

따라서, 이 발명의 펩티드콘주게이트에서, 각각의 수식당 성분이 모든 다른 수식당이 접합된 악셉터 부위와 동일한 구조를가진 악섭터 부위에 접합되어 있어, 그 펩티드콘주게이트는 약 100%의 상동성이 있는 것이라고 말할 수 있다.

상동성은 주로 범위로서 나타낸다.

그 펩티드콘주게이트의 상동성 범위 하한단(lower end)은 약 60%, 약 70% 또는 약 80% 이고, 순도범위의 상한단(upper end)은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 90% 이상이다.

그 펩티드콘주게이트가 약 90% 의 상동성 또는 그 이상일 경우, 이들의 상동성은 범위로서 바람직하게 나타낸 것이다. 상동성의 범위의 하한단은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98% 이다.

순도범위의 상한단은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100% 의 상동성이다.

글리코펩티드 종을 말할때 "거의 균일한 글리코폼"(glycoform) 또는 "거의 균일한 글리코실화패턴" 은 관심있는 글리코실전이효소(즉, 푸코실전이효소)에 의해 글리코실화 된 아셉터 성분% 를 말한다.

예로서, α 1,2 푸코실전이효소의 경우,

거의 균일한 푸코실화 패턴은 Galβ1,4-GlcNAc-R 및 그 시알화 동족체의 거의 대부분(아래에서 정의한 바와 같이)이 이 발명의 펩티드콘주게이트에서 푸코실화 할 때 존재한다.

그 출발재에는 글리코실화된 악셉터 성분(즉, 푸코실화된 Galβ1,4-GlcNAc-R 성분)을 포함할 수 있다는 것은 이 분야 기술자에 의해 알 수 있다.

따라서, 그 계산 %의 글리코실화에는 이 발명의 방법에 의해 글리코실화한 악셉터 성분과, 그 출발재에서 이미 글리코실화된 악셉터 성분을 포함한다.

"거의 균일한" 의 상기 정의에서 "거의" 라는 용어는 소정의 글리코실전이효소의 악셉터 성분 최소 약 40%, 최소 약 70%, 최소 약 80%, 또는 바람직하게는 최소 약 90%와, 더 바람직하게는 최소약 95% 가 글리코실화 되는 것을 의미한다.

이 발명의 다른목적, 관련된 발명과 이점은 다음의 구체적 설명에서 알 수 있다.

약어

PEG는 폴리(에틸렌글리콜)을 표시하고;

m-PEG는 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)을 표시하며;

PPG는 폴리(프로필렌글리콜)을 표시하고,

m-PPG는 메톡시-폴리(프로필렌글리콜)을 표시하며;

Fuc는 푸코실을 표시하고;

Gal은 갈락토실을 표시하며;

GalNAc는 N-아세틸갈락토사미닐을 표시하고;

Glc는 글루코실을 표시하며;

GlcNAc는 N-아세틸글루코사미닐을 표시하고;

Man은 만노실을 표시하며;

ManAc는 만노사미닐아세테이트를 표시하고;

Sia는 시알산을 표시하며;

NeuAc는 N-아세틸뉴라미닐을 표시한다.

개요

이 발명은 치료목적으로 사용된 재조합 인간성장호르몬의 효과를 향상시키기 위하여, 자연발생하는 인간성장호르몬에 존재하지 않은 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위를 함유한 인간성장호르몬의 유전공학변이체를 제공한다.

이들의 hGH변이체는 실질적으로 그 야생형 인간성장호르몬의 생물학적 활성을 갖고 있어, 새로 도입한 글리코실화 부위가 그 재조합 생성된 hGH 변이체를 여러가지의 패턴으로 글리코실화 하도록 한다.

더욱이, 그 비자연글리코실화 부위는 그 펩티드에 수식그룹을 접합하는 부위, 즉 글리코접합(glycoconjugation)에 의한 부위를 제공한다.

하나의 예로서 수식 그룹에는 폴리(에틸렌글리콜), 즉 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)등 수용성 폴리머가 있다.

상기 hGH 변이체의 수식은 환자의 혈행(血行)에서 재조합 hGH의 안정성과 보유시간을 개선할 수 있고, 이들의 항원성을 감소하며 치료가 필요할 때 특정조직의 표적능을 높일 수 있다.

변이체

이 발명은 야생형펩티드에서 확인되지 않은 1개 이상의 O-또는 N-결합글리코실화 부위를 포함하는 hGH의 변이체를 제공한다.

이들의 변이체를 야생형 펩티드에서 정상으로 글리코실화가 되지 않거나, 빈약하게 글리코실화 되는 1개 이상의 부위에서 효소에 의한 글리코실화할 수 있는 기재이다.

따라서, 상기 변이체는 글리코실잔기 또는 글리코실결합기의 위치를 특정지게 처리하여 소정의 선택 특성을 가진 펩티드를 얻도록 한다.

글리코실잔기 또는 글리코실결합기의 위치와 수 이외에,

본 발명의 변이체와 방법을 사용하여 변경시킬 수 있는 다른 특성으로는 약물동태학, 약역학, 단백질분해저향력, 면역원성, 망상내피계에 의한 인식, 조직분포 등이 있다.

따라서, 첫째로, 이 발명은 변이 인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 분리된 핵산을 제공한다.

상기 변이 인간성장호르몬은 그 상응하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않는 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위로 이루어진다.

일부예에서, 그 상응하는 야생형 인간 성장호르몬은 아미노산서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 가진다.

일부 바람직한 예에서, 상기 변이인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어진다.

둘째로, 이 발명은 변이인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클로티드 서열을 포함하는 핵산, 즉 분리된 핵산으로 이루어진 발현카세트 또는 세포를 제공한다.

그 변이 인간성장호르몬에는 그 상응하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않은 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위를 포함한다.

셋째로, 이 발명은 그 상응하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 아니한 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위를 포함하는 변이 인간성장호르몬을 제공한다.

일부예에서, 그 상응하는 야생형 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 가진다.

일부 바람직한 예에서 그 변이인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:2,3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어진다.

넷째로, 이 발명은 그 상응하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 아니한 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위를 포함하는 변이 인간성장호르몬을 생성하는 방법을 제조한다.

이 방법은 상기 변이인간성장호르몬을 재조합 생성하는 스텝과,새로운 글리코실화 부위에서 상기 변이인간성장호르몬을 글리코실화 하는 스텝으로 이루어진다.

일부예에서, 그 상응하는 야생형 인간성장호르몬은 아미노산서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 가진다.

일부 바람직한 예에서, 그 변이 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어진다.

hGH 코딩서열의 획득

일반재조합기술

이 발명은 재조합 유전자의 기술 분야에서 상용기술에 의한 것이다.

이 발명에서 사용할 수 있는 일반적인 방법을 기재한 기본참고문헌으로는 다음 문헌이 있다:

Sambrook 및 Russell, Molecular Cloning,

A Laboratory Manual(3rd ed. 2001);

Kriegier, Gene Transfer and Expressin ;

A Laboratory Manual(1990) ; 및

Ausubel 등, eds. Current proto cols in Molecular Biology(1994).

핵산에 있어서, 크기는 킬로베이스(kb)또는 염기쌍(bp) 으로 나타낸다.

그 크기는 아가로스 또는 아크릴아마이드 겔 전기영동, 서열결정된 핵산 또는 발표된 DNA 서열에서 유도된 추정치이다.

단백질에 있어서, 크기는 킬로달톤(kDa) 또는 아미노산잔기수로 나타낸다. 단백질 크기는 겔 전기영동, 서열결정된 단백질, 유도된 아미노산 서열 또는 발표 된 단백질 서열에서의 추정치이다.

상품으로 이용할 수 없는 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성할 수 있다. 즉 참고문헌(Van Devanter 등, Nucleic Acids Res. 12:6159-6168(1984))에서 기재되어 있는 바와 같이 자동 합성기를 사용하여 고상포스포르아미다이트트리에스테르방법(참고문헌에 의해 초기에 기재된 방법:Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862(1981))에 의해 화학적으로 합성할 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 공지된 기술, 즉 참고문헌(Peason & Reanier, J. Chrom, 255:137-149(1983)에 기재된 미변성 아크릴마이드겔 전기영동법 또는 아니온-교환 HPLC를 사용하여 정제한다.

클로닝된 야생형 인간성장호르몬 유전자, 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 변이인간성장호르몬 및 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 클로닝 사용후, 즉 참고문헌(Wallace 등, Gene 16:21-26(1981))의 이중가닥 주형을 서열결정하는 사슬종지법을 사용하여 수식할 수 있다.

야생형 hGH 코딩서열의 클로닝 및 서브클로닝

야생형인간성장호르몬은 코딩하는 다수의 폴리뉴클레오티드 서열, 즉, GenBank Accession NOs. NM000515, NM002059, NM022556, NM022557, NM022558, NM022559, NM022560, NM022561 및 NM022562가 결정되어 공급업자로 부터 취득할 수 있다.

인간게놈 연구의 급속한 진보로 클로닝 접근이 가능하게 되어, 사전에 동정 된 인간성장호르몬을 코딩하는 서열 등, 공지된 뉴클레오티드 서열의 소정 % 의 서열 상동성을 가진 유전자 세그멘트에 대하여 인간 DNA 서열 데이타베이스를 탐색할 수 있다.

이와 같이 동정된 DNA 서열은 그 다음으로 중복확장방법(overlap extention method)등 화학적 합성 및/또는 PCR(중합효소연쇄반응)기술에 의해 취득할 수 있다.

길이가 짧은 서열에 대해서는 완전히 새로운 합성으로 충분하다.

이에 대하여, 합성 프로브를 사용하여 인간 cDNA 또는 게놈라이브러리(genomic library)에서 서열을 코딩하는 전장(full length)분리는 큰유전자를 취득하는데 필요하다.

또, 인간성장호르몬을 코딩하는 핵산서열은 중합효소연쇄반응(PCR)등 표준클로닝 기술을 사용하여 인간 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 분리할 수 있고, 여기서 상동성 기재 프라이머는 인간성장호르몬을 코딩하는 공지의 핵산서열에서 자주 유도할 수 있다.

여기서 대부분 공통적으로 사용되는 기술은 표준참고문헌(Sambrook 및 Russell, 상기문헌참조)에 기재되어 있다.

야생형 인간성장호르몬의 코딩하는 서열을 얻는데 적합한 cDNA 라이브러리 상품으로 얻거나 구성할 수 있다.

mRNA의 분리, 역전사에 의한 cDNA의 생성, 재조합 벡터에 cDNA의 결합, 증식을 위한 재조합 숙주로의 이입(transfecting), 스크리닝 및 클로닝에 대한 일반적 인 방법은 공지된 것이다(Gubler 및 Hoffman, Gene, 25:263-269(1983); Ausubel 등, 상기문헌참조).

뉴클레오티드 서열의 증폭서열을 PCR에 의해 얻을 때, 그 세그멘트는 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리에서 야생형 인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전장서열을 분리할 수 있다.

적합한 처리과정에 대한 일반적인 설명은 참고문헌(Sambrook 및 Russell, 상기문헌참조)에 기재되어 있다.

동일한 처리절차에 따라 인간게놈 라이브러리에서 야생형 인간성장호르몬을 코딩하는 전장서열, 즉 위에서 설명한 GenBank Accession Nos 중 어느하나를 얻을 수 있다.

인간게놈라이브러리는 상품으로 입수하거나 여러가지의 공지된 종래기술의 방법에 의해 구성할 수 있다.

일반적으로, 게놈라이브러리를 구성하기 위하여 그 DNA는 우선 인간성장호르몬이 동일하게 확인되는 조직에서 추출하고, 그 다음 기계적으로 전단(Shear)하거나 효소에 의해 분해하여 길이 약 12 ~ 20kb의 프라그멘트를 얻는다.

그 다음으로, 그 프라그멘트는 크기가 바람직하지 않은 폴리뉴클레오티드 프라그멘트에서 경사원심분리에 의해 분리하여 박테리오파아지 入 벡터에 삽입한다.

이들의 벡터와 파아지는 생체에 충전(packaging)한다.

재조합파아지는 참고문헌(Benton 및Davis, science, 196:180~182(1977))에서 설명한 바와 같이 플라크 하이브리디제이션(Plaque hybridization)에 의해 분석한 다.

클로니하이브리디제이션(colony hybridization)은 참고문헌(Grunstein 등, proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:3961-3965(1975))에서 설명한 바와같이 실시한다.

서열상동성을 기준으로, 변성된 올리고뉴클레오티드는 프라이머세트(primer sets)로 구성할 수 있고, PCR은 적합한 조건하에서 실시하여(White 등, PCR Protocols:Current Methods and Applications,1993; Griffin 및 Griffin, PCR Technology, CRC Press Inc.1994) cDNA 또는 게놈라이브러리에서 뉴클레오티드 서열의 세그멘트를 증폭할 수 있다.

프로브로서 증폭된 세그멘트를 사용하여, 야생형 인간성장호르몬을 코딩하는 전장의 핵산을 얻는다.

야생형인간성장호르몬을 코딩하는 핵산서열을 얻을때, 그 코딩하는 서열은 벡터, 예로서 발현벡터에 섭클로닝되어, 재조합 야생형인간성장호르몬은 그 결과 얻어진 구조물에서 생성할 수 있다.

그 다음, 그 야생형 인간성장호르몬코딩서열의 수식, 즉 뉴클레오티드 치환을 하여 그 분자의 특성을 변화시킬 수 있다.

hGH 서열에서의 도입변이

코딩한 폴리뉴클레오티드 서열에서 인간성장호르몬의 아미노산 서열, 즉 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 결정할 수 있다.

그 다음으로, 그 아미노산 서열은 수식하여 아미노산 서열의 여러가지의 위 치에서 추가로 글리코실화 부위를 도입함으로써 단백질의 글리코실화 패턴을 변경할 수 있다.

몇가지 타입의 단백질 글리코실화 부위는 이 기술에서 공지되었다. 예로서, 진핵생물에서 N-결합글리코실화가 공통서열 Asn-Xaa-Ser/Thr 의 아스파라긴에서 발생한다.

여기서, Xaa는 플로린을 제외한 아미노산이다.

참고문헌으로 다음의 문헌을 예시할 수 있다:

kornfield 등, Ann.Rev.Biochem.54:631-664(1985);

kukuruzinska 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2145-2149(1987);

Herscovies 등, FASEB J7:540-550(1996):

Orlean, Saccharomyces Vol.3(1996).

O-결합글리코실화는 세린 또는 트레오닌 잔기에서 발생한다(Tanner 등, Biochem. BioPhys.Acta. 906: 81-91(1987); Hounsell 등, Glycoconj. J.13:19-26(1996)).

다른 글리코실화 패턴은 그 단백질의 카르복실-말단카르복실기에 글리코실포스페이티딜리노시톨을 결합하여 형성한다(Takeda 등, Trends Biochem. Sci,20:367-371(1996); Udenfriend 등, Ann. Rev. Biochem. 64:593-591(1995)).

따라서, 이 정보지식을 기초로 하여, 적합한 변이를 야생형 인간성장 호르몬 서열에 도입함으로써 새로운 글리코실화 부위를 형성할 수 있다.

인간성장호르몬의 폴리펩티드 서열내에서 아미노산잔기의 직접 수식이 새로 운 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위를 도입하는데 적합하나,

인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 변이함으로써 새로운 글리코실화 부위의 도입을 더 자주 얻는다.

이것은 공지된 변이유발방법중 어느 방법을 사용하여도 얻을 수 있으며, 그 방법중 일부를 아래에서 설명한다.

인간성장호르몬의 대표적 예의 수식에는 SEQ IDNO:3 또는 SEQ IDNO:4 에서 설명한 수식이 있다.

여러가지의 변이발생 프로토콜이 이 기술분야에서 제정되어 기술내용을 설명하였다 (Zhang 등, Proc Natl. Acod. Sci. USA,94:4504-4509(1997); Stemmor, Nature, 370:389-391(1994)).

그 처리절차는 개별적으로 또는 조합하여 사용되어 다수의 핵산의 변이체 즉, 코딩된 폴리펩티드의 변이체를 생성할 수 있다.

변이발생 키트(kits), 라이브러리 구성물 및 다른 다양성 발생방법을 이용할 수 있다.

다양성(diversity)변이유발 방법에는 예로서 부위특이적 변이유발(site-directed mutagenesis)Botstein 및 Shortle, Science, 229:1193-1201(1985), uracil 함유주형을 사용하는 변이유발(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492(1985)), 올리고뉴클레오티드 특이적 변이유발(Zoller 및 Smith, Nacl. Acids Res. 10:6487-6500(1982)), 포소포로티오에이트-수식DNA 변이유발(Taylor 등, Nacl. Acids Res., 13:8749-8764 및 8765-8787(1985)) 및 간격을 둔 2중 DNA 를 사용하는 변이유발(kramer 등, Nacl.Acids Res. 12:9441-9456(1984)) 이 있다.

다른 기능성 있는 변이유발방법에는 점부적정수복(point mismatch repair)(kramer 등, Cell, 38:879-887(1984)), 수복-결실 숙주주를 사용하는 변이유발(Carter 등, Nucl. Acids Res., B:4431.4443(1985)),

결실변이유발(Eghtedarzad도 및 Henikoff, Nucl. Acids. Res., 14:5115(1986), 제한-선택 및 제한-정제(weils 등, Phil. Trans. R. Soc. Land. A, 317:415-423(1986),총유전자 합성에 의한 변이유발(Nambiar 등, Science, 223:1299-1301(1984)), 이중가닥절단수복(Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181(1986)), 폴리뉴클레오티드 연쇄정지방법에 의한 변이유발(USP5,965,408)및 오류가 많은 PCR(Leung 등, Biotechniques, 1:11-15(1989))이 있다.

숙주균의 바람직한 코돈사용에 대한 핵산의 수식

변이인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 변경하여 소정의 숙주의 바람직한 코돈사용과 일치시킬 수 있다.

예로서, 세균세포의 하나 균주의 바람직한 코돈사용을 하여 이 발명의 변이인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유도할 수 있고, 이 코돈사용에는 이 균주에 의한 코돈이 포함되어 있다.

숙주세포에 의해 나타낸 바람직한 코돈사용의 빈도(frequency)는 그 숙주세포에 의해 발현된 다수의 유전자에서 바람직한 코돈사용의 빈도를 평균하여 계산할 수 있다(즉, 계산방법은 일본카즈사 DNA 연구소의 웹사이트를 이용하여 도움을 받을 수 있다).

이 분석은 숙주세포에 의해 고도로 발현된 유전자로 한정하는 것이 바람직하다.

예로서, 특허문헌 USP5,824,864 명세서에서는 고도로 발현된 유전자(디코틸도너스식물과 모노코틸도너스식물에서 나타낸 유전자)에 의해 코돈사용의 빈도에 대하여 기재되어 있다.

상기 변이 인간성장호르몬을 코딩하는 서열은 수식(modification)이 완료될 때 서열결정에 의해 검증되고, 그 다음 그 서열은 야생형 인간성장 호르몬에서 동일하게 재조합생성을 하고 적절한 발현벡터에 섭클로닝 된다.

변이 hGH 의 발현 및 정제

이 발명의 변이인간성장호르몬은 서열검증에 이어, 재조합유전학 분야에서 통상적인 기술을 사용하여 여기서 설명한 폴리펩티드로 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 생성할 수 있다.

발현시스템

이 발명의 변이 인간성장호르몬을 코딩하는 핵산의 레벨이 높은 발현을 얻기 위하여, 변이인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 직접 전사, 전사/번역 터미네이터 및 번역개시를 위한 리보솜사이트에 강한 프로모터를 함유한 발현백터 에 주로 섭클로닝을 한다.

적합한 세균 프로모터는 이 기술에서 잘 알려진 것으로, 참고문헌(Sambrook 및 Russell, 상기문헌참조) Ausubel 등, 상기문헌참조)에 기재되어 있다.

그 야생형 또는 변이인간성장호르몬을 발현하는 세균발현시스템은 E Coli, Bacllus sp. Salmonella 및 Caulobactu 에서 얻을 수 있다.

이와같은 발현시스템의 키트(Kits)는 시중에서 얻을 수 있다.

포유동물세포, 효모 및 곤충세포의 진핵발현시스템은 이 분야에서 잘 알려진 것으로, 역시 시중에서 얻을 수 있다.

하나의 예로서 그 진핵발현벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련벡터 또는 레트로바이러스 벡터가 있다.

이종핵산의 직접발현에 사용된 프로모터는 소정의 응용에 따라 좌우된다.

그 프로모터는 자연위치 설정(natural Setting)의 전사개시 위치에서와 같이 이종 전사개시 위치에서 동일한 거리 주위에 선택적으로 위치시킨다.

그러나, 이 기술에서 공지된 바와 같이 이 거리에서의 일부변이는 프로모터 기능의 손실없이 수용할 수 있다.

상기 프로모터 이외에, 그 발현벡터에는 숙주세포에서 변이인간성장호르몬의 발현에 필요로 하는 전추가요소를 포함하는 전사유닛 또는 발현카세트가 주로 있다.

이와같이, 주요한 발현카세트에는 상기 변이인간성장호르몬을 코딩하는 핵산서열에 작동할 수 있게 결합된 모로모터와 전사, 리보솜결합 위치 및 변역종결의 유효한 폴리아데닐화에 필요로 하는 신호가 포함한다.

그 인간성장호르몬을 코딩하는 핵산서열은 절단할 수 있는 신호펩티드 서열에 주로결합하여 형질전환된 세포에 의해 인간성장호르몬의 분비를 촉진한다.

이와같은 신호 펩티드에는 다른 신호펩티드 중에서 조직 플라스미노겐 활성인자, 인슐린, 뉴론성장인자 및 헬리오티스 비레스센스(Heliothis virescens)의 유연성 호르몬에스테라아제의 신호 펩티드를 포함한다.

상기 카세트의 추가 요소에는 촉진제(enhancers)와, 게놈 DNA가 구조 유전자로 사용될 경우 기능성 스플라이싱 도너(donor)와 악셉터 부위를 가진 인트론을 포함한다.

프로모터 서열 이외에, 또 상기 발현카세트에는 상기 구조 유전자의 하류에서 전사종결영역을 포함하여 유효한 종결을 제공한다.

그 종결영역은 상기 프로모터 서열과 동일한 유전자에서 얻을 수 있거나 다른 유전자에서 얻을 수 있다.

세포에 유전정보를 수송하는데 사용된 소정의 발현 벡터는 특히 중요하지 않다.

진핵세포 또는 원핵세포에서 발현에 사용된 통상의 벡터중 어느 것이라도 사용할 수 있다.

일반 세균발현벡터에는 pBR322의 플라스미드, pSKF, pET23D 등의 플라스미드와, GST 및 LacZ 등의 융합발현시스템을 포함한다.

또, 에피톱태그(epitope tags)를 제조합 단백질에 부가하여 간단한 분리방 법, 즉 c-myc를 제공한다.

진핵바이러스의 조절요소를 포함하는 발현벡터에는 진핵 발현벡터, 즉 SV40 벡터, 파필로마(papilloma)바이러스 벡터와 에프스테인-바르바이러스(Epstein-Barr Virus)에서 유도된 벡터에서 주로 사용된다.

다른예의 진핵벡터에는 pMSG;pAv009/A;pMTO10/A;pMAMeo-5;바쿨로바이러스(baculovirus)pDSVE; 및 SV40 초기 프로모터, SV40 후기프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein)프로모터, 마우스유암 바이러스프로모터,라우스육종바이러스, 폴리헤드린프로모터, 또는 진핵세포에서 발현에 유효하게 나타낸 기타 프로모터에 의해 단백질을 발현하도록 하는 다른 벡터를 포함한다.

일부발현시스템은 티미딘카나아제, 히그로마이신B 포스포전이효소 및 디히드로플레이트 환원효소 등 유전자 증폭을 제공하는 표지(markers)를 가진다.

또, 곤충세포에서 바클로바이러스벡터 등 유전자 증폭을 포함하지 않는 수율이 높은 발현시스템은 폴리헤드린프로모터 또는 기타 강한 바쿨로바이러스프로모터에 의한 상기변이인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드서열에 적합하다.

또, 발현벡테어 주로 포함하는 요소에는 E. coli에서 기능적 작용을 하는 레플리콘(repicon), 재조합 플라스미드를 가진 박테리아를 선택하도록 항생물질 내성을 코딩한 유전자, 진핵 서열을 삽입하도록, 상기 플라스미드의 비필수영역에서의 유닉제한부위(unique restriction site)를 포함한다.

선택한 소정의 항생물질 내성을 가진 유전자는 중요하지 않으며, 이 기술에서 공지된 다수의 내성 유전자 중 어느 것이라도 적합하다.

상기 원핵서열은 필요할 경우, 진핵세포에서 DNA의 복제와 간섭하지 않도록 선택한다.

항생물질 내성을 가진 선택마커(markers)와 동일하게, 공지된 대사성경로상에서의 대사성 선택마커를 또 형질전환된 숙수세포를 선택하는 수단으로 사용할 수 있다.

재조합단백질(즉, 이발명의 hGH 변이)의 주변플라즘(주변세포질)발현이 필요할 경우, 그 발현백터는 E.coliOppA(주변플라즘성 올리고펩티드 결합 단백질)분비 신호 또는 그 수식버전(modified version)등 분비신호를 코딩하는 서열로 이루어지며, 그 수식버전은 발현되는 단백질의 그 코딩서열의 5'에 직접 연결된다.

이 신호서열은 주변플라즘 공간내 세포막을 통해 세포질내에서 생성되는 재조합 단백질로 지향한다.

그 발현벡터는 그 재조합단백질이 주변 플라즘 공간내에 들어올때 그 신호서열을 효소에 의해 절단할 수 있는 신호펩티드 1의 코딩서열을 추가로 구성할 수 있다.

재조합 단백질의 주변 플라즘 생성에 대한 더 구체적인 설명은 참고문헌(Gray 등, Gene 39:247-254(1985);USP6,160,089 및6,436,674)에 기재되어 있다.

위에서 설명한 바와 같이, 이 분야 기술에서 통상의 기술자는 여러가지의 보존적 치환을 야생형 또는 변이인간성장호르몬 또는 그 코딩서열에 대하여 실시할 수 있으나, 그 인간성장호르몬의 생물학적 활성을 아직도 가진다는 것으로 이해할 것이다.

더욱이, 폴리뉴클레오티드 코딩서열의 수식을 실시하여, 그 결과 얻어진 아미노산 서열의 수식없이 소정의 발현 숙주에서 바람직한 코돈의 사용을 수용할 수 있다.

트랜스펙션(transfection)방법

일반적인 트랜스펙션 방법을 사용하여 다량의 변이인간성장호르몬을 발현하는 박테리아, 포유동물, 효소, 곤충 또는 식물의 세포를 생성하며, 그 다음 일반기술을 사용하여 정제한다(참고문헌:Colley 등, J.Biol. Chem. 264:17619-17622(1989); Guide to protein purification,in methods in Enzymology, Vol.182(Deutscher,ed.1990).

진핵세포 및 원핵세포의 형질전환은 일반기술에 의해 실시한다(Morrison, J. Bact. 132:349-351(1977);Clark-curtiss & curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362(wu 등, eds,(1983))

외래뉴클레오티드 서열은 숙주세포에 도입하는 공지된 방법중 어느 방법이라도 사용할 수 있다.

이들의 방법에는 칼슘 포스테이트 트랜스펙션, 폴리브렌(polybrene), 원형질체융합, 이렉트로포레이션(electroporation) 리포솜, 마이크로인젝션(microinjection), 플라즈마벡터, 바이러스벡터의 사용과, 숙주세포에 클로닝된 게놈DNA, cDNA, 합성DNA, 또는 다른 외래 유전재료를 도입하는 기타 공지된 방법을 포함한다(Sambrook 및 Russel, 상기 참고문헌 참조).

