HUT64589A

HUT64589A - Superactive grf analogues

Info

Publication number: HUT64589A
Application number: HU9201399A
Authority: HU
Inventors: Richard Dennis Dimarchi; Mark Louis Heiman; James Edwin Shields; David Lee Smiley; David Ira Wickiser
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1991-04-26
Filing date: 1992-04-27
Publication date: 1994-01-28
Also published as: NZ242459A; FI921855A; IL101620A; TW360661B; CA2067304A1; ATE178073T1; KR920019817A; BR9201512A; NO921595D0; NO921595L; GR3030459T3; IE921338A1; AU690264B2; SG46364A1; DK0511003T3; MX9201878A; AU1513292A; EP0511003B1; AU2333495A; HU9201399D0

Description

A növekedési hormon az agyalapi mirigy szekretálódó proteinje, amelynek jelentős hatása van az organizmus fejlődésére. A növekedési hormon szintjének mesterséges befolyásolásával a vizsgálatok szerint komoly terápiás hatásokat érhetünk el. Kimutatták, hogy a humán növekedési hormon adagolásával a növekedési hormon hiánya miatt fellépő tünetcsoportokat és a hiány'miatt fellépő humán megbetegedéseket hatásosan kezelhetjük a növekedési hormon adagolásával. Az ilyen irányú felhasználáson túl bizonyos vizsgálatok a növekedési hormon uj és jelentős tulajdonságait tárták fel, amelyek a növekedési hormon szintjének szabályozhatóságával összefüggő, további jelentős lehetőségeket tártak fel. így például, újabb klinikai vizsgálatok jelzik, hogy növekedési hormon adagolásával sikeresen küzdhetünk az ember öregedésével együttjáró problémákkal. Az állatok megnövelt növekedési hormonszintje a vizsgálatok szerint növeli a zsírmentes, azaz a sovány izomzat tömegét. Ez utóbbi megfigyelés azt eredményezheti, hogy növelhetjük a sovány hús termelését vagy a nagyobb és/vagy erősebb állatok tenyésztését.

A növekedési hormon természetes körülmények között az agyalapi mirigyben bioszintetizálódik, ugyanakkor a növekedési hormon szekréciója a véráramba egy másik protein által szabályozott, ezt növekedési hormon releasing faktornak (a továbbiakban GRF) nevezzük. Ezt a hormont a szakemberek szomatokrininnek, növekedési hormon releasing hormonnak (GHRH) vagy növekedési releasing hormonnak (GRH) is nevezik. A fentiek szerint a véráramban jelenlevő növekedési hormon szintjének növelésére két lehetőségünk van:

1) a növekedési hormon koncentrációját az organizmusban közvetlenül fokozzuk, vagy

2) fokozzuk a szervezet természetes képességét a növekedési hormon termelésére.

Ez utóbbit elérhetjük GRF adagolásával. A GRF in vivő növeli a vér növekedési hormon szintjét (Rivier és munkatársai, Natúré, 300, 276., 1982). A GRF hatását (továbbá ennek különböző szerkezeti analógjainak hatását) a növekedési hormontermelésre széleskörűen tanulmányozták. A GRF közvetlen adagolásának elsődleges akadálya ennek in vivő mutatkozó rövid felezési ideje (Frohman, L. A. és munkatársai, J. Clin. Invest., 7 8, 906., 1986). Hatásosabb és/vagy hosszabb életidejü GRF molekulák használata éppen ezért előnyös lenne a hatásos humán terápia vagy az állattenyésztés szempontjából.

A GRF szerkezetét sokféleképpen módosították, amiután hosszabb életidejü és/vagy hatékonyabb GRF analógokat kaptak. Kimutatták, hogy az első 29 N-terminális aminosav elegendő a GRF teljes aktivitásának megtartásához (Speiss és munkatársai, Biochemistry, 21, 6037., 1982). Az egyik stratégia az volt, hogy a GRF molekula különböző régióiba uj D-aminosavakat építettek be (Láncé, V. A. és munkatársai, BBRC, 119, 265., 1984; Coy, D. H. és munkatársai, Peptides, 8(1), 49., 1986). Másik stratégia szerint a GRF peptid lánc gerincét módosították oly módon, hogy az N-terminális részbe peptidkötés izotereket építettek be (Tourwe, D., Janssen. Chim. Acta, 3, 3., 1985; Hocart, S. J.

és munkatársai, J. Med. Chem., 33, 1954 - 58., 1990).

az eddig

A találmány tárgya eljárás megnövelt hatású és ismert GRF analógokhoz képest technikai előnyökkel

rendelkező GRF analógok előállítására. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket előnyösen használhatjuk az állatorvosi gyakorlatban, különösen a szarvasmarha-,

sertés-,

juh-, baromfi- és haltenyésztésben. Az alábbiakban megadjuk a leírásban használt rö-

viditések és kifejezések jelentését:

Alá:	alanin aminosav.
Analóg:	egy vegyülethez szerkezetileg hasonlító vegyület. Ha a kifejezést polipeptidekkel kapcsolatban használjuk, úgy az a primer, szekunder és tercier szerkezetre is vonatkozik.
Arg:	az arginin aminosav.
Asn:	az aszparagin aminosav.
Asp:	az aszparaginsav aminosav.
Bázispár	(bp): dezoxi-ribonukleinsavat vagy ribonukleinsavat jelent. Az A, C, G és T betűk a nukleotidok 5'-monofoszfát alakjait jelenti, nevezetesen a dezoxi-adenint, dezoxi-citidint, dezoxi-guanint, illetve a dezoxi-timint, akkor, ha dezoxi-ribonukleinsav molekulákról van szó. Az U, C, G és T betűk a ribonukleinsav molekulák esetén az uracil, citidin, guanin és timin nukleozidok monofoszfát alakjait jelentik sorrendben. A kettősszálu dezoxi-ribonukleinsavban az adenin timinnel vagy a

• · · · citozin guaninnal párosodik. A dezoxi-ribonukleinsav/ribonukleinsav heteroduplex bázispárok kialakulásakor a timin uracillal, a citozin guaninnal párosodik.

Cys: cisztein aminosavat jelent, vagy a cisztein molekula egy részét, amely diszulfid kötéssel kovalensen kapcsolódik egy másik cisztein molekularészhez .

DNS:' dezoxi-ribonukleinsav.

EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav.

EDj-θ: közepes hatásos dózis.

Funkcionális analóg:

olyan molekulát jelent, amely funkcionális tulajdonságaiban hasonló, de a vegyület természetben előforduló alakjától szerkezetileg különbözik. Funkcionális analógként tárgyaljuk a szülőmolekula fragmenseit (vagy ezek különböző csoportokkal kiegészített alakjait), amelyek a szülőmolekulához viszonyítva hasonló funkcionális tulajdonságokkal rendelkeznek.

Gin: glutamin aminosav.

Glu: glutaminsav aminosav.

Gly: glicin aminosav.

GRF PEPTID: egy olyan polipeptid, amely a 27 - 76. helyen olyan aminosavakat tartalmaz, amely elősegíti az agyalapi mirigyben a növekedési hormon szekrécióját és szintézisét. A GRF PEPTIDEK közé soroljuk a természetes vagy a szintetikus utón ·«··· · · ·

His :	előállított funkcionális analógokat is, amelyeket a 4,517,181, 4,518,586, 4,528,190, 4,529,595, 4,563,352, 4,585,756, 4,595,676, 4,605,643, 4,620,976, 4,626,523, 4,628,043 és a 4,689,318 sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetnek; a fenti leírásokat referenciaként épitjük'be a jelen leírásba. A GRF PEPTID-ek kifejezés magában foglalja a fentiek nem toxikus sóit is. a hisztidin aminosav.
Hse:	a homoszerin aminosav.
Ile:	az izoleucin aminosav.
Leu:	a leucin aminosav.
Lys :	a lizin aminosav.
Met:	a metionin aminosav vagy ennek deformilezett
mRNS:	analógja. hírvivő ribonukleinsav.
MWCO:	a molekulasúlyában csökkentett vegyület rövidítése .
Orn:	ornitin.
Phe:	a fenil-alanin aminosav.
Plazmid:	extrakromoszómális, autonóm replikálódó genetikai elem.
PMSF:	a fenil-metil-szulfonil-fluorid rövidítése.
Pro:	a prolin aminosav.
Leolvasási	fázis: olyan nukleotid szekvencia, amelyről a nukleotid triplettek, a transzlációs apparátus, a transzfer

• · ♦ · ·

- 7 ribonukleinsav és a riboszómák, továbbá az ezzel kapcsolatos sejtfaktorok közreműködésével a fehérje szintézise (transzláció) megtörténik, oly módon, hogy az egyes aminosavakat meghatározó tripletteket helyes sorrendben ismeri fel az apparátus. Mivel mindegyik triplett különböző és ugyanakkor azonos hosszúságú, a kódoló szekvencia a hármas egységek többszöröséből áll, egy bázispár beépülése vagy kiesése (ezt frameshift mutációnak nevezzük) azt eredményezheti, hogy azonos dezoxi-ribonukleinsav szegmens két különböző proteint kódol. Ennek elkerülésére a megfelelő polipeptidet meghatározó triplett kodonok az iniciációs kodontól kezdve megfelelő hármas egységbe kell, hogy sorakozzanak, azaz meg kell, hogy tartsák a megfelelő leolvasási fázist.

Rekombináns DNS klónozó vektor:

bármely replikálódó molekula,.ideértve - nem limitáló jelleggel - a plazmidokat és fágokat, amelyekbe egy vagy több további dezoxi-ribonukleinsav szegmens építhető be, vagy amelyekbe ez a beépítés már megtörtént.

Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektor: bármely olyan rekombináns DNS klónozó vektor, amelybe egy promotert építettünk be.

Replikon: egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely szabályozza és amely így lehetővé teszi egy plazmid vagy egy másik vektor molekula autonóm replikációját.

«*« «

RNS:	ribonukleinsav.
RP-HPLC:	reverz fázisú nagyfelbontású folyadék-kromatográfia.
Ser:	a szerin aminosav.
Thr:	a treonin aminosav.

Transzkripció: az a folyamat, amelynek során a dezoxi-ribonukleinsav nukleotid-szekvenciájában meghatározott információ a komplementer ribonukleinsav szekvenciává alakul.

Transzláció:	az a folyamat, amelynek során a hírvivő ribonukleinsavban meghatározott genetikai információ a polipeptid lánc szintézisében nyilvánul meg.
Trisz:	a trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán rövidítése.
Trp:	a triptofán aminosav.
Tyr:	a tirozin aminosav.
Val:	a valin aminosav.
Vektor:	egy olyan replikon, amely génmanipulációs technikák során használatos sejtek transzformálására, továbbá, amely egy megfelelő protein molekula szintézisét meghatározó polinukleotid-szekvenciát hordoz, amely megfelelő szabályozó szekvenciákkal kombinálva a transzformált gazdasejtnek specifikus tulajdonságokat biztosit. A plazmidok, vírusok és bakteriofágok megfelelő vektorok, mivel ezek saját törvényeik szerint replikálódnak. Mesterséges vektorokat állíthatunk elő oly módon, hogy restrikciós enzimekkel és ligázokkal hasítjuk és

« « · · · · • * · · * · •»♦# < * · · • « · ····♦·· r

- 9 összekapcsoljuk a különböző forrásból származó dezoxi-ribonukleinsav molekulákat. A vektor kifejezést a leírásban a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorokra és a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorokra is használjuk.

A leíráshoz mellékelt ábrákon megadott restrikciós helyek és funkcionális térképek a leírásban megadott rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorokat reprezentálják. A restrikciós helyek nem kizárólagosak, azaz az ábrákon megadott vektorok több restrikciós helyet is tartalmazhatnak.

Az 1. ábrán megadjuk a pHS19O jelű plazmid restrikciós és funkcionális térképét.

A 2. ábrán ismertetjük a pHS5OO plazmid restrikciós és funkcionális térképét.

A pHS452 sorszámú plazmid restrikciós és funkcionális térképét a 3. ábrán adjuk meg.

A 4. ábrán grafikusan ábrázoljuk a p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH adagolásával elért növekedési hormon szint növekedését sertésekben.