사용한 소정의 유전공학처리방법은 변이 인간성장호르몬을 발현할 수 있는 숙주세포에 최소 하나의 유전자를 계속 도입할 수 있도록 하는 것만 필요하다.

숙주세포에서 변이 hGH 의 발현 검출

상기 발현벡터를 적절한 숙주세포에 도입한 후에,

트랜스펙트된(transfected)세포를 그 변이 인간성장호르몬의 발현이 바람직한 조건하에서 배양한다. 그 다음, 그 세포를 재조합 폴리펩타드의 발현을 위해 스크리닝(screening)하고, 이어서 일반기술을 사용하여 그 배양물에서 회수 한다.

(Scopes, Protein Purification:Principles and Practice(1982);USP 4,673,641;Ausubel 등, 상기문헌참조;Sambrook 및 Russell, 상기문헌참조).

유전자 발현을 검색하는 수종의 일반방법은 이 분야의 기술자에 의해 공지되었다.

첫째로, 유전자 발현은 핵산레벨에서 검색할 수 있다.

핵산 혼성화 기술을 사용하여 소정의 DNA 및 RNA를 측정하는 여러가지의 방법이 통상적으로 사용된다(즉, Sambrook 및 Russell, 상기 기술문헌 참조).

일부방법에는 전기영동분리(즉, DNA를 검출하는 사우선 블롯법 및 RNA를 검출하는 노우선 블롯법)가 포함되나, DNA 또는 RNA의 검출은 전기영동 없이 실시할 수 있다.(돗블롯에 의함 등).

트랜스펙트된 세포에서 변이인간성장호르몬을 코딩하는 핵산의 존재는 서열이 특정된 프라이머를 사용하여 PCR 또는 RT-PCR에 의해 검출할 수 있다.

둘째로, 유전자 발현은 폴리펩티드 레벨에서 검출할 수 있다. 여러가지의 면역아세이를 통상적으로 이 분야기술자에 의해 사용하여 유전자 생성물의 레벨을 측정한다. 특히 아미노산서열 SEQ IDNO:3,4 또는 5를 가진 폴리펩티드등 이 발명의 변이인간성장호르몬과 특정지게 반응하는 폴리클론 또는 모노클론 항체를 사용하여 특히 측정한다(Harlow 및 Lane,Antibodies, A Laboratory Marual, Chapter14, Cold Spring Harbor,1998; Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495-497(1975)참조).

이와같은 기술은 변이인간성장호르몬에 대한 특이성이 높은 항체 또는 그 항원부분을 선택하여 항체를 만드는데 필요하다.

폴리클론항체 및 모노클론항체의 증가 방법이 설정되어 이들의 설명은 다음의 기술문헌에서 기재되어 있다(Harlow 및 Lane, 상기문헌참조;Kohler 및Milstein, Eur.J.Immunol., 6:511-519(1976)).

본 발명의 변이 인간성장호르몬에 대한 항체를 만들어 변이인간성장호르몬을 검출하는 면역아세이를 실시하는 더 구체적인 설명은 다음의 섹션에서 기재한다.

재조합에 의해 생성된 변이 hGH 의 정제

트랜스펙트된 숙주세포에서 재조합변이 인간성장호르몬의 발현이 일단 확인되면, 그 다음 그 숙주세포는 그 재조합 폴리펩티드를 정제할 목적으로 적절한 규모에서 배양한다.

박테리아에서 재조합에 의해 생성된 변이 hGH 의 정제

이 발명의 변이인간성장호르몬이 주로 프로모터 유도후 다량의 형질전환된 박테리아에 의해 재조합 생성될 때, 발현을 구성할 수 있으나 그 단백질은 불용성 응집물을 형성할 수 있다. 단백질 봉입체의 정제에 적합한 수종의 프로토콜이 있다.

예로서, 응집단백질(아래에서는 봉입체라함)의 정제에는 박테리아 세포의 파괴, 즉 라이소자임 1㎖ 당 약 100~150㎍ 와 0.1% NonidetP40 의 버퍼에서의 인큐베이션에 의한 봉입체의 추출, 분리 및/또는 정제와 비이온 세제를 주로 포함한다.

폴리트론 그라인더(Polytron grinder)(Brolkman Instruments, Westbury, NY)를 사용하여 그 세포 현탁액을 분해할 수 있다.

또, 세포를 얼음(ice)상에서 음파 처리할 수 있다.

박테리아를 용해하는 다른 방법은 참고문헌(Ausabel 등과, Sambrook 및 Russell; 상기 참고문헌 참조)에 기재되어 있으며, 이 분야의 기술자에 의해 이해할 수 있다.

세포 현탁액은 일반적으로 원심분리하여 그 봉입체 함유 펠릿을 버퍼중에서 재현탁한다. 여기서 그 버퍼는 용해하지 않으나 그 봉입체를 세척한다

즉, 버퍼 20mMTris-HCl(pH7.2), 1mMEDTA, 150mM NaCl 및 2% Triton-X100은 비이온세제로서 그 봉입체를 세척한다.

가급적 많은 세포성 단편을 제거하는 세척스텝을 반복하는 것이 필요하다.

그 봉입체의 잔류펠릿은 적절한 버퍼(즉, 20mM 소듐포스페이트, PH6.8., 150mM Nacl)중에서 재현탁 할 수 있다.

다른 적절한 버퍼는 이 기술분야의 기술자에 의해 이해할 수 있다.

세척공정 다음에, 그 봉입체를 강한수소 수용체와 강한 수소도너(또는 이들의 성질 하나를 각각 가진 용제의 배합물)인 용제를 첨가하여 가용화 한다.

그 다음, 그 봉입체를 형성한 단백질은 혼화성 버퍼로 희석 또는 투석(dialysis)에 의해 복원할 수 있다.

적합한 용제에는 우레아(약 4M ~ 약 8M), 포름아미드(최소 약 8%, vol/vol 기준) 및 구아니딘히드로클로라이드 (약 4M ~ 약 8M)를 포함하며, 한정된 것은 아니다.

SDS(소듐도데실술페이트)및 70% 포름산등 응집물 형성 단백질을 가용화 할 수 있는 일부용제는 면역원성 및/또는 활성의 결여에 따라 수반되는 단백질의 비가역성 복원가능성으로 인하여 이 처리공정에서 사용에 적합하지 않다.

구아니딘히드로클로라이드와 그와 동일한 처리제가 변성제이나, 이 변성은 비가역성이 아니며 복원은 변성제의 제거(예로서 투석에 의해)또는 희석에 따라 발생하여, 관심을 가진 그 면역원성 및/또는 생물학적 활성이 있는 단백질을 재형성하도록 한다.

가용화 후, 그 단백질은 일반분리기술에 의해 다른 박테리아 단백질에서 분리할 수 있다.

박테리아 봉입체에서 재조합 인간성장 호르몬의 정제에 대한 더 구체적 설명은 다음 문헌을 참조할 수 있다(Patra 등, protein Expression and purifigrion 18:182~190(2000)).

또, 재조합폴리펩티드, 즉 변이인간성장호르몬을 박테리아 주변폴라솜에서 정제할 수 있다.

그 재조합 단백질을 그 박테리아의 주변 플라솜에 도입할 때 그 박테리아의 주변플라솜 프랙션은 이 분야 기술자에 의해 공지된 다른기술 이외에 한냉 삼투압 쇼크에 의해 분리할 수 있다(Ausubel 등, 상기 인용참고문헌).

그 주변 플라솜에서 재조합 단백질을 분리하기 위하여,

그 박테리아 세포를 원심분리하여 펠릿을 형성한다.

그 펠릿을 20% 수크로오스 함유버퍼중에서 재현탁한다.

이 세포를 용해 하기 위하여, 그 박테리아를 원심분리하고 펠릿을 얼음으로 냉각한 5mM MgSO₄ 액 중에서 재현탁하여 얼음욕조내에서 약 10분간 유지한다.

그 세포 현탁액을 원심분리하고 그 상증액을 데칸트(decanting)하여 저장한다.

그 상증액 중에 있는 재조합 단백질을 일반분리기술(통상의 기술자에 의해 공지된 기술)에 의해 그 숙주 단백질로부터 분리할 수 있다.

정제에 대한 일반 단백질 분리기술

재조합 폴리펩티드 즉, 이 발명의 변이 인간성장호르몬은 가용성 형태의 숙주세포에서 발현될 경우 그 정제는 아래서 설명한 일반 단백질 정제 처리공정을 따라 실시할 수 있다.

용해도 분획(Solubility fractionation)

초기 스텝에서 자주 그 단백질 혼합물이 복합상태로 있을 경우, 초기염분획으로 그 재조합 단백질, 즉 이 발명의 변이 인간성장호르몬에서 바람직하지 않은 숙주세포 단백질(또는 세포배양 배지에서 유도되는 단백질)의 대부분을 분리할 수 있다.

바람직한 염으로는 암모늄 술페이트가 있다. 암모늄술페이트는 단백질 혼합물중에서 물의 양을 효과적으로 감소시켜 단백질이 침전 한다.

그 다음, 단백질은 이들의 용해도에 따라 침전한다.

단백질이 더 소수성일수록 암모늄술페이트의 저농도에서 그 단백질이 침전하도록 한다.

하나의 대표적인 프로토콜에서는 단백질 용액에 포화암모늄술페이트를 첨가하여 그 결과 얻어진 암모늄술페이트의 농도를 20~30% 로 되도록 하였다. 이것은 대부분의 소수성 단백질을 침전한다. 그 침전물은 페기하며(그 단백질이 소수성이 아닐경우) 암모늄술페이트를 그 상증액에 공지된 농도로 될때까지 첨가하여 그 단백질을 침전한다.

그 다음, 그 침전물을 버퍼중에서 가용화 하며, 필요할 경우 투석 또는 다이어필트레이션(diafiltration) 에 의해 염을 제거한다.

한냉에타놀 침전등 단백질의 용해도에 따르는 다른 방법은 이 분야의 통상의 기술자에 의해 공지 되었으며, 이 방법을 사용하여 복합 단백질 혼합물을 분획할 수 있다.

사이즈차에 대한 여과(size differential filtration)

계산한 분자량을 기준으로 한 사이즈가 더 크고 더작은 단백질을 세공크기가 다른 막[예로서 아미콘(Amicon 또는 밀리포어(Milipore)막을 통과하는 한외 여과법을 사용하여 분리할 수 있다.

1차 스텝으로 그 단백질 혼합물은 세공 크기를 가진 막을 통하여 한외여과 한다. 그 세공사이즈는 관심을 가진 단백질, 즉 변이인간 성장호르몬의 분자량 보다 더 작은 분자량의 절단분(cut-off)을 가진다.

그 다음, 그 한외여과 리텐테이트(retentate)는 관심을 가진 단백질의 분자량 보다 더 큰 분자 컷오프(절단분)을 가진 막에 대하여 한외여과한다.

그 재조합단백질은 그 막을 통과하여 여액으로 한다. 그 다음, 그 여액은 아래의 설명에서와 같이 크로마토그래피에 의해 분석할 수 있다:

컬럼 크로마토그래피

그 관심을 가진 단백질(이 발명의 변이 인간성장호르몬 등)은 또 이들의 크기(size), 순표면차지(charge), 소수성 또는 리간드의 친화성을 기준으로 하는 다른 단백질에서 분리할 수 있다.

또, 인간성장호르몬에 대한 증가항체는 컬럼매트릭스에 접합할 수 있다. 이들의 방법 전체는 이 분야에서 공지되었다.

변이 hGH 발현 검출에 대한 면역아세이

재조합 변이 인간성장호르몬의 생성을 확인하기 위하여 면역아세이는 폴리펩티드의 발현을 샘플에서 검출하는데 유용하다.

또, 면역아세이는 그 재조합 호르몬의 발현레벨을 정량화 하는데도 유용하다.

변이 인간성장호르몬에 대한 항체는 이들의 면역아세이를 실시하는데 필요하다.

변이 hGH 에 대한 항체의 생성

관심을 가진 면역원과 특이성 있게 반응하는 폴리클론 및 모노클론항체를 생성하는 방법은 이 기술분야의 기술자에 의해 공지 되었다(Coligan, Current Protocols in Immunology willey/Grcene, NY,1991; Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Stites 등(eds.)Basic and clinical Immunology(4th ed.)Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및

여기서 인용한 참고문헌;

Goding Monoclonal Antibodies : Principles and Practice(2d ed.) Academic Press, New York, NY, 1986; 및 Kohler 및 Milstein, Nature 256:495-497,1975).

이와 같은 기술에는 파아지와 동일한 벡터에서 재조합 항체의 라이브러리에서 항체의 선택에 의한 항체제조를 포함한다(Huse 등, Science 246:1275-1281, 1989; Ward 등, Nature 340:544-546, 1989)

특이성이 바람직한 항체를 포함하는 면역혈청을 생성하기 위하여 관심이 있는 폴리펩티드(즉, 이 발명의 변이 인간성장호르몬) 또는 그 항원성단편을 사용하여 적합한 동물, 즉, 마우스, 토끼 또는 영장류를 면역할 수 있다.

프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant)등 일반 아쥬반트는 일반면역화 프로토콜에 따라 사용할 수 있다.

또, 소정의 폴리펩티드에서 유도되는 합성 항원성 펩티드는 캐리어 단백질에 접합하여 면역원으로 사용할 수 있다.

면역원 제조에 대한 동물의 면역응답은 테스트블리드(test bleeds)를취하여 모니터링하여 관심있는 항원에 대한 반응성의 높은 역가를 적합하게 얻을 경우, 혈액을 동물에서 채취하여 항혈청(antisera)을 만든다.

또, 항원에 대하여 특이하게 반응성이 있는 항체를 농후(enrich)하게하는 항혈청의 분획을 실시할 수 있다(Harlow 및 Lane, 상기 인용문헌참조).

그 다음, 단백질 정제의 일반 설명은 위에서 설명한 바와 같다.

단클론성 항체는 이 기술분야의 기술자에 의해 알려진 여러가지의 기술을 사용하여 얻어진다. 주로 바람직한 항원으로 면역화된 동물의 스폴린(spleen)세포는 마이엘로마(myeloma)세포와의 융합에 의해 일반적으로 면역화 한다(kohler 및 Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976).

다른 면역화 방법에는 엡스테인바르 바이러스(Epstein Barr virus), 온고(onco)유전자 또는 레트로 바이러스와의 형질전환, 또는 이 분야에서 공지된 다른 방법이 있다.

불사화 단세포에서 일어나는 콜로니를 스크리닝하여 항원에 대한 바람직한 특이성과 친화성을 가진 항체를 생성하며, 이와 같은 세포에 의해 생성된 단클론성 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복강(복막)캐비티 내에 주입을 포함하여 여러가지의 기술에 의해 높일 수 있다.

또, 단클론성 항체는 참고문헌(Huse 등, 상기 인용문헌)에 의해 개략적으로 설명한 일반 프로토콜에 의해 인간 B세포 cDNA 라이브러리를 스프리닝 함으로써 상기 항체의 결합단편 또는 특이성이 바람직한 항체를 코딩하는 핵산 서열을 동정할 때 재조합 생성할 수 있다.

위에서 설명한 재조합 폴리펩티드 생성 방법 및 일반 원칙은 재조합 방법에 의한 항체생성에 적용할 수 있다.

필요할 경우, 이 발명의 변이 인간성장호르몬을 특이성 있게 인식할 수 있는 항체는 그 야생형 인간 성장호르몬에 대한 항체의 교차반응성(cross-reactivity)에 대하여 테스트 할 수 있어, 그 결과 야생형 단백질에 대한 항체와 현저하게 다르다.

예로서, 변이 인간성장호르몬으로 면역화된 동물에서 얻은 항혈청은 야생형 인간성장호르몬이 면역화 되는 컬럼을 통하여 실시할 수 있다.

그 컬럼을 통과하는 항혈청의 부분은 변이인간성장호르몬만이 인식되고 야생형 인간 성장호르몬을 인식하지 않는다.

동일하게, 변이 인간성장호르몬에 대한 단클론성 항체는 또 그 변이 인간성장호르몬만을 인식하고 야생형 인간성장호르몬을 인식하지 않는 이들 항체의 배타 성에 대하여 스크리닝 할 수 있다.

이 발명의 상기 변이인간호르몬만을 특이성 있게 인식되나 야생형 인간성장호르몬을 인식하지 않은 다클론성 또는 단클론성 항체는 야생형 단백질에서 변이단백질을 분리하는데 유용하다.

예로서, 고상지지체 상에서 고정된 변이인간성장호르몬의 특이성 있는 다클론성 또는 단클론성 항체를 가진 샘플을 배양시켜 분리하는데 유용하다.

변이 hGH 발현을 검출하는 면역 아세이

이 발명의 변이인간성장호르몬에 대하여 특이성 있는 항체가 사용되면, 샘플, 즉 세포용해물에서 폴리펩티드의 양은 이 분야 기술자에 의해 공지된 정량 및 정성 결과를 제공하는 여러가지의 면역아세이 방법에 의해 측정할 수 있다.

일반적으로 면역 및 면역아세이 처리스텝에 대해서는 다음 참고문헌을 예시할 수 있다;

Stites, 상기 문헌참조 ; USP4,366,352; 4,376,110; 4,517,288; 4,837,168.

면역아세이의 표지

면역아세이는 표지제를 사용하여 항체와 표적단백질에 의해 형성된 결합복합체에 특이성 있게 결합하여 그 복합체를 표지한다.

그 표지제는 항체/표적단백질 복합체로 이루어지는 성분중 하나이거나, 또는 항체/표적단백질복합체에 결합하는, 다른 항체등 제 3성분이다.

표지는 분광수단, 광화학수단, 생화학수단, 면역화학수단, 전기수단, 광 또는 화학수단에 의해 검출할 수 있다.

예로는 자기비드(magnetic beads)(즉, 상품명:Dynabeads),형광염료(즉, 플루오르에스세인 이소티오시아네이트, 텍사스레드, 로드아민 등), 방사성 표지(즉, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³²P), 효소(즉, 효스래디쉬퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제, 기타(ELISA에서 통상 사용되는것) 및 콜로이드형상 골드 또는 착색글라스 또는 플라스틱(즉, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)비드가 있으나, 한정되어 있는것은 아니다.

일부경우, 표지제로는 검출할 수 있는 표지를 가진 제 2 항체가 있다. 또, 그 제 2항체는 표지가 결여되어 있으나, 제 2항체가 유도된 종의 항체에 특이성 있는 표지된 제 3항체에 의해 결합할 수 있다.

그 제 2항체는 효소가 표지된 스트렙타비딘등 제 3의 표지된 분자를 특이성 있게 결합한 바이오틴 등의 검출할 수 있는 성분으로 수식할 수 있다.

단백질 A 또는 단백질 C 등 면역글로불린의 일정한 영역을 특이성 있게 결합할 수 있는 다른 단백질을 표지제로써 사용할 수 있다.

이들의 단백질은 스트렙토콕컬 박테리아의 세포벽의 정상적인 성분이다. 이들의 단백질을 여러가지의 종에서의 면역글로불린의 일정한 영역을 가진 강한 비면역원성 반응성을 나타낸다(Kronual 등, J. Immunol., 111:1401-1406(1973); Akerstrom 등, J. Immunol. 136;2589-2542(1985).

면역아세이 포맷(Immunoassay Formats)

샘플에서 관심있는 표적단백질(즉, 변이인간성장호르몬)을 검출하는 면역아세이는 경합 또는 비경합아세이로 할 수 있다.

비경합면역아세이는 표적단백질의 포획량을 직접 측정하는 아세이이다. 하나의 바람직한 "샌드위치" 식 아세이에서는 예로서 그 표적단백질에 대하여 특이성인 항체를 고상기질에 직접 결합할 수 있으며, 여기서 그 항체는 고정화 되어 있다. 그 다음, 이것은 테스트 샘플에서 표적단백질을 포획한다(잡는다). 그 다음으로, 이와같이 고정화된 그 항체/표적단백질복합체는 위에서 설명한 바와같이 표지를 가진 제 2 또는 제 3 항체등 표지제에 의해 결합된다.

경합아세이에서는 샘플에서의 표적단백질의 양을, 샘플에 존재한 표적단백질에 의해 그 표적단백질에 대하여 특이성 있는 항체에서 변위된(또는 경합)부가(외인성)표적단백질의 양의 측정에 의해 간접측정한다.

이와같은 아세이의 주요한 하나의 예에서, 그 항체는 고정되어 외인성 표적단백질을 표지한다. 그 항체에 결합된 외인성 표적단백질의 양은 샘플에 존재한 표적단백질의 농도에 역비례하기 때문에, 그 샘플에서 표적단백질 레벨은 그 항체에 결합되어 고정된 외인성 표적단백질의 양을 기준으로 하여 결정할 수 있다.

일부의 경우, 웨스턴블롯(면역블롯:immunoblot)분석을 사용하여 샘플중에서 변이인간성장호르몬의 존재를 검출하여 정량한다. 이 기술은 일반적으로 분자량을 기준으로 한 겔 전기영동에 의해 샘플단백질을 분리하고, 그 분리된 단백질을 적합 한 고상지지물(니트로셀룰로오스필터, 나일론필터, 또는 유도화된 나일론필터)로 이입(tranfer)하여, 그 표적단백질을 특이성 있게 결합하는 항체를 가진 샘플을 배양하는 구성으로 이루어진다.

이들의 항체는 직접 표지할수 있고, 또 변이인간성장호르몬에 대한 항체에 특이성 있게 결합한 표지된항체(즉, 표지된 양 및 마우스 항체)를 사용하여 후검출할 수 있다.

다른 아세이 포맷에는 리포솜 면역아세이(LIA)를 포함하며, 이 LIA는 특이성분자(즉,항체)를 결합하고 봉입시약 또는 마커를 방출하도록 구성된 리포솜을 사용한다.

그 다음, 방출된 화학물질은 일반기술에 의해 검출한다

(Monroe 등, Amer. clin. prod. Rev., 5:34-41(1986).

변이 hGH 의 글리코실화 및 글리코콘주게이션(glycoconjugation)

효소방법에 의한 글리코실화 및 글리코콘주게이션

펩티드의 생체외수식의 후발현은 새로운 부위에서 글리칸의 도입 또는 글리칸구조의 수식을 포함하여, 발현 시스템의 작동에 의해 글리코실화의 조정에 따르는 방법의 결여를 치유하는 유인성 있는 설계이다.

사카라이드 도너성분을 이입한 효소의 폭넓은 수집물을 이용할 수 있어, 통상적으로 구성한 글리코실화 패턴과 글리코실 구조체를 가진 글리코콘주게이트의 생체외 효소합성이 가능하다.

예로서 특허참고문헌으로 다음 문헌을 예시할 수 있다;

USP5,876,980; 6,030,815; 5,728,554; 5,922,577.

또, 공개특허문헌으로는 다음 문헌을 예시할 수 있다;

WO98/31826; WO 01/88117; WO 03/031464; WO 03/046150; WO 03/045980; WO 03/093448; WO 04/009838; US2002/142370; US2003/040037; US2003/180835; US2004/063911; US2003/207406; 및 US2003/124645.

이 발명은 변이 인간성장호르몬에 상응하는 야생형 hGH 에 존재하는 새로운 글리코실화 부위를 가진 글리코실화 및 비글리코실화 변이 인간성장호르몬의 콘주게이트(conjugates)를 제조하는 방법을 제공한다.

이와같은 콘주게이션(conjugation)은 글리코실화 변이 hGH 의 적합한 당단위상에서 직접 발생하며, 또 그 발생후에 바람직하지 않은 당단위를 제거한다(즉, 그 당단위를 정돈함:"trimming back").

상기 콘주게이트는 펩티드와 여러가지의 종(수용성폴리머, 치료성분, 진단성분, 표적성분 등)의 사이에서 형성한다.

또, 링커암(linker arm)에 의해 동시에 결합된 2개이상의 펩티드를 포함한 콘주게이트, 즉 다기능성 콘주게이트를 구성한다.

이 발명의 다기능성 콘주게이트에는 동일한 펩티드의 2개 이상의 복제 또는 구조와 특성이 다른 여러가지의 펩티드의 수집이 포함되어 있다.

이 발명의 콘주게이트는 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드에 수식당의 효소에 의한 결합에 의해 형성된다.

그 수식당은 펩티드와 그 당에서의 수식그룹 사이에 개재될 경우 무손상 글리코실 결합기라 한다.

글리코실전이효소 등 효소의 정밀한 선택성을 사용하여, 본 발명의 방법에서는 1개 이상의 특정위치에서 소정의 기를 가진 펩티드를 구성한다.

이와같이, 본 발명에 의해, 수식당은 펩티드 사슬에서 선택된 위치에 직접 결합하거나, 또는 그 수식당이 글리코펩티드의 탄수화물 성분에 부가한다.

글리코펩티드 탄수화물과 직접 그 펩티드 골격의 아미노산 잔기에 그 수식당이 결합된 펩티드는 역시 이 발명의 범위에 속한다.

이 발명의 방법은 공지된 화학적 및 효소에 의한 펩티드 제조설계와 비교하여 상동성 유도체화 패턴을 가진 펩티드와 글리코펩티드를 접합할 수 있으며;

이 발명에서 사용된 효소는 일반적으로 소정의 아미노산잔기 또는 그 펩티드의 아미노산잔기 배합물에 대하여 선택적이다.

이 방법은 또 수식 펩티드와 글리코펩티드의 대규모 제조에 대하여 실제적으로 실시할 수 있다.

이와같이, 이 발명의 방법은 사전에 선택한 균일한 유도체화 패턴을 가진 글리코펩티드의 대규모 제조를 하는 수단을 제공한다.

이 방법은 세포의 배양세포(즉, 포유동물세포, 곤충세포, 식물세포, 균세포, 효모세포, 또는 진핵세포)또는 형질전환된 식물 또는 동물에서 생성할 때 불완전하게 글리코실화된 글리코펩티드를 포함하며, 한정되지 아니한 치료성 펩티드의 수식에 특히 적합하다.

이 발명의 방법은 또 예로서, 면역 또는 리티쿨로엔도텔리얼 시스템(RES)에 의해 흡수율 감소 또는 클리어런스율 감소에 의해 치료성 반감기가 증가된 글리코실화 또는 비글리코실화펩티드의 콘주게이트를 제공한다.

더욱이, 이 발명의 방법은 펩티드 상에서 항원성 결정자를 마스킹하여 그 펩티드에 대한 숙주면역응답을 감소 또는 제거하는 수단을 제공한다.

또, 포적제의 선택성 결합을 사용하여 펩티드를 소정의 포적제에 대하여 특이성이 있는 소정의 조직 또는 세포표면리셉터에 표적으로 표지할 수 있다.

콘주게이트 (Conjugates)

첫째로, 이 발명은 야생형 펩티드에 존재하지 않은 글리코실화 부위를 가진 hGH 변이펩티드와 선택된 수식그룹 사이에 콘주게이트를 구성한다.

그 수식 그룹은 변이 글리코실화 부위 또는 야생형 펩티드에 존재한 부위에 결합할 수 있다.

그 펩티드와 수식그룹 사이의 결합에는 그 펩티드와 선택된 성분사이에 개재된 글리코실결합기를 포함한다.

여기서 설명한 바와 같이, 그 선택된 성분에 사카라이드 단위에 결합할수 있는 어느 종(specics)이라도 주로 가능하며, 펩티드에 수식당을 부가하는 적절한 트랜스페라아제 효소에 의해 인식되는 수식당이 얻어진다.

그 수식당의 사카라이드 성분은 그 펩티드와 선택성분 사이에 개재되어 있을 경우 "글리코실결합기" 즉 "무손상 글리코실결합기" 로 된다.

그 글리코실결합기는그 수식당과 수식후에 펩티드의 아미노산잔기 또는 글리코실잔기에 그 수식당을 부가하는 효소용 기질인 모노 또는 올리고사카라이드에서 형성된다.

그 글리코실결합기는 그 수식그룹의 부가중에 분해할 수 있게 수식되는 사카라이드 성분이며, 그 성분을 포함할수 있다.

예로서, 그 글리코실결합기는 사카라이드잔기에서 유도될 수 있으며, 그 사카라이드잔기는 그 상응하는 알데히드에 대하여 무손상 사카라이드의 산화분해에 대해 생성된다. 즉, 메타퍼아이오데이트의 작용에 의해 생성되고, 그 다음 적합한 아민을 가진 쉬프염기로 전화한다. 그리고, 그 아민은 상응하는 아민으로 환원된다.

이 발명의 콘주게이트는 주로 다음 구조에 상응한다:

위 구조에서,

부호 a,b,c,d 및 s 는 양(+) 의 영(zero)아닌 정수이고, 부호 t 는 0 또는 양(+) 의 정수이다.

"작용제"(agent)는 치료제, 바이오활성제, 검지가능한 표지, 수용성성분(즉, PEG, n-PEG, PPG 및 m-PPG) 등이다.

상기 "작용제"(agent) 는 펩티드, 즉 효소, 항체, 항원 등이다.

상기 링커(linker)는 폭넓은 배열을 하는 결합기중 어느하나이다(아래에서 기재). 또, 그 링커는 단결합 또는 "0차링커"(zero order linker) 이다.

하나의 대표적 예로서 수용성 폴리머에는 폴리(에틸렌글리콜), 즉 메톡시폴리(에틸렌글리콜)이 있다.

이 발명에서 사용된 폴리(에틸렌글리콜)은 소정의 형태 또는 분자량 범위에 한정되어 있는 것은 아니다.

그 폴리(에틸렌글리콜)분자량은 500~100,000의 범위가 바람직하다.

분자량 500~60,000의 사용이 바람직하며, 바람직하게는 1,000~40,000이고, 더 바람직하게는 분자량 약 5,000~약40,000이다.

다른예에서, 그 폴리(에틸렌글리콜)은 1개 이상의 PEG 성분을 가진 분기 PEG를 결합한다.

분기 PEG의 예로는 다음의 특허문헌과 기술문헌에 기재되어 있다:

USP 5,832,462; USP 5,342,940; USP 5,643,575; USP 5,919,455; USP 6,113,906; USP 5,183,660; WO 02/09766; Kodera Y, Bioconjugate Chemistry 5:283-288(1994); Yamasaki 등, Agric. Biol. Chem. 52:2125-2127,1998.

바람직한 예에서, 분기 PEG의 각폴리(에틸렌글리콜)의 분자량은 5,000 ~ 20,000 이다.

효소에 의해 부가된 글리코실 결합기에 의해 형성되는 콘주게이트의 구성이외에, 이 발명은 이들의 치환패턴에서 고도로 상동성이 있는 콘주게이트를 제공한다.

이 발명의 방법을 사용하여, 이 발명의 한집단의 콘주게이트에 걸처 주로 수식당 성분 전체가 구조적으로 동일한 아미노산 또는 글리코실잔기의 다중 복제에 결합하는 펩티드의 콘주게이트를 형성할 수 있다.

따라서, 둘째로, 이 발명은 무손상 글리코실결합기에 의해 펩티드에 공유결합하는 수용성폴리머 성분 집단을 가진 펩티드 콘주게이트를 제공한다.

이 발명의 바람직한 콘주게이트에서, 그 집단의 각각의 멤버는 그 펩티드의 글리코실잔기에 글리코실 결합기에 의해 결합되고, 그 글리코실 결합기가 결합된 펩티드의 각 글리코실잔기는 동일한 구조를 가진다.

또, 글리코실결합기에 의해 공유 결합된 한집단의 수용성폴리머 성분을 가진 펩티드 콘주게이트를 구성한다.

바람직한 예에서, 그 집단의 수용성 폴리머 성분의 모든 멤버는 글리코실결합기의 아미노산잔기에 결합되고, 결합된 글리코실 결합기를 가진 각 아미노산 잔기는 동일한 구조를 가진다.

이 발명은 또 위에서 설명한 것(콘주게이트)과 동족체인 콘주게이트를 제공하며, 그 콘주게이트에서는 그 펩티드가 치료성분, 진단성분, 표적성분, 톡신(toxin)성분 등에 무손상글리코실 결합기에 의해 접합되어 있다.

상기 인용한 성분 각각은 크기가 작은 분자, 자연폴리머(즉, 폴리펩티드)또는 합성폴리머이다.

하나의 예로서, 변이 인간성장호르몬은 PEG 성분의 각 말단에 무손상글리코실결합기를 포함하는 2작용성 링커에 의해 트랜스페린(tranoferrin)에 접합된다(처 리공정도:스컴 1 참조).

예로서, 그 PEG 링커의 하나의 말단은 트랜스페린에 결합된 무손상시알산링커와 기능성 작용을 하며, 다른 말단은 변이 hGH에 결합된 무손상 GalNAc 링커와 기능성 작용을 한다.

이 발명의 콘주게이트는 1가(mono-valent)또는 다가(valent)(즉, 촉각형상구조)인 무손상글리코실결합기를 포함한다. 이와같이, 이 발명의 콘주게이트는 선택성분이 1가 글리코실결합기에 의해 펩티드에 결합된 2종을 포함한다. 또, 1개 이상의 선택성분이 다가결합기에 의해 펩티드에 결합된 콘주게이트가 이 발명의 범위내에 포함한다.

또 다른예에서, 이 발명은 콘주게이트의 성분으로써 표적제의 존재에 의해 소정의 조직내에서 선택적으로 위치하는 콘주게이트를 구성한다.

하나의 대표적예에서, 그 표적제는 단백질이다.

대표적인 예로서 단백질에는 트랜스페린[브레인(brain), 블러드풀(blood pool)], HS-글리코단백질(뼈, 브레인, 블러드풀), 항체(브레인, 항체가 특이성 있는 항원을 가진 조직, 블러드풀), 응집인자 V-XI(손상조직, 클롯, 암, 블러드풀), 혈청단백질, 즉 α-산글리코단백질, 페투인, α-페탈(fetal)단백질(브레인, 블러드풀), β2-글리코단백질(간, 아테로스 클레로시스플라크, 브레인, 블러드풀), G-CSF, GM-CSF, M-CSF 및 EPO (면역자극, 암, 블러드풀, 적혈구세포 과잉생산, 신경보호), 알부민(반감기증가), 리포단백질E 를 포함한다.

방법

위에서 설명한 콘주게이트 이외에, 이 발명은 이들의 콘주게이트와 다른 콘주게이트를 제조하는 방법을 구성한다.

세째로, 이와같이 이 발명은 선택된 성분과 펩티드 사이에서 공유결합된 콘주게이트를 형성하는 방법을 구성한다.

또, 이 발명은 이 발명의 콘주게이트를 상기 항체의 영역 또는 소정의 조직에 표적을 정하는 방법을 구성한다.

더 나아가서, 이 발명은 이 발명의 콘주게이트를 질병이 발생하는 피검자 또는 질병을 가진 피검자에 투여하여 질병상태를 예방, 치료 및 개선하는 방법을 구성한다.

예로서, 그 콘주게이트는 수용성폴리머, 치료성분, 표적을 정하는 성분 또는 바이오분자 및 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드 사이에서 형성된다.

상기 폴리머, 치료성분 또는 바이오분자는 펩티드와 수식그룹(즉, 수용성폴리머)사이에 개재하여 공유결합한 무손상 글리코실결합기에 의해 펩티드에 접합한다.

상기 방법에는 상기 펩티드와, 수식당 및 그 수식당을 기질로 하는 글리코실전이효소를 함유한 혼합물의 접촉을 포함한다.

그 반응은 수식당과 펩티드 사이에서 공유결합의 형성에 충분한 조건하에서 실시한다.

그 수식당의 당성분은 뉴클레오티드당, 활성당 및 뉴클레오티드도 활성화도 아닌 당에서 선택하는 것이 바람직하다.

그 악셉터 펩티드(글리코실화 또는 비글리코실화)는 주로 새로 합성하거나, 또는 원핵세포(즉, E.coli등 박테리아세포)또는 진핵세포(포유동물, 효모, 곤충, 균 또는 식물세포 등)에서 재조합에 의해 발현한다.

그 펩티드는 전장 단백질 또는 프라그멘트이다.

더욱이, 그 펩티드는 야생형 또는 변이 펩티드이다.

하나의 대표적 예에서, 그 펩티드에는 1개 이상의 공통 글리코실화 부위를 그 펩티드 서열에 부가한 변이를 포함한다.

또, 이 발명의 방법은 재조합에 의해 제조되는 불충분한 글리코실화 펩티드의 수식(modification)을 제공한다.

대부분 재조합에 의해 형성된 글리코단백질은 불충분하게 글리코실화 되고, 바람직하지 않은 특성, 즉 면역원성, RES에 의한 인식을 가진 탄수화물 잔기를 노출한다.

이 발명의 방법에서 수식당을 사용하여, 그 펩티드는 동시에서 글리코실화 되고 수용성폴리머, 치료제 등으로 유도체화 할 수 있다.

그 수식당의 당성분은 완전글리코실화된 펩티드에서의 악셉터에 적합하게 접합되는 잔기 또는 바람직한 특성을 가진 다른 당성분이다.

이 발명의 방법에 의해 수식된 펩티드는 합성펩티드 또는 야생형 펩티드이며, 또 이들은 부위지향 변이발생등 공지된 방법에 의해 형성된 변이 펩티드이다.

펩티드의 글리코실화는 주로 N-결합 또는 O-결합을 한다.

하나의 대표적예로서 N-결합은 아스파라진 잔기의 결사슬에 수식당을 결합한다.

그 트리펩티드 서열 아스파라진-X-세린과 아스파라진-X-트레오닌(X는 프롤린을 제외한 아미노산이다)은 아스파라진 결사슬에 탄수화물 성분을 효소에 의해 결합한 인식서열이다.

따라서, 폴리펩티드에서 이들의 트리펩티드 서열(양자)의 존재로 가능성 있는 글리코실화 부위를 형성한다.

O-결합글리코실화는 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신을 사용할 수 있으나, 히드록시아미노산, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌의 히드록시결사슬에 1개의 당(즉, N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 만노오스, GlcNAc, 글루코오스, 푸코오스 또는 키실로오스)을 결합한다.

펩티드 또는 다른 구조체에 글리코실화 부위의 부가는 아미노산서열이 1개 이상의 글리코실화 부위를 포함하도록, 아미노산 서열을 변경시켜 통상적으로 얻는다.

그 부가는 또 펩티드(O-결합글리코실화 부위에 대하여)의 서열내에서, -OH기, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌잔기를 제공하는 1개 이상의 종의 결합에 의해 얻어진다.

그 부가는 펩티드의 완전 화학적 합성에 의해 또는 변이에 의해 얻을 수 있다.

그 펩티드의 아미노산 서열은 DNA 레벨에서 변경을 통해, 특히 바람직한 아 미노산으로 번역되는 코돈이 발생하도록 하는 사전 선택된 염기에서 그 펩티드를 코딩하는 DNA의 변이에 의해 변경하는 것이 바람직하다.

그 DNA변이는 이 분야에서 공지된 방법을 사용하여 실시하는 것이 바람직하다.

하나의 예에서, 그 글리코실화 부위는 폴리뉴클레오티드를 셔플링(shuffling)하여 부가한다.

하나의 후보(candidate)펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA셔플링 프로토콜로 조정할 수 있다.

DNA 셔플링은 관련유전자의 풀(pool)의 임의단편(random fragmentation)에 의해 실시한 다음, 중합효소사슬 반응과 동일한 프로세스에 의해 그 단편은 재집합 하는 반복성 재조합변이 프로세스이다.

참고문헌으로는 다음의 문헌을 예시한다:

stemmer, proc. Natl.Acad.Sci USA 91:10747-10751(1994);

Stemmer, Nature 370:389-391(1994);

USP5,605,793;5,837,458;5,830,721;5,811,238.

이 발명은 또 펩티드에 1개 이상의 선택된 글리코실잔기를 부가(또는 제거)하고, 그 다음 수식당을 그 펩티드의 선택된 글리코실잔기 중 최소 1개에 접합하는 수단을 제공한다.

이 발명은 예로서 펩티드에 존재하지 않거나 또는 바람직한 양으로 존재하지 않은 선택된 글리코실잔기에 그 수식당을 접합하는 것이 바람직할 경우에 유용하 다.

이와같이, 수식당을 펩티드에 결합하기전에,

그 선택된 글리코실잔기를 효소 또는 화학적 결합에 의해 펩티드에 접합한다.

다른예에서, 글리코펩티드의 글리코실화 패턴은 글리코펩티드에서 탄수화물 잔기의 제거에 의해 수식당의 접합전에 변경된다.

참고문헌의 예로서 아래의 특허문헌을 참조할 수 있다;

WO98/31826.

글리코펩티드상에 존재한 탄수화물 성분의 부가 또는 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 얻는다.

화학적 탈글리코실화는 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 당량화합물에 폴리펩티드 변이체의 노출(접촉)에 의해 실시하는 것이 바람직하다.

이 처리는 결합당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 모든 당을 절단하여 얻으며, 동시에 그 펩티드는 무손상으로 있게 된다.

화학적 탈글리코실화는 다음문헌에 기재되어 있다:

Hakimuddin 등, Arch. Biochem. BioPhy. 259: 52(1987);

Edge등, Anal. Biochem. 118:131(1981).

폴리펩티드 변이체 상에서 탄수화물 성분의 효소에 의한 절단은 다음문헌에서 기재된 바와 같이 여러가지의 엔도 및 엑소글리코시다아제를 사용하여 얻을수 있다:

Thotakura등, Meth. Enzymol. 138:350(1987).

글리코실성분 상에서의 화학적 부가는 종래기술에서 알려진 방법에 의해 실시한다.

당 성분의 효소에 의한 부가는 여기서 설명한 방법의 변형을 사용하여 이 발명에서 사용된 수식당의 원래 글리코실 단위를 치환하여 얻는 것이 바람직하다.

당성분을 부가하는 다른방법은 다음 특허문헌에 기재되어 있다:

USP5,876,980;6,030,815;5,728,554;5,922,577.

선택된 글리코실잔기의 대표적인 결합지점에는

(a) N-결합글리코실화 및 O-결합글리코실화의 공통부위;

(b) 글리코실전이효소의 악셉터인 말단글리코실성분;

(c) 아르기닌, 아스파라긴 및 히스티딘;

(d) 유리카르복실기;

(e) 시스테인의기등 유리술프히드릴기;

(f) 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의기 등 유리히드록실기;

(g) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의기등 방향족잔기; 또는

(h) 글루타민의 아미드기를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

이 발명에서 사용하는 대표적인 방법은 다음문헌에서 기재되어 있다:

WO87/05330(1987.09.11. 공개);

Aplin 및 Wriston, CRC CRIT.REV.BIOCHEM., PP259-306(1981).

하나의 예에서, 이 발명은 hGH와 1개 이상의 펩티드를 결합기에 의해 결합하 는 방법을 제공한다.

그 결합기는 유용한 구조로 되어 있으며, 직쇄구조와 분기쇄 구조에서 선택할 수 있다.

그 링커의 각각의 말단은 펩티드에 결합되며, 수식당(즉, 미완성 무손상 글리코실결합기)을 포함한다.

이 발명의 하나의 대표적인 방법에서, 2개의 펩티드는 PEG링커를 포함하는 링커성분에 의해 동시에 결합한다.

그 구조는 상기 명세서의 식별번호에서 설명한 일반구조와 일치한다.

여기서 설명한 바와 같이, 이 발명의 구조는 2개의 무손상 글리코실결합기(즉,s+t=1) 를 포함한다.

2개의 글루코실기를 포함하는 PEG 링커의 포커스(focus)는 명백하게 하는데 목적이 있으며, 이 발명의 예에서 사용하는 링커암(arms)의 동정(identity)을 한정하는 것으로 해석하는 것은 아니다.

이와같이, PEG 성분은 제 1 글리코실단위를 가진 제 1말단과 제 2 글리코실단위를 가진 제 2 말단에서 기능성 작용을 한다.

제 1 및 제 2 글리코실 단위는 전이효소가 다른 기질이 바람직하며, 각각 제 1 및 제 2 글리코실 단위에 제 1 및 제 2 펩티드의 직교 결합을 하도록 한다.

실제로, 그 (글리코실)¹PEG-(글리코실)² 링커는 제 1 글리코실단위가 기질인 제 1 전이효소 및 제 1 펩티드와 접촉하여 (펩티드)¹-(글리코실)¹-PEG-(글리코실)² 를 형성한다.

그 다음, 글리코실전이효소 및/또는 미반응 펩티드는 그 반응 혼합물에서 선택적으로 제거한다.

제 2 펩티드와, 제 2 글리코실단위가 기질인 제 2 전이효소가 (펩티드)¹-(글리코실)¹-PEG-(글리코실)² 콘주게이트에 부가되어 (펩티드)¹-(글리코실)¹-PEG-(글리코실)²-(펩티드)² 를 형성한다.

이 분야의 기술자는 위에서 설명한 방법이 예로서 분기 PEG, 덴드라이머(dendrimer), 폴리(아미노산), 폴리사카라이드 등을 사용하여 2개 이상의 펩티드 사이에 콘주게이트의 형성에 적용할 수 있다는 것을 알 수 있다.

하나의 대표적 예에서, 인간성장호르몬은 PEG 성분의 각각의 말단에서 무손상 글리코실결합기를 포함하는 2작용성 링커에 의해 트랜스페린에 접합한다(처리공정도(스킴)1).

상기 hGH 콘주게이트는 그 콘주게이트의 분자크기보다 더 크기 때문에 hGH 단독의 반감기 이상으로 증가되는 생체내 반감기를 가진다.

더욱이, 트랜스페린에 hGH의 접합은 뇌(brain)에 콘주게이트를 선택적으로 표적을 정하는데 사용한다.

예로서, PEG링커의 하나의 말단은 CMP시알산으로 기능적 작용을 하며, 다른 말단은 UDPGalNAc로 기능적 작용을 한다.

그 링커는 GalNAc 전이효소의 존재하에서 hGH와 조합하여, 그 hGH상에서 세 린 및/또는 트레오닌 잔기에 그 링커암의 GalNAc를 결합한다.

위에서 설명한 프로세스는 가급적 바람직한 다수의 사이클을 통하여 실시하며, 단일링커를 가진 2개의 펩티드 사이에 하나의 콘주게이트의 형성에 한정되어 있는 것은 아니다.

더욱이, 이 분야의 기술자는 그 펩티드를 가진 PEG링커(또는 다른링커)의 말단에서 무손상글리코실결합기의 기능적 작용을 하는 반응을 동일반응 용기내에서 동시에 발생할 수 있으며, 또 이들의 반응은 하나의 처리 스텝방식으로 실시할 수 있다.

그 반응은 하나의 처리 스텝방식으로 실시할 경우, 각 스텝에서 생성된 콘주게이트는 1종 이상의 반응성분(즉, 효소, 펩티드)에서 선택적으로 정제한다.

또 다른 예로 처리공정도 2(스킴2)에서 설명한다.

그 처리공정도 2에서는 선택된 단백질, 즉 인간성장호르몬을 골격(bone)에 표적을 정하여 그 선택 단백질의 순환성 반감기를 증가하는 콘주게이트의 제조방법을 나타낸다.

위도에서, G는 활성화당 성분(즉, 당뉴클레오티드)상의 글리코실잔기이며, 콘주게이트에서 무손상글리코실링커기로 전환한다. S가 O 보다 더 클때, L은 GalNAc 또는 GalNAc-Gal 등 사카릴결합기이다.

[0182]

1종 이상의 펩티드 성분을 상기 링커에 결합하는 PEG(또는 다른 링커)의 반응성 유도체는 이 발명의 범위내에서 사용한다.

이 발명은 그 반응성 PEG유사체의 동정에 의해 한정되는 것은 아니다.

폴리(에틸렌글리콜)의 활성화된 유도체 대부분은 시판용으로, 또 문헌을 통하여 입수할 수 있다.

이 분야 기술자의 능력 범위내에서, 필요할 경우 적합한 활성화된 PEG 유도체를 선택하고 합성하여 이 발명에서 유용한 기질을 제조한다.

참고문헌으로 다음 문헌을 에시할 수 있다.

Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186(1984);Abuchowski et al.,J.Biol.Chem.,252:3582:3586(1977);Jackson et al.,Anal.Biochem.,165:114-127(1987);Koide et al.,

Biochem Biophys.Res.Commun.,111:659-667(1983)),tresylate(Nilsson et al.,Methods Enzymol.,104:56-69(1984);Delgado et al., Biotechnol. Appl. Biochem.,12:119-128(1990));N-hydroxysuccinimide derived active esters(Buckmann et al., Makromol.Chem.,182:1379-1384(1981);Joppich et al., Makromol.Chem.,180:1381-1384(1979);

Abuchowski et al.,Cancer Biochem.Biophys.,7:175-186(1984);Katreet al.proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 84:1487-1491(1987);Kitamura et al.,Cancer Res., 51:4310-4315(1991);Boccu et al.,Z.Naturforsch.,38C:94-99 (1983), carbonates (Zalipsky et al., POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY:BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, Harris,Ed.,Plenum Press,New York,1992,pp.347-370;Zalipsky et al.,Biotechnol.Appl. Biochem.,15:100-114(1992);Veronese et al., Appl. Biochem.Biotech.,11:141-152(1985)),imidazolyl formates(Beauchamp et al., Anal.Biochem.,131:25-33(1983);Berger et al.,Blood,71:1641-1647(1988)),4-dithiopyridines(Woghiren et al.,Bioconjugate Chem.,4:314-318 (1993) ; Isocy anates(Byun et al.,ASAIO Joumal,M649-M-653(1992))and epoxides (U.S. Pat. No. 4,806,595,issued to Noishiki et al.,(1989).

다른 결합기에는 아미노기와 활성화된 PEG 사이에 우레탄 결합기를 포함한다(Veronese등, Appl.Biochem.Biotechnical, 11:141-152(1985)).

또 다른예에서, 이 발명은 글로메룰루스(glomerules)(즉, 알부민)에 의해 단백질의 여과를 억제하는데 충분한 사이즈의 합성 또는 자연폴리머에 펩티드를 접합함으로써, 선택된 펩티드의 혈액순환 반감기를 연장하여, 그 펩티드를 혈액풀 (blood pool)에 주로 표적을 정하는 방법을 제공한다.

이 발명의 예를 아래의 처리공정도 3에서 설명한다.

그 처리공정도3에서는 hGH가 화학적으로 또는 효소에 의한 수식의 조합을 사용하여 PEG링커에 의해 알부민에 접합한다.

따라서, 처리공정도3에서 나타낸 바와 같이, 알부민의 잔분(residue)(즉, 아미노산결사슬)은 X-PEG-(CMP-시알산)등 반응성 PEG 유도체로 수식한다.

여기서, X는 활성그룹(즉, 활성에스테르, 이소티오시아네이트 등)이다.

그 PEG 유도체와 hGH는 결합하여 CMP-시알산이 기질인 전이효소와 접촉한다.

또 다른예에서, 라이신의 E-아민은 PEG-링커의 N-히드록시숙신이미드에스테르와 반응하여 알부민콘주게이트를 형성한다.

그 링커의 CMP-시알산은 hGH 상에서의 적합한 잔분(즉, Gal 또는 GalNAc)에 효소에 의해 접합됨으로써 콘주게이트를 형성한다. 이 분야의 기술자는 위에서 설명한 방법은 설명한 반응파트너에 한정되지 않는다는 것을 이해한다.

더욱이, 그 방법을 실시하여 콘주게이트를 형성할 수 있으며, 그 콘주게이트에는 예로서 2개 이상의 말단을 가진 분기링커를 이용함으로써, 2종 이상의 단백질 성분을 포함한다.

수식당 (modified sugars)

수식글리코실도너종("수식당")은 수식당 뉴클레오티드, 활성화 수식당 및 뉴클레오티드도 아니고 활성화도 아닌 단순사카라이드인 수식당에서 선택하는 것이 바람직하다.

바람직한 탄수화물 구조는 이 발명의 방법을 사용하여 펩티드에 부가된다.

주로, 그 구조는 모노사카라이드이나, 이 발명은 수식 모노사카라이드당의 사용에 한정하지 않으며, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드도 유용하다.

그 수식기는 효소수단, 화학적수단 또는 그 조합에 의해 당성분에 결합됨으로써, 수식당을 형성한다.

그 당은 펩티드에 수식당을 결합하는데 사용된 효소 기질로서 그 당이 기능적 작용을 하도록 하고 수식성분의 결합이 가능한 어느 위치에서도 치환된다.

바람직한 예에서, 시알산이 상기 당인 경우, 그 시알산은 피루빌곁사슬상에서 P-위치 또는 시알산에서 정상적으로 아세틸화된 아민성분상에서의 5-위치에서 그 수식기로 치환된다.

이 발명의 예에서, 수식당 뉴클레오티드를 사용하여 그 수식당을 펩티드에 부가한다.

이 발명에서 수식형태로 사용되는 대표적인 당뉴클레오티드에는 뉴클레오티드모노, 디 또는 트리포스페이트 또는 그 유사체를 포함한다.

바람직한예에서, 그 수식당뉴클레오티드는 UDP-글리코시드, CMP-글리코시드 또는 GDP-글리코시드에서 선택한다.

그 수식당뉴클레오티드는 UDP-갈락토오스, UDP-갈락토사민, UDP-글루코오스, UDP-글루코사민, GDP-만노오스, GDP-푸코오스, CMP-시알산 또는 CMP-NeuAc에서 선택하는 것이 더 바람직하다.

그 수식당 뉴클레오티드의 N-아세틸아민 유도체는 또 이 발명의 방법에서 유용하다.

이 발명은 또 수식당, 즉 수식-갈락토오스, 수식-푸코오스, 수식-GalNAc 및수식-시알산을 사용하여 수식펩티드를 합성하는 방법을 제공한다.

수식시알산을 사용할 경우, 시알릴전이효소 또는 트랜스-시알리다아제(α 2,3-결합 시알산 단독에 대하여)를 이들 방법에서 사용할 수 있다.

다른예에서, 그 수식당은 활성화당이다.

이 발명에서 유용한 활성화 수식당은 합성에 의해 변경시켜 활성화 이탈기를 포함하는 글리코시드이다.

여기서 사용되는 용어 "활성화 이탈기" 는 효소에 의해 조정되는 친핵성 치환반응에서 용이하게 치환되는 글리코시드 성분을 말한다.

대부분 활성화당은 이 기술분야에서 공지되었다.

참고문헌으로 다음 문헌을 예시할 수 있다:

Vocadlo et al.,In CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY, Vol,2,Ernst et al.Ed.,Wiley-VCH Verlag:Weinheim,Germany,2000;Kodama et al.,Tetrahedron Lett.34:6419(1993);Lougheed,et al.,J.Biol.Chem.274:37717(1999)).

활성기(이탈기)의 예로는 플루오로, 클로로, 브로모, 토실레이트에스테르, 메실레이트에스테르, 트리플레이트에스테르등을 포함한다.

이 발명에서 사용되는 바람직한 활성화 이탈기는 악셉터에 글리코시드의 효소에 의한 전이를 현저하게 입체 장애하지 않는 이탈기이다.