Az 5. ábrán grafikusan ábrázoljuk a p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH adagolását követő változásokat a sertés vizeletben levő karbamid nitrogén szint-kiválasztásban.

- 10 A találmány eljárás az alábbi képletben megadott szintetikus GRF peptid analógok (GRF PEPTIDEK) előállítására:

Xl-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12

Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu

Gln-A25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T,

ahol
A9	: Ser, Alá, Leu, Thr vagy Asn,
A12	: Arg vagy Lys,
A15	: Gly, Alá, Thr vagy Leu,
A21	: Arg vagy Lys,
A2 2	: Alá vagy Leu,
A25	: Asp vagy Glu,
A27	: Met, Ser, Arg, Leu vagy norleucin,
A28	: Ser vagy Asn,
Y	: 0 vagy az 1-15. aminosavaknak megfelelő amino-
	sav-szekvencia,
Z	: 0 vagy az 1-32. aminosavaknak megfelelő
	aminosav-szekvencia, és
ahol
T	: az alábbi általános képletekkel megadható karb-
	oxil-terminális csoport: -C00R , -CR 0, 8. 8 -CONHNHR , -C0N(R ) (R, ) vagy CH„0R , ahol 8 8 D Z cL R és R. egymástól függetlenül rövidszénláncu

alkilcsoport, hidrogénatom, egy Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_c)(R^), ahol ^Rc és R^ egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövidszénláncu alkilcsoport • *« • 44 « • •4 4 44

XI az alábbi általános képlettel megadott acil csoport:

II

R_x-A-(CH₂)_d-(NH)_c-B-(NH)_b~(CH₂)_aCH-C^R2 ahol ^R1 : hidrogénatom, metil-, etil-, hdiroxi-etilvagy fenilcsoport, vagy halogénatommal szubsztituált fenilcsoport, rövidszénláncu alkilcsoport, rövidszénláncu alk^R2 oxicsoport, hidroxilcsoport, acetamido-, trifluor-metil-, vagy szulfamidocsoport; vagy nitro-, amino-, hidroxi-metil5- vagy 6-tagu, egy vagy több nitrogénatomot, oxigénatomot vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos gyűrű;

1, 2 vagy 3;

: 0 vagy 1;

- 12;

: 0, oxigén- vagy kénatom;

: karbonil-, szulfonil- vagy szulfinilcsoport;

: hidrogénatom, metilcsoport, hidroxi-metil-csoport, p-hidroxi-benzil-csoport vagy ahol

5;

·*»·

- 12 met.il-, etil-, hidroxi-etil-, amino-, hidroxil-, fenil- vagy halogénatommal, alkilcsoporttal, alkoxicsoporttal, hidroxilcsoporttal, nitrocsoporttal, aminocsoporttal vagy acetamidocsoporttal szubsztituált fenilcsoport, vagy szulfamidocsoport, vagy egy vagy több nitrogén-, oxigén- vagy kénatomot tartalmazó, 5- vagy 6-tagu heterociklusos gyűrű;

továbbá fentiek nem-toxikus, gyógyszerészeti szempontból elfogadható sói.

Az (1) általános képletben rövidszénláncu alkilcsoport jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport, például metil-, etil-, n-izopropil-, izopropil-, η-butil-, szek-butil-, izobutil- vagy tercier-butil-csoport, rövidszénláncu alkoxicsoport jelentése például metoxi-, etoxi-, n-propoxi-, tercier-butoxi-csoport és hasonlók; a halogénatom jelentése fluor-, klór-, bróm- vagy jódatom; a szubsztituált fenilcsoport egy vagy több, azonos vagy különböző csoporttal, például halogénatommal, rövidszénláncu alkil-, rövidszénláncu alkoxi-, hidroxil-, nitro-, amino-, acetamido- vagy szulfonamidocsoporttal szubsztituált fenilcsoport, például 4-klór-fenil-, 3-jód-fenil-, 2-fluor-fenil-, 4-metil-fenil-, 3-klór-4-metil-fenil-, 3-bróm-fenil-, 4-etil-fenil-,

3-etoxi-fenil-, 2-metoxi-fenil-, 4-izopropoxi-fenil-,

4-hidroxi-fenil-, 3,4-dihidroxi-fenil-, 2,4-dihidroxi-fenil-, 4-nitro-fenil-, 3-amino-fenil-, 3-klór-4-hidroxi-fenil-, 2-acetamido-fenil-, 4-szulfonamido-fenil-, 3,4-dimetoxi-fenil-, 2-fluor-4-amino-fenil-csoport vagy hasonlók; az egy vagy több nitrogén-, oxigén- vagy kénatomot tartalmazó 5- vagy 6-tagu heterociklusos gyűrű alatt olyan 5-tagu heterociklusokat értünk, mint például a pirrol, tiofén, furán, imidazol, oxazol, oxadiazol, tiazol, 1,3,4-tiodiazol, azoxazol és más, hasonlók; 6-tagu gyűrűk alatt például piridint, pirimidint, piránt, dihidro-piránt, tiazint, tiapirámot, triazint és más, hasonló, 6-tagu heterociklusokat értünk. Az ilyen 5- és 6-tagu heterociklusos vegyületek szubsztituenseket is hordozhatnak, például rövidszénláncu alkil-, rövidszénláncu alkoxi-, hidroxil-, aminocsoportot vagy halogénatomot .

Az (1) általános képletben

XI például p-klór-hippuroil-csoport, p-metil-hippuroil-csoport, p-nitro-hippuroil-csoport, hippuroilcsoport, p-hidroxi-hippuroil-csoport, 3-benzoil-propionil-csoport, n-ftáloil-glicil-csoport, n-fenil-malonamidoil-csoport, p-metil-N-fenil-malonamidoil-csoport vagy p-fluor-hippuroil-csoport lehet.

Ahogy a fentiekben már megadtuk, a találmány előnyös vegyületei az állati eredetű GRF peptidek származékai és módosu latai .

A korábbiakban (1) általános képletben az A20, A21, stb. jellel jelölt csoportok az egyes aminosavaknak felelnek meg, mégpedig úgy, hogy a protein egyes aminosavait az amino-terminális végtől kezdve számozzuk, ahogy ezek a természetes vegyületben és az irodalomban szerepelnek. A témában jártas szakemberek előtt a jól jellemzett proteinek aminosav-csoportjainak jelölése ismert. Például a des-Tyrl-GRF jelölés jól érthető a szakember számára, a jelölés azt jelenti, hogy a természetes GRF molekulában hiányzik az amino-terminális tirozin aminosav. A további aminosavak ujraszámozása az adott proteinben szükségtelen, és zavarokat okozhat. A fenti példában a természetben előforduló protein második aminosava lesz az amino-terminális aminosav, de a számozáskor Ala2 jelet fog kapni. Az aminosavak jelölése terén a különböző GRF molekulákat a fentiek szerint adjuk meg.

A találmány egyik előnyös peptidje a sertés GRF (pGRF) módosult változata, ezt a korábbiakban megadott (1) képlettel Írhatjuk le, ahol

A9	Asn,
A12	Arg,
A15	Thr,
A21	Arg,
A2 2	Leu,
A2 5	Asp,
A2 7	Leu, és
A2 8	Ser.

A találmány egy további előnyös peptidje a szarvasmarha GRF (bGRF) egy módosított változata, amely az (1) általános képlettel irható le, ahol

A9	Asn,
A12	Arg,
A15	Thr,
A21	Arg,
A2 2	Leu,
A25	Asp,
A27	Leu, és
A28	Asn. A találmány egy további előnyös peptidje a

humán GRF (hGRF) egy módosított változata, amely az (1) kép-

lettel	adható meg, ahol
A9	Ser,
A12	Lys,
A15	Gly,
A21	Lys,
A22	Leu,
A25	Asp,
A27	Met, és
A2 8	Ser.

A találmány előnyös peptidjeit azzal az (1) általános képlettel írhatjuk le, ahol az érett GRF PEPTID 30 - 43. aminosav-szekvenciája.

A találmány előnyös peptidjei között szerepel egy olyan (1) képletű vegyület, ahol

Y a természetben előforduló egyes GRF peptidek, például a pGRF, bGRF, hGRF, stb. 30 - 43. amino sav-szekvenciájával azonos.

Különösen előnyös Y peptid az alábbi:

Gln-Gln-Gly-Glu-A34-A35-Gln-Glu-A38-A39-A4O-Arg-A42Arg-Leu, ahol

A34 Asp vagy Ser,

A38 Arg vagy Gin,

A39 Gly vagy Arg,

A40 Alá vagy Ser, és

A42 Alá, Val vagy Phe.

Egy különösen előnyös Y peptid az alábbi aminosav- sor rendű:

Glu Gin Gly Glu Ser Asn Gin Glu Arg

Gly Alá Arg Alá ^.rg Leu, ahol egyébként a kérdéses GRF a szarvasmarha GRF-je.

Egy másik, különösen előnyös Y peptid az alábbi aminosav-sorrendű:

Gin Gin Gly Glu Arg Asn Gin Glu Gin

Gly Alá Arg Val Arg Leu, ahol az adott GRF a sertés GRF-je.

Különösen előnyös Y peptid továbbá az alábbi aminosav-sorrendű:

Glu Gin Gly Glu Ser Asn Gin Glu Arg Gly

Alá Arg Alá Arg Leu, amikor az adott GRF peptid a humán GRF.

A találmány szerinti előnyös peptideket azok a vegyületek jelentik, ahol az (1) képletben

Z a GRF prekurzor peptidek 44 - 76. aminosav-szekvenciája.

Különösen előnyösek azok, amelyekben a 44 - 76. aminosav-szekvencia a kérdéses GRF természetben előforduló 44 - 76. aminosav-szekvenciájával azonos. A legelőnyösebb Z peptid-szekvencia az a GRF természetben előforduló 44 - 76. aminosav-szekvencia, ahol a lizint argininnel, és a metionint leucinnal helyettesítjük. Például, az egyik legelőnyösebb GRF peptid aminosav-szekvencia az, amikor Z az alábbi aminosav- szekvencia :

Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-AlaAsp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-LeuLeu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-GIn-Gly, amely a sertés GRF egy módosulata, és amely akkor előnyös, ha a kérdéses GRF a sertés GRF peptidje.

A GRF PEPTID egy igen előnyös aminosav-szekvenciája az, amikor az (1) képletben

Z az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti:

Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-LeuAla-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-ArgAsn-Ser-Gln-Gly, amely a szarvasmarha GRF egy módosulata, és amely akkor előnyös, ha a kérdéses GRF a szarvasmarha peptidje.

Az egyik legelőnyösebb Z szekvencia az (1) képletben az, amikor Z jelentése 0, és ez akkor előnyös, ha a kérdéses GRF a humán peptid.

A találmány előnyös vegyületeit reprezentálják azok, amelyek olyan, korábban megadott (1) általános képlettel irhatok le, ahol Y és/vagy Z peptidek elegendő hosszúak ahhoz, hogy E. coli sejteken nagymértékű expressziót érhetünk el.

A találmány szerinti előnyös vegyületeket továbbá azok a GRF peptidek reprezentálják, amelyekben szabad aminocsoporttal rendelkező aminosavakat egyáltalán nem, vagy ezek közül egyet, vagy több mint egyet kémiailag módosítunk.

A találmány során kémiai módosítás alatt azt értjük, hogy egy aminosav szabad aminocsoportját alkil- vagy hidroxi-alkil-csoporttal dérivatizáljuk. A módosítás mértékét a reakcióidő hosszával vagy a reagens mennyiségével szabályozzuk. Előnyös, ha a szabad aminocsoporttal rendelkező összes aminosavat kémiailag módosítjuk. Különösen előnyös az a GRF peptid, amely mindössze egy kémiailag módosítható aminocsoportot tartalmaz. Egy ilyen vegyületben nincs lizin vagy metionin.

A lizint és/vagy metionint tartalmazó vegyületeket olyan vegyületekké alakítjuk, amelyek az N-terminális végen hordoznak szabad aminocsoportot, az átalakítás során a lizineket argininekké, és a metioninokat leucinokká cseréljük ki.