따라서, 활성화 글리코시드 유도체의 바람직한 예로는 글리코실플루오리드, 와 글리코실메실레이트가 있으며, 글리코실플루오리드가 특히 바람직하다.

그 글리코실플루오리드 중에서는 α-갈락토실플루오리드, α-만노실플루오리드, α-글루코실플루오리드, α-푸코실플루오리드,α-키실로실플루오리드,α-시알릴플루오리드,α-N-아세틸글루코사미닐플루오리드,α-N-아세틸갈락토사미닐플루오리드,β-갈락토실플루오리드,β-만노실플루오리드,β-글루코실플루오리드,β-푸코실플루오리드,β-키실로실플루오리드,β-시알릴플루오리드,β-N-아세틸글루코사미닐플루오리드 및 β-N-아세틸갈락토사미닐플루오리드가 가장 바람직하다.

구체적으로 설명하면, 글리코실플루오리드는 그 당을 우선 아세틸화한 다음, HF/피리딘으로 처리하여 그 유리당에서 제조한다. 이것은 보호된(아세틸화된)글리코실플루오리드(즉,α-글리코실플루오리드)의 열역학적으로 가장 안정성있는 아노머(anomer) 를 생성한다.

덜 안정성 있는 아노머(즉, β-글리코실플루오리드)를 필요로할 경우. 이것은 그 퍼아세틸화당을 HBr/HOAc 또는 HCI 로 전환하여 아노머브로미드 또는 클로리드를 생성하여 제조한다.

이 중간체는 실버플루오리드등 플루오리드염과 반응하여 글리코실플루오리드를 생성한다.

아세틸화 글리코실 플루오리드는 메타놀(즉,NaOMe/MeOH) 중에서 온화한 상태의 (촉매)염기와 반응시켜 탈보호할 수 있다.

또, 대부분의 글리코실플루오리드는 상품에서 얻을 수 있다.

다른 활성화 글리코실 유도체는 이 분야의 기술자에 의해 공지된 통상의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

예로서, 글리코실메실레이트는 그 당의 완전 벤질화된 헤미 아세탈형태를 메실클로리드로 처리한 다음, 촉매에 의한 수소첨가하여 벤질기를 제거함으로 제조할 수 있다.

또 다른 예에서, 그 수식당은 안테나 형상구조를 가진 올리고사카라이드이다.

바람직한 예에서, 그 안테나 형태 구조의 1개 이상의 말단에는 그 수식당 성분을 가진다.

1개 이상의 수식당 성분이 안테나 형상 구조를 가진 올리고사카라이드에 결합할 경우, 그 올리고사카라이드는 그 수식성분을 "증폭" 하는데 유용하며, 그 펩티드에 접합된 각각의 올리고사카라이드는 그 수식기의 다중복제를 그 펩티드에 결합한다.

위 처리공정도에서 설명한 바와 같이 이 발명의 주요한 킬레이트의 일반구조는 다가의 종(species)을 포함하고 있어, 그 결과 안테나 형상 구조를 이용하여 이 발명의 콘주게이트를 제조한다.

대부분 안테나 형상의 사카라이드 구조는 공지되어 있으며, 이 발명의 방법에서는 제한 없이 이들의 구조를 사용하여 실시할 수 있다.

대표적인 수식기를 아래에서 설명한다.

수식기는 폴리펩티드에 한가지 이상의 바람직한 특성을 부여할 수 있는 능력에 대하여 선택할 수 있다.

대표적인 특성에는 약물동태학적 촉진, 약역학적 촉진, 바이오디스트리뷰션(biodistribution)향상, 다가종제공, 물용해도 향상, 지방친화성 촉진 또는 감소, 및 조직표적 설정이 있으나, 한정되어 있는 것은 아니다.

수용성 폴리머

선택된 펩티드의 수소친화성은 아민, 에스테르, 히드록실, 폴리히드록실함유분자등 극성분자와의 접합(conjugation)에 의해 촉진된다.

대표적인 예로는 폴리라이신,폴리에틸렌이민 및 폴리에테르, 즉, 폴리(에틸렌글리콜), m-폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), m-폴리(프로필렌글리콜) 및 기타 O-알킬폴리(알킬렌글리콜)성분이 포함되나, 한정되는 것은 아니다.

바람직한 수용성폴리머는 주로 비형광성이거나, 아세이에서 형광마커(표지)로서 사용에 적합하지 않은 최소량의 형광을 발생한다.

더욱이, 자연발생하는 당이 아닌 폴리머의 사용이 일반적으로 바람직하다.

이와같이 바람직한 폴리머 사용의 제외에는 다른 구성성분(즉, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 바이오분자, 치료성분, 진단성분 등)의 공유결합에 의해 수식되는 자연적으로 발생하는 다른 당의 사용이 있다.

다른예에서, 치료성 당성분은 링커암에 접합되고, 그 다음 그 당-링커암카세트가 이 발명의 방법에 의해 펩티드에 접합된다.

수용성폴리머와 사카라이드의 활성화 하는 방법 및 그 화학적 특성과, 사카라이드와 폴리머를 여러가지의 종에 접합하는 방법은 참고문헌에 기재되어 있다.

폴리머를 활성화하는 통상사용 되는 방법에는 시아노겐브로미드, 퍼아이오데이트, 디비닐술폰, 카르보디이미드, 술포닐할리드, 트리클로로트리아진 등에 작용기를 활성화하는 방법을 포함한다.

참고문헌으로 다음문헌을 예시할 수 있다.

R.F. Taylor,(1991)PROTEIN IMMOBILISATION, FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS,Marcel Dekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992),CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton;G.T.Hermanson et al.,(1993),IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press,N.Y.;R.L.,et al,Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469,American Chemical Society, Washington,D.C.1991).

대부분의 수용성폴리머는 이 분야의 기술자에 의해 공지된 것으로, 이 발명을 실시하는데 유용한다.

그 용어 수용성폴리머에는 사카라이드(즉,덱스트란, 아밀로오스, 히알로우론산, 폴리(시알산), 헤파란스, 헤파린스 등); 폴리(아미노산); 핵산; 합성폴리머( 즉, 폴리(아크릴산), 폴리에테르),즉 폴리(에틸렌글리콜); 펩티드, 단백질 등의 종이 포함한다.

이 발명은 어떤 수용성폴리머 라도 사용하여 실시할 수 있다.

다만, 한정되는 조건을 가진 수용성폴리머는 상기 콘주게이트의 나머지 부분에 결합될 수 있는 지점을 포함할 필요가 있다.

폴리머의 활성화 방법은 다음 특허문헌에 기재되어 있다:

WO94/17039; USP5,324,844; WO94/18247; WO94/04193;USP5,219,564; USP5,122,614;WO90/13540;USP5,281,698;WO93/15189, 활성화폴리머와 펩티드 사이의 접합에 대하여 즉 응집인자 VIII(WO94/15625), 헤모글로빈(WO94/09027), 산소보유분자(USP4,412,989), 리보뉴클레아제 및 수퍼옥사이드 디스무타아제(Veronese등, App.Biochem.Biotech. 11:141-45(1985)).

바람직한 수용성폴리머는 그 폴리머의 샘플중에서 폴리머분자의 실질적인 비가 거의 동일분자량으로 구성되는 폴리머이다. 이와같은 폴리머를 "균일분산성" (homodisperse) 또는 "단분산성" (monodisperse) 이라한다.

또, 이 발명을 폴리(에틸렌글리콜)또는 모노메톡시-폴리(에틸렌글리콜)(m-PEG)콘주게이트에 대하여 설명한다.

PEG의 기능성 작용과 접합에 대한 참고문헌 (수종의 기술잡지와 단행본)을 이용할 수 있다.

예로서, 아래에 참고문헌을 예시한다:

Harris,Macronol.Chem.Phys.C25:325-373(1985);Scouten,Methods in Enzymology 135:30-65(1987);Wong et al.,Enzyme Microb.Technol.14:866-874 (1992) ;Delgado et al.,Critical Reviews in Therapeutic Carrier Systems9:249-304(1992);Zalipsky,Bioconjugate Chem. 6:150-165(1995);and Bhadra,et al.,Pharmazie,57:5-29(2002).

이 발명의 콘주게이트를 형성하는데 유용한 폴리(에틸렌글리콜)은 선상 또는 분기상(branched)이다.

치료성글리코펩티드의 커어브(curve)(AUC)하에 있는 생체내 반감기 또는 영역은 PEG, m-PEG, PPG 및 m-PPG 등 수용성폴리머로 촉진(증강)시킬 수 있다.

예로서, PEG(PEG화)화 또는 m-PEG(m-PEG화)화한 단백질의 화학적 수식은 이들의 분자크기를 증가시키고 이들의 표면과 작용기의 접근성을 감소시킨다.

그 각각의 단백질은 단백질에 결합한 PEG의 크기에 따라 좌우된다.

이 결과, 플라즈마 반감기 또는 AUC 를 개선하며, 단백질 가수분해의 안정성을 얻고, 면역원성 및 간장의 흡수력을 감소한다.

참고문헌은 아래의 문헌을 예시한다:

Chaffee등, J.Clin.Fuvest.89:1643-1651(1992); Pyatak 등, Res.commun. Chem.Pathol.Pharmacol.29:113-127(1980).

인터류킨-2의 PEG화는 생체내 항종양 잠재력을 증가하는 것으로 보고되었다.

참고문헌은 다음과 같다:Katre 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:1487-1491(1987).

단클론성 항체 A7에서 유도된 F(ab') 2의 PEG 화는 종양국부화를 향상한다 (kitamura 등, Biochem. Biophy.Res. commun. 28:1387-1394(1990)).

따라서, 다른바람직한 예에서, 이 발명의 방법에 의해 수용성폴리머로 유도체화한 펩티드의 생체내 반감기는 비유도체화 펩티드의 생체내 반감기 또는 AUC와 대비하여 증가된다.

펩티드에서 생체내 반감기 또는 AUC의 증가는 이양의 % 증가범위로 나타낸다.

% 증가범위의 하한단(lower end)은 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150% 또는 약 200% 이다.

그 % 증가 범위의 상한단은 약 60%, 약 80%, 약100%, 약 150% 또는 약 250% 이상이다.

어느 분자량, 즉 5KD, 10KD, 20KD 및 30KD 의 PEG 성분은 이 발명에서 유용하다.

바이오분자( biomolecules )

다른바람직한 예에서, 그 수식당은 바이오분자를 가진다.

더 바람직한예에서, 그 바이오분자는 작용성(기능성)단백질, 효소, 항원, 항체, 펩티드, 핵산(즉, 단일뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 한가닥사슬 및 사슬핵산), 렉틴, 리셉터 또는 그 조합물이다.

바람직한 바이오 분자는 주로 비형광성 이거나, 또는 아세이에서 형광표지(마커:marker)로서 사용에 적합하지 않은 최소량의 형광을 발광한다.

더욱이, 당이 아닌 바이오분자를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.

이와같이 바람직한 바이오분자의 사용이외에, 자연적으로 발생하는 다른 당의 사용이 있으며, 그 당은 다른성분(즉, PEG, 바이오분자, 치료성분, 진단성분등)의 공유결합에 의해 수식된다.

하나의 대표적예에서, 바이오분자인 당성분은 링커암에 접합되며, 그 다음 그 당-링커암카세트는 이 발명의 방법에 대해 펩티드에 접합한다.

이 발명을 실시하는데 유용한 바이오분자는 어떤 소오스(source)에서도 유도할 수 있다.

그 바이오분자는 자연 소오스에서 분리하거나, 또는 합성방법에 의해 생성할 수 있다.

펩티드에는 자연펩티드 또는 변이 펩티드가 있다. 변이는 화학적 변이유발, 부위지향 변이유발 또는 이 기술분야의 기술자에 의해 공지된 변이를 유발하는 다른 수단에 의해 실행할 수 있다.

이 발명을 실시하는데 유용한 펩티드에는 예로서 효소, 항원,항체,리셉터를 포함한다. 항체는 다클론성 또는 단클론성 이며, 무손상이거나 단편이다. 그 펩티드는 방향성 방출 프로그램의 선택적인 생성물이다.

자연적으로 유도되며 합성된 펩티드와 핵산은 이 발명에서 유용하다.

이들의 분자는 허용할 수 있는 반응성기에 의해 당잔기 성분이나 가교제에 결합할 수 있다.

예로서, 펩티드는 반응성아민, 카르복실, 술프히드릴, 또는 히드록실기에 의 해 결합할 수 있다.

그 반응성기는 펩티드 말단에 또는 펩티드 사슬 내부 위치에 위치할 수 있다.

핵산은 염기(즉, 엑소사이클릭아민)상에서 반응성기에 의해, 또는 당성분(즉, 3'-또는 5'-히드록실)상에서 허용할 수 있는 히드록실기에 의해 결합할 수 있다.

그 펩티드와 핵산사슬은 하나 이상의 부위에서 더 유도체화 되어 그 사슬상에서 적합한 반응성기를 결합하도록 한다.

참고문헌은 다음과 같다:

chrisey 등, Nucleic Acids Res.24:3031-3039(1996).

또 하나의 바람직한 예에서, 그 바이오분자를 선택하여 이 발명의 방법에 의해 수식한 펩티드를 특정조직에 투여함으로써 그 조직에 투여하는 비유도체화 펩티드의 양과 대비하여 상기 조직에 그 수식된 펩티드의 투여를 촉진한다.

또 다른 바람직한 예에서, 선택시간내에서 소정의 조직에 투여한 유도체화된 펩티드의 양은 최소 약 20%, 바람직하게는 최소 약 40%, 더바람직하게는 최소약 100%에서 유도체화를 촉진한다.

표적설정에 적용하는 바람직한 바이오분자에는 항체, 호르몬 및 세포표면 리셉터의 리간드(ligands)를 포함한다.

하나의 대표적예에서, 바이오틴(biotin)을 가진 콘주게이트를 제공한다.

이와같이, 하나의 예로서 선택적으로 바이오티닐화된 펩티드를 1개 이상의 수식기를 가진 아비딘(avidin)또는 스트렙트아비딘 성분을 결합시켜 제조한다.

치료성분

또 다른바람직한 예에서, 그 수식당에는 치료성분을 포함한다.

이 분야 기술자는 오버랩(overlap)이 치료성분과 바이오분자 사이에 존재한다는 것을 알 수 있다.

다수의 바이오 분자는 치료특성 또는 치료 잠재성을 가진다.

상기 치료성분은 임상용으로 이미 허용되는 화학제, 또는 사용을 실험한 약제이며, 그 활성 또는 작용메카니즘은 연구중에 있다.

그 치료성분은 소정의 질병상태에서 입증된 작용을 가지며, 또 소정의 질병상태에서 바람직한 작용을 나타내는 것으로 가정할 뿐이다.

바람직한 예에서, 그 치료성분은 화합물로서 선택된 조직과 새로 작용할 수 있는 작용능력에 대하여 스크리닝을 한 것이다.

이 발명을 실시하는데 유용한 치료성분에는 여러가지의 약리학적 활성을 가진 범위가 넓은 약제등급에서 선정된 약제를 포함한다.

바람직한 치료성분은 주로 비형광성이거나, 또는 아세이에서 형광표지로서 사용에 적절하지 아니한 최소량의 형광을 발광한다.

더욱이, 당이 아닌 치료성분의 사용이 일반적으로 바람직하다. 이와같이 바람직한 당사용 이외에, PEG, 바이오분자, 치료성분, 진단성분 등 또 다른성분의 공유결합에 의해 수식된 당의 사용이 있다.

다른 대표적예에서, 치료당성분은 링커암에 접합되고, 그 다음 당-링커암카세트가 이 발명의 방법에 의해 펩티드에 접합된다.

여러가지의 다른종에 치료제와 진단제를 접합하는 방법은 이 분야의 기술자에 의해 공지되었다.

참고문헌을 아래에 예시한다:

Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego,1996; and Dunn et al.,Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol.469, American Chemical Society, Washington,D.C.1991.

하나의 대표적예에서, 그 치료성분은 선택조건에 따라 분리되어 결합에 의해 수식당에 결합된다.

대표적인 조건에는 선택된 pH(즉, 위, 장, 세포질내 액포), 활성효소(즉, 에스테라아제, 환원효소, 산화효소), 일광, 열 등을 포함하며, 한정된 것은 아니다.

다수의 분리기(cleaveable group) 은 공지되었다.

참고문헌으로 다음의 문헌을 예시한다:

Jung et al., Biochem. Biophys.Acta,761:152-162(1983);Joshi et al., Biol. Chem, 265:14518-14525(1990);Zarling et al.,J. Immunol.,124;913-920(1980);Bouizar et al.,Eur.J.Biochem.,155:141-147(1986),Park 등, J.Biochem.,261:205-210(1986);Browning et al.,J.Immunol.,143:1859-1867(1989).

유용한 치료성분의 등급에는 예로서, 비스테로이드당 항염증 약제(NSAIDS)가 있다.

그 NSAIDS는 예로서 다음 카테고리에서 선택할 수 있다:

(즉, 프로피온산유도체, 아세트산유도체, 페남산유도체, 비페닐카르복실산유도체 및 옥시캄);

스테로이달항염증약제(히드로코르티손등 포함);

항히스타민약제(즉, 클로르페니라민, 트리프롤리딘);

진해성 약제(즉, 덱스트로메토르판, 코데인, 카라미펜 및 카르베타펜탄);

지양약제(antipruritic drugs)(즉, 메트딜라진 및 트리메프라진); 콜린억제성 약제(즉, 스코폴라민, 아트로핀, 호마트로핀, 레보도파); 진토 밑 최토억제 약제(즉, 시클리진, 메틀리진, 클로르프로마진, 부클리진); 식용감퇴약제(즉, 벤즈페타민, 펜테르민, 클로르펜테르민, 펜플루라민);

중추자극약제(즉, 암페타민, 메탐페타민, 덱스트로암페타민 및 메틸페니레이트);

부정맥 억제약제(즉, 프로파놀롤, 프로카인아미드, 디소피라미드, 퀴니딘, 엔카인이드);

β- 아드레날린차단약제(즉, 메토프롤롤, 아세부톨롤, 베탁솔롤, 라베탈롤 및 티몰롤);

강심약제(즉, 밀리논, 암리논 및 도부타민);

승압약제(즉, 에날라프릴, 클로니딘, 히드랄라진, 미녹시딜, 구아나드렐, 구아네티딘);

이뇨약제(즉, 아밀로디드 및 히드로클로로티아지드);

혈관확장약제(즉, 딜티아젬, 아미오다론, 이속스수프린, 닐리드린, 톨라졸린 및 베아파밀);

혈관수축약제(즉, 디히드로에르고타민, 에르고타민 및 메틸세르기드);

향궤양약제(즉, 라니티딘 및 시메티딘);

마취제(즉, 리도카인, 부피바카인, 클로로프로카인, 디부카인);

항우울제(즉, 이미프라민, 데시프라민, 아미트립틸린, 노르트립틸린);

정안 안정제 및 진정제(즉, 클로르디아제폭시드, 베나시티진, 벤즈퀸아미드, 플루라제판, 히드록시진, 록사핀 및 프로마진);

항정신 병약(즉, 클로르프로틱센, 플루페나진, 할로페리돌, 몰린돈, 티오리다진 및 트리플루오페라진);

향균성약제(항균(박테리아)약제, 항진균약제, 항원충약제 및 항바이러스약제).

이 발명 조성물에 배합하는데 바람직한 향균성약제에는 예로서, β-락탐약제, 퀴놀론약제, 시프로플록사신, 노르플록사신, 테트라시클린, 에리트로마이신, 아미카신, 트리클로산, 독시시클린, 카프레오마이신, 클로르헥시딘, 클로르테트라시클린, 옥시테트라시클린, 시클린다마이신, 에탑부톨, 헥사미딘, 이소티오네이트, 메트로니다졸, 펜타미딘, 겐타마이신, 카나마이신, 리네오마이신, 메타시클린, 메텐아민, 미노시클린, 네오마이신, 네틸마이신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 미코나졸 및 아만타딘이 있다.

이 발명을 실시하는데 유용한 다른 약제성분에는 항종양약제(항암제)[즉, 항 안드로겐(즉, 류롤리드 또는 플루타미드)], 세포치사성제(즉, 아드리아마이신, 독소루비신, 탁솔, 시클로포스파미드, 부술판, 시스플라틴, β-2-인터페론), 항에스트로겐(즉, 타목시펜), 항대사제(즉, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토푸린, 티오구아닌)가 있다.

또, 이 등급약제에는 진단 및 치료용 방사성 동위원소 기초제와, 콘주게이트 톡신(리신, 겔다나마이신, 미탄신, CC-1065, 듀오카르마이신, 킬리케아마이신 및 관련 구조체와 그 유사체 등)을 포함한다.

그 치료성분에는 또 호르몬(즉, 메드록시프로게스테론, 에스트라디올, 류프롤리드, 메게스트롤, 옥트레오티드 또는 소마토스타틴); 근육이완약제(즉, 신나메드린, 시클로벤자프린, 플라복스에이트, 오르페나드린, 파파베린, 메베베린, 이다베린, 리토드린, 디페녹실레이트, 단트롤렌 및 아주몰렌);

항경축약제(antispasmodic drugs); 뼈 활성약제(즉, 디포스페이트 및 포스포노알킬포스피네이트 약제 화합물); 내분비 조절약제(즉, 피임약 즉, 에티노디올, 에티닐에스트라디올,노레틴드론,메스트라놀,데소게스트렐, 메드록시프로게스테론),당뇨병 조절제(즉, 글리부리드 또는 클로르프로프아미드), 아나볼직(테스토락톤 또는 스타노졸롤 등), 안드로겐(즉, 메틸테스토스테론, 테스토스테론 또는 플루옥시메스테론), 항이뇨제(즉, 데스모프레신) 및 칼시토닌)가 있다.

또, 이 발명에는 에스토로겐(estrogen)(즉, 디에틸스틸-베스테롤), 글루코코르티코이드(즉, 트리암시놀론, 베타메타손 등) 및 프로게스토겐(노레틴오론, 에티노디올, 노레틴드론, 레보노노로게스트렐 등); 갑상선제(즉, 리오티로닌 또는 레보 티록신) 또는항갑상선제(즉, 메티마졸); 항하이퍼프로낙틴혈증약제(즉, 카베르골린); 호르몬 억제제(즉, 다나졸 또는 고세렐린), 자궁수축제(즉, 메틸에르고노빈 또는 옥시토신) 및 프로스타글라딘(미오프로스톨, 알프로스타딜 또는 디노프로스톤 등)이 유용하게 사용할 수 있다.

다른 유용한 수식그룹(modifying groups)에는 면역조절약제(즉, 앤티히스타민, 비만세포안정제[로독사미드 및/또는 크로몰린, 스테로이드/즉 트리암시놀론, 베클로메타존, 코르티손, 덱사메타손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베클로메타손, 또는 클로베타솔등)], 히드타민 H2 길항물질(즉, 파모티딘, 시메티딘, 라니티딘), 면역억제제(즉, 아자티오프린, 시클로스포린) 등이 있다.

술린닥, 에토도락, 케토프로펜 및 케토로락등 항염증활성을 가진 그룹도 유용하다.

이 발명과 관련된 유용한 다른 약제는 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.

수식당의 제조

일반적으로, 상기 당성분과 수식그룹은 반응성기를 사용하여 동시에 결합된다. 여기서 반응성기는 생리적으로 관련된 상태하에서 미반응성인 새로운 유기질 작용기 또는 종(species)으로 결합프로세스에 의해 주로 형질전환된다.

그당 반응성 작용기는 그 당 성분상의 어느 위치에 설정된다.

이 발명을 실시하는데 유용한 반응등급과 반응성기는 일반적으로 바이오콘주게이트 화학의 기술분야에서 공지된 것이다.

반응성 당성분과 허용할 수 있는 현행 등급의 반응은 비교적 온화한 조건하에서 처리되는 반응이다.

이들의 반응에는 친핵치환(즉, 아민 및 알코올과 아실할라이드, 활성에스테르의 반응), 친전자치환(즉, 에나미반응) 및 탄소-탄소와 탄소-헤테로원자 다중결합의 부가(즉, 미카엘반응, 리엘스-알데르부가)가 포함되나, 한정된 것은 아니다.

상기 반응과 다른 유용한 반응은 다음문헌에 기재되어 있으며, 다음 문헌을 예시할 수 있다;

March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3rd Ed.,John Wiley & Sons, New York,1985;Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego,1996; and Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS;Advances in Chemistry Series,Vol. 198,American Chemical Society, Washington, D.C.,1982.

당핵 또는 수식그룹에서 다른(현수된)유용한 반응성작용기에는 다음에 설명하는 기(groups)가 포함되나, 한정된 것은 아니다:

(a) N-히드록시숙신이미드에스테르, N-히드록시벤즈트리아졸에스테르, 산할라이드, 아실이미다졸, 티오에스테른, P-니티로페닐에스테르, 알킬,알케닐, 알키닐 및 방향족에스테르를 포함하는 카르복실기 및 여러가지의 그 유도체(한정된 것은 아님);

(b) 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환시킬 수 있는 히드록실기;

(c) 할로알킬기, 여기서 할라이드는 아민, 카르복실레이트아니온, 티올아니온 카르바니온, 또는 알콕시드이온 등 친핵기와 후치환하여 할로겐 원자의 작용기 에서 새로운 기의 공유결합을 얻는다;

(d) 친디엔체기(dienophile groups),즉 말리이미도기(maleimido groups)등 디엘스-알데르(Diels-Alder)반응에 참가 할 수있는 친디엔체기;

(e) 예로서 이민, 히드라존, 세미카르바존 또는 옥심등 카르보닐유도체의 형성에 의해, 또는 그리그나아드(Grignard)부가 또는 알킬리튬 부가 등의 메카니즘에 의해 후(subsequent)유도체화가 가능하도록 하는 알데히드기 또는 케톤기;

(f) 예로서, 아민과의 후반응으로 술폰아미드를 형성하는 술포닐할라이드기;

(g) 예로서 디술피드로 전환하거나 아실할라이드와 반응할 수 있는 티올기;

(h) 예로서 아실화, 알킬화 또는 옥시다이즈화 할 수 있는 아민 또는 술프히드릴기;

(i) 예로서 시클로부가, 아실화, 미카엘 부가등을 실시할 수 있는 알켄; 및

(j) 예로서, 아민과 히드록실화합물을 반응할 수 있는 에폭시드.

그 반응성 작용기는 반응성 당핵 또는 수식그룹을 집합하는데 필요한 반응에 참가하거나, 간섭하지 않도록 선택할 수 있다.

또, 반응성작용기는 보호기의 존재에 의해 반응의 참가에서 보호받을수 있다.

이 분야의 기술자는 선택한 반응조건에 간섭하지 않도록 소정의 작용기를 보호하는 방법에 대하여 이해한다.

유용한 보호기의 예로서, 다음문헌을 예시할 수 있다:

Greene 등, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

아래의 설명에서는 이 발명을 실시하는데 유용한 수식당의 다수의 소정예를 설명한다.

대표적인예에서, 시알산유도체는 수식그룹이 결합된 당핵으로 이용한다.

시알산 유도체에 대한 설명요지는 구체적 설명만을 명백하게 하기 위한 것으로, 이발명의 범위를 한정한 것은 아니다.

이 분야의 기술자는 다수의 다른당 성분을 활성화시켜, 예로서 시알산을 사용하여 기술된 것과 상동성 있게 유도체화 할수 있다는 것을 이해한다.

예로서, 이 기술분야에서 알려진 방법에 의해 용이하게 수식되는 수종의 당기질인 갈락토오스, 글루코오스, N-아세틸갈락토사민 및 푸코오스를 수식하는데 여러가지의 방법을 이용할 수 있다.