A találmány szerinti GRF peptidek előállításakor először az N-terminális végen szabad aminocsoporttal rendelkező GRF peptidek szintetizálunk, majd ezután egy megfelelő XI savval vagy ennek egy aktív származékával acilezzük az N-terminális véget. A GRF peptideket előállíthatjuk peptidszintézissel vagy rekombináns módszerekkel. Mindkét módszert megismerhetjük a 4,617,149 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból; a leírást a jelen találmányban referenciaként használjuk. A rekombináns módszerek akkor előnyösek, ha magas hozam elérése a cél.

A szilárd fázisú polipeptid szintézis alapjai jól ismertek a szakemberek körében, alapjai megismerhetők például az alábbi irodalomból: Dugas, H. és Penney, C., Bioorganic Chemistry, Springer-Verlag, New York, 54 - 92. oldal (1981). A GRF analógok szilárd fázison kivitelezett szintézisének technikáit és módszerét leírják a 85302975.9 sorszámú európai közrebocsátási iratban (publikációs száma: 0,161,852, 1985. november 21.). Ezen leírást teljes egészében referenciaként építjük be a jelen leírásba .

A találmány egyik előnyös kiviteli módja szerint a GRF peptideket rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákkal állítjuk elő. A témában jártas szakemberek tudják azt, hogy hogyan kell teljes mértékben vagy szemiszintetikus módon egy adott aminosav-szekvenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat előállítani /lásd például Brown és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 109. (1979)/. Az adott polipeptid transzlációjához az előállított szintetikus dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát a bőségesen rendelkezésre álló rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok valamelyikébe építjük be megfelelő restrikciós endonukleázokat használva.

A ténylegesen használt endonukleázokat a használt expressziós vektor restrikciós térképe határozza meg. A GRF peptidet kódoló szekvenciát a promoterhez és a riboszóma kötőhelyhez képest megfelelő leolvasási fázisba kell beépítenünk az expressziós vektorba, a promoternek és a riboszóma kötőhelynek abban a mikroorganizmus sejtben funkcionálnia kell, amelyben a GRF peptidet expresszálni kívánjuk. Ismeretes a szakemberek körében az is, hogy megfelelő mértékű expreszszió eléréséhez milyen kodonokat kell használnunk /lásd See, W. Fiers és munkatársai, Natúré, 260, 500. (1976) ·, továbbá a 4,356,270 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást/.

Az E. coli sejtekben történő expresszióhoz előnyösen használhatjuk a pHS190 jelű E. coli plazmid származékait, ezek tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztositó gént, lambda cI857 jelű represszort és lambda pL promotert hordoznak. A pHS19O plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg. A pHS190 plazmid a Northern Régiónál Research Laboratories törzsgyüjteményében van letétbe helyezve NRRL B-18410 sorszámon (1988. szeptember 9-i letéti dátummal).

• · · · ·

- 21 A találmány szerinti szintetikus gén-szekvenciák az alábbi sertés, szarvasmarha és humán GRF analógokat kódolják:

Met₁-Ala₂-pGRF(3-76)OH, Met^-Ala₂~bGRF(3-76)OH, és Met₁-Ala₂-hGRF(3-76)OH.

Más állatfajoknál, például lónál, kacsánál, patkánynál, tengeri malacnál, csincsillánál, baromfiaknál és más állatoknál felhasználható GRF analógok előállítására az ismert aminosav-szekvenciák alapján tervezett szintetikus génekkel állítjuk elő az adott GRF peptidet, és a leírásban a szarvasmarha és a sertés GRF peptidek kapcsán bemutatott módon módosítjuk azokat.

Az E. coli sejtekben meglevő metionil-amino-peptidáz (MAP) enzim hatására a fenti vegyületekről sejten belül lehasad az N-terminális metionin, amiután létrejönnek az alábbi GRF peptidek:

pGRF(2-76)OH, bGRF(2-76)OH és hGRF(2-76)OH.

Ezeket a (2-76)OH GRF peptideket a találmány szerinti vegyületekké /(1) képlet/ alakítjuk át az amino-terminális aminocsoport acilezésével, amit egy XI savval vagy ennek egy aktivált származékával végzünk el.

A molekuláris biológusok körében ismeretes, hogy peptideket fúziós proteinként is expresszálhatunk. Abban az esetben, ha a GRF peptidet fúziós proteinként állítjuk elő, és ezt a terméket később hasítjuk, akkor a kódoló szekvenciát úgy kell megterveznünk, hogy egy proteázzal (például karboxi-peptidázzal) vagy egy kémiai vegyülettel (például bróm-ciánnal) hasítható helyek alakuljanak ki a GRF peptid és a kapott fúziós konstrukció heterológ peptidje között.

A szakemberek körében jól ismertek azok a technikák, amelyekkel olyan fúziós proteinek állíthatók elő, amelyekből az exogén heterológ peptid felszabadítható a fúziós proteinből. Ilyen módszereket ismertetnek például a 4,336,246 számú, valamint a 4,425,437 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. A megfelelő proteolitikus enzim kiválasztásakor azt kell figyelembe vennünk, hogy előnyös, ha a fúziós protein aminosav-láncában az előállítani kívánt polipeptid nem rendelkezik további hasítható hellyel (esetünkben a GRF peptidről van szó). Hasítható helynek az előállítandó peptid és az exogén peptid között kell lenni. így elkerüljük az előállítandó GRF peptid degradációját. Néhány kémiai és enzimatikus ágens specifikus aminosav-szekvenciája jól ismert a szakemberek körében: lásd például Benyon, R. J. és Bond,

J. S., Proteolytic Enzymes: A Practical Approach (1989), Oxford University Press, Oxford, Anglia.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint a GRF peptidet kódoló kívánt szintetikus dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát úgy tervezzük, hogy a kódoló szál 5¹-végén egy Xbal hely, a kódoló szál 3'-végén pedig egy BamHI hely legyen. A vektor dezoxi-ribonukleinsav előállítására a pHS19O plazmid EcoRI helyét eltávolítjuk. A pHS19O vektort EcoRI enzimmel emésztjük, az egyszálu végeket feltöltjük, és a plazmidot újra ligáljuk. Az ezután végzett BamHI és Xbal emésztés után megkapjuk a használható vektor dezoxi-ribonukleinsavat. A szintetikus GRF peptidet kódoló • · · ·

- 23 szekvenciát ezután beépítjük a vektor dezoxi-ribonukleinsavba, és religáljuk.

A ligáit expressziós vektort baktériumsejtbe (például E. coli sejtbe) vagy megfelelő expressziós vektor használatakor emlős gazdasejtbe transzformáljuk, amiután GRF peptid expressziójára képes rekombináns sejtet kapunk, amelyeket a találmány szerinti eljárás során használhatunk. Baktérium és emlős expressziós körülmények között használható megfelelő expressziós vektorok jól ismertek a laboratóriumi gyakorlatban (lásd például Current Protocols in Molecular Biology (1989 és a kiegészítések), Ausubel és munkatársainak szerkesztésében, John Wiley és fia, New York.

A találmány egy előnyös kiviteli változata szerint a pHS452 plazmidot állítjuk elő, és az előzőekben röviden ismertetett módon beépítjük a Met₁-Ala₂~GRF(3-76)OH GRF peptidet kódoló szekvenciát. A fenti peptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát és az ebből adódó megfelelő aminosav-szekvenciát az alábbiakban adjuk meg:

	ATG Met	GCT Alá	GAT Asp	GCT Alá	ATT Ile	TTT Phe	ACT Thr	AAT Asn
AAT	TAT	CGA	CGC	GTT	CTG	ACT	CAG	CTG	TCT
Asn	Tyr	Arg	Arg	Val	Leu	Thr	Gin	Leu	Ser
GCT	CGT	CGT	CTG	CTG	CAG	GAT	ATT	CTG	TCT
Alá	Arg	Arg	Leu	Leu	Gin	Asp	Ile	Leu	Ser
CGT	CAG	CAG	GGT	GAA	CGT	AAC	CAG	GAA	CAA
Arg	Gin	Gin	Gly	Glu	'Arg	Asn	Gin	Glu	Gin
GGA	GCC	CGT	GTT	CGT	CTT	GGT	CGT	CAG	GTT
Gly	Alá	Arg	Val	Arg	Leu	Gly	Arg	Gin	Val
GAT	TCT	CTG	TGG	GCT	GAT	CAA	CGT	CAG	CTT
Asp	Ser	Leu	Trp	Alá	Asp	Gin	Arg	Gin	Leu
GCT	CTC	GAG	TCT	ATC	CTG	GCT	ACT	CTG	CTG
Alá	Leu	Glu	Ser	Ile	Leu	Alá	Thr	Leu	Leu
CAG	GAA	CAT	CGT	AAT	TCT	CAG	GGT	TAA	TAG
Gin	Glu	His	Arg	Asn	Ser	Gin	Gly	StopStop

Ha a beépített dezoxi-ribonukleinsav szekvencia a Met^-Ala2“bGRF(3-76)OH GRF peptidet kódolja, úgy a kapott plazmidot pHS5OO jellel jelöljük. A fenti GRF peptidet kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát és a megfelelő aminosav-szekvenciát az alábbiakban adjuk meg:

ATG	GCT	GAT	GCT	ATT	TTT	ACT	AAT	TCT	TAT
Met	Alá	Asp	Alá	Ile	Phe	Thr	Asn	Ser	Tyr
CGT	CGT	GTC	CTT	ACT	CAG	CTG	TCT	GCG	CGC
Arg	Arg	Val	Leu	Thr	Gin	Leu	Ser	Alá	Arg
CGT	CTG	CTG	CAG	GAT	ATC	CTG	AAT	CGT	CAG
Arg	Leu	Leu	Gin	Asp	Ile	Leu	Asn	Arg	Gin

				25
CAA	GGT	GAA	CGT	AAT	CAG	GAA	CAA	GGT	GCT
Gin	Gly	Glu	Arg	Asn	Gin	Glu	Gin	Gly	Alá
CGT	GTA	CGT	CTG	GGT	CGC	CAA	GTT	GAT	GGT
Arg	Val	Arg	Leu	Gly	Arg	Gin	Val	Asp	Gly
GGT	TGG	ACT	GAT	CAA	CAG	CAG	CTT	GCT	CTC
Val	Trp	Thr	Asp	Gin	Gin	Gin	Leu	Alá	Leu
GAG	TCT	ACA	CTA	GTT	TCT	CTG	CTG	CAG	GAA
Glu	Ser	Thr	Leu	Val	Ser	Leu	Leu	Gin	Glu
CTG	CGG	AAT	TCT	CAA	GGT	TAA	TAG
Arg	Arg	Asn	Ser	Gin	Gly	StopStop .

Beépíthetünk egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát is, amely a Met-^Ala^hGRF (3-44) OH GRF peptidet határozza meg. A fenti peptidet kódoló dezoxi-ribonukleinsavat és az ebből adódó aminosav-szekvenciát az alábbiakban adjuk meg:

ATG	GCT	GAC	GCT	ATC	TTC	ACT	AAC	TCT	TAC	CGT
Met	Alá	Asp	Alá	Ile	Phe	Thr	Asn	Ser	Tyr	Arg
AAA	GTT	CTG	GGT	CAG	CTG	TCT	GCT	CGT	AAA	CTG
Lys	Val	Leu	Gly	Gin	Leu	Ser	Alá	Arg	Lys	Leu
CAG	GAC	ATC	ATG	TCT	CGT	GAG	CAG	GGT	GAA	TCT
Gin	Asp	Ile	Met	Ser	Arg	Glu	Gin	Gly	Glu	Ser
AAC	CAG	GAA	CGT	GGT	GCT	CGT	GCT	CGT	CTG	TAA
Asn	Gin	Glu	Arg	Gly	Alá	Arg	Alá	Arg	Leu	Stop

/Cravador, A. és munkatársai, Biochemie 67:829-834. oldal (1985)/.