아래의 문헌을 예시한다:

Elhalabi 등, Curr.Med.Chem.6:93(1999); 및 Schafer 등, J. Org. Chem. 65: 24(2000).

하나의 대표적예에서, 이 발명의 방법에 의해 수식된 펩티드는 원핵세포(즉, E.coli),진핵세포(효모 및 포유동물세포포함)(즉,CHO 세포) 또는 형질전환 동물에서 생성된 글리코펩티드 이며, 불충분하게 시알릴화된 N-및/또는 O-결합올리고사카라이드 사슬을 포함한다.

시알산이 결여되고 말단갈락토오스잔기가 함유된 글리코펩티드의 상기 올리고사카라이드 사슬은 PEG화 할 수 있고, PPG화 할 수 있으며,또는 수식시알산으로 수식할 수 있다.

대표적인 PPG-시알산 유도체는 다음 2가지 식을 포함한다:

(위식에서, L 은 시알산 성분과 PEG 성분을 연결하는 치환 또는 비치환 알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬링커 성분이며, "n" 은 1 이상이다.)

(위식에서, 지수 "s" 는 0~20의 정수를 나타내며, "n" 는 1이상이다.)

다음의 처리공정도(스킴)4에서는 아미노글리코시드1 을 보호아미노산(즉, 글리신)유도체의 활성에스테르와 처리하여, 그당 아민잔기를 그상응하는 보호 아미노산아미드부가물로 전환 한다.

그 부가물(adduct)는 알돌라아제로 처리하여 α-히드록시카르복실레이트 2를 형성한다.

그 화합물 2는 CMP-SA 합성효소의 작용에 의해 그 상응하는 CMP 유도체로 전환한 다음, 그 CMP유도체를 촉매에 의해 수소첨가하여 화합물 3을 생성한다.

그 글라이신 부가물의 형성에 의해 도입된 아민은 화합물 3을 활성화된 PEG 또는 PPG 유도체(즉, PEG-C(0)NHS, PEG-oc(0))-P-니트로페닐)와 반응하여 PEG 결합위치로 이용하여, 각각 화합물 4 또는 5 등의 종(species)을 생성한다.

다음표 1은 PEG 또는 PPG 성분으로 유도체화한 당모노포스페이트의 대표적예를 설명한 것이다.

인간성장호르몬 변이체는 처리공정도 1의 방법에 의해 수식할 수 있다.

다른 유도체는 이 기술분야에서 알려진 방법에 의해 제조한다.

참고문헌을 다음에 예시한다:

Keppler 등, Glycobiology 11:11R(2001);

charter 등, Glycobiology 10:1049(2000).

다른 아민반응성 PEG 및 PPG유사체는 상품으로 입수 하나거나, 이 분야 기술자에 의해 쉽게 이용할 수 있는 방법에 의해 제조할 수 있다.

이 발명을 실시하는데 유용한 수식당포스페이트는 다른 위치와 위에서 설명한 위치에서 치환할 수 있다.

시알산의 바람직한 치환은 다음식(I)에서 설명한다:

위식에서,

X는 결합기로, -o-, -N(H)-, -S, CH₂-, -N(R)₂

(각각 R은 R¹-R⁵ 에서 각각 선택한 멤버임) 에서 선택하는 것이 바람직하며,

Y, Z, A 및 B는 각각 하나의 기를 나타내며, 그 기는 X 의 동정에 대하여 위에서 설명한 기에서 선택한다.

X, Y, Z, A 및 B는 각각 독립적으로 선택되고, 이들의 기는 같거나 다르다.

R¹, R², R³, R⁴ 및 R⁵ 는 H, 수용성폴리머, 치료성분, 바이오분자, 또는 다른성분을 나타낸다.

또, 상기부호(R¹~R⁵)는 수용성폴리머, 치료성분, 바이오분자 또는 다른성분에 결합하는 하나의 링커를 나타낸다.

여기서 설명한 콘주게이트에 결합한 대표적성분에는 PEG유도체(즉, 알킬-PEG, 아실-PEG, 아실-알킬-PEG, 알킬-아실-PEG카르바모일-PEG, 아릴-PEG), PPG유도체(즉, 알킬-PPG, 아실-PPG, 아실-알킬-PPG, 알킬-아실-PPG카르바모일-PPG, 아릴-PPG), 치료성분, 진단성분, 만노오스-6-포스페이트, 헤파린, 헤파란, SLex, 데르마 탄, 알부민, 인터그린, 촉각형상 올리고사카라이드, 펩티드 등이 있으며, 한정된 것은 아니다.

여러가지의 수식그룹을 사카라이드 성분에 접합하는 방법은 이 분야의 기술자에 의해 쉽게 이용할 수 있다.

다음에 참고문헌을 예시한다:

POLY(ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY:BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS,J.Milton Harris,Ed.,Plenum Pub. Corp.,1992;POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS,J.Milton Harris,Ed.,ACS symposium Series No.680, American Chemical Society,1997;Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego,1996;and Dunn et al.,Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,ACS Symposium Series Vol.469,American Chemical Society, Washington,D.C.1991.

가교기(cross-linking groups)

이 발명의 방법에 유용한 수식당의 제조에는 당잔기에 수식그룹의 결합과 글리코실전이효소의 기질인 안정성 있는 부가물의 형성을 포함한다.

그당 및 수식그룹은 O(zero)차 또는 고차(higher-order)가교제에 의해 결합할 수 있다.

카르보히드레이트 성분에 수식그룹을 결합하는데 사용할 수 있는 대표적인 2작용성 화합물에는 2작용성 폴리(에틸렌글리콜), 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리에 스테르 등이 있다.

다른분자에 카르보하이드레이트를 결합하는 일반적인 접근방법은 다음 참고문헌에서 공지되었다:

Lee등, Biochemistry 28;1856(1989);

Bhatia등, Anal.Biochem.178:408(1989);

Janda등, J.Am.Chem.Soc.112:8886(1990);

Bednarski등, WO92/18135.

다음 설명에서, 그 반응성기는 미완성 수식당의 당성분상에서 양성(benign)으로 처리한다.

상기 설명의 요지는 설명을 명백하게 하기 위한 것이다.

이 분야의 기술자는 상기 설명은 수식그룹상에서의 반응성기에 관련하여 구체적으로 설명한 것으로 이해할 것이다.

하나의 대표적인 구성지침에는 헤테로 2 작용성가교제(crosslinker)SPDP(n-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 사용하여 그 당에 보호된 술프히드릴의 결합과 그 다음 그 수식그룹상에서 다른 술프히드릴과 디술피드 결합을 형성하는 것을 포함한다.

SPDP가 글리코실전이효소기질로서 작용하는 수식당의 작용능력에 유해할 경우 2-이미노티올란 또는 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA)등 다른가교제 중 하나를 사용하여 디술피드를 형성한다.

2-이미노티올란은 1급 이민과 반응하여, 즉시 아민함유분자 상에서 탈보호된 술프히드릴을 결합한다.

또, SATA는 1급 아민과 반응하나, 탈보호술프히드릴을 결합하며, 히드록실아민을 사용하여 후탈아세틸화(later deacetylation)시켜 유리술프히드릴을 생성한다.

각각의 경우, 그 결합된 술프히드릴은 유리하여 다른 술프히드릴 또는 보호 술프히드릴과 반응함으로써 SPDP에서와 같이 필요로 하는 디술피드 결합을 형성한다.

위에서 설명한 구성지침은 이 발명에서 유용한 링거(linkers)의 대표적인 예로서, 한정한 것은 아니다.

상기 수식그룹을 펩티드에 가교하는 다른 구성에서 사용할 수 있는 다른 가교링커를 이용할 수 있다.

예로서, TPCH(S-(2-티오피리딜)-L-시스테인히드라지드)와 TPMPH(S-(2-티오피리딜)메르캅토-프로피오노히드라지드)는 퍼아이오데이트와 온화한 반응을 하여, 가교제의 하이드라지드 부분과 퍼아이오데이트 발생 알레히드 사이에서 히드라존 결합을 형성한다.

TPCH 및 TPMPH는 2-피리딜티온보호술프히드릴기를 그 당에 도입하여, DTT로 탈보호한 다음 성분사이에서 디술피드 결합의 형성등 콘주게이션(conjugation)에 사용할 수 있다.

디술피드결합이 안정성 있는 수식당의 생성에 부적합한 것으로 확인될 경우, 성분사이에서 더 안정성 있는 결합을 형성하는 다른 가교제를 사용할 수 있다.

그 헤테로 2 작용성 가교제 GMBS(N-감마-말이미도부티릴옥시)숙신이미드)와 SMCC(숙신이미딜4-(N-말레이미도-메틸)시클로헥산)는 1급 아민과 작용함으로써, 말레이미드기를 그 성분에 도입한다.

그 말레이미드기는 다음으로 다른 성분상에서 술프히드릴과 반응하여, 위에서 설명한 가교제에 의해 도입됨으로써 성분 사이의 안정성 있는 티오에테르 결합을 형성한다.

성분사이에서 입체장애가 성분의 활성 또는 글리코실 전이효소기질로서 작용하는 수식당의 작용능력과 간섭될 경우, 성분사이에 긴스페이서암(spacer arms)을 도입하여 위에서 설명한 가교제(즉, SPDP)의 일부유도체를 포함한다.

이와같이, 다수의 적합한 가교제(crosslinkers)가 존재하여, 이들의 가교제는 유용하며 각각 효과에 따라 선택한다. 최적의 펩티드 상에는 콘주게이트와 수식당 생성물을 가진다.

여러가지의 시약을 사용하여 수식당의 성분을 분자간 화학적 가교제로 수식한다.

가교시약 및 가교처리공정에 대한 문헌을 아래에 예시한다:

Wold,F.,Meth.Enzymol.25:623-651,1972;Weetall,H.H.,and Cooney,D.A.,In:ENZYMES AS DRUGS.(Holcenberg,and roberts,eds.)pp.395-442,Wiley,New York,1981;Ji,T.H.,Meth.Enzymol.91:580-609,1983;Mattson et al.,M ol.Biol.Rep.17:167-183,1993

위 인용한 문헌은 여기서 참고로 설명한 것이다.

바람직한 가교시약은 여러가지의 0(zero)-길이, 호모(homo) 2작용성 및 헤테로 2 작용성 가교시약에서 유도된다.

0(zero)길이 가교시약에는 외인성재(extrinsic material)의 도입이없는 2개의 내인성 화학기의 직접접합(Conjugation)을 포함한다.

디술피드 결합의 형성을 촉진하는 촉진제는 이카테코리에 속한다. 다른예에는 카르복실기와 1급 아미노기의 축합을 유도하여, 카르보디이미드, 에틸클로로포름메이트, 우드워드시약 K(2-에틸-5-페닐이소옥사졸륨-3'-술포네이트) 및 카르보닐디이미타졸 등 아미드결합을 형성하는 시약이 있다.

이들의 화학적 시약 이외에, 효소 트랜스글루타미나아제(글루타밀-펩티드 γ-글루타밀전이효소; EC2,3,2,13)를 제로길이 가교시약으로 사용할 수 있다.

이 효소는 단백질-결합 글루타미닐잔기의 카르복사미드기에서 아실전이 반응을 통상적으로 기질로서 1급 아미노기로 촉진한다.

바람직한 효모-및 헤테로-2 작용성 시약에는 2개의 동일 또는 2개의 다른 부위를 각각 포함하여, 아미노,술프히드릴,구아니디노, 인돌 또는 비특정기에 대하여 반응성이 있다.

아미노- 반응성기

하나의 바람직한예에서, 가교링커상에서 부위는 아미노반응성기이다.

아미노반응성기의 유용한 비한정예에는 카르보네이트에스테르, N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 아실할라이드, 아릴 아지드, P-니트로페닐에스테르, 알데히드 및 술포닐클로리드가 있다.

NHS에스테르는 수식당성분의 1급(방향족 포함)아미노기와 반응하는 것이 바람직히다.

히스티딘의 이미다졸기는 반응에서 1급 아민의 수용적격에 대하여 공지되어있으나, 그 반응생성물은 불안정하여 용이하게 가수분해 한다. 그 반응에는 NHS에스테르의 산카르복실상에서 아민의 친핵공격을 포함한다.

따라서, 원(original)아미노기의 포지티브(positive)변화를 상실한다.

"이미도에스테르" 는 수식당성분의 아민기와의 반응에서 가장 특이성 있는 아실화 시약이다.

PH7 ~ PH10 에서 이미도에스테르는 1급 아민과 단독으로 반응한다. 1급 아민은 이미데이트에 대하여 친핵을 공격하여 중간체 물질을 생성하며, 그 중간체 물질은 pH값이 높을때 아미딘으로 또는 PH값이 낮을때 새로운 이미데이트로 절단(break down)하여 분리된다.

그 새로운 이미데이트는 다른 1급 아민과 반응함 으로써, 2개의 아미노기를 가교하며, 하나의 추정되는 단작용성 이미데이트의 경우에는 2 작용성 반응을 한다.

1급아민과의 반응에서 주생성물은 아미딘이며, 그 아미딘은 원(original) 아민보다 더 강한 염기이다. 따라서, 그 원 아미노기의 포지티브 전하를 가진다.

이소시아네이트(및 이소티오시아네이트)는 수식당성분의 1급 아민과 반응하여 안정성 있는 결합을 형성한다.

술프히드릴, 이미다졸 및 티로실기와 이들의 반응에는 비교적 불안정성이 있는 생성물을 얻는다.

아실아지드는 또 아미노특이성 시약으로 사용되며, 이 시약에서는 그 친화성 성분의 친핵아민이 약알칼리 상태하에서, 즉 PH8.5에서 산성의 카르복실기를 공격한다.

1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠등 아릴할라이드는 수식당 성분의 아미노기 및 티로신페놀성기와 바람직하게 반응하나, 술프히드릴기 및 이미다졸기와도 반응한다.

모노 및 디카르복실산의 P-니트로페닐에스테르는 또 유용한 아미노-반응성기이다.

그 시약의 특이성이 대단히 높지 않으나, α-및 ε-아미노기가 출현하여 가장 신속하게 반응한다.

글루타르알데히드등 알데히드는 수식당의 1급 아민과 반응한다.

불안정한 쉬프(schiff) 염기는 알데히드족의 알데히드와 아미노기가 반응할 때 형성되나, 글루타르알데히드는 그 수식당을 안정성 있는 가교에 의해 수식할 수 있다.

주요한 가교조건의 PH로서, PH 6 ~ 8에서 그 사이클릭폴리머는 탈수반응을 하여 α-β 불포화알데히드폴리머를 형성한다. 그러나, 쉬프염기는 다른 2중결합에 접합(conjugation)할 때 안정성이 있다.

2개의 2중결합의 공명상호작용으로 쉬프결합의 가수분해를 방지한다.

또, 높은 국부농도(local concentration)에서 아민은 에틸렌 2중결합을 공격하여 안정성 있는 미카엘 부가 생성물을 형성한다.

술포닐클로라이드가 수식당성분의 다수의 부위와 반응하나, 아미노기과의 반응이 가장 중요한 것으로 안정성 있는 술폰아미드 결합이 얻어진다.

술프히드릴 반응성기

다른 바람직한예에서, 그 부위에는 술프히드릴 반응성기가 있다.

술프히드릴 반응성기의 유용한 예(제한없음)에는 말레이미드, 알킬할라이드, 피리딜디술피드 및 티오프탈이미드가 있다.

말레이미드는 수식당성분의 술프히드릴기와 반응하여 안정성 있는 티오에테르 결합을 형성하는 것이 바람직하다.

또 말레이미드는 히스티딘의 1급아미노기 및 이미다졸기와 상당히 느린속도로 반응한다. 그러나, PH7에서 간단한 티올의 반응속도는 그 대응하는 아민의 반응속도보다 1000배 더 크기때문에 PH7에서 말레이미드기는 술프히드릴-특정기로 볼 수 있다.

알킬할라이드는 술프히드릴기, 술피드, 이미다졸 및 아미노기와 반응한다.

그러나, 중성내지 약알칼리 PH에서 알킬할라이드는 우선 술프히드릴기와 반응하여 안정성 있는 티오에테르 결합을 형성한다.

PH가 더 높아질 때 아민기와의 반응이 바람직하다.

피리딜디술피드는 디술피드 교환에 의해 유리술프히드릴과 반응하여 혼합디 술피드를 얻는다.

그 결과, 피리딜디술피드는 가장특이성 있는 술프히드릴 반응성기가 된다.

티오프탈이미드는 유리술프히드릴기와 반응하여 디술피드를 얻는다.

카르보닐- 반응성잔기

또 다른 예에서, 물 및 유기용제에서 용해할 수 있는 카르보디이미드는 카르복실 반응성 시약으로 사용된다.

이들의 화합물은 유리카르복실기와 반응하여 슈도우레아를 형성하며, 그 다음 이용할수 있는 아민에 결합하여 아미드 연결을 얻는다. 이것은 카르복실기를 카르보디이미드로 수식하는 방법을 나타낸 것이다(Yamada등, Biochemistry 20: 4836-4842,1981).

부위-특정 반응성성분의 사용이외에, 이 발명에서는 비특정반응성기의 사용을 고려하여 그 당을 수식그룹에 결합한다.

대표적인 비특정 가교링커에는 어두운 곳에서 완전 불활성인 광활성화기가 포함되며, 그 활성화기는 적합한 에너지의 광자를 흡수할 때 반응성종으로 전환한다.

하나의 바람직한 예에서, 광활성화기는 아지드의 가열 또는 광분해를 할 때 발생하는 니트렌(nitrenes)의 전구물질에서 선택한다.

전자-결함 니트렌(electron-deficient nitrenes)은 가장반응성이 있어, N-H, O-H, C-H 및 C=C 를 포함하는 여러가지의 화학적 결합과 반응할 수 있다.

3가지 타입의 아지드(azides)(아릴, 알킬 및 아실유도체)를 사용할 수도 있으나, 현재로는 아릴아지드가 바람직하다.

광분해 할 때 아릴아지드의 반응성은 C-H 결합에서 보다 N-H 와 O-H 의 결합에서 더 좋다.

전자-결함아릴니트렌은 신속하게 링-확대하여 탈수소아제핀을 형성하며, C-H 삽입 생성물의 형성보다 오히려 친핵과 반응하는 경향이 있다.

아릴아지드의 반응성은 그 링에서 히드록실기 또는 니트로기등 전자중단치환체(electron-withdrawing substituents) 의 존재에 의해 증가할 수 있다.

이와같은 치환체는 아릴아지드의 최대흡수를 더 긴 파장까지 촉진한다.

비치환 아릴아지드는 260~280nm의 최대흡수를 가지나, 히드록시 및 니트로아릴아지드는 305nm 이상의 상당한 빛을 흡수한다.

따라서, 히드록시 및 니트로아릴아지드가 가장바람직하다.

그 이유는 비치환 아릴아지드에서 보다 그 친화성 성분에 대하여 덜 유해한 광분해 조건의 사용을 허용하기 때문이다.

다른바람직한예에서, 광활성화기는 플루오린화 아릴아지드에서 선택한다.

플루오린화아릴아지드의 광분해 생성물은 아릴니트렌이며, 모두 상기 아릴니트렌은 C-H 결합 삽입을 포함하여 이 그룹의 특징적인 반응을 효율높게 실시한다

(Keana 등, J.org.chem. 55:3640-3647, 1990).

또다른예에서, 광활성화기는 벤조페논 잔기에서 선택한다. 벤조페논 시약은 일반적으로 아릴아지드 시약에서 보다 가교수율이 더 높다.

다른예에서, 광활성화기는 광분해할때 전자결함 카르벤을 형성하는 디아조 화합물에서 선택한다.

이들의 카르벤은 C-H 결합의 삽입, 2중 결합의 부가(방향족계 포함), 수소유인(atraction) 및 카본이온을 나타내는 친핵센터(nucleophilic centers)의 배위를 포함하는 여러가지의 반응을 실시한다.

또 다른 예에서, 광활성화기는 디아조피루베이트에서 선택한다. 예로서, P-니트로페닐디아조피루베이트의 P-니트로페닐에스테르는 지방족 아민과 반응하여 디아조피루브산아미드를 얻으며, 그 디아조피루브산 아미드는 자외선 광분해를 하여 알레히드를 형성한다.

광분해한 디아조피루베이트-수식친화성 성분은 포름알데히드 또는 글루타르알데히드와 같이 반응하여 가교를 형성한다.

1급 아민과 반응성이 있는 호모 2작용성 가교링커

아민-반응성 가교링커의 합성, 특성 및 적용은 참고문헌에 기재되어 있다(가교처리공정 및 시약에 대해서는 위에서 인용한 문헌참조).

대부분의 시약은 제품으로 입수할 수 있다(즉, Pierce chemical company, Rockford, Ⅲ; sigma chemical company, St.Louis, MO; Molecular probes, Inc, Eugene, OR.).

호모 2작용성 NHS 에스테르의 바람직한 예(비한정)에는 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(술포숙신이미딜) 수베레이트 (BS), 디숙신이미딜 타르타레이트(DST), 디술포숙신이미딜 타르타레이트(Sulfo-DST), 비스-2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸술폰(BSOCOES), 비스-2-(술포숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸술폰(sulfo-BSCOES), 에틸렌글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜비스(술포숙신이미딜숙시네이트)(sulfo-EGS), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP) 및 디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트)(sulfo-DSP)가 있다.

호모 2작용성 이미도에스테르의 바람직한예(비한정)에는 디메틸말론이미레이트(DMM),디메틸숙신이미레이트(DMSC), 디메틸아디피미레이트(DMA), 디메틸피멜이미레이트(DMP), 디메틸수베르이미레이트(DMS), 디메틸-3,3'-옥시디프로피온이미레이트(DODP), 리메틸-3,3'-(메틸렌디옥시)디프로피온이미레이트(DMDP), 리메틸-3'-(디메틸렌디옥시)의 프로피온이미레이트(DDDP), 리메틸-3,3'-(테트라메틸렌드옥시)-디프로피온이미레이트(DTDP) 및 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미레이트(DTBP)가 있다.

호모 2 작용성 이소티오시아네이트의 바람직한예(비한정)에는 P-페닐렌디이소티오시아네이트(DTTC)와 4,4'-디이소티오시아노-2,2'-디술폰산스틸벤(DDS)이 있다.

호모 2작용성 이소시아네이트의 바람직한예(비한정)에는 키실렌-디이소시아네이트, 톨루엔-2,4-디이소시아네이트, 톨루엔-2-이소시아네이트-4-디소티오시아네이트, 3-메톡시디페닐메탄-4,4'-디이소시아네이트, 2,2'-디카르복시-4,4'-다조페닐디이소시아네이트 및 헥사메틸렌디이소시아네이트가 있다.

호모 2 작용성 아릴할라이드의 바람직한예(비한정)에는 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(DFDNB)와 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐-술폰이 있다.

호모 2 작용성 지방족 알레히드시약의 바람직한예(비한정)에는 글리옥살, 말론디알레히드 및 글루타르알레히드가 있다.

호모 2 작용성 아실화시약의 바람직한예(비한정)에는 디카르복실산의 니트로페닐에스테르가 있다.

호모 2작용성 방향족 술포닐클로리드의 바람직한예(비한정)에는 페놀-2,4-디술포닐클로리드와 α-나프톨-2,4-디술포닐클로리드가 있다.

부가아미노-반응성호모 2 작용성시약의 바람직한예(비한정)에는 아민과 작용하여 비스카르바메이트를 얻는 에리트리톨비스카르보네이트가 있다.

술프히드릴기와의 반응성이 있는 호모 2 작용성가교링커

이와같은 시약의 합성, 특성 및 적용은 참고문헌에 기재되어 있다(가교처리공정과 시약에 대한 참고문헌은 위에서 인용한 문헌참조).

대부분의 시약은 허용할 수 있는 상품을 사용할 수 있다(즉, Pierce Chemical Company, Rockford, Ⅲ; Sigma Chemical Comvany, St. Louis, Mo.;Molecular Proves,Inc.,Eugene,OR).

호모 2 작용성 말레이미드의 바람직한예(비한정예)에는 비스말레이미도헥산(BMH), N,N'-(1,3-페닐렌) 비스말레이미드; N,N'-(1,2-페닐렌)비스말레이미드, 아조페닐디말레이미드 및 비스(N-말레이미도메틸)에테르가 있다.

호모 2 작용성 피리딜디술피드의 바람직한예(비한정예)에는 1,4-디-3'-(2-피리딜디티오)프로피온아미도부탄(DPDPB)이 있다.

호모 2 작용성 알킬할라이드의 바람직한 비한정예에는 2,2'-디카르복시-4,4'-디아이오도아세트아미도아조벤젠, αα'-디아이오도-P-키실렌술폰산, αα'- 디브로모-P-키실렌술폰산, N,N'-비스(b-브로모에틸)벤질아민, N,N'-디(브로모아세틸)페닐티드라진 및 1,2-디(브로모아세틸)아미노-3-페닐프로판이 있다.

호모 2 작용성의 광활성화 할 수 있는 가교링커

이와같은 시약의 합성, 특성 및 적용은 참고문헌에 기재되어 있다(가교처리공정 및 시약의 문헌으로 위에서 인용한 문헌참조).

일부시약은 시중에서 입수하여 사용할 수 있다(즉, Pierce Chemical Company, Rockford, Ⅲ; sigma Chemical Company, St. Louis, MO.; MolewlarProbes, Inc. Eugene,OR).

호모 2 작용성의 광활성화 활 수 있는 가교링커의 바람직한 비한정예에는 비스-β-(4-아지도살리실아미도)에틸디술피드(BASED), 디-N-(2-니트로-4-아지도페닐)-시스타민-S,S'-디옥시드(DNCO)및 4,4'-디티오비스페닐아지드가 있다.

피리딜디술피드 성분을 가진 아미노- 반응성헤테로 2작용성 시약

이와같은 시약의 합성, 특성 및 적용은 참고문헌에 기재되어 있다(가교처리공정 및 시약의 참고문헌에 대해서는 위에서 인용한 문헌참조).

대부분의 시약은 상품으로 사용할 수 있다(즉, Pierce chemical company, Rockford,Ⅲ; Sigma chemical company, St. Lousis, MO.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).

피리딜디술피드 성분과 아미노-반응성 NHS에스테르를 가진 헤테로 2 작용성 시약의 바람직한 비한정예에는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜리티오)프로피오네이트(SPDP),숙신이미릴 6,3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도헥산오에이트(LC-SPDP), 술포숙신이미딜6,3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도헥산오에이트(sulfo-LCSPDP), 4-숙신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(SMPT) 및술포숙신이미딜 6-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도헥산오에이트(sulfo-LC-SMPT)가 있다.

말레이미드성분을 가진 아미노-반응성 헤테로 2 작용성 시약

이와같은 시약의 합성, 특성 및 적용은 참고문헌에 기재되어 있다.

말레이미드성분과 아미노-반응성 NHS 에스테르를 가진 헤테로-2 작용성 시약의 바람직한 비한정예에는 숙신이미딜말레이미딜아세테이트(AMAS), 숙신이미딜3-말레이미딜프로피오네이트(BMPS), N-R-말레이미도부티릴옥시숙신이미드에스테르(CMBS), N-r-말레이미도부티릴옥시술포숙신이미드에스테르(sulfo-GMBS),

숙신이미딜6-말레이미딜헥사노에이트(EMCS),숙신이미딜3-말레이미딜벤조에이트(SMB),m-말레이미도벤조일-N-히드로옥시숙신이미드에스테르(MBS),

m-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드에스테르(sulfo-MBS),

숙신이미릴4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC),

술포숙신이미딜4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-SMCC),

숙신이미딜4-(P-말레이미딜페닐)부티레이트(SMPB) 및 술포숙신이미딜4-(P-말레이미도페닐)부트레이트(sulfo-SMPB)가 있다.

알킬할라이드 성분을 가진 아미노-반응성 헤테로 2 작용성 시약

이와같은 시약의 합성, 특성 및 적용은 참고문헌에 기재되어 있다.

알킬할라이드 성분과 아미노-반응성 NHS에스테르를 가진 헤테로-2작용성 시약의 바람직한 비한정예에는 N-숙신이미딜-(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB), 술포숙신이미딜-(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(sulfo-SIAB),

숙신이미딜-6-(아이오도아세틸)아미노헥사노에이트(SIAX),

숙신이미딜-6-(6-(아이오도아세틸)-아미노)헥사노일아미노)헥사노에이트(SIAXX),

숙신이미딜-6-(((4-(아이오도아세틸)-아미노)-메틸)-시클로헥산-1-카르보닐)아미노헥사노에이트(SIACX) 및 숙신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노)메틸시클로헥산-1-카르복실레이트(SIAC)가 있다.

아미노-반응성 NHS에스테르와 알킬디할라이드 성분을 가진 헤테로-2작용성 시약의 바람직한 에에는 N-히드옥시숙신이미들 2,3-디브로모프로피오네이트(SDBP), 가 있다.

그 SDBP 는 그 아미노기를 접합함으로써 친화성 성분에 분자간 가교를 도입 한다.

1급 아민기에 대한 디브로모프로피오닐 성분의 반응성은 반응온도에 의해 조절한다(McKenzie 등, Protein Chem. 7:581-592(1988)참조).

알킬할라이드 성분과 아미노-반응성 P-니트로페닐에스테르 성분을 가진 헤테로-2 작용성 시약의 바람직한 비한정예에는 P-니트로페닐아이오도아세테이트(NPIA)가 있다.

다른가교제는 이 기술분야의 기술자에 의해 공지되었다.

(Pomato 등, USP5,965,106).

소정의 사용에 적합한 가교제의 선택은 이 기술분야의 기술자의 능력범위내에서 가능하다.

절단할 수 있는 링커기

또 다른예에서, 상기 링커기는 상기 당 잔기에서 수식기를 절단하여 유리할 수 있는 기로 구성한다.

다수의 절단할 수 있는 기는 이 기술분야에서 공지되었다.

다음에 관련된 문헌을 예시한다:

Jung et al.,Biochem.Biophys.Acta 761:152-162(1983); Joshi et al.,J.Biol. Chem.265:14518-14525(1990);Zarling et al.,J.Immunol.124:913-920(1980); Bouizar et al.,Eur.J.Biochem.155:141-147(1986);Park et al., J.Biol. Chem.261:205-210(1986);Browning et al., J. Immunol.143:1859- 1867(1989).

더욱이, 절단할 수 있는 2 작용성(호모-및 헤테로-2작용성)링커기는 상품으로서 공급업자(Pierce 등)로부터 얻어 사용할 수 있다.

대표적인 절단할 수 있는 성분은 광, 열 또는 시약(티올,히드록실아민,염기,퍼아이오데이트 등)을 사용하여 절단할 수 있다.

더욱이, 바람직한 기(groups)는 세포내 이입되는 생체내 반응으로 절단된다(cis-아코니틸;Shen 등, Biochem. Biophys. Res. Commun 102:1048(1991)).

바람직한 절단가능한 기는 디술피트,에스테르, 이미드, 카르보네이트, 니트로벤질, 펜아실 및 벤조인 기로 이루어진 그룹에서 선택한 하나의 멤버이다.

펩티드에 수식당의 접합(conjugation)

수식당은 콘주게이션을 매개하는 적합한 효소를 사용하여 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드에 접합한다.

수식도너당, 효소 및 악셉터 펩티드의 농도를 선택하여, 그 악셉터가 소모 될때 까지 글리코실화가 진행하도록 하는 것이 바람직하다.

아래의 시알릴전이효소에서의 설명은 일반적으로 다른 글리코실전이효소 반응에 적용할 수 있다.

글리코실전이효소를 사용하여 바람직한 올리고사카라이드 구조체를 합성하는 다수의 방법은 이 발명에 일반적으로 적용할 수 있다.

대표적인 방법은 예로서 다음 문헌에 기재되어 있다:

WO96/32491;Ito 등, Pure Appl.Chem.65:753(1993); USP5,352,670;5,374,541 및 5,545,553.

이 발명은 1종의 글리코실전이효소 또는 다수종을 조합한 글리코실전이효소를 사용하여 실시한다.

효소 사용예중 하나로, 예로서 시알릴전이효소와 갈락토실전이효소를 조합하여 사용할 수있다.

1종 이상의 효소를 사용하는 예에서는 효소와 기질을 초기 반응혼합물 중에 배합하거나, 또는 제 2 효소반응에서 효소와 시약을 제1 효소반응이 완료되거나 거의 완료될 때, 그 반응배지에 첨가한다.

단일용기내에서 차례로 두가지 효소반응을 실시함으로써 중간물 종이 분리되는 처리과정에서 전체 수율이 개선된다.

더욱이, 특별한 용제와 부생물의 클린업(cleanup)과 폐기가 감소한다.

바람직한예에서, 각각의 제 1효소와 제 2 효소는 글리코실전이효소이다. 다른 바람직한예에서, 하나의 효소는 엔도글리코시다아제이다.

추가로 바람직한예에서, 2종 이상의 효소를 사용하여 이 발명의 수식 글리코단백질을 집합한다.

이들의 효소가 사용되어 펩티드에 수식당의 부가전후 어느지점에서 펩티드상에서의 사카라이드 구조를 변경한다.

다른예에서, 상기 방법에서는 1종 이상의 엑소 또는 엔도글리코시다아제를 사용한다.

그 글리코시다아제는 주로 변이체이며, 그 변이체는 작용하여 글리코실 결합을 전단하기보다 형성한다.

그 변이체 글리카나아제에는 산성아미노산잔기의 활성위치에 대하여 아미노산 잔기의 치환을 주로 포함한다.

예로서, 그 엔도글리카나아제가 엔도-H일 경우 그 치환 활성부위잔기는 주로 위치 130에서 ASP, 위치 132에서 Glu 또는 그 조합이다.

그 아미노산은 일반적으로 세린, 알라닌, 아스파라진 또는 글루타민으로 전환된다.

그 변이체 효소는 엔도글리카나아제 가수분해스텝의 역반응과 유사한 합성스텝에 의해 통상적으로 그 반응을 촉진한다.

이예에서, 글리코실도너분자(즉, 바람직한 올리고 또는 모노사카라이드 구조)에는 이탈기가 포함되어 있어 그 반응은 단백질에서의 GlcNAc 잔기에 그도너분자를 부가하면서 처리를 진행한다.

예로서, 그 이탈기는 플루오리드 등 할로겐이다.

다른예에서, 그 이탈기는 Asn 또는 Asn-펩티드 성분이다.

또 다른예에서, 그 글리코실도너 분자상에서 그 Glc NAc 잔기를 수식한다.

예로서, 그 GlcNAc 잔기는 1,2옥사졸린 성분으로 이루어진다.

하나의 바람직한 예에서, 이 발명의 콘주게이트를 생성하는데 이용되는 각각의 효소는 촉매량으로 존재한다.

소정의 효소의 촉매량은 효소의 기질의 농도와, 반응조건(온도,시간 및 PH 값 등)에 따라 변한다.

사전에 선택한 기질 농도와 반응농도에서 주어진 효소의 촉매량을 결정하는수단은 이 분야의 기술자에 의해 공지되었다.

상기 처리프로세스를 실시하는 온도는 동결바로 위온도에서 가장 민감한 효소가 변성하는 온도까지의 범위로 할 수 있다.

바람직한 온도범위는 약 0℃ ~ 약 55℃ 이고, 더 바람직하게는 약 20℃ ~ 약 30℃ 이다.

다른예에서, 이 발명의 방법에서 1종 이상의 성분은 고온성 효소를 사용하여 고온에서 실시한다.

그 반응혼합물은 그 악셉터가 글리코실화 하는데 충분한 시간동안 유지됨으로써 바람직한 콘주게이트를 형성한다.

일부 콘주게이트는 종종 수시간후에 검출할 수 있어. 회수할 수 있는 양은 통상적으로 24시간 이내에서 얻어진다.

반응속도는 다수의 가변요소(즉, 효소농도, 도너농도, 악셉터농도, 온도, 용제용량)에 따라 좌우되며, 이들의 요소가 선택된 시스템에 대하여 최적이라는 것은 이 분야 기술자에 의해 알 수 있다.

이 발명은 수식펩티드의 공업적 규모의 제조를 제공한다. 여기서 사용되는 공업적 규모는 바람직하게는 단일반응주기후, 마무리한 정제 콘주게이트 최소 약 250mg, 바람직하게는 최소 약 500mg, 더바람직하게는 최소 약 1gr을 일반적으로 제조하는 것을 말한다. 즉 그 콘주게이트는 동일하게 연속적인 반복합성 사이클에서 의 반응생성물의 배합물이 아니다.

다음의 설명에서, 이 발명은 글리코실화펩티드에 수식 시알산 성분의 접합(conjugation)을 예시한 것이다.

그 대표적인 수식 시알산은 m-PEG로 표지한 것이다.

PEG-수식 시알산과 글리코실화펩티드의 사용에 대한 다음설명은 구체적 설명에 대하여 명백하게 하기 위한 것이며, 2종의 파트너의 접합으로 한정한 것을 의미하지 않는다. 시알산이외 수식 글리코실 성분의 부가에 일반적으로 적용할 수 있다는 것은 이 분야 기술자에 의해 알 수 있다.

더욱이, 다른 수용성폴리머, 치료성분 및 바이오분자를 포함하는 m-PEG이외 작용제로 글리코실 단위의 수식과 동일하게 적용할 수 있다.

효소에 의한 접근방법은 펩티드 또는 글리코펩티드 상에 m-PEG화 또는 m-PPG화 탄수화물의 선택적인 도입에 대하여 사용할 수 있다. 그 방법은 PEG, PPG 또는 차폐반응성 작용기를 포함한 수식당을 사용하여 적합한 글리코실전이효소 또는 글리코실 합성효소와 배합한다.

바람직한 탄수화물의 연결을 하는 글리코 전이효소를 선택하여 도너기질로서 수식당을 사용함으로써, 그 PEG 또는 PPG는 그 펩티드 골격, 글리코펩티드의 기존의 당잔기 또는 펩티드에 부가되는 당잔기에 직접 도입할 수 있다.

시알릴 전이효소의 악셉터는 펩티드상에 존재하여 자연발생하는 구조로서 또는 재조합에 의해, 효소에 의해 또는 화학적으로 위치한 구조로서 이 발명의 방법에 의해 수식된다.

적합한 악셉터에는 예로서 Galβ1, 4GlcNAc, Galβ1, 4GalNAc, Galβ, 3GalNAc, 락토-N-테트라오스, Galβ1, 3GlcNAc, GalNAc, Galβ1, 3GalNAc, Galβ1, 6GlcNAc, Galβ1, 4Glc(락토오스)등의 갈락토실악셉터와, 이 기술의 기술자에 의해 공지된 다른 악셉터가 포함한다(Paulson 등, J.Biol.Chem. 253:5617-5624(1978)).

하나의 예에서, 시알릴전이효소의 악셉터는 글리코펩티드 상에 존재하여 글리코펩티드의 생체내 합성으로 수식된다.

이와같은 글리코펩티드는 글리코펩티드의 글리코실화패턴의 사전수식없이 이 발명의 방법을 사용하여 시알릴화 할 수 있다.

또, 이 발명의 방법을 사용하여 적합한 악셉터를 포함하지 않은 펩티드를 시알릴화 하고 기술자에 의해 공지된 방법에 의해 악셉터를 포함한 펩티드를 우선수식한다.

하나의 예에서, GalNAc 잔기는 GalNAc 전이효소의 작동에 의해 부가한다.

한예에서, 그 갈락토실 악셉터는 펩티드 즉, GalNAc 에 결합된 적합한 악셉터에 갈락토오스잔기를 결합하여 집합한다.

이 방법에는 적량의 갈락토실전이효소(즉 Galβ1,3 또는 Galβ1,4)와, 적합한 갈락토실도너(즉,UDP-갈락토오스)를 함유한 반응혼합물로 수식되는 펩티드의 배양을 포함한다.

그 반응은 거의 완료될 때까지 처리하도록 하거나, 또는 사전 선택된 양의 갈락토오스잔기를 부가할 때 그 반응을 종결한다. 선택된 사카라이드 악셉터를 집합하는 다른 방법은 이 분야기술자에 의해 알 수 있다.

또 하나의 예에서, 글리코펩티드 결합 올리고사카라이드는 우선 전체적으로 또는 부분적으로 "트리밍"(trimming)하여 시알릴전이효소의 악셉터 또는 1개 이상의 적합한 잔기를 부가하여 적합한 악셉터를 얻을 수 있는 성분을 접촉한다.

글리코실전이효소와 엔도글리코시다아제 등의 효소(예로서 USP5,716,812 명세서 참조)가 결합 및 트리밍 반응에 유용하다.

다음설명에서, 이 발명의 방법은 수용성 폴리머가 결합된 수식당을 사용하는 예를 예시한다.

구체적 설명의 요지는 그 설명을 명백하게 하는데 있다. 수식당이 치료성분, 바이오분자 등을 가진 예와 동일하게 관련되어 있는 설명이라는 것을 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.

하나의 대표적예에서, O-결합탄수화물 잔기는 수식당의 부가전에 "트리밍"(trimming) 한다.

예로서, GalNAc-Gal 잔기는 GalNAc 뒤에 트리밍을 한다.

수용성 폴리머를 가진 수식당은 "트리밍" 에 의해 노출된 1개 이상의 그 당 잔기에 접합한다.

하나의 예에서, 글리코펩티드는 "트리밍" 되어, 수용성 폴리머가 그 얻어진 O-측쇄 아미노산 또는 글리코펩티드 글리칸에 사카릴 성분 즉, 수용성폴리머에 접합된 Sia, Gal 또는 GalNAc 성분에 의해 부가된다.

그 수식 사카릴 성분은 "트리밍" 된 글리코펩티드 상에서의 아셉터 부위에 결합된다.

또, 수식하지 않은 사카릴 성분, 즉 Gal 은 O-결합글리칸의 말단에 부가된다.

또 다른 예에서, 수용성폴리머는 갈락토오스잔기를 가진 수식당에 의해 GalNAc 잔기에 부가된다.

또, 수식하지 않은 Gal은 GalNAc 잔기 말단에 부가 할 수 있다.

또 하나의예에서, 수용성폴리머는 수식시알산을 사용하여 Gal 잔기에 부가된다.

또 다른예에서, O-결합글리코실잔기는 아미노산에 결합한 GalNAc에 트리밍백(trimming back) 된다.

하나의 예에서, 수용성폴리머는 그 폴리머로 수식된 Gal에 의해 부가된다.

또, 수식되지 않은 Gal은 GalNAc에 부가된 다음에, 부가된 수용성 폴리머를 가진 Gal에 의해 부가된다.

또 다른예에서, 1개 이상의 수식하지 않은 Gal 잔기는 GalNAc에 부가된 다음에, 수용성폴리머로 수식된 시알산 성분에 의해 부가된다.

이 발명의 방법을 사용하여, 실질적으로 바람직한 구조를 가진 탄수화물 잔기를 "트리밍백" 하여 구성할 수 있다.

그 수식당은 위에서 설명한 탄수화물 성분의 말단에 부가할 수 있거나, 그 펩티드코어와 탄수화물의 말단 사이에 매개할 수 있다.

하나의예에서, 그 수용성폴리머는 시알산을 수식한 폴리머를 사용하여 Gal잔기 말단에 부가된다.

적합한 시알릴전이효소를 사용하여 수식된 시알산을 부가한다.

그 접근방법을 다음 처리공정도(스킴) 5에서 요약한다.

또다른 접근방법에서는 다음 처리공정도(스킴)6에서 요약한다.

시알산에는 차폐된(masked) 반응성 기능이 존재한다.

그 차폐된 반응성기는 수식 시알산을 펩티드에 결합하는데 사용되는 조건에 의해 영향을 받지 않는 것이 바람직하다.

그 펩티드에 수식시알산을 공유 결합한 다음에 그 차폐(mask)를 제거하고, 그 펩티드를 PEG, PPG, 치료성분, 바이오분자 등 작용제 또는 다른 작용제와 접합한다.

그 작용제는 수식당잔기상에서 차폐하지 않는 반응성기 와의 반응에 의해 특정지게 그 펩티드에 접합된다.

글리코펩티드의 올리코사카라이드의 말단당에 따라 수식당을 적합한 글리코실전이효소와 함께 사용한다(다음표 2).

위에서 설명한 바와 같이, PEG화 또는 PPG화 구조를 도입하는데 필요한 글리코펩티드의 말단당을 발현할 때 자연적으로 도입할 수도 있고, 또 적합한 글리코시다아제, 글리코실전이효소 또는 글리코시다아제와 글리코실전이효소의 혼합물을 사용하여 후발현(Post expression)을 생성할 수 있다.

또 다른예에서, UDP-갈락토오스-PEG는 젖소우유 β1,4-갈락토실전이효소와 반응함으로써, 수식갈락토오스를 적합한 말단 N-아세틸글루코사민 구조로 전이한다.

글리코펩티드 상에서 그 말단 GlcNAc 잔기는 포유동물, 곤충, 식물 또는 균등 발현시스템에서 발현하는 것과 같이 발현중에 생성되나, 필요에 따라 시알릴라아제 및/또는 글리코시다아제 및/또는 글리코실전이효소와 글리코펩티드를 처리함 으로써, 생성할 수도 있다.

또다른예에서, GNT1-5등 GlcNAc 전이효소를 사용하여 PEG화 GlcN을 글리코펩티드 상에서 말단 만노오스잔기로 전이한다.

또하나의 다른예에서, N-및/또는 -0-결합글리칸 구조는 글리코펩티드에서 효소에 의해 제거되어 아미노산 또는 수식당과 후접합되는 말단글리코실 잔기를 노출한다.

예로서, 엔도글리카나아제를 사용하여 글리코펩티드의 N-결합구조를 제거(이탈)하여 그 글리코펩티드 상에서 GlcNAc-결합-Asn으로서 말단 GlcNAc 를 노출한다.

UDP-Gal-PEG와 적합한 갈락토실전이효소를 사용하여 그 노출된 GlcNAc 상에서 PEG-또는 PPG-갈락토오스의 기능을 도입한다.

또하나의 예에서, 그 수식당은 펩티드 골격에 당잔기의 전이를 하는데 공지된 글리코실전이효소를 사용하여 그 펩티드 골격에 직접 부가한다.

이 예를 처리공정도(스킴) 7 에서 설명한다.

이 발명을 실시하는데 유용한 대표적인 글리코실전이효소에는 GalNac 전이효소(GalNacTI-20), GlcNAc 전이효소, 푸코실전이효소, 글루코실전이효소, 키실로실전이효소, 만노실전이효소 등이 있으며, 한정된 것은 아니다.

이와같은 접근방법을 사용하여, 탄수화물이 결여된 펩티드 또는 현행 글리코펩티드 상에서 수식당의 직접부가를 하도록 한다.

두 경우, 그 수식당의 부가는 글리코실전이효소의 기질 특이성에 의해 구성된 펩티드 골격상에서 어느 위치에 발생하며, 화학적 방법을 사용하여 단백질의 펩 티드의 골격을 수식할 때 임의로 발생하지 않는다.

작용제의 배열구조에는 글리코실전이효소 기질이 결여된 단백질 또는 글리코펩티드에, 적합한 아미노산 서열을 폴리펩티드 사슬에 작용시킴으로써 펩티드 서열을 도입할 수 있다.

위에서 설명한 각각의 예에서, 1개 이상 추가로 화학적 또는 효소에 의한 수식 스텝을 사용하여 펩티드에 수식당을 접합한다.

하나의예에서, 하나의 효소(즉, 푸코실전이효소)를 사용하여 글리코실 단위(즉, 푸코스)를 그 펩티드에 결합한 말단 수식당에 부가한다.

또 하나의예에서, 효소에 의한 반응을 사용하여 수식당이 접합되지 않은 위치를 "캐핑(capping)(즉 시알릴화)한다.

또, 화학적 반응을 사용하여 접합된 수식당의 구조를 변경한다. 예로서, 그 접합된 수식당은 그 수식당이 결합된 펩티드 성분과의 결합을 안정화 또는 탈안정화 하는 작용제와 반응한다.

또 다른예에서, 그 수식당의 하나의 성분을 탈보호한 다음에 펩티드에 접합을 한다. 이 분야의 기술자에 의해, 그 수식당이 펩티드에 접합하는 후단계에서 이 발명의 방법에 유용한 효소에 의한 처리공정과 화학적 처리공정이 설정되어 있다는 것을 알 수 있다.

그 수식당-펩티드 콘주게이트는 이 발명의 범위내에서 추가로 제조한다.

효 소

글리코실전이효소

글리코실전이효소는 스텝(step)식으로 단백질, 글리코펩티드, 리피드 또는 글리코리피드에 또는 성장하는 올리고사카라이드의 비환원단(non-reducing end)에 활성화된당(도너 NDP당)의 부가를 촉진한다.

N-결합글리코펩티드는 전이효소와 리피드-결합올리고사카라이드도너 Dol-PP-NAG₂Glc₃ Man₉ 에 의해 그 코어의 트리밍에 따르는 일괄전이를 하여 합성된다.

이 경우, "코어" 사카라이드의 특성은 후결합물(subsequent attachmants) 과 약간 다르다. 대부분의 글리코실전이효소는 이 분야에서 공지된 것이다.

이 발명에서 사용되는 글리코실전이효소는 사용할 수 있는한 당도너로서 수식당이다.

이와같은 효소의 예에는 갈락토실전이효소, N-아세틸글루코사미닐전이효소, N-아세틸갈락토사미닐전이효소, 푸코실전이효소, 시알릴전이효소, 만노실전이효소, 키실로실전이효소, 글루쿠로노닐전이효소 등 르로르경로(Leloir Pathway)글리코실전이효소가 있다.

글리코실전이효소 반응을 포함하는 효소에 의한 사카라이드 합성에 있어서, 글리코실전이효소는 클로닝 되거나, 어느 소오스(source)에서 분리할 수 있다.

대부분 클로닝된 글리코실전이효소는 이들의 폴리뉴클레오티드 서열에서와 같이 공지된 것이다(즉, "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases", (http:/www.Vei.co.uk/TGN/gtguide.htm).

아미노산 서열을 유도할 수 있는 글리코실전이효소를 코딩하는 글리코실전이효소 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열은 GenBank, Swiss-Prot, EMBL을 포함하여, 여러가지의 공개 이용할 수 있는 데이타베이스 등에서 확인할 수 있다.

이 발명의 방법에서 사용될 수 있는 글리코실전이효소에는 갈락토실전이효소, 푸코실전이효소, 글루코실전이효소, N-아세틸갈락토사미닐전이효소, N-아세틸글루코사미닐전이효소, 글루쿠로닐전이효소, 시알릴전이효소, 만노실전이효소, 글루쿠론산전이효소, 갈락투론산전이효소 및 올리고사카릴전이효소가 있다.

적합한 글리코실전이효소에는 진핵생물과 원핵생물에서 얻어진 글리코실전이효소가 있다.

상기 효소 글리코실전이효소를 코딩하는 DNA는 화학적 합성, 적합한 세포 또는 세포계 배양에서 mRNA의 역전자의 스크리닝, 적합한 세포에서 게놈라이브러리의 스크리닝, 또는 이들 처리의 조합에 의해 얻을 수 있다.

mRNA 또는 게놈 DNA의 스크리닝은 글리코실전이효소 유전자 서열에서 생성된 올리고뉴클레오티드 프로브로 실시할 수 있다.

프로브는 형광그룹, 방사성원자 또는 화학발광그룹 등 검출가능한 그룹에서 통상의 혼성화 아세이에서 사용되는 공지된 처리방법에 의해 표지(label)할 수 있 다.

또, 글리코실전이효소 유전자 서열은 중합효소 사슬반응(PCR) 처리스텝을 사용하여 얻을수 있으며, 그 PCR 올리고뉴클레오티드프라이머는 글리코실전이효소 유전자 서열에서 생성된다(참조: USP 4,683,195(Mullis 등); USP 4,683,202(Mullis)).

효소 글리코실전이효소는 그 효소 글리코실전이효소를 코딩하는 DNA를 함유한 벡터로 형질전환된 숙주세포에서 합성할 수 있다.

벡터는 복제할 수 있는 DNA 구축물이다. 벡터를 사용하여 그 효소 글리코실전이효소를 코딩하는 DNA를 증폭하거나 또는 그 효소 글리코실전이효소를 코딩하는 DNA를 발현한다.

발현벡터는 복제할 수 있는 DNA 구축물이며, 그 구축물에는 그 효소 글리코실전이효소를 코딩하는 DNA 서열이 적합한 숙주에서 효소 글리코실전이효소의 발현을 할 수 있는 적합한 조절서열에 작용할 수 있게 연결된다.

이와같은 조절서열의 필요성은 선택된 숙주와 선택된 형질전환 방법에 따라 변한다.

일반적으로, 조절서열에는 전사프로모터, 전사를 조절하는 선택오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜결합부위를 코딩하는서열 및 전사와 번역의 종결을 조절하는 서열이 있다.

증폭벡터는 발현조절 도메인을 필요로 하지 않는다.

모두 필요로 하는 것은 통상적으로 복제기원(origin)이라 할 수 있는 숙주 와, 형질전환체의 인식을 촉진하는 선택유전자에서 복제하는 복제 능력에 있다.

푸코실전이효소

일부예에서, 이 발명의 방법에서 사용된 글리코실전이효소는 푸코실전이효소이다. 푸코실전이효소는 이 분야의 기술자에 의해 공지된 것이다.

대표적인 푸코실전이효소에는 GDP-푸코오스에서 악셉터 상의 히드록시위치로 L-푸코오스를 전이하는 효소가 있다.

비뉴클레오티드 당을 악셉터로 전이하는 푸코실전이효소는 또 이 발명에서 유용하다.

일부예에서, 그 악셉터당은 예로서 올리고사카라이드 글리코시드에서 Galβ(1→3,4)GlcNAcβ-그룹의 GlcNAc 이다.

이 반응의 적합한 푸코실전이효소에는 사람유즙(human milk)에서 1차 특징이 있는 Galβ(1→3,4)GlcNAcβ1-α(1→3,4)푸코실전이효소(FTIII E.C.NO.2.4. 1.65) [참고문헌:Palcic 등, Carbohydrate Res. 190:1-11(1989);Prieels등, J.Biol.Chem.256:10456-10463(1981);Nunez등, Can.J.Chem.59:2086-2095(1981)] 와, 사람혈청에서 확인되는 Galβ(1→4)GlcNAcβ-α푸코실전이효소(FTIV, FTV, FTVI)가 있다.

FTVII(C.NO.2.4.1.65), 시알릴α(2→3)Galβ(1→3)GlcNAcβ푸코실전이효소도 특징이 있다.

그 Galβ(1→3,4)GlcNAcβ-α(1→3,4)푸코실전이효소의 재조합 형태도 특징 이 있다(Dumas 등, Bioorg.Med.Letters 1:425-428(1991);Kukowska-Latallo 등, Genes and Development 4:1288-1303(1990)).

다른 대표적인 푸코실전이효소에는 예로서 α1,2푸코실전이효소(E.C.No.2.4.1.69)가 있다.