A találmány előnyös kiviteli változata szerint, amikor a pHS19O expressziós vektort használjuk, a gazdasejtet 32°C hőmérsékleten tenyésztjük, mig az alkalmassá nem válik a polipeptid expressziójára. A CI857 represszor inaktiválódik, ha a tenyésztési hőmérsékletet 42°C-ra emeljük, és akkor a pL promoter derepresszálódik. Ilyenkor nagy mennyiségű GRF aktivitással rendelkező polipeptid termelődik, ennek mennyisége eléri a sejt összproteinjének 15 %-át. Az aktív polipeptidet a témában jártas szakemberek által jól ismert módon tisztíthatjuk, ahogy azt a következő példákban is megadjuk. Ahogy azt az előzőekben ismertettük, a MAP sejten belüli működése révén lehasad az N-terminális metionin, amiután megkapjuk a GRF(2-76)OH GRF peptidet. A protein ezután következő tisztítása során ismert enzimatikus kezeléssel eltávolíthatjuk az esetleg megmaradó N-terminális helyzetű metionint, például megfelelő amino-peptidázzal vagy kémiai utón, például bróm-ciánnal kivitelezett kezeléssel.

A találmány igénypontjaiban megadott vegyületek előállítására a (2-76)OH GRF peptidek amino-terminális végét egy XI karbonsav aktív észterével N-acilezzük. A (2-76)OH GRF peptid amino-terminális nitrogénjének acilezését előnyösen az XI általános képletű karbonsav szukcinimidil-észtereivel végezzük. A (2-76)OH GRF peptid amino-terminális nitrogénjének nukleofil támadása a szukcinimidil-észter észterkötésének karbonil-szénatomjára eredményezi az acilezést. Az A-reakcióegyenlettel szemléltetjük az acilezési reakciót, amely után a hippuroil-GRF(2-76)OH-t kapjuk meg.

• ·ν 4·· • 9 · ··· • « ··< «

9999 » W ♦ w

99 999 ····

Az XI karbonsav más aktív észtereit is használhatjuk acilezésre. Használhatunk például kloroformátokkal, például etil-kloroformáttal és izobutil-kloroformáttal vagy N-hidroxi-heterociklikus vegyületekkel, például a HoBT (hidroxi-benzotriazol)-lal kialakított aktív észtereket is. Felhasználhatók az aminosavak acilezésére, vagy az aminosavak kapcsolására általánosan használt más aktív származékok is. Ilyenek lehetnek például a szimmetrikus vagy az N-karboxi-anhidridek is.

Az acilezést vizes közegben végezzük, 7,5 és 9,5 közötti pH-η, és 15 - 35°C hőmérsékleten. Használhatunk aprotikus oldószert, például dimetil-szulfoxidot (DMSO) is.

Az (1) képletű GRF peptidek előállítására használt XI savak például a következők lehetnek: hippuroilsav, para-metil-hippuroilsav, para-klór-hippuroilsav, para-nitro-hippuroilsav, para-hidroxi-hippuroilsav, fenil-amino-karbonsav, 4-hidroxi-fenil-piruvánsav, p-fluor-hippuroilsav, N-fenil-malonsav-amid, p-metil-N-fenil-malonsav-amid, N- (2-tienoil)-glicin, N-(2-furoil)-glicin, N-(2-furoil)-b-amíno-propionsav, N-(3-tienoil)-a-amino-propionsav, N-(3-piridinoil)-glicin, Ν-4-piridinil)-malonamidsav, N-(l,3-tiazinil)-malonamidsav, N-(1,3-tiazinil)-szukcinamid, N-fenil-glutáramidsav, N-(2-metoxi-etil)-amino-szulfonil-glicin és -szulfinil, N-/(2-etil-tio-etil)-amino-szulfonil/-glicin és -szulfinil, N-(2-hidroxi-etil)-malonamidsav, amikor egy (2-29,44 vagy 76)GRF peptidet acilezünk.

A témában jártas szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vegyületeket előállíthatjuk egy (3-29,44 vagy 76) GRF peptiddel, (4-29,44 vagy 76) GRF peptiddel kezdve, szabadon vagy hordozóhoz kötve, egy hasonlóképpen N-terminálisan védett peptiddel vagy szubsztituált karbonsav-származékkal.

A találmány szerinti vegyületek közé soroljuk az előállított acilezett GRF peptidek gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sóit is. A gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sók alatt értjük a szerves és szervetlen savakkal képzett addiciós sókat, például azokat, amelyeket savakkal, például hidro-kloriddal, hidro-fluoriddal, kénsavval, szulfonsavval, fumársavval, hidro-bromiddal, glikolsavval, citromsavval, maleinsavval, foszforsavval, borostyánkősavval·, ecetsavval, salétromsavval, benzoesavval, aszkorbinsavval, para-toluol-szulfonsavval, benzol-szulfonsavval, naftalin-szulfonsavval, propionsavval vagy hasonló, más savakkal állítunk elő. Az előnyös savaddiciós sók azok, amelyeket hidro-kloriddal, ecetsavval vagy borostyánkősavval kapunk. A fenti sók bármelyikét ismert módszerekkel kapjuk. Ideértjük a karbonsav-sókat is, például az aminokat, az ammóniumsókat, a kvaterner ammóniumsókat, az alkálifém és alkáli-földfémsókat, mint például a kalcium-, magnézium-, nátrium-, kálium-és lítium-sókat, továbbá minden hasonló sót, ami a jelenlevő bármelyik karboxilcsoporttal képződik.

A következőkben megadott I., II. és III. táblázatban ismertetjük a jelen leírás szerinti vegyületek megnövekedett aktivitását:

I. TÁBLÁZAT

A bGRF (1-77)OH peptid Tyr-1 cserével elért megnövekedett növekedési hormon releasing aktivitása

Peptid

EC5O (nM)^XX bGRF (1-77)OH 0,59 hippuroil-1 bGRF(2-77)OH 0,86 p-hidroxi-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,33 p-klór-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,19 p-fluor-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,14 p-nitro-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,51 p-metil-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,05 n-fenil-malonamindoil bGRF(2-77)OH 0,19

II. TÁBLÁZAT

A bGRF (1-77)OH peptid Tyr-1 cserével elért	megnövekedett
növekedési hormon releasing aktivitása
Peptid	EC50 (nM)^xx
dez-Tyr-1 pGRF(2-76)OH	95,0
hippuroil-1 pGRF(2-76)OH	0,28
p-metil-hippuroil pGRF(2-76)OH	0,06
p-metil-fenil-malonamindoil pGRF(2-76)OH	0,06

III. TÁBLÁZAT

A különböző hosszúságú p-metil-hippuroil-1 pGRF analógok in vitro aktivitása

Pép	t i d	EC50 (nM)
p-metil-hippuroil	pGRF(2-29)NH2	0,02
p-metil-hippuroil	pGRF(2-44)OH	0,07
p-metil-hippuroil	pGRF(2-76)OH	0,06

= A patkány primer agyalapi mirigyéből a közegbe szekretált növekedési hormont 7 dózis (3 óra alatt) adagolása után mértük.

= A számított közepes hatásos dózis.

A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyszerészeti készítmények előállítására, amelyek aktív összetevőként az (1) képletü vegyületek valamelyikét tartalmazzák, vagy ezek egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sóját és egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható, szilárd vagy folyékony halmazállapotú vivőanyagot .

A találmány szerinti polipeptidek parenterális adagolásakor olyan gyógyszerészeti alakot készítünk, amely alkalmas injekciózásra, idetartoznak a steril vizes oldatok vagy diszperziók és a steril porok, amelyekből steril injektálható oldatokat vagy diszperziókat állítunk elő. Vivőanyagként oldatot vagy diszpergáló közeget használhatunk, ezek lehetnek például viz, etanol, poliolok (például glicerin, propilén-glikol, folyékony polietilén-glikol és mások), használhatjuk fentiek megfelelő keverékeit, és használhatunk növényi olajokat is. A megfelelő fluiditást megtarthatjuk például lecitin adagolásával, diszperziók esetén pedig a diszperzió fenntartására adhatunk különböző szereket, például felületaktív anyagokat. A mikroorganizmusok hatását gátolhatjuk különböző antibakteriális és gombaellenes szerek, például parabének, klór-butanol, fenol, vagy más, hasonló és ismert anyagok adagolásával. Sok esetben előnyös, ha a készítményhez izotóniás szereket, például cukrokat, nátrium-kloridot vagy más, hasonlókat adunk. A prolongált abszorpció az injektálható gyógyszerészeti készítményeknél elérhető különböző abszorpciót befolyásoló szerekkel, például aluminium-monosztearáttal vagy zselatinnal.

A steril injektálható oldatok előállítására a találmány szerinti peptideket megfelelő mennyiségben adagoljuk megfelelő oldószerhez, amihez azután más összetevőket adunk, szükség szerint. Ha szükséges, vagy a hatásosabb eloszlás elősegítésére a vegyületeket beépíthetjük olyan anyagokba, amelyekből azok lassan szabadulnak fel, vagy adott helyen lépnek ki a rendszerből. Ilyen lehet például egy polimer mátrix, ilyenek a liposzómák és a mikroszférák.

A hatásos anyag felszabadítható mechanikai eszközökkel, ozmotikus pumpákkal vagy bármely más rendszerrel vagy eszközzel, amely folyamatos vagy pulzáló felszabadulást tesz lehetővé.

Intravénás (iv) használathoz a találmány szerinti vegyületek vízben oldható alakjait intravénás oldatokhoz adjuk, és infúzióval adagoljuk. Ilyen intravénás anyagok például a következők: fiziológiás só-oldat, Ringer-oldat vagy például az 5 %-os dextróz-oldat. A vegyület megfelelő oldhatatlan alakja előállítható, és vizes bázisként vagy gyógyszerészeti szempontból elfogadható olajos bázisként adagolható, például egy hosszú szénláncu zsírsav, például etil-oleát észtereként .

A találmány szerinti peptid egységdózisa lehet a. vegyület egy oldata, ilyenkor a készítmény előnyösen só, az oldást megfelelő oldószerben végezzük steril, hermetikusan lezárható ampullákban. A vegyület koncentrációja változó, az egyes vegyületektől függően, függően az oldhatóságtól és a felhasználáskor szükséges dózistól 1 és 50 % között változhat.

A találmány tárgya módszer növekedési hormon szekréció indukálására, amely abban áll, hogy az (1) képletű polipeptid vegyület vagy ennek egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sóját gyógyszerészeti szempontból elfogadható, szilárd vagy folyékony halmazállapotú vivőanyaggal együtt hatásos mennyiségben adagoljuk.

A találmány szerinti vegyületek különböző dózisait a páciensnek olyan időn át adagoljuk, amialatt kívánatos a növekedési hormon szekréciójának stimulálása. A szük séges dózis nagyságát befolyásolja a páciens testsúlya, az adagolás módja és az egyén válasza az indukcióra. Juhoknál az előnyös dózis 0,01 - 3,0 mg/kg/nap; legelőnyösebben

0,5 mg/kg/nap. Sertéseknél az előnyös dózis 3 ^ug/kg/nap és /Ug/kg/nap között változik. A legelőnyösebb dózis sertésnél 3 /Ug/kg/nap. Szarvasmarhánál az előnyös dózis

0,5 - 12 mg/kg/nap, különösen előnyös a 3 mg/kg/nap dózis ada golása. Embernél az előnyös dózis 0,03 és 1,0 mg/kg/nap között változik, legelőnyösebb a 0,3 mg/kg/nap nagyságú dózis.

Különösen előnyösen járunk el akkor, ha a találmány szerinti vegyületekből készült készítményeket egységdózisként formulázzuk, ilyenkor könnyű az adagolás és a dózisok hasonlóak. Az egységdózisok azokat a mennyiségeket reprezentálják, amelyek a kezelendő páciensnek adagolandók. Mindegyik egység előre meghatározott mennyiségű vegyületet tartalmaz, amely a gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt a kívánt terápiás hatást kiváltja. A specifikus dózisegységek kialakítása attól függ, hogy az adott készítmény milyen tulajdonságú, illetve, hogy milyen különleges terápiás hatást kívánunk elérni.

A GRF és előnyösen a találmány szerinti GRF vegyületek megfelelő gyógyszerészeti szempontból elfogadható alakként való adagolásakor emlősökben növekszik a növekedési hormon termelése. Ezért az emlős növekedési hormon gyógyászati és mezőgazdasági célú alkalmazása kiváltható a találmány szerinti vegyületek adagolásával. Jelenleg növekedési hormont adagolnak például törpe-növekedéskor és oszteoporóziskor (csontritkulás). A növekedési hormonnak más hatásai is vannak, például növekszik a zsírmentes izomtömeg, gyorsabban gyógyulnak a sebek, és az öregkori tünetek csökkennek. Mindezek elérhetők a találmány szerinti vegyületek adagolásával.

A találmány szerinti polipeptid tipusu vegyületeket különböző rendszerekben mérhetjük. Egy in vivő mérési módszer nátrium-pentobarbitállal altatott patkányokkal vételezhető ki /Wehrenberg és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 109:382 (1982)/. A növekedési hormon releasing-jét (felszabadulását, szekrécióját) in vitro patkány anterior agyalapi mirigy sejtekkel mérjük /Heiman és munkatársai, Endocrinol., 116:410 (1985)/.

Az alábbiakban példákkal szemléltetjük a találmány szerinti eljárást, a példák azonban nem limitálják a leírás oltalmi körét.

1. példa

A bGRF(2-77)OH előállítása szilárd fázison

A GRF peptideket szilárd fázishoz kötött módszerrel állítjuk elő Applied Biosystems 43OA peptidszintetizátorral (megkapható az Applied Biosystems-től, Foster City California), és a szintézis ciklusait az Applied Biosystems-től kaptuk. A BOC aminosavakat és más reagenseket is a fenti cégtől, illetve más katalógusokban szereplő forrásokból szereztük be. Kettős kapcsolásos protokolokat használva szekvenciális BOC kémiát alkalmaztunk a kiindulási p-metil-benzhidril-amin gyantán a C-terminális karboxamidok termelésére. A C-terminális savak előállítására a megfelelő PAM gyantát alkalmaztuk. Aszparagint, glutamint, arginint, /alfa-(p-hidroxi-fenil)-ecetsavakat/, /béta-(p-hidroxi-fenil)-propionsavakat/, p-hidroxi-benzoesavakat, p-hidroxi-cinnaminsavakat, para-hidroxi-fenoxi-ecetsavakat kapcsoltunk előre elkészített hidroxi-benzo-triazol-észtereket használva. Az összes N-terminális kapcsolást HOBT-aktivált aminosavakkal végeztük a szilárd fázisos szintézisben.

Az alábbi oldallánc-védőcsoportokat használtuk:

arginin, tozilcsoport aszparagin, ciklohexilcsoport glutamin, ciklohexilcsoport szerin, benzilcsoport, treonin, benzilcsoport, tirozin, 4-bróm-karbobenzoxicsoport.

A BOC hasítást trifluor-ecetsavval (TFA) végeztük metilén-kloridos reakcióelegyben. A peptidszintézis befejezését követően a peptideket védőcsoport-mentesitjük, és 10 % meta-krezolt tartalmazó vízmentes hidrogén-fluoriddal lehasitjuk a gyantáról. Az oldallánc-védőcsoportok hasítását és a peptid leválasztását a gyantáról 0°C vagy hidegebb, előnyösen -20°C hőmérsékleten végezzük 30 percen át, majd a reakciót 30 percen át 0°C hőmérsékleten folytatjuk. A hidrogén-fluorid eltávolítása után a peptid/gyanta szuszpenziót éterrel mossuk, majd a peptidet jégecettel extraháljuk, és fagyasztva szárítjuk. A tisztítást kiszoritásos kromatográfiával végezzük Sephadex G-10 gyantán (Pharmacia), 10 %-os HOAc jelenlétében.

2. példa

A GRF peptidek előállítása rekombináns technikával

2A. A GRF(2-76)OH rekombináns peptid expressziója

2A.1. A Met^-pGRF(2-76)OH peptidet kódoló pHS452 plazmid szintézise

A pHS452 plazmid egy olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektor, amely nagy mennyiségben expresszálja a találmány szerinti egyik előnyös polipeptidet, a pGRF(2-76)OH-t, akkor, ha a gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztjük.

A liofilezett E. coli K12 RV3O8/pHS19O törzset az NRRL, Peoria, IL 61604 törzsgyüjteményből szerezhetjük be

NRRL B-18410 letéti számon (a letét ideje: 1988. szeptember 9.). Ezt a törzset közvetlenül használjuk az alábbi eljárásban. A pHS19O plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg.

Az E. coli K12 RV3O8/pHS19O törzset 10 ml, az alábbiakban megadott összetételű TY táptalajba oltjuk:

tripton 10 g nátrium-klorid 5 g élesztőkivonat 5 g víz 1 1.

A táptalajt ml-enként 5 mg tetraciklinnel egészítjük ki. A tenyészetet 30°C hőmérsékleten, 15 - 18 órán át levegőztetve inkubáljuk. A kapott tenyészetet használjuk fel a pHS190 plazmid izolálására.

1, 5 mg/ml tetraciklint tartalmazó TY táptalajt oltunk az E. coli K12 RV3O8/pHS19O tenyészettel, és 32°C hőmérsékleten, 15 - 18 órán át levegőztetve inkubáljuk a tenyészetet. Ezután percenként 52OO-at forduló rotorban centrifugálunk (Sorvall, DuPont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CT 06470). A GSA tipusu rotor 10 percen át 4°C hőmérsékleten forog, amikor a sejtek leülepszenek. A felüluszót kiöntjük. A sejteket 28 ml alábbi összetételű elegyben szuszpendáljuk:

% szacharóz és mmól etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA).

A szuszpenzióhoz 1 ml, 0,25 mólos trisz-hidro-klorid-oldatban oldott 20 mg/ml koncentrációjú lizozim-oldatot (pH = 8,0),

1,5 ml 0,5 mólos EDTA-oldatot (pH = 8,0) adagolunk, és keverjük a szuszpenziót. A kapott készítményt 15 percen át jégfürdőben inkubáljuk. Ezután a lizozimmal kezelt sejtekhez enyhe keverés közben 3 ml lizáló oldatot adagolunk, ennek összetétele a következő:

% Triton^ X-100 (Rohm and Haas) 3 ml;

0,25 mólos EDTA (pH = 8,0) 75 ml; és ml viz.

A kapott szuszpenziót 15 percen át jégfürdőben inkubáljuk.

Centrifugálással eltávolítjuk a sejttörmeléket az oldatból, a centrifugálást Sorvall SS34 rotorban végezzük 45 percen át, 4°C hőmérsékleten úgy, hogy a rotor percenként 17.000-et fordul. A 30 ml térfogatú felüluszóhoz 28,6 g cézium-kloridot és 1 ml 5 mg/ml koncentrációjú etidium-bromid-oldatot adunk. Ezután vízzel 40 ml-re egészítjük ki az elegy térfogatát, és az oldatot ultracentrifuga-csőbe dekantáljuk. A csövet leforrasztjuk, és az oldatot Ti70 rotorban percenkénti 49.500-as fordulatszámmal centrifugáljuk Beckman centrifugában (7360 N. Lincoln Avenue, Lincolnwood, IL 60646). A centrifugálást 8 órán át végezzük. A plazmidcsikot ultraibolya fényben vizsgálva azonosítjuk, izoláljuk, cézium-kloriddal telitett izopropanollal extraháljuk az etidium-bromid eltávolítására, és három oldatcserével 20-szoros térfogatú, alábbi összetételű TE pufferral szemben dializáljuk:

mmól trisz-hidro-klorid, pH = 7,05, mmól EDTA.

A dializátumot összegyűjtjük, majd 2 térfogat etanolt és 0,05 térfogat 3 mólos nátrium-acetát-oldatot adunk hozzá.

Az etanolos oldatot -20°C hőmérsékletre hütjük, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat centrifugálással összegyűjtjük. A centrifugálást SS34 rotorban végezzük, percenkénti 10.000-es fordulatszámmal 30 percen át, -10°C hőmérsékleten. A kapott üledéket 1 ml TE pufferban reszuszpendáljuk, és ezután azonos térfogatú, alábbi eleggyel extraháljuk:

fenol : kloroform =1:1 (térfogatarány). A vizes fázisban levő dezoxi-ribonukleinsavat 0,1 térfogat 3 mólos nátrium-acetát és 2 térfogat etanol adagolásával kicsapjuk, a szuszpenziót 30 percen át -20°C hőmérsékleten inkubáljuk, amiután SS34 jelű rotorban percenkénti 15.000-es fordulatszámmal 20 percen át centrifugálunk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav csapadékot 70 %-os etanolban, majd 100 %-os etanolban mossuk, és szárítjuk.

A fenti eljárással előállított 1,0 mg mennyiségű pHS190 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 1,5 ml O,1X TE pufferban szuszpendáljuk, és -20°C hőmérsékleten tároljuk. 10 mg pHS190 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 10 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk, az alábbi reakcióelegyben:

trisz-hidro-klorid, pH = 7,5	100	mmól
magnézium-klorid	5	mmól
nátrium-klorid	50	mmól.

A reakcióelegyet 2 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten.

Az 5'-kinyúló végek tompa véggé alakítására

O, 5 - 0,5 mmól mennyiségű dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és TTP-t adagolunk a reakcióelegyhez 1-5 egység Klenow fragmenssel együtt (Boehringer Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Dr.,

P. O. Box 50816, Indianapolis', IN 46250). 15 percen át 30°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd az enzim inaktiválására 10 percen át 75°C hőmérsékleten tartjuk. Fenollal, fenol és kloroform elegyével, végül kloroformmal extraháljuk az elegyet, ezután etanollal kicsapjuk.

A kicsapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 50 ml alábbi összetételű elegyben szuszpendáljuk:

trisz-hidro-klorid, pH =	7,5	40 mmól
magnézium-klorid		10 mmól
ditio-treitol		10 mmól
adenozin-trifoszfát		0,5 mmól
T4 dezoxi-ribonukleinsav	ligáz	1 egység.

A ligázt a Boehringer Mannheim Biochemicals-tól vásároltuk (lásd előbb). A reakcióelegyet egy éjszakán át 14°C hőmérsékleten inkubáljuk.

A ligáit termékkel ezután E. coli K12 RV3O8 sejteket transz formálunk Maniatis és munkatársai szerint /Molecular Cloning, 250 - 251. oldal, Cold Spring Harbor

Press (1982)/. Az E. coli törzset az NRRL törzsgyüjteményből szerezzük be NRRL B-15624 deponálási számon.

500 ml térfogatú lombikban 100 ml TY táptalajt sterilezünk, majd 1 ml RV3O8 tenyészettel oltjuk be. Az inokulumot egy éjszakai tenyésztéssel kapjuk. A sejteket erőteljes rázással növesztjük 37°C hőmérsékleten addig, mig a teg nyészet ml-enként 5 x 10 sejtet tartalmaz. 10 percen át jégfürdőben tartjuk a tenyészetet, majd 4000 x g-vel centrifugáljuk 5 percen át, 4°C hőmérsékleten. 50 ml jéghideg, alábbi összetételű elegyben szuszpendáljuk a sejteket:

mmól kalcium-klorid, 10 mmól trisz-hidro-klorid, pH = 8,0.

percen át ismét jégfürdőben tartjuk a sejtszuszpenziót, majd centrifugáljuk. A sejteket ezután 3,3 ml kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk. A ligációs elegyet 200 ml sejthez adjuk, és 30 percen át jégfürdőben inkubálunk. Ezután 42°C-os vízfürdőbe helyezzük a sejtszuszpenziót, és 2 percen át ott tartjuk. 1 ml TY táptalajt adunk a szuszpenzióhoz, és a sejteket további 1 órán át 30°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután TY agarra 0,2 ^ul alikvotokat teszünk, és 30°C hőmérsékleten egy éjszakán át tenyésztünk. A TY agar összetétele azonos a TY táptalajéval, azzal a különbséggel, hogy 1,5 % agart is tartalmaz. A petri-csészékbe öntött TY agart 5 mg/ml tetraciklinnel egészítjük ki.

A plazmidot ezután 10 ml vízben oldjuk. A vektor előállítására a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Xbal és BamHI enzimekkel emésztjük. 10 ml plazmid dezoxi-ribonukleinsavhoz (10 mg) 1 ml Xbal restrikciós enzimet (10 egység) adunk, és 5 ml 10X Xbal pufferral egészítjük ki a reakcióelegyet. A puffer összetétele a következő:

trisz-hidro-klorid, pH = 8,0 magnézium-klorid nátrium-klorid

500 mmól

100 mmól

500 mmól percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 0,5 ml 5 mólos nátrium-klorid-oldatot adagolunk, és 1 ml BamHI (10 egység) enzimmel egészítjük ki az elegyet.