효소에 의한 푸코실화는 참고문헌(Mollicone 등, Eur.J.Biochem.191:169-176(1990) 또는 USP 5,374,655)에 기재된 방법에 의해 실시할 수 있다.

푸코실전이효소를 제조하는데 사용되는 세포에는 또 GDP-푸코오스를 합성하는 효소계가 있다.

갈락토실전이효소

또 다른 그룹의 예에서, 글리코실전이효소는 갈락토실전이효소이다.

대표적인 갈락토실전이효소에는 α(1,3)갈락토실전이효소(E.C.NO.2.4.1.151)가 있다:

Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921(1993)and Yamamoto et al.,Nature 345:229-233(1990),bovine(GenBankj04989,Joziasse et.al.,J.Biol. Chem.264:14290-14297(1989)),murine(GenBank m26925;Larsen et al., Proc. Nat'I. Acad.Sci.USA 86:8227-8231(1989)),porcine(GenBank L36152;Strahan et al., Immunogenetics 41:101-105(1995)).

또다른 적합한 α1,3 갈락토실전이효소가 혈액형 B항원의 합성에 포함된다.(EC2.4.1.37;Yamamoto 등, J.Biol.Chem.265:1146-1151(1990)(인간)).

예로서, EC2.4.1.90(LacNAc 합성효소)과 EC 2.4.1.22(락토오스합성효소) [(bovine(D'Agostaro et al.,Eur.J.Biochem.183:211-217(1989)), human(Masir et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.157:657-663(1988)),murine(Nakazawa et al., J. Biochem. 104:165-168(1988)).]와 E.C. 2.4.1.38 및 세라미드 갈락토실전이효소[EC 2.4.1.45;stahl 등, J.Neurosci. Res. 38:234-242(1994)]를 포함하는 β(1,4)갈락토실전이효소가 이 발명의 방법에서 사용에 적합하다.

다른 적합한 갈락토실전이효소에는 예로서 α1,2 갈락토실전이효소가 있다

[Schizosaccharomyces pombe,Chapell et al.,Mol.Biol.Cell 5:519-528(1994)].

유전자공학에 의해 클로닝된 유전자에서 효소 GalNAc T_{I - XIV} 등 단백질의 제조는 공지되었다(USP 4,761,371).

하나의 방법에는 충분한 샘플을 수집(포집)한 다음, 그 효소의 아미노산 서열을 N-말단 서열결정에 의해 결정하는 방법이 있다. 그 다음, 이 처리정보를 사용하여 곤충세포계 Sf9 에서 발현할 때 완전 활성효소의 합성이 얻어지는 전장(막결합)전이효소를 코딩하는 cDNA 클론을 분리한다.

그 다음 그 효소의 악셉터 특이성은 16개의 다른 단백질에서 공지의 글리코실화 부위를 둘러싼 아미노산의 반정량분석을 사용하여 측정하고, 이어서 합성펩티드의 생체외 글리코실화 연구조사를 한다. 그 연구조사에서는 어떤 아미노산잔기가 글리코실화 펩티드 세그멘트에서 과잉발현되고, 글리코실화된 세린 및 트레오닌 잔 기를 둘러싼 소정 위치에서의 잔기가 다른 아미노산 성분보다 악셉터 효율면에서 더 현저한 영향을 미친다는 것을 나타내었다.

시알릴전이효소

시알릴전이효소는 이 발명의 재조합 세포와 반응혼합물에 있어서 유용한 또하나의 타입의 글리코실전이효소 이다. 재조합 시알릴전이효소를 생성하는 세포는 CMP-시알산을 생성하며, 그 CMP-시알산은 시알릴전이효소의 시알산 도너이다.

이 발명에서 사용에 적합한 시알릴전이효소의 예로는 ST3 GalIII(즉, 랫 또는 인간 ST3 GalIII), ST3 GalIV, ST3GalI, ST6GalI, ST3Gal V, ST6GalⅡ, ST6Gal NAc I, ST6Gal NAcII 및 ST6GalNAc III(여기서 사용된 시알릴전이효소 명칭은 참고문헌(Tsuji 등, Glycobiology 6:v-xiv(1996)에 기재되어 있는 것과 같음)가 있다.

α(2,3)시알릴전이효소(EC 2.4.99.6)로 칭하는 대표적인 α(2,3)시알릴전이효소는 시알산을 Galβ1→3Glc 디사카라이드 또는 글리코시드의 비환원 말단으로 전이한다(Van den Eijnde 등, J.Bio.Chem. 256:3159(1981);Weinstein 등, J.Biol.Chem.257:1384591982); Ven 등, J.Biol.Chem. 267:21011(1992)).

또다른 대표적인 α2,3-시알릴전이효소(EC 2.4.99.4)는 시알산을 디사카라이드 또는 글리코시드의 비환원 단말 Gal로 전이한다(Rearick 등, J.Biol.Chem. 254:4444(1979);Gillespie 등, J.Biol.Chem. 267:21004(1992)).

또다른 대표적인 효소에는 Gal-β-1,4-GlcNAcα-2.6 시알릴전이효소가 있다(Kurosawa 등, Eur. J. Biochem. 219:375-381(1994)).

글리코펩티드의 탄수화물의 글리코실화에 있어서 그 시알릴전이효소는 시알산을 그 서열 Galβ1,4 GlcNAc 로 전이할 수 있어, 가장공통적인 말단에서 두번째 있는 서열은 완전 시알릴화된 탄수화물 구조에서 말단 시알산 아래에 있다(다음표 3 참조).

표3 : 악셉터기질로서 Galβ1,4GlcNAc 서열을사용한 시알릴전이효소

시알릴전이효소	소오스	형성된 서열	참고문헌
ST6Gal I	포유동물	NeuAcα2,6Galβ1,4GICNAc-	1
ST3GalⅢ	포유동물	NeuAcα2,3Galβ1,4GICNAc- NeuAcα2,3Galβ1,3GICNAc-	1
ST3GalⅣ	포유동물	NeuAcα2,3Galβ1,4GICNAc- NeuAcα2,3Galβ1,3GICNAc-	1
ST6GalⅡ	포유동물	NeuAcα2,6Galβ1,4GICNA
ST6GalⅡ	광박테리아	NeuAcα2,6Galβ1,4GICNAc-	2
ST3GalⅤ	N.meningitides N.gonorrhoeae	NeuAcα2,3Galβ1,4GICNAc-	3

1) Goochee et al.,Bio/Technology 9:1347-1355(1991)

2) Yamamoto et al., J. Biochem. 120:104-110(1996)

3) Gilbert et al., J. Biol.Chem. 271:28271-28276(1996)

이 발명의 방법에서 유용한 시알릴전이효소의 한예로는 ST3Gal III가 있으며, 이것은 α(2,3)시알릴전이효소(EC 2.4.99.6) 라고도 말한다.

이 효소는 Galβ1, 3GlcNAc 또는 Galβ1, 4GlcNAc 글리코시드의 Gal로 실알산의 전이를 촉진하며(Wen 등, J. Biol. Chem. 267:21011(1992);Van den Bijnden 등, J.Biol.Chem. 256:3159(1991)), 글리코펩티드에서 아스파라진-결합올리고사카라이드의 시알릴화에 응답할 수 있다.

그 시알산은 2개의 사카라이드 사이에서 α-결합을 형성하여 Gal에 연결된다.

그 사카라이드 사이의 결합(연결)은 Gal의 3-위치와 NeuAc의 2-위치 사이에 있다.

이 특정의 효소는 랫의간(ratliver)에서 분리할 수 있다(Weinstein 등, J. Biol. Chem. 257:13845(1982); 인간 cDNA(Sasaki 등,(1993), J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; kitagawa & Paulson(1994) J. Biol. Chem. 269:1394-1401) 과 게놈(Kitagawa 등((1996) J.Biol.Chem.271:931-938)DNA 서열은 공지되었으며, 재조합 발현에 의한 이효소의 생성을 촉진한다.

바람직한 예에서, 이 발명의 시알릴화 방법은 랫(rat) ST3Gal을 사용한다.

이 발명에서 유용한 다른대표적인 시알릴전이효소에는 α(2,3)을 포함하여 캄필로 박터 제주리(jejuni)에서 분리된 시알릴전이효소이다(즉, WO99/49051).

표 3에서 열거한 것 이외에 시알릴전이효소는 또 상품으로서 중요한 글리코펩티드의 시알릴화에 경제적 이며 효율적인 대규조 프로세스에 유용하다.

이들의 다른 효소의 능력을 확인하는 간단한 테스트로서, 여러가지의 각각의 효소(1-100mU/mg 단백질)는 소정의 시알릴전이 효소의 능력을 대비하기 위하여 아시알로-α₁AGP(1-10mg/㎖에서)와 반응하여 소(bovine) ST6Gal I, ST3GalⅢ 또는 시알릴전이효소에 대하여 글리코펩티드를 시알릴화 한다.

또, 다른 글리코펩티드 또는 글리코펩티드, 또는 펩티드 골격에서 효소에 의해 이탈된 N-결합 올리고사카라이드를 이 평가를 위해 아시알로-α₁AGP 대신 사용할 수 있다.

ST6GaI 보다 더 효율적인 글리코펩티드의 N-결합올리고사카라이드를 시알릴화 하는 능력을 가진 시알릴전이효소가 펩티드 시알릴화의 실제적인 대규모 처리 프로세스에서 유용하다(이 명세서에서 ST3Gal에 대하여 설명한 바와 같이).

다른글리코실전이효소

다른 글리코실전이효소는 시알릴전이 효소에 대하여 구체적으로 설명한 바 있는 유사한 전이효소 사이클로 치환시킬 수 있다는 것은 이 분야 기술자에 의해 알 수 있다.

특히, 그 글리코실전이효소는 예로서 글루코실전이효소, 즉 Alg8 (Stagljov 등, Prac.Natl.Acad.Sci.USA 91:5977(1994)) 또는 Alg8(Heesen 등, Eur. J. Biochem. 224:71(1994))이다.

N-아세틸갈락토사미닐전이효소는 또 이 발명을 실시하는데 유용하다.

적합한 N-아세틸갈락토사미닐전이효소에는

α(1,3)N-아세틸갈락토사미닐전이효소,

β(1,4)N-아세틸갈락토사미닐전이효소(Nagata 등, J.Biol.Chem.267:12082-12089(1992);Smith등,J.Biol.Chem.269:15162(1994) 및 폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐전이효소(Homa 등, J.Biol.Chem.268:12609(1993))가 있다.

적합한 N-아세틸글루코사미닐전이효소에는 GnTI(2.4.1.101,Hull 등, BBRC 176:608(1991)), GnTII, GnTIII(Ihara 등, J.Biochem. 113:692(1993)),

GnTIV 및 GnTV(Shoreiban 등, J.Biol.Chem. 268:15381(1993)), 0-결합 N-아 세틸글루코사미닐전이효소(Bierhuizen 등, Proc.Natl.Acal.Sci.USA89;9326 (1992)),N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 전이효소(Rajput 등, Biochem.J.285:985 (1992) 및 히알루로난 합성효소가 있다.

만노실전이효소에는 수식만노오스 성분에 유용하다.

적합한 만노실전이효소에는 α(1,2)만노실전이효소, α(1,3)만노실전이효소, α(1,6)만노실전이효소, β(1,4)만노실전이효소, Dol-P-Man 합성효소,Och1 및 Pmt1 이있다(Kornfeld 등, Annu.Rev.Biochem. 54:631-664(1985)).

키실로실전이효소는 또 이 발명에서 유용하다(예로서, Rodgers 등, Biochem.J.,228:817-822(1992);Elbain 등, USP 6,168,937).

다른 적합한 글리코실전이효소 사이클은 다음 참고문헌에 기재되어 있다:

Ichikawa 등, ZACS 114:9283(1992);Wong 등, J. Org. Chem. 57: 4343 (1992) ;Ichikawa 등, in Carbohydrates And Carbohydrate polymers, Yaltami, ed(ATL Press,1993):

원핵 글리코실전이효소는 또 이 발명의 실시에 유용하다.

이와같은 글리코실전이효소에는 다수의 그람음성균에 의해 생성된 리포올리고사카라이드(LOS)를 합성할때 함유된 효소가 있다.

상기 LOS는 외래글리코콘주게이트가 사람의 상피세포 표면 또는 숙주분비물에서 확인되는 말단 글리칸 서열을 주로 가진다(Preston 등, Critical Reviews in Microbiology 23(3):139-180(1996)).

이와같은 효소에는 β1,6 갈락토실전이효소와 β1,3 갈락토실전이효소[EMBL Accession NOS. M80599 및 M86935(E.coli);EMBL Accession NO. S56361 (S.tgph inurium)],글루코실전이효소[swiss-pront Accession NO. P 25740(E.coli)], β1,2-글루코실전이효소(rfaJ)[(Swiss-protAccession NO. P27129(E.coli) 및 swiss-prot Accession NO. P19817(S.typhimurium)] 및 β1,2-N-아세틸글루코사미닐전이효소(rfaK)[(EMBL Accession NO. Uooo39(E.coli)]를 포함하는 E.coli 및살모넬라피티무륨(Salmonella typhimurium)등 종(species)의 rfa 오페론의 단백질을 포함하며, 한정된 것은 아니다.

아미노산 서열이 공지된 다른 글리코실전이효소에는 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella Pneumoniae), E.coli, 살모넬라티피무륨, 살모넬라 엔테리카, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 미코박테륨 레프로숨(Mycobacterium leprosum) 등 미생물에서 특징이 있는 rfαB 등 오페론과, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 rh1 오페론에 의해 코딩하는 글리코실전이효소가 있다.

글리코실전이효소는이 발명의 사용에 적합하다.

상기 글리코실전이효소는 락토-N-네오테트라오스, D-갈락토실-β1,4-N-아세틸-D-글루코사미닐-β1,3-D-갈락토실-β1,4-D-글루코오스, 및 P^k 혈액형 트리사카라이드 서열, D-갈락토실-α-1,4-D-갈록토실-β1,4-D-글루코오스를 함유하는 구조물의 생성을 포함하며, 점막병원체 네이세리아 곤노르회애(Neisseria gonnorhoeae) 및엔.메닝기티디스(N.meningitidis)의 상기 LOS에서 동정한다(Scholten 등, J.Med.Microbiol. 41:236-243(1994)).

상기 구조물의 생합성에 관련된 글리코실전이효소를 코딩하는 엔.메닝기티디스와 엔.고노르회애 유래유전자는 엔.메닝기티디스 면역타입 L3 및 L1(Jenningo 등, Mol.Microbiol. 18:729-740(1995)과 엔.고노르회애 변이체 F62 (Gotshlich, J. Exp.Med. 180:2181-2190(1994)) 에서 동정한다.

엔.메닝기티디스에서 3종유전자, 1gtA, 1gtB, 1gB 로 이루어진 부위(locus)에서는 락토-N-네오테트라오스 사슬에서 당의 최종 3개의 부가에 필요로하는 효소로서 글리코실전이효소를 코딩한다(Wakarchuk 등, J.Biol.Chem.271:19166-73(1996)).

최근에 1gtB 및 1gtA 유전자 생성물의 효소 활성은 추전된 글리코실전이효소 기능에 대한 직접입증을 우선 제공하여 나타낸다(Wakarehuk 등, J.Biol.chem. 271(45):28271-276(1996)).

엔.고노르회애에서는 2종의 추가유전자, 락토-N-네오테트라오스 구조의 말단 갈락토오스의 3위치에 β-D-GalNAc 를 추가하는 1gtD와, 단을 절취한 LOS의 락토오스 요소에 말단 α-D-Gal 를 부가하는 1gtC 가 존재하여, P^k 혈액형 항원 구조체를 생성한다(Gotshlich 등(1994), 상기 인용문헌).

엔.메닝기티디스에서는 분리면역타입 L1이 또 Pk 혈액형 항원을 발현하여 1gtC 유전자의 보유를 나타낸다(Jennings 등,(1995), 상기문헌참조).

네이세리아(Neisseria) 글리코실전이효소와 관련유전자는 또 참고문헌 (USPN5,545,553(Gotschlich))에 기재되어 있다.

헬리코박터필로리(Helicobacter pylori)에서의 α1,2-푸코실전이효소와 α1,3-푸코실전이효소의 유전자는 또 그 특징이 있다.

술포전이효소

이 발명은 또 예로서 헤파린, 헤파란, 술페이트, 카르라게넨(Carragenen) 및

관련 화합물 등 술페이트화 폴리사카라이드를 포함하여, 술페이트와 분자함유 펩티드의 생성방법을 제공한다.

적합한 술포전이효소에는 예로서 콘드로이틴-6-술포전이효소[닭cDNA, 참고문헌(Fukuta 등, Biol.Chem. 270:18575-18580(1995))에 기재되어 있음; GenBank Accession NO. D49915],글리코사미노글리칸 N-아세틸글루코사민 N-데아세틸라아제/N-술포전이효소1 (Dixon 등, Genomico 26:239-241(1995); UL18918); 및 글리코사미노글리칸N-아세틸글루코사민 N-데아틸라아제/N-술포전이효소 2 [마우스 cDNA, 참고문헌(Orellana 등, J.Biol.Chem. 269:2270-2276(1994))과 참고문헌(Eriksson 등, J.Biol.Chem.269:10438-10443(1994))에 기재되어 있는 인간 cDNA, GenBank Accession N0. L12304에 기재되어 있음] 가 포함되어 있다.

세포- 결합글리코실전이효소

또다른예에서, 이 발명의 방법에서 사용되는 효소는 세포-결합 글리코실전이효소이다.

다수의 가능성 글리코실전이효소가 공지되어 있으나(USP5,032,519), 글리코실전이효소는 세포와 관련되어 있을때 일반적으로 막결합형태 이다.

이와같이 대부분의 막결합효소는 내인성 단백질이다.

즉, 이들의 효소는 음파처리(sonication)에 의해 그 막에서 이탈되지 않으며, 가용화를 위한 세제를 필요로 한다.

표면 글리코실전이효소는 척주 및 무척주 세포의 표면상에서 동정하여, 이들의 표면전이효소가 또 생리적 조건하에서 촉매 활성을 유지하는 것으로 인식되었다.

그러나, 세포표면 글리코실전이효소의 더인식된 기능은 세포간 인식에 있다(Roth, Molecular Approaches to Supracellular Phenomena, 1990).

[0334]

여러가지의 방법이 개발되어 세포에 의해 발현된 글리코실전이효소를 변경한다.

예로서, 참고문헌(Larsen 등, Proc.Natl.Acad.sci.USA86:8227-8231(1989))에서는 세포표면 올리고사카라이드 구조와 이들의 동족 글리코실전이효소의 발현을 결정하는 클로닝된 cDNA 서열을 분리하는 유전자 접근에 대하여 보고된 바 있다.

cDNA 라이브러리는 UDP-갈락토오스 발현에 공지된 마우스 세포계에서 분리된 mRNA 에서 생성된다:

β-D-갈락토실-1,4-N-아세틸-D-글루코사미니드 α-1,3-갈락토실전이효소는 COS-1 세포에 이입한다.

그 다음에 그 이입된 세포를 배양하여 α1-3 갈락토실전이효소 활성에 대하여 검정한다.

참고문헌(Francisco 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2713-2717(1992)) 에는 에쉐리키아콜리(Escherichiacoli)의 외측표면에 β-락타마아제를 고정하는 방법이 기재되었다.

(i) 외측막단백질의 단일서열, (ii)외측막 단백질의 막-스파닝 섹션(spanning section) 및 (iii) 완전성숙 β-락타마아스 서열로 이루어진 3분 절계융합이 생성되어 활성면 결합 β-락타마아스 분자를 얻는다.

그러나, 상기문헌(Francises)의 방법은 원핵세포계만으로 한정되어 있어, 연구자(발명자)가 인식하고 있는 것과 같이, 적합한 작용기능을 하는 완전한 3분절에 융합을 필요로 한다.

융합단백질

다른대표적예에서, 이 발명의 방법은 소정의 글리코펩티드 콘주게이트의 합성에 관련된 1종 이상의 효소활성을 가진 용융단백질을 사용한다.

그 융합폴리펩티드는 예로서 보조효소의 촉매활성 도메인에 결합된 글리코실전이효소의 촉매활성 도메인으로 구성할 수 있다.

그 보조효소의 촉매도메인은 예로서 글리코실전이효소의 도너인 뉴클레오티드 당을 형성하는 스텝을 촉진할 수 있거나, 또는 글리코실전이효소 사이클에 관련된 반응을 촉진할 수 있다.

예로서, 글리코실전이효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드당 합성에 관련된 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에, 골격내부에서, 결합할 수 있다.

그 다음, 그 결과 얻어진 융합단백질은 뉴클레오티드당의 합성만이 아니라, 악셉터 분자에 당성분의 전이도 촉진할 수 있다.

그 융합단백질은 하나의 발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 결합된 2종 이상의 사이클 효소이다.

다른예에서 그 융합단백질에는 2종 이상의 글리코실전이효소의 촉매활성 도메인을 포함한다(예로서, USP 5,641,668 참조).

이 발명의 수식글리코펩티드는 여러가지의 적합한 용융단백질을 사용하여 용이하게 구성하여 제조할 수 있다[예로서, PCT/CA98/01180(대응하는 WO99/31224; 1999.06.24. 공개)참조)].

고정화 효소

세포결합효소 이외에, 이 발명은 또 고형 및/또는 가용 지지체 상에서 고정화 하는 효소의 사용을 제공한다.

하나의 예에서, 이 발명의 방법에 의해 무손상글리코실링커에 의해 PEG에 접합된 글리코실전이효소를 구성한다.

그 PEG-링커-효소콘주게이트는 고형지지체에 선택적으로 결합한다.

이 발명의 방법에서 고형지지효소의 사용으로 반응혼합물의 조성과 반응생성 물의 정제를 간단하게 하며, 또 효소의 회수를 용이하게 할 수 있다.

그 글리코실전이효소 콘주게이트는 이 발명의 방법에서 사용된다.

효소와 지지체의 다른 조합은 이 기술분야의 기술자에 의해 알 수 있다.

재조합방법에 의한 글리코실화

변이인간성장호르몬의 글리코실화는 또 재조합 수단에 의해 세포내에서 얻을 수 있다.

최소 1개의 새로 도입한 N-또는 0-결합글리코실화 위치로 이루어진 변이 인간성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 적합한 숙주세포계, 즉 효모, 곤충 또는 포유동물기원에서 유래된 진핵세포계에 이입할 수 있다.

이와같은 세포계에서 재조합에 의해 생성된 그 변이 인간성장호르몬은 숙주세포글리코실화 구조에 의해 글리코실화 한다.

글리코실화 변이 hGH 의 정제

상기 처리프로세스에 의해 생성된 글리코실화된 인간성장호르몬은 사용전에 정제하는 것이 바람직하다.

박층크로마토그라피, 컬럼크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 또는 막여과 등 공지된 일반기술을 사용할 수 있다.

막여과의 사용이 바람직하며, 역삼투압막 또는 아래에서 설명되고 여기서 인용한 참고문헌에서 설명된 바와같이 회수용으로 1종 이상의 컬럼크로마토그래피 기술의 사용이 더 바람직하다.

글리코실화된 변이 인간성장호르몬이 세포내에서 생성될 경우, 1차 스텝으로, 그 입자상 단편, 숙주세포 또는 용해 단편은 예로서, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거하며;

선택적으로는 그 단백질을 상품으로 이용할 수 있는 단백질 농축 필터로 농축한 다음에, 아래의 방법에서 선택된 1개 이상의 스텝에 의해 다른 불순물에서 폴리펩티드 변이체를 분리할 수 있다:

면역친화성크로마토그래피, 이온교환컬럼분획(즉, 디에틸아미노에틸(DEAE),또는 카르복시메틸 또는 술포프로필기 함유 매트릭스 상에서 분획), 블루-세파로스(Blue Sepharose)상에서의 크로마토그래피, CM-블루-세파로스, MONO-Q, MONO-S,렌틸렉틴(lentil lactin)-세파로스, WGA-세파로스, 콘(Con)A-세파로스, 에테르토요펄(Ether Toyopearl), 부틸토요펄, 페닐토오펄, SP-세파로스, 또는 단백질A 세파로스, SDS-PAGE 크로마토그래피, 실리카 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofucusing)(즉, 등전크로마토그래피), 역상HPLC(즉, 지방족기를 부가한 실리카겔), 겔여과(즉, 세파덱스분자체(sieve) 또는 사이즈 배제 크로마토그래피를 사용하는 겔여과), 폴리펩티드를 선택적으로 결합하는 컬럼상의 크로마토그래피 및 에타놀 또는 암모늄술페이트침전.

배양물에서 생성된 글리코실화 변이인간성장호르몬은 통상적으로, 세포의 초기추출물, 세포용액, 배지등에 의해 분리한 다음, 1회 이상 농축, 염석(Salting-out), 수용상태에서의 이온교환, 또는 사이즈배제 크로마토그래피 스텝에 의해 분리한다.

추가로, 글리코단백질은 친화성크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 최종적으로 HPLC는 최종정제 스텝에서 사용할 수 있다.

프로테아제억제제, 즉, 메틸술포닐플루오리드(PMSF)가 선행 스텝중 어느 스텝에서도 포함되어 있어 단백질 분해를 억제하며, 항생물질이 포함되어 있어 외래오염균(adventitious contaminant)의 성장을 방해할 수 있다.

어느 경우에서는 이 발명의 글리코실화된 인간성장호르몬을 생성하는 시스템에서의 상징액은 상품으로 사용할 수 있는 단백질 농축 필터,

예로서, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellipore), 한외여과 장치(unit)를 사용하여 우선 농축한다.

그 농축 스텝에이어, 그 농축액을 적합한 정제 매트릭스에 처리할수 있다.

예로서, 적합한 친화성 매트릭스는 그 펩티드의 리간드, 적합한 지지체에 결합한 항체분자 또는 렉틴으로 구성할 수 있다.

또. 아니온교환수지에는 예로서 현수된 DEAE기를 가진 매트릭스 또는 기질을 사용할 수 있다.

적합한 매트릭스에는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에서 통상적으로 사용되는 다른 타입이 포함한다.

또, 카티온-교환 스텝을 사용할수 있다.

적합한 카티온 교환제에는 술포프로필 또는 카르복시메틸기로 이루어진 여러가지의 불용성 매트릭스가 있다.

술포프로필기가 특히 바람직하다.

최종적으로, 소수성 RP-HPLC 배지; 즉 현수메틸 또는 다른 지방족기를 가진 실리카겔을 사용하는 1개 이상의 RP-HPLC 스텝을 사용하여, 글리코실화 변이인간성장호르몬을 더 정제할수 있다.

또, 선행정제스텝 일부 또는 전부를 여러가지로 조합하여 사용함으로써 글리코단백질을 얻을 수 있다.

대규모 발효에서 얻은 이발명의 글리코실화 변이인간성장호르몬은 참고문헌(Urdal 등, J.Chromato.296:171(1984)에 기재된 것과 동일한 방법에 의해 정제할 수 있다.

이 참고문헌에서는 예비 HPLC 컬럼상에서 재조합 인간 IL-2를 정제하는 2개의 연속적인 RP-HPLC 스텝에 대하여 기재되어 있다.

또, 친화성 크로마토그래피 등의 기술을 사용하여 그 글리코단백질을 정제할수 있다.

변이 hGH 의 기능성 아세이

글리코실화된 변이 인간성장호르몬의 생성과 바람직하게는 정제 다음에, 그 글리코단백질의 생물학적 기능은 이 분야기술에서 공지된 수개의 방법을 사용하여 테스트 한다.