Az inkubációt további 90 percen át folytatjuk 37°C hőmérsékleten. A reakcióelegyet agaróz gél-elektroforézissel választjuk szét, és az 5,75 kb nagyságú Xbal-BamHI vektor fragmenst elektroelucióval izoláljuk, majd etanollal kicsapjuk.

Az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát szintetizáljuk Applied Biosystems Model 38OB szintetizátorral, a témában jártas szakemberek előtt jól ismert technikákat alkalmazva. Szintetikus gén előállítására oligonukleotid szekvenciákat állítunk elő, majd ezeket az oligonukleotidokat ligáljuk. A folyamatot lényegében Brown és munkatársai szerint eljárva végezzük (Methods in Enzymology, 68:109 (1979). Az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvencia a találmány egyik előnyös polipeptidjét kódolja, ahol A9 aszparagin,

A12 arginin,

A15 treonin,

A21 arginin,

A22 leucin,

A25 aszparagin,

A27 leucin,

A28 szerin, « A • · v · «

	- 43 -
A38	glutamin,
A39	glicin,
A40	alanin,
A42	valin, és ahol
Z	az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti:

Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-LeuAla-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-ArgAsn-Ser-Gln-Gly.

A fenti szekvencia pozitív szálja az alábbi nukleotid sorrendű:

ATG

GCT

GAT

GCT

ATT

TTT

ACT

JVAT

AAT

TAT

CGA

CGC

GTT

CTT

ACT

CAG

CTG

TCT

GCT

CGT

CTG

CAG

GAT

ATT

CTG

TCT

CGT

CAG

GGT

GAA

CGT

AAC

CAG

GAA

CAA

GGA

GCT

CGT

GTT

CGT

CTT

GGT

CGT

CAG

GTT

GAT

TCT

CTG

TGG

GCT

GAT

CAA

CGT

CAG

CTT

GCT

CTC

GAG

TCT

ATC

CTG

GCT

ACT

CTG

CAG

GAA

CAT

CGT

ΆΑΤ

TCT

CAG

GGT

TAA

TAG

A kódoló szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsavat összekapcsoljuk a fentiek szerint előállított Xbal-BamHI vektor fragmenssel. A ligáit eleggyel ezután a fentiek szerint eljárva E. coli K12 RV3O8 sejteket transzformálunk. A tetraciklinre rezisztens transzformánsok plazmid dezoxi-ribonukleinsavát restrikciós enzimekkel analizáljuk a pHS452 plazmid azonosítására.

	2A.2. A Met^-bGRF(2-76)OH peptidet kódoló pHS5OO plazmid szintézise A szarvasmarha GRF peptidek rekombináns alakját
a 2A.1.	példában megadottak alapján állítjuk elő. A rekombi-

náns szarvasmarha GRF peptid előállításakor a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia az alábbi előnyös, találmány szerinti polipeptidet határozza meg:

A9	szerin,
A12	arginin,
A15	treonin,
A21	arginin,
A22	leucin,
A25	aszparagin,
A27	leucin,
A2 8	aszparagin,
A3 8	glutamin,
A39	glicin,
A40	alanin,
A42	valin, továbbá

- 45 ··«

Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-GlnGln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-SerLeu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.

A fenti dezoxi-ribonukleinsav szekvencia pozitív szálja az alábbi nukleotid sorrendű:

ATG	GCT	GAT	GCT	ATT'TTT	ACT	AAT	TCT	TAT	CGT	CGT	GTC
CTT	ACT	CAG	CTG	TCT GCG	CGC	CGT	CTG	CTG	CAG	GAT	ATC
CTG	AAT	CGT	CAG	CAA GGT	GAA	CGT	AAT	CAG	GAA	CAA	GGT
GCT	CGT	GTA	CGT	CTG GGT	CGC	CAA	GTT	GAT	GGT	GTT	TGG
ACT	GAT	CAA	CAG	CAG CTT	GCT	CTC	GAG	TCT	ATA	CTA	GTT
TCT	CTG	CTG	CAG	GAA CGT	CGG	AAT	TCT	CAA	GGT	ΤΆΑ	TAG,

A kódoló szekvenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat elegyítjük az Xbal-BamHI vektor fragmenssel, és ligáijuk a 2A.1. példában megadottak szerint eljárva. A ligáit eleggyel a fentiek szerint E. coli K12 RV3O8 sejteket transzformálunk. A bGRF szekvenciát kódoló plazmidot pHS5OO jellel jelöljük. A tetraciklinre rezisztens transzformánsok plazmid dezoxi-ribonukleinsavát restrikciós enzimes analízissel vizsgáljuk a pHS5OO plazmid azonosítására.

- 46 4 «4 « « · • « ·>

• ·4 ·«·♦ • 4 4« ···· · *

2A.3. A Met,-hGRF(2-46)OH peptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szintézisé^ A humán GRF peptidek rekombináns előállítását a

2Ά.1. példában megadottak alapján végezzük. Ugyanakkor, a találmány előnyös kiviteli módja szerint a rekombináns humán GRF peptid előállításakor módosított hGRF peptidet használunk, ahol

A9	szerin,
A12	lizin,
A15	glicin,
A21	lizin,
A2 2	leucin,
A25	aszparáginsav,
A27	metionin,
A28	szerin, továbbá, ahol
Y	az alábbi aminosav sorrendű: Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg- Ala-Arg-Leu, és továbbá, ahol
Z	0.

A peptidet kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvencia pozitív szálja az alábbi nukleotid szekvenciáju:

ATG	GCT	GAC	GCT	ATC	TTC	ACT	AAC	TCT	TAC	CGT	AAA
GTT	CTG	GGT	CAG	CTG	TCT	GCT	CGT	AAA	CTG	CTG	CAG
GAC	ATC	ATG	TCT	CGT	GAG	CAG	GGT	GAA	TCT	AAC	CAG
GAA	CGT	GGT	GCT	CGT	GCT	CGT	CTG	. TAA

•w *» t V · ··« ♦ · Ο ·* ···· * · *Τ * ··· ····

A kódoló szekvenciát hordozó dezoxi-ribonukleinsavat összekeverjük a 2A.1. példában megadottak szerint előállított Xbal-BamHI fragmenssel, és ligálunk. A ligáit elegygyel a fentiek szerint eljárva E. coli K12 RV3O8 sejteket transz formálunk.

2B. példa

A rekombináns GRF peptidek izolálása

2B.1. A GRF analóg expressziója E. coli sejtekben

Az E. coli K12 RV3O8/pHS451 törzset 5 mg/ml tetraciklint tartalmazó TY táptalajban tenyésztjük 32°C hőmérsékleten addig, mig a tenyészet eléri a közép-logaritmikus fázist. A tenyészet hőmérsékletét ekkor 42°C-ra emeljük, és az inkubációt 3 órán át folytatjuk. A lambda pL promoter cI857 jelű hőmérséklet-érzékeny represszora, amely a pHS451 plazmádban a GRF analóg expresszióját szabályozza, 42°C-on inaktiválódik, amiután lehetségessé válik a GRF analóg expressziója. A bGRF peptidet a pGRF expressziója kapcsán a fentiekben megadottak alapján expresszáljuk, azzal a különbséggel, hogy a pHS452 plazmid helyett a pHS500 jelű plazmidot használjuk.

2B.2. A GRF analógot tartalmazó granulátumok izolálása

Ha igen erős E. coli expressziós rendszert használunk, ahogy az itt meg van adva, a protein termék úgynevezett inclusion bodies vagy granulátumok alakjában képződik.

• ···· • ·· » 4 · · • · ·· • t·· · « • ·· ·

- 48 A GRF analógot tartalmazó granulátumokat izoláljuk, és a számunkra érdekes GRF peptid izolálására oldatba visszük. Először a teljes sejtet centrifugáljuk, majd 10°C hőmérsékletű vízben szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót Gaulin homogenizátorban homogenizáljuk 8000 psig-en. A homogenizált szuszpenziót vízzel hígítjuk, és 10 percen át keverjük, amiután pH-ját 10 %-os,-> vizes nátrium-hidroxid-oldattal 8,4 - 8,6-ra állítjuk be. Ezután centrifugálunk. Az üledék a GRF analógot tartalmazó granulátumokból áll, ezt további felhasználásig -70°C hőmérsékleten tartjuk.

2B.3. A GRF analóg végső tisztítása

A fenti 2B.2. példában megadottak szerint izolált granulátumokat 2 - 5°C hőmérsékleten felolvasztjuk. A granulátumok oldására 10 térfogat 0,05 normál ecetsav és 7 mólos karbamid elegyét adagoljuk, majd 5-8 percen át homogenizálunk. Ezután 10 %-os hidroklorid-oldattal

2,5 - 2,6-ra állítjuk be a szuszpenzió pH-já.t. 12 - 15 órán át 2 - 5°C hőmérsékleten keverünk. Az oldatot szűréssel tisztítjuk, a szűrést Dicalite Speedex szűrési segédanyaggal (Grefco, Torrance, CA) fedett Sparkler szűrőn végezzük. Az oldat konduktivitása 4000 mohm-ra csökken az ecetsavas-karbamidos oldattal való hígítás után.

p Kationcserélő oszlopot készítünk S Sepharose (Pharmacia, 800 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854) gyantából. Az oszlopot úgy készítjük el, hogy az 1 1 gyantát tartalmazzon 50 g anyagra számítva. A feldolgozandó anyagot 0,1 1/cm/óra ráfolyási sebességgel juttatjuk az oszlopra, és 2 oszlop-térfogatnyi, 0,1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk a gyantát, a sós oldatot ecetsav-karbamid-oldattal készítjük el. A GRF analógot lineáris gradienssel eluáljuk, ezt ecetsav-karbamid-oldattal készített 0,25 mólos - 1,6 mólos nátrium-klorid koncentrációval állítjuk be. Mindegyik eluátumból háromszoros oszlop-térfogatnyi mennyiséget használunk, ugyanakkor 0,1 oszlop-térfogatnyi frakciókat gyűjtünk. A GRF analógot tartalmazó frakciókat konduktivitás-méréssel, Οϋ,^θ meghatározással, HPLC-analizissel és poliakril-amid gél-elektroforézissel azonosítjuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük.

Az összegyűjtött frakciókat azonos térfogatú ecetsav-karbamid eleggyel egészítjük ki. Ezután az oldatot p ecetsav-karbamid-oldattal kiegyensúlyozott S Sepharose gyantára visszük, az oszlopot úgy készítjük el, hogy 50 g proteinre 1 1 gyantát számítunk. Az átfolyási sebességet

0,02 1/cm /órára állítjuk be. A GRF analógot tartalmazó frakciókat olyan lineáris gradienssel eluáljuk, amely ecetsav és karbamid elegyével készült, és 0,25 mól - 1,2 mól nátrium-kloridot tartalmaz. 0,1 oszlop-térfogatnyi frakciókat gyűjtünk. A frakciókat az előzőekben megadottak szerint analizáljuk, és a GRF analógot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük.

- 50 ρ

Sephadex G-15 (Pharmacia) oszlopot készítünk 0,02 mólos, 2,5 pH-ju glicin-oldattal. Az oszlop térfogata az előzőleg összegyűjtött frakciók térfogatának ötszöröse. A kromatográfia során összegyűjtjük az θ°276 hullámhosszon csúcsot mutató frakciókat.

%-os acetonitril - 0,02 mól glicin (pH = 2,5) p kiegyenlítő oldattal SP20SS'gyantából (Sephabeads ,

Mitsubishi Chemical, Tokyo) oszlopot készítünk. Az összegyűjtött GRF analógokat tartalmazó oldatot 10 %-osra hígítjuk acetonitrillel, és az oszlopra juttatjuk 1,5 - 2 oszlop-térfogat/óra átfolyási sebességgel. Az oszlopot 2 oszlop-térfogatnyi acetonitril-glicin pufferral mossuk. A GRF analógot gradiens elucióval eluáljuk, a gradienst 3 oszlop-térfogatnyi, 10 % acetonitril - 0,02 mól glicin és 3 oszlop-térfogatnyi, 50 % acetonitril - 0,02 mól glicin elegyével állítjuk elő. 0,1 oszlop-térfogatnyi frakciókat gyűjtünk, és meghatározzuk bennük a GRF analóg koncentrációját.

A GRF analógot tartalmazó elegyet ezután

R

Sephadex G15 oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot

0,25 mólos ecetsavval egyensúlyozzuk ki. Az 0D₂^g csúcsot mutató frakciókat összegyűjtjük, és felhasználásig fagyasztva szárított alakban tároljuk.

3. példa

A hippuroil-l-pGRF(2-76)OH előállítása ml dimetil-formamidban keverés közben

3,58 g benzoil-glicint (Transworld Chemicals) oldunk, az oldatot jégfürdőben lehűtjük. 2,5 g N-hidroxi-szukcinimidet adunk az oldathoz, majd 4,5 g diciklohexil-karbodiimidet (DCC). Egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet.

A reakció során képződött oldhatatlan diciklohexil-karbamidot (DCU) szűréssel eltávolítjuk, és a dimetil-formamidos szürletet csökkentett nyomású térben töményitjük. A desztillációs maradékot diklór-metánnal·hígítjuk. A képződő csapadékot szűréssel eltávolítjuk, és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amikor 3,79 g szukcinimidil-hippuroátot kapunk.

A 2A. példában megadottak szerint eljárva 72 mg pGRF(2-76)OH-t állítunk elő. A terméket 3 ml 0,1 mól trisz-hidroklorid (pH = 7,8) és 30 %-os propanol élegyében oldjuk úgy, hogy szobahőmérsékleten keverjük. 57 mg szukcinimidil-N-benzoil-glicinátot adunk a reakcióelegyhez, és szobahőmérsékleten keverjük, miközben a 15. percben, az 1. órában és a 2. órában a szukcinimidil-N-benzoil-glicinát adagolása után 5 ./Ul mintákat veszünk, a reakció előrehaladtának vizsgálatára. A mintákat 500 /U1 0,1 %-os trifluor-ecetsav-oldattal (0,15 - 0,2 mg/ml) hígítjuk, és nagynyomású folyadék-kromatográfiás analízis céljából 0,46 x 15 cm-es

Vydac C18 oszlopba injektáljuk, majd összehasonlítjuk az eredményekét a kiindulási anyagéval.

2.5 óra múlva a reakcióelegyet 1 ml jégecettel készült HOAc-oldattal savanyítjuk, és 2,2 x 28,5 cm méretű Sephadex G-10 oszlopra öntjük. Az oszlopot 10 %-os HOAc-oldattal eluáljuk, és 7,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk.

A frakciók abszorpcióját 280 nm-en mérjük, a peptid jelenlétét vizsgálva. A 7 - 10. frakciók peptidet tartalmaznak, ezeket összeöntjük, fagyasztjuk, és fagyasztva szárítjuk, amiután 70 mg liofilizátumot kapunk.

mg mintát 1,0 ml 0,1 %-os trifluor-ecetsavban oldunk. Az oldatot 10 x 0,1 ml térfogatú alikvótokra osztjuk, majd lefagyasztjuk, és fagyasztva szárítjuk. A liofilizátum egy mintáját tömegspektrográfiával (FAB-MS) analizáljuk. Egy másik mintából aminosav-szekvencia analízist végzünk.

4. példa

A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH előállítása

4A. A p-metil-benzoil-glicin szintézise

7.5 g glicint oldunk 105 ml 2 normál nátrium-hidroxidból· és 50 ml dioxánból készült elegyben, az oldatot O - 5°C hőmérsékleten keverjük. Ezután 14,9 ml p-toluil-kloridot 50 ml-re egészítünk ki dioxánnal, majd ezt

- 20 perc alatt cseppenként hozzáadjuk a fenti reakcióelegyhez. Egy éjszakán át 25°C hőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet.

Ezután vizes nátrium-hidroxid-oldattal bázikusra állítjuk be az elegy pH-ját, majd ezután dietil-éterrel extraháljuk. A vizes fázis pH-ját 6 normál hidroklorid-oldattal 3,0-ra állítjuk be. A vizes fázist etil-acetáttal extraháljuk, az extraktumot vízzel mossuk, és magnézium-szulfáttal szárítjuk. A vízmentes oldatot szűrjük, a szürletet csökkentett nyomású térben közel szárazra pároljuk. A szilárd desztillációs maradékot Et₂O-ban szuszpendáljuk, szűrjük és desztilláljuk, amiután 14,25 g, a vizsgálatok szerint p-metil-hippuroilsavval azonos terméket kapunk. A termék azonosítását olvadáspontjával és elemanalizissel végezzük, a kapott eredményeket összehasonlítjuk a termék elméleti számítás szerinti értékeivel. Az előállított termék olvadáspontja 151 - 154°C. A következőkben megadott I. táblázatban ismertetjük az elemanalizis adatait.

4B. A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH szintézise

1,65 g, a 4A. példában megadottak szerint előállított p-metil-hippuroilsavat 15 ml dimetil-formamidban oldunk keverés közben, majd jégfürdőben lehűtjük. Az oldathoz 1 g N-hidroxi-szukcinimidet adunk, majd 1,9 g DCC-t. A reakcióelegyet 25°C hőmérsékleten keverjük egy éjszakán át.

A DCU csapadékot szűréssel izoláljuk, és a szürletet csökkentett nyomáson koncentráljuk. A desztillációs maradékként kapott olajos anyagot Et₂0-ban hígítjuk, amikor kristályosodás indul meg. A kristályokat szűréssel elkülönítjük, Et20-val mossuk, és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután 167 - 170°C hőmérsékleten olvadó 3,28 g súlyú terméket kapunk. A terméket elemanalizissel azonosítjuk, és az elméleti értékkel összehasonlítva a kapott eredményeket, a termék azonosnak bizonyult a p-metil-hippuroilsav szukcinimidil-észterével (^C34^Hi4^N2^O5^·

A 2A. példában megadottak szerint előállított pGRF(2-76)OH 72 mg-ját 3 ml, 30 % propanolt tartalmazó 0,1 mólos trisz-hidrokloridban (pH = 7,8) oldjuk szobahőmérsékleten, keverés közben. A reakcióelegyhez 57 mg p-metil-hippuroilsav-szukcinimidil-észtert adunk, és szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet, miközben az adagolást követő 15., 60. és 120. percben 5-5 ^ul mintát veszünk a reakció előhaladásának vizsgálatára. Mindegyik mintát 500 ml-re hígítunk 0,1 %-os trifluor-ecetsavval, és RP-HPLC analízishez 0,46 x 15 cm-es Vydac C18 oszlopba injektálunk. Az analízis eredményeit összehasonlítjuk a kiindulási anyaggal kapott értékkel.

2,5 óra múlva a reakcióelegyet 1 ml jégecettel savanyítjuk, és az oldatot 2,2 x 28,5 cm méretű Sephadex G-10 oszlopra juttatjuk. Az oszlopot 10 %-os HOAc-oldattal eluáljuk, és 7,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A frakciók abszorpcióját 280 nm-en meghatározzuk, az eredmények jelzik a polipeptid-vegyületek jelenlétét. A 7., 8., 9. és 10. frakciók polipeptidet tartalmaznak, ezeket egyesitjük, fagyasztjuk és fagyasztva szárítjuk, amiután 70 mg lizofilizátumot kapunk.

5. példa

A p-klór-hippuroil-bGRF(2-77)OH előállítása

A 4. példában megadottak szerint eljárva p-klór-hippuroil-GRF-származékot állítunk elő, azzal a különbséggel, hogy a p-toluoil-klorid helyett p-klór-benzoil-kloridot használunk az A. részben megadott reakcióban, és a bGRF(2-77)0H-GRF peptidet az 1. példában ismertetett, szilárd fázishoz kötött eljárással állítjuk elő.

6. példa

A p-nitro-hippuroil-bGRF(2-77)OH előállítása

A 4. példában megadottak szerint eljárva előállítjuk a p-nitro-hippuroil-GRF-származékot, azzal a különbséggel, hogy az eljárásban a p-toluoil-klorid helyett p-nitro-benzoil-kloridot használunk az A. részben ismertetett reakcióban, és a bGRF(2-77)OH-GRF peptidet az 1. példában megadottak szerint (szilárd fázison) állítjuk elő.

7. példa

A p-hidroxi-hippuroil-bGRF(2-77)OH előállítása

A p-hidroxi-hippuroil-GRF-származék előállítására a 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a p-toluoil-klorid helyett az A. példa részében megadott reakcióban p-hidroxi-benzoil-kloridot használunk, és a bGRF(2-77)OH GRF peptidet az 1. példában megadott módon szilárd fázishoz kötött módszerrel állítjuk elő.

8. példa

A p-fluor-hippuroil-bGRF(2-77)OH előállítása

A p-fluor-hippuroil-GRF-származék előállítására a 4. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a példa A. részében megadott reakcióban p-toluoil-klorid helyett p-fluor-benzoil-kloridot használunk, és a bGRF(2-77)OH GRF peptid előállítására az 1. példában megadottak szerint járunk el (szilárd fázis).

9. példa

Az N-fenil-malonamindoil-l-bGRF(2-77)OH előállítása

Keverés közben 25°C hőmérsékleten 9,1 ml (0,1 mól) anilint oldunk 100 ml diklór-metánban. Az oldathoz 15,1 g dikálium-karbonátot adunk, majd 20 ml diklór-metánban 14 ml etil-malonil-kloridot csepegtetünk a reakcióelegyhez. 3-4 órán át keverjük az elegyet 25°C hőmérsékleten, majd 72 órán át hagyjuk tovább futni a reakciót.

Ezután 500 ml vizes diklór-metánnal hígítjuk az elegyet. Összerázzuk, majd a diklór-metános fázist elkülönítjük, először sósavval, majd vízzel mossuk, ezután magnézium-szulfáttal vizmentesitjük, szűrjük, és a szürletet olajos desztillációs maradékig desztilláljuk, amiután 14,5 g terméket kapunk.

A fentiek szerint előállított etil-N-fenil-malonamid 14 g-ját 25 ml dioxán és 75 ml 1 normál nátrium-hidroxid elegyében oldjuk. 3 órán át 25°C hőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet.

Ezután dietil-éterrel extraháljuk az elegyet, ekkor az még lúgos kémhatásu. A vizes fázist 6 normál hidroklorid-oldattal savanyítjuk, és EtOAc-val extraháljuk. Az extraktumot magnézium-szulfáttal vizmentesitjük. A szerves oldószeres szürletet szárazra pároljuk. A desztillációs maradékot dietil-éterrel telitjük, szűrjük, és csökkentett nyomású térben szárazra desztilláljuk, amiután 5,1 g súlyú terméket kapunk.

A terméket elemanalizissel és ^H-NMR vizsgálattal azonosítjuk. Az eredmények szerint a termék N-fenil-malonamidsav vagy N-fenil-malonsav-monoamid.

Az N-fenil-malonamidsavat bGRF(2-77)-gyantához kapcsoljuk egy HOBT-észterrel.

10. példa

Az N-fenil-malonamindoil-l-pGRF(2-77)OH előállítása

A 9. példában megadottak szerint előállított N-fenil-malonamidsav 3,58 g-ját keverés közben 20 ml dimetil-formamidban oldjuk, és az oldatot jégfürdőben lehűtjük. Az oldathoz 2,5 g N-hidroxi-szukcinimidet, majd ezután

4,5 g diciklohexil-karbodiimidet (DCC) adunk. Egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet.

A DCU csapadékot szűréssel eltávolítjuk, és a dimetil-formamidos szürletet csökkentett nyomású térben desztilláljuk. A desztillációs maradékot dietil-éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük, és csökkentett nyomású térben desztillálva töményitjük, amikor desztillációs maradékként 3,79 g N-fenil-malonamidsav-szukcidimidil-észtert kapunk.

A 2A. példában megadottak szerint előállított pGRF(2-76)OH 72 mg-ját 3 ml, 30 % propanolt tartalmazó, 0,1 mólos trisz-hidrokloridban (pH = 7,8) oldjuk, majd szobahőmérsékleten keverjük az elegyet. Az oldathoz 57 mg, a fentiek szerint előállított N-fenil-malonamidsav-szukcidimidil-észtert adunk, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük, miközben az észter adagolását követő 15., 60. és 120. percben 5-5 /Ül térfogatú mintát veszünk, a reakció előrehaladtának ellenőrzésére. A mintákat 500 ^ul 0,1 %-os trifluor-ecetsavval hígítjuk (0,15 - 0,2 mg/ml), és RP-HPLC analízisre 0,46 x 15 cm méretű Vydac C18 oszlopra injektáljuk. Az analízis során az eredményeket összehasonlítjuk a kiindulási anyag eredményével.