그 기능성 아세이(assays)는 인간성장호르몬 리셉터에 특이성 있는 결합, hGH 리셉터의 활성화 및 세포성장촉진 활성등 인간성장호르몬의 여러가지 특징을 기준으로 한다.

각각의 아세이에서, 양성조절(Positive control) 하여 야생형 인간성장호르몬이 포함되어 있다.

방사수용체 결합아세이(radioreceptor binding assays)를 실시하여 방사표지를 한 hGH 리셉터와 이 발명의 변이인간성장호르몬 사이의 결합을 측정할 수 있다.

이와같은 아세이의 구체적인 설명은 참고문헌(즉, Tsushima 등, J.clin. Endocrinol.Metab.,37:334-337(1973); Chin 등, Endocr. Meta. 37:334(1973); USP 4,871,835;USP 5,079,230)의 기재에서 확인할수 있다.

변이인간성장호르몬의 세포성장촉진능력은 경골(tibia) 테스트 등의 방법에 의해 평가한다(Parlow 등, Endocrinology 77:1126(1965);USP 4,871,835;USP 5,079,230)

간단하게 설명하면, 연령 28~30일의 랫(rats)에서 뇌하수체를 적출시켜 처리없이 10~14일간 보관한다.

그 다음, 재조합원(source)에서 유도된 인간성장호르몬변이체를 일일피하주사에 의해 랫에 투여한다.

이들의 동물(랫)은 6일째에 희생하여 앞다리 무릎뼈를 끄집어내어 골단판(epiphyseal plates)의 폭을 측정한다.

실험개시와 희생전에 이들 랫의 중량을 감시하고, 농도를 달리하여, 변이인간성장호르몬을 일일주사로 투여하는 서로 다른 그룹간을 비교한다.

또, 변이인간성장호르몬의 생물학적 활성은 인간림프모구종(lymphoblastoma)의 클론에서 유도되고 세포표면상에서 인간성장호르몬 리셉터를 발현하는 IM-9 세 포에서 hGH-의존성 티로신 인산화를 발생하는 능력으로 나타낸다.

또, MB-2 세포등 다른 세포타입은 hGH 기능 어세이에 적합하다.

변이인간성장호르몬에 노출될 때 세포성 단백질의 티로신 인산화 레벨은 참고문헌(silva 등, Endocrinology, 132:101(1993) 및 USP 6,238, 915)에서 기재된 바와같이, 인산화 된 티로신에 대한 단클론성 항체에 의해 나타낸다.

의약조성물 및 투여

위에서 설명한 바람직한 올리고사카라이드 결정인자를 가진 글리코실화된 변이인간성장호르몬은 성장호르몬의 결핍에 관련된 여러가지의 질병과 상태를 치료하는 치료제로서 사용할 수 있다.

이 발명의 변이인간성장호르몬으로 치료할 수 있는 성장관련 상태에는 다음과 같은 것을 포함한다:

소인증(dwarfism), 어린이 및 성인의 단신장(short-stature), 카켁시아(cachexia)/근육소모병, 일반 근육축(muscular atrophy) 및 성염색체 이상성(Sex chromosome abnormality)(즉, 터너증후군:Turner's Syndrome).

다른상태는 이 발명의 변이 hGH를 사용하여 다음 증상을 처리할 수 있다:

짧은 창자증후군, 지방이영양증, 골다공증, 우래마이아(uraemaia), 화상(burns), 여성불임증, 뼈재생, 일반당뇨병, 타입Ⅱ 당뇨병, 골관절염, 만성폐쇄성폐질환(COPD) 및 불면증(insomia).

이 발명의 변이 hGH 는 또 여러가지의 치료과정, 즉 일반조직재생, 뼈재생, 상처치료를 촉진하는데 사용할 수 있고 또는 백신 보조약으로 사용할 수 있다.

따라서, 이 발명은 또 위에서 설명한 방법에 의해 생성한 글리코실화된 변이 인간성장호르몬의 유효량으로 이루어진 의약조성물을 제공한다.

이 발명의 의약조성물은 여러가지의 약제투여 시스템에 사용하는데 적합하다.

이 발명에서 사용하는 적합한 조성물(조제물)은 다음 문헌의 기재에서 확인된다(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed.(1985)).

약제투여 방법의 간단한 설명에 대해서는 다음 문헌에 기재되어 있다(Langer, Science 249:1527-1533(1990)).

상기 의약조성물은 피하주사, 분무흡입 또는 경피흡수 등에 의한 비경구투여, 비강내투여, 국소투여, 경구투여, 또는 국부투여, 또는 예방 및/또는 요법치료에 쓰여진다.

통상적으로, 의약조성물은 비경구투여, 즉 피하투여 또는 정맥내 투여를 한다.

따라서, 이 발명은 허용할 수 있는 캐리어, 바람직하게는 수용성캐리어, 즉 물, 완충수, 식염수, PBS 등에 용해 또는 현탁시킨 글리코실화된 변이인간성장호르몬으로 이루어진 비경구투여용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 또 Tween 20 및 Tween 80등 세제;

만니톨, 소르비톨, 수크로오스 및 트레할로오스 등 안정제;

EDTA 및 m-크레솔등 방부제를 포함한다.

상기 조성물은 PH조정 및 완충제, 긴장조절제, 습윤제, 세제 등 거의 생리적 상태에 필요로 하는 의약상 허용할 수 있는 조제를 함유한다.

이들의 조성물은 통상의 멸균기술에 의해 멸균할 수 있고, 또 멸균여과 할 수 있다. 그 결과 얻어진 수용액은 동결건조한 상태로 사용하기 위하여 패키징(packaging)할 수 있으며, 그 동결건조된 조제물은 투여전 수용성 멸균 캐리어와 배합할 수 있다.

그 조제물의 pH는 주로 pH3~pH11이며, 더바람직하게는 pH5~9 이고, 가장바람직하게는 pH7~8 이다.

글리코실화 변이인간성장호르몬을 함유한 상기 조성물은 예방치료 및/또는 요법치료용으로 투여할 수 있다.

치료적용에 있어서, 조성물은 질병증상과 그 합병증을 치료 또는 부분정지하는데 충분한 양으로 성장호르몬 결핍과 관련된 질병에 이미 걸려 있거나 또는 그 질병상태에 있는 환자에 투여한다.

이 투여에 적당한 양을 "치료유효량" 으로 정의한다.

이 사용에 유효한 양은 그 질병 또는 그 상태의 중증도(severity)와 환자의 체중 및 일반상태에 좌우되나, 일반적으로 환자체중 70Kg에 대하여 1일당 글리코실화된 변이인간성장호르몬 약 0.1mg ~ 약 2,000mg 의 범위를 가진다.

예방적 적용에 있어서, 이 발명의 글리코실화 변이인간성장호르몬을 함유한 조성물은 소정 질병의 위험에 민감한 환자에 투여한다.

이와같은 양을 "예방적인 유효량" 으로 정의한다.

이 사용에서, 정확한 양은 또 환자의 건강상태와 체중에 따라 좌우되나, 일반적으로 환자체중 70kg 당 약 0.1mg ~ 약 1,000mg이며, 특히, 체중 70kg 당 약 5g ~ 약 200mg 이다.

상기 조성물의 단일 투여 또는 복수투여는 사용량 레벨에 따라 실시할 수 있으며, 그 투여패턴은 치료하는 의사에 의해 선택한다.

어느 경우에서나, 의약조성물은 환자를 효과적으로 치료하는데 충분한 이 발명의 글리코실화 된 변이 인간성장호르몬의 일정량을 구성할 필요가 있다.

다음실시예는 이 발명을 더 구체적 설명하기 위하여 제공한 것이며, 한정된 것은 아니다.

이 발명의 기술분야의 기술자에 의해, 변경 또는 수식하여 유사한 결과를 얻을 수 있는 여러가지의 파라미터를 쉽게 알 수 있다.

실시예 1

인간성장호르몬은 여러가지의 다른 이소형(isoforms)와 다른 아미노산 서열에서 발생한다.

2종의 가장 좋은 특징이 있는 형태에는 GH-V(PDB P01242)로 공지된 태반유도 hGH와, 소마토트로핀(somatotropin)또는 GH-N(P01241)으로 공지된 뇌하수체유도 hGH 가 포함된다; 도 1 참조.

상기 뇌하수체 유도 hGH는 글리코실화 되지 않으며, 치료제로서 에쉐리키아 콜리에서 생성된다.

상기 태반유도 hGH(GH-V)는 아미노산 140에서 하나의 N-글리코실화 위치를 가진다(표4와 도1 참조, 화살표 참조).

표 4. 인간성장호르몬( GH -V), 태반유도 : P01242 ( SEQIDNO :2)

상기 뇌하수체유도 hGH(GH-N)는 아미노산 위치 140에서 수식하여, 야생형라이신(다음표 5와 도 1에서 GH-N 폴리펩티드 서열의 아미노산 140에서 " k " 로 약칭) 을 코딩하는 대신, 그 뉴클레오티드는 GH-N 의 아미노산 위치 140에서 아스파라진("m" 으로 약칭)을 코딩하도록, 이 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 변이시켜 N-결합글리코실화 위치를 도입할 수 있다(도2 참조).

표 5. 인간성장호르몬( GH -N), 뇌하수체유도 : P01241 ( SEQIDNO :1)

이 폴리펩티드를 생성하는데 사용된 발현시스템과 관계없이 그 다음, 이 변이뇌하수체유도 hGH는 글리코실화 또는 글리코접합을 할 수 있다(WO03/31464 참조).

상기 변이 뇌하수체유도hGH 는 글리코PEG화 하는 것이 바람직하며, 여기서, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 성분은 글리코실결합에 의해 상기변이 뇌하수체유도hGH 폴리펩티드에 접합된다(WO03/31464 참조).

도 3은 Sf9 곤충세포 또는 포유동물세포에서 생성된 hGH N-결합글리칸 변이체의 글리코PEG화를 설명한 것이다.

상기 변이 뇌하수체유도hGH의 글리코PEG화는 반감기개선, 커어브(AUC)값영역개선, 클리언스 감소 및 면역원성 감소를 포함하는 생물물리학적 특성의 향상이 기대된다.

실시예 2

또 다른 접근 방법은 상기 뇌하수체유도hGH 폴리펩티드에 O-결합 글리코실화 위치를 형성하는데 있다.

그 다음, 이 O-결합글리코실화 위치는 GalNAcT² 효소 등을 사용하여 변이 hGH 폴리펩티드가 글리코PEG화 할 수 있는 위치로 사용할 수 있다.

그 다음으로, 1종 이상의 추가전이효소를 사용하여 그 위치에 글리칸 또는 글리코콘주게이트를 부가할 수 있다.

상기 변이 뇌하수체 유도hGH 폴리펩티드는 글리코PEG화 하는 것이 바람직하다.

도 4는 에쉐리키아콜리에서 생성된 hGH O-결합글리칸 변이체의 글리코 PEG화를 설명한 것이다.

실시예 3

hGH 및 그 리셉터의 결정구조에 의해 동정되는, 뇌하수체유도hGH상의 단백질 루프영역은 글리코실화 위치를 도입하는 변이에 가장 적합하다(도5).

구체적으로 말하면, 야생형 뇌하수체 유도hGH 아미노산서열(다음표 5 및 도 1 참조)의 아미노산1-6(FPTLPL;SEQIDNO:10), 아미노산 48-52(PQTSL;SEQIDNO:11), 아미노산 59-64(PTPSNR;SEQIDNO:12), 아미노산 133-139(PRTGQIF;SEQIDNO:13), 아미노산 133-145(PRTGQIFKQTYSK;SEQIDNO:14) 또는 아미노산 139-142(FKQT;SEQIDNO;15) 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, N-결합 또는 O-결합 글리코실화 위치가 얻어진 변이뇌하수체유도hGH 폴리펩티드에 도입되도록 변이할 수 있다.

도 6은 6개의 도입된 O-결합 글리코실화 위치를 나타낸 것이다. 도 6에서 화살표 각각은 O-결합 글리코실화가 GH-N O-결합글리칸hGH 변이체에서 발생하는 트레오닌잔기를 나타낸다.

도 7 및 도 8은 각각 2종의 추가 GH-N O-결합글리칸hGH변이체를 나타낸다.

실시예 4

이 실시예는 야생형 인간성장호르몬 서열 또는 그 수식버젼(modified version)의 바람직한 프롤린 함유위치에 O-결합글리코실화 위치, 즉 세린 또는 트레오닌잔기를 도입하는 아미노산 서열변이를 설명한 것이다.

1. N-말단변이

N-말단변이체에서, 야생형hGH, FP²TIP⁵ LS;SEQIDNO:16의 N-말단은 MXnTP²TIP⁵ 또는 MAPTSSXnP²TIP⁵LS로 치환한다.

바람직한 변이예는 다음것을 포함한다:

2. 내부변이위치 1

이 타입의 변이체에서, 야생형hGH,FP²TIP⁵LS; SEQIDNO:24의 N-말단은 ZmP²TXnBoP⁵LS로 치환한다.

바람직한 변이예는 다음것을 포함한다:

3. 내부변이위치 2

이 타입의 변이체에서, P³⁷를 둘러싼 아미노산서열, AYIP³⁷KEQKY;SEQIDNO:30 은 AZmJQP³⁷ orZnBo△pY로 치환한다(여기서, Z, I, O, X와 B중 최소 하나는 Thr 또는 Ser 에서 각각 선택하며, △ 에는 Lys(k)를 포함하고, X는 Asp(D)이다).

바람직한 변이체예에는 다음것을 포함한다:

4. 내부변이위치 3

이 타입의 변이체에서, P⁴⁸을 둘러싼 아미노산 서열, LQNP⁴⁸QTSLC; SEQIDNO:35는 LZmJqP⁴⁸ OrXnBoLC로 치환한다(여기서, Z, J, O및 X중 최소 하나는 Thr 또는 Ser 에서 각각 선택한다.

바람직한 변이체예에는 다음것을 포함한다:

5. 내부변이위치4

이 타입의 변이체에서, P⁵⁹를 둘러싼 아미노산서열, SESIP⁵⁹ TPNREET;SEQIDNO:38은 SZmUsJqP⁵⁹TPOrXnBo△ rT 로 치환한다(여기서, Z, J, O, B, △, U 및 X 중 최소 하나는 각각 Thr 또는 Ser 에서 선택한다; B, △ 및 Z는 전하아미노산(charged amino acids)을 포함한다).

바람직한 변이체예에는 다음것을 포함한다:

6. 내부변이위치 5

이 타입의 변이체에서, P⁸⁹를 둘러싼 아미노산 서열, SWLEP⁸⁹VQFLRS;SEQIDNO:48은 SZmUsJqP⁸⁹OrXnBo△ rλts 로 치환한다(여기서, Z, U, J, O, B 및 X 중 최소 하나는 Thr 또는 Ser 에서 각각 선택하며; J 및 λ 에는 전하아미노산을 포함한다.

바람직한 변이체예에는 다음것을 포함한다:

7. 내부변이위치 6

이 타입의 변이체에서, P¹³³ 를 둘러싼 아미노산서열, EDGSP¹³³RTGQIF; SEQIDNO:54는 EZmUsJqP¹³³OrXnBo△rλtF 로 치환한다(여기서, Z, U, J, O, B 및 X 중 최소 하나는 Thr 또는 Ser 에서 각각 선택한다.

바람직한 변이체예에는 다음 것을 포함한다:

8. 내부변이위치 7

이 타입의 변이체에서, P¹⁴⁰을 둘러싼 아미노산서열, GQIFK¹⁴⁰ QTYS; SEQIDNO:65 는 GZmUsJg△r¹⁴⁰orXnBoS(여기서, Z, U, J, O, B 및 X 중 최소 하나는 Thr 또는 Ser 에서 선택한다.)로 치환한다.

바람직한 변이체예로는 다음것을 포함한다.

9. C-말단변이

이 타입의 변이체에서, 야생형hGH 의 C-말단에서 아미노산서열, VEGSCG¹⁹⁰F; SEQIDNO:74는 VEGSCG¹⁹⁰PXnBoZmUsP(여기서, Z, U, B 및 X 중 최소하나는 Thr 또는 Ser 에서 각각 선택함)로 치환한다.

바람직한 변이체예로는 다음것을 포함한다:

위의 모든 경우에서, X, Z, B, △, J, U, O 및 λ 는 E(글루타메이트), 전하없는 아미노산 또는 M, F, MF 를 포함하는 디펩티드 조합등에서 각각 선택하며, m,n,o,p,q,r,s는 각각 정수 0~3에서 선택한다.

위의 모든경우, N-말단 Met는 hGH 변이체에 존재할 수 있거나, 없을 수도 있다.

아미노산 잔기의 번호붙침은 수식되지 않은 초기 서열을 기준으로 하며, 그 서열에서 가장왼쪽 잔기를 1로 번호를 붙친다.

수식하지 않은 아미노산의 번호붙침은 변경없이 한 다음 그 수식을 한다.

위에서 설명한 1개 이상의 서열수식은 이 발명의 hGH 변이체에 존재한다.

이 발명은 소정의 실시예에 따라 설명하였으나,

이 발명의 다른 예와 변형은 이 발명의 범위에서 벗어남이 없이 이 분야의 기술자에 의해 실시할 수 있다.

이 특허출원에서 인용한 모든특허, 특허출원 및 다른 간행물은 참고문헌으로 인용하여 설명한 것이다.

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Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> NON_CONS <222> (1)..(191) <223> mature human growth homone (GH-V) <400> 2 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Gln Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Glu Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 3 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> NON_CONS <222> (1)..(191) <223> human growth hormone mutant 1 <400> 3 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Gln Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Glu Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 4 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> NON_CONS <222> (1)..(193) <223> human growth hormone mutant 2 (O-linked N-terminus) <400> 4 Pro Thr Thr Phe Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met 1 5 10 15 Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Gln Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln 35 40 45 Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser 50 55 60 Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg 85 90 95 Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val 100 105 110 Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 115 120 125 Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr 130 135 140 Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys 145 150 155 160 Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu 165 170 175 Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly 180 185 190 Phe <210> 5 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> NON_CONS <222> (1)..(191) <223> human growth hormone mutant 3 <400> 5 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Gln Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Glu Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 6 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> NON_CONS <222> (1)..(191) <223> human growth hormone mutant 4 (O-linked N-terminus) <400> 6 Met Val Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met 1 5 10 15 Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln 35 40 45 Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser 50 55 60 Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg 85 90 95 Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val 100 105 110 Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 115 120 125 Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr 130 135 140 Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys 145 150 155 160 Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu 165 170 175 Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly 180 185 190 Phe <210> 7 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> NON_CONS <222> (1)..(193) <223> human growth hormone mutant 5 <400> 7 Met Val Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met 1 5 10 15 Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln 35 40 45 Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser 50 55 60 Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg 85 90 95 Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val 100 105 110 Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 115 120 125 Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr 130 135 140 Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys 145 150 155 160 Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu 165 170 175 Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly 180 185 190 Phe <210> 8 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> NON_CONS <222> (1)..(192) <223> human growth hormone mutant 6 <400> 8 Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu 1 5 10 15 Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe 20 25 30 Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn 35 40 45 Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 50 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Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 50 55 60 Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser 65 70 75 80 Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 85 90 95 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 100 105 110 Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg 115 120 125 Leu Glu Asp Gly Ser Pro Thr Val Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr 130 135 140 Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn 145 150 155 160 Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr 165 170 175 Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Phe Pro Thr Ile Pro Leu 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Pro Gln Thr Ser Leu 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Pro Thr Pro Ser Asn Arg 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe 1 5 <210> 14 <211> 13 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<220> <221> ACT_SITE <222> (1)..(11) <223> N-terminal mutants <400> 21 Met Pro Thr Thr Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> ACT_SITE <222> (1)..(11) <223> N-terminal mutants <400> 22 Met Pro Thr Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> ACT_SITE <222> (1)..(12) <223> N-terminal mutants <400> 23 Met Pro Thr Ser Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser 1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 25 Met Phe Pro Thr Gln Ile Pro Leu Ser 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 26 Met Phe Pro Thr Ser Ile Pro Leu Ser 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 27 Met Phe Pro Thr Ser Ser Pro Leu Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 28 Met Thr Pro Thr Gln Ile Pro Leu Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 29 Met Phe Pro Thr Thr Thr Pro Leu Ser 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 30 Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 31 Ala Tyr Ile Pro Thr Gln Gly Ala Tyr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 32 Ala Tyr Ile Pro Thr Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 33 Ala Gln Ile Thr Pro Thr Glu Gln Lys Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN 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(1)..(11) <223> mutants <400> 53 Ser Met Val Thr Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 55 Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Gly Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 56 Glu Asp Gly Ser Pro Asn Thr Gly Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 57 Glu Asp Gly Ser Pro Thr Gln Gly Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 58 Glu Asp Gly Ser Pro Thr Val Gly Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 59 Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Thr Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 60 Glu Asp Gly Ser Pro Thr Ser Ser Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 61 Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Gln Gly Ile Phe 1 5 10 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 62 Glu Asp Gly Ser Pro Gln Thr Gly Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 63 Glu Asp Gly Thr Pro Asn Thr Gly Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 64 Glu Asp Gln Thr Pro Asn Thr Gly Gln Ile Phe 1 5 10 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 66 Gly Gln Ile Phe Asn Gln Thr Tyr Ser 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 67 Gly Gln Ile Phe Asn Ile Thr Tyr Ser 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 68 Gly Gln Ile Phe Pro Gln Thr Ser Ser 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 69 Gly Gln Ile Phe Pro Thr Thr Thr Ser 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 70 Gly Gln Ile Thr Pro Gln Thr Tyr Ser 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 71 Gly Gln Ile Phe Thr Gln Thr Tyr Ser 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 72 Gly Gln Ile Ser Thr Gln Thr Tyr Ser 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(9) <223> mutants <400> 73 Gly Gln Ile Pro Thr Thr Thr Tyr Ser 1 5 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 1 5 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 75 Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 76 Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 77 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> mutants <400> 77 Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 78 Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Thr Ile Pro 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> mutants <400> 79 Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Met Val Thr Pro 1 5 10

Claims (42)

1. 변이 인간성장호르몬(mutant human growth hormone) 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 분리된 핵산에 있어서,

   상기 변이 인간성장호르몬이 그 상응하는 야생형 인간성장 호르몬에 존재하지 않은 새로 도입한 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위로 이루어짐을 특징으로 하는 분리된 핵산.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 상응하는 야생형 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 새로 도입한 글리코실화 부위는 프롤린 잔기에 근접하여 있는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산
4. 제 3항에 있어서,

   상기 프롤린잔기는 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 의 위치 2,5,37,48,59,89,113,140 또는 190에 위치되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
5. 제 1항에 있어서,

   상기 변이 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또 9로 이루어짐을 특징으로 하는 분리된 핵산.
6. 제 1항에 있어서,

   상기 변이 인간성장호르몬은 한개 이상의 새로 도입한 글리코실화 부위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
7. 제 1항의 분리된 핵산으로 이루어진 발현 카세트(expression cassette).
8. 제 1항의 분리된 핵산으로 이루어진 세포.
9. 변이인간성장호르몬에 상응하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않은 새로 도입한 N-결합 또는 C-결합 글리코실화 부위로 이루어짐을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬.
10. 제 9항에 있어서,

    상기 상응하는 야생형 인간성장호르몬은 아미노산서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 가짐을 특징으로 하는 변이 인간성장호르몬.
11. 제 9항에 있어서,

    상기 새로도입한 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위는 프롤린 잔기에 근접하여 있는 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬.
12. 제 11항에 있어서,

    상기 프롤린잔기는 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 의 위치 2, 5, 37, 48, 59, 89,113,140 또는 190에 위치되는 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬.
13. 제 9항에 있어서,

    아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어지는것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬.
14. 제 9항에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬이 1개 이상의 새로 도입한 글리코실화 부위로 이루어짐을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬.
15. 제 9항에 있어서,

    글리코실링커(glycosyl linker)에 의해 글리코실화 부위에 부착한 수용성폴리머로 이루어지는 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬.
16. 제 15항에 있어서,

    상기 글리코실링커는 무손상(intact)글리코실링커인 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬.
17. 제 15항에 있어서,

    글리코실화 부위는 변이글리코실화 부위인 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬.
18. 변이인간성장호르몬에 상응하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않은 새로 도입한 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위로 이루어지는 변이인간성장호르몬의 생성방법에 있어서,

    (a) 상기 변이인간성장호르몬을 재조합 생성하는 스텝과,

    (b) 상기 변이인간성장호르몬을 새로 도입한 글리코실화 부위에서 글리코실화 하는 스텝으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬의 생성방법.
19. 제 18항에 있어서,

    상기 상응하는 야생형 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 갖는 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬의 생성방법.
20. 제 18항에 있어서,

    상기 새로 도입한 글리코실화 부위가 프롤린 잔기에 근접하여 있는 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬의 생성방법.
21. 제 20항에 있어서,

    상기 프롤린 잔기는 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 의 위치 2,5,37,48,59,89, 113,140 또는 190에 위치하는 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬의 생성방법.
22. 제 18항에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어지는 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬의 생성방법.
23. 제 18항에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬은 1개 이상의 새로 도입한 글리코실화 부위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 변이인간성장호르몬의 생성방법.
24. 변이인간성장호르몬에 상응하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않은 새로 도입한 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위로 이루어지는 유효량의 변이인간성장호르몬으로 조성하는 의약조성물.
25. 제 24항에 있어서,

    상기 상응하는 야생형 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 갖는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
26. 제 24항에 있어서,

    상기 새로 도입한 글리코실화 부위는 플롤린 잔기에 근접하여 있는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
27. 제 26항에 있어서,

    상기 프롤린 잔기는 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 의 위치 2,5,37,48,59,89, 113,140 또는 190에 위치하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
28. 제 24항에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어지는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
29. 제 24항에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬은 1개 이상의 새로 도입한 글리코실화 부위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
30. 유효량의 변이인간성장호르몬을 환자에 투여하여 환자의 인간성장호르몬의 결핍을 치료하는 방법에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬이 그 상응하는 야생형 인간 성장호르몬에 존재하지 않은 새로 도입한 N-결합 또는 O-결합글리코실화 부위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 30항에 있어서,

    상기 상응하는 야생형 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 30항에 있어서,

    상기 새로 도입한 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위는 프롤린 잔기에 근접하여 있는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 32항에 있어서,

    상기 프롤린 잔기는 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 의 위치 2,5,37,48,59,89, 113,140 또는 190에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 30항에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 30항에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬은 1개 이상의 새로 도입한 글리코실화 부위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 변이인간성장호르몬에 상응하는 야생형 인간성장호르몬에 존재하지 않은 새로 도입한 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위로 이루어지는 변이인간성장호르몬의 생성방법에 있어서, 글리코 콘주게이트(glycoconjugate)를 제조하는 방법에 있어서,

    (a) 상기 변이인간성장호르몬을 재조합 생성하는 스텝과,

    (b) 상기 새로 도입한 글리코실화 부위에서 수식당으로

    상기 변이인간성장호르몬을 효소에 의해 글리코실화 하는 스텝으로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
37. 제 36항에 있어서,

    상기 수식당은 폴리(에틸렌글리콜)과 m-폴리(에틸렌글리콜)에서 선택한 하나의 멤버(member)로 수식하는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 36항에 있어서,

    상기 상응하는 야생형 인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:1 또는 SEQ IDNO:2 를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 36항에 있어서,

    상기 새로 도입한 글리코실화 부위는 프롤린 잔기에 인접하여 있는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제 36항에 있어서,

    상기 프롤린 잔기는 SEQ IDNO: 1 또는 SEQ IDNO:2 의 위치 2,5,37,48,59,89, 113,140 또는 190에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제 36항에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬은 아미노산 서열 SEQ IDNO:3,4,5,6,7,8 또는 9로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 36항에 있어서,

    상기 변이인간성장호르몬은 1개 이상의 새로 도입한 글리코실화 부위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.

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