2,5 óra múlva a reakcióelegyet 1 ml jégecetes HOAc-val savanyítjuk, és az elegyet 2,2 x 28,5 cm méretű Sephadex G-10 oszlopra öntjük. Az oszlopot 10 %-os HOAc-oldattal eluáljuk, és 7,5 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciók abszorpcióját 280 nm-en meghatározzuk, és a polipeptidet tartalmazó frakciókat kiválasztjuk. A 7 - 10. frakciókban polipeptid van jelen, ezeket összeöntjük, fagyasztjuk, és liofilezzük, amiután 70 mg liofilizátumot kapunk.

11. példa

A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH-t tartalmazó készítmény előállítása

1,38 g dinátrium-hidrogén-foszfátot és 1,0 g

PSA-t oldunk 1 1 végtérfogatban, pirogénmentes vízben, az elegy pH-ja 5,1. 27,4 mg, a 4B. példa szerint előállított p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH peptidet adunk 64 ml vivőanyaghoz, amiután ml-enként 360 milliekvivalens végkoncentráció ju készítményt kapunk.

12. példa

A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH in vivő hatása napi háromszori szubkután vagy intravénás adagoláskor, sertésekben hibrid sertést, amelyek átlagsulya 72 kg, katéterezünk a femorális vénában, majd a p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH hatását vizsgáljuk. A 11. példában megadottak szerint előállított p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH-t tartalmazó készítményt naponta háromszor injekciózzuk intravénásán vagy szubkután az állatoknak 10,0 ^ug/kg/injekció mennyiségben.

Az állatokat naponta 2000 g 18,5 % nyers proteint tartalmazó kukorica-szója takarmánnyal etetjük, az etetést két alkalommal, reggel 8 órakor és délután 4 órakor végezzük.

Az állatok az injekciót reggel 8 órakor, délután 4 órakor és éjjel 12 órakor kapják. A vizeletben kiválasztott karbamid-nitrogént 5 napos kontroll szakaszban határozzuk meg, négy 3 napos kezelési időszakban, és két 3 napos szakaszban, a kezelés után. 24 órás időszakban 30 vérszérum mintát gyűjtöttünk a kezelés 12. napján. A szérum mintákat a növekedési hormon (GH), a BÚN, a glükóz, az inzulin, az FFA és a trigliceridek koncentrációjának meghatározására használtuk. A mérési eredmények átlagait az alábbi, IV. táblázatban adjuk meg.

d •rl r—I

N d H

U H tó EH tó tó

N Ό tó :d r4 u

IV. TABLAZAT

tó u

Ό •H g (tí tói ín cd tó tn 'Φ ω •H >s d d Φ 3 ui 'Φ i—I

Φ

N Φ tó

tó	rQ	tó	O 1	0	d
00	00	00	σ>	μ		•H
X	X	X	- 1	ρ
o	kD	CM		λ
CM	r-	CM	t—1 1	Ο,		μ
			^1-1 1	•Η		φ		X
				Λ		m		tó
			1	1		m		Φ
				r—!		P		+1
			tói ¹	Ή		Ö4		ω
tó	X	tó	rö \|	41				Φ
00	CO	co	in	Φ		•μ
X	X	X	·> 1	g		'cd		Γ—1
co	in		04 ,	1		m		:0
CM	co	CM	m ¹	Λ		N		Γ—1
			\|			(Λ		φ
				cd		o		Λ
			l
				X		·*—		d
tó	Λ	tó	tó! ¹	d				φ
00	co	συ	m ,	ο		ι—1		tó
X	X	X	X	Ό		cd		'Φ
in	r-	in	t 1	Ό		tn		41
in	συ	in	σ>	g		Cn		μ
			1			cd		'φ
			\|	-μ		>1
				•μ		d		ιη
tó	XI	tó	tó! 1	φ		cd		Ο
	r-		m	Ν		»0		X
X	X	X	1	ι—1		>		ο
m	CM	yd	f 1	Φ		•H
σ>	CO	o		•ΓΊ		>
	yd	r—1	rH 1
			1	tó		cd		tó
			I	-Ρ		1—1		cd
tó	tói	tó	tó!	tó		cd	•
00	o	in	m i	Λί		g	d	tó
X	X	x	X	0		g	0	:Ρ
in	r-	in	r- ¹	-Ρ		o	Π5	41
«----1		yd	1	tó		1—1	Ό	Φ
				ι—1		cd	g	Λ
			1	1—1		tó!
				'tó		1—1	Ή	ω
tó	Λ	tó	tói ¹			<d	ω	0
in	συ	t—1	cn ,	Ν			'cd	d
χ	X	X	X	tó		m	ι—1	0
CM	συ	CM	00 1				o	Ν
				Λί		•H	tr>	<d
			1	:p		£14	cd
			\|	-Ρ	*	cd	TJ	Ν		I
				ι—1	1—1	d	cd	cd		41
			1	Φ	Φ					d
				Ν	TJ	-μ	•μ	ι—1	•	Ή
			1	Φ	Ό	cd	-μ		ω	Ν
			\|	rM	•μ	tó!	0	1—I	<—ι	ω
tó	rQ	tó	tói		-μ	0		Φ	μ
m	CO	o	1	1------1		μ	cd	Λ	φ	d
χ	X	»*	*·	tó	φ	cd			Κζ* , I	ο
	<D	co	<o i	§	£14	r~d	N	d	1	g
CM	yd	CM	^1-1 1	g		t—1	cd	ο	d	μ
				0	W	'tó		£14	<d	0
			1	rd	O		·.	0	g	χ:
				tó	.—.	I—1	tó	Γ—1	ζ*
			1	X	l£>	r*d	2	Ν	Φ	•Η
			1	ι—1	r~	o	41	Μ	tó	ω
	o		o	tó	1	P	N	0	ι	'Φ
o	n	O	oi i		CM	-P	Ό		41	Ό
				CO	'—	£	-H	tn	d	Φ
>	>	o	O ¹		tó	0	0	0	φ	tó
H	H	cn	ω i	•H	tó	Λί	tó	£	Ό	Φ
				CU	u		Φ	Ο	μ	>
			1	tó	£14	tó	•π	Ν	41	:Ο
			1	a	1			tó	ω	d
			\|	,,		ι—1
			ω	ω		ι—1
	-μ		'Φ I	'Φ		0		-—X
•	1—1	•	I—I	1—1		μ		X
•P	φ	-P	φ ¹	Φ		-μ
c	N	a	Ν ,	N		d		X		..
o	Φ	o	Φ ¹	Φ		o		tó
	tó		tó ι	X		tó				ο

- 62 A táblázat adatai jelzik, hogy a napi háromszor adagolt (30,0 /Ug/kg/nap) p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH hatásos volt, ami látszik a vizelet csökkent karbamid-nitrogén tartalmából (41 %), a szérum BÚN értékének csökkenéséből (54 %) . A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH adagolása négyszeres növekedést okozott a szérum növekedési hormon szintjében, ami együttjárt a szérum glükóz, inzulin, FFA és triglicerid koncentrációjának növekedésével.

Nem mutatkozott különbség a szérum vizsgált értékeiben az adagolás módja szerint, kivéve, hogy szubkután adagolással magasabb inzulin-koncentrációt mértünk a sertéseknél, mint intravénás adagoláskor. A vizelet karbamid-nitrogén kiválasztásában is csökkenést tapasztaltunk, a kezelés befejezését követő 2-3 napon át, ha az állatokat szubkután injekcióval kezeltük (lásd az 5. ábrát).

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás GRF (növekedési hormon releasing faktor) analógok előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) kémiai vagy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákat használva egy dez-Tyrl-GRF peptidet állítunk elő, és

b) a peptid amino-terminális végét kémiailag módosítjuk .

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az

Xl-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu-GlnA25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T általános képletű vegyületek és ezek gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sóinak előállítására, az-

zal jellemezve, hogy a képletben A9 Ser, Alá, Leu, Thr vagy Asn, * A12 Arg vagy Lys, A15 Gly, Alá, Thr vagy Leu, A21 Arg vagy Lys, A22 Alá vagy Leu, A25 Asp vagy Glu, A27 Met, Ser, Arg, Leu vagy norleucin, A2 8 Ser vagy Asn,

- 64 Υ Ο vagy egy 1-15 aminosavból álló peptid,

Z 0 vagy egy 1-32 aminosavból álló peptid,

T az alábbi karboxil-terminális csoportok egyike:

-COOR , -CR 0, -CONHNHR , -C0N(R ) (R, ) vagy

3 3 3 3 D

-CH„0R , ahol

Z 3

R_a és Rfc egymástól függetlenül rövidszénláncu alkilcsoport, hidrogénatom, egy Hse(lakton), HseOH vagy HseN (R^) (R^) , ahol

R_c és R^ egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövidszénláncu alkilcsoport,

XI egy alábbi általános képlettel megadható acilcsoport:

ll

R₁-A- (CH₂) _d- (NH) _c-B- (NH) (CH^ _a~CH-C- , ^R2 ahol

R^ hidrogénatom, metil·-, etil·-, hidroxi-etil- vagy fenilcsoport, vagy halogénatommal, rövidszénláncu alkilcsoporttal, rövidszénláncu alkoxicsoporttal, hidroxilcsoporttal, nitrocsoporttal vagy aminocsoporttal szubsztituált szubsztituált fenilcsoport, acetamidocsoport, trifluor-metil-csoport, hidroxi-metil-csoport vagy szulfamidocsoport, vagy egy 5- vagy 6-tagu, nitrogén-, oxigén- vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos gyűrű, továbbá, ahol ·»♦ ·*·

0, 1, 2 vagy 3, vagy 1, vagy 1,

12, vagy oxigén- vagy kénatom, karbonil-, szulfonil- vagy szulfinil csoport, ^R2 ^R3 hidrogénatom, metilcsoport, hidroxi

-metil-csoport, p-hidroxi-benzil-cso port vagy az alábbi csoport:

II

-(CH₂)_e-C-R₃, metil-, etil-, hidroxi-etil-, amino-, hidroxil-, fenil- vagy halogénatommal, alkil-, alkoxi-, hidroxil-, nitro-, amino-, acetamido- vagy szulfamido csoporttal szubsztituált fenilcsoport vagy 5- vagy 6-tagu, nitrogén-, oxigén vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos gyütü.

3. A

2.

igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 0,

1, B karbonilcsoport, c 0, d

0 és A 0.
4. A igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R^ metil-, fenil-, p-nitro-fenil-, p-klór-fenil-, p-fluor-fenil-, p-hidroxi-fenil-, p-metil-fenil- vagy

N-benzil-csoport (izonikotinil).
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle mezve, hogy hidrogénatom, metilcsoport vagy hidroxi-metil-csoport.

··· »···

0 « «· • ♦ ·*
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R₂ hidrogénatom,
7. A 2 - 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Ά9 aszparagin, A12 arginin, A15 treonin, A21 arginin, A22 leucin, A25 aszparaginsav, A27 leucin és

A28 jelentése szerin.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Y az alábbi aminosav-székvenciát jelenti:

Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu vagy ennek egy funkcionális származéka.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Z az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti:

Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-AlaLeu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-SerGln-Gly vagy ennek egy funkcionális származéka.
10. A 2 - 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A9 szerin, A12 arginin, A15 treonin,

A21 arginin, A22 leucin, A25 aszparaginsav és A28 aszparagin.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Y az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti: Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu vagy vagy ennek egy funkcionális származéka.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Z az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti: Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-AlaLeu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-SerGln-Gly.
13. A 2 - 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A9 szerin, A12 lizin, A15 glicin, A21 ·· *>·*·» lizin, A22 leucin, A25 aszparaginsav, A27 metionin és A28 szerin.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Y az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti: Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu vagy ennek egy funkcionális származéka.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Z 0.
16. Eljárás gyógyszerészeti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy GRF analógot egy vagy több gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal, higitószerrel vagy excipienssel keverünk.