HUT64589A - Superactive grf analogues - Google Patents
Superactive grf analogues Download PDFInfo
- Publication number
- HUT64589A HUT64589A HU9201399A HU9201399A HUT64589A HU T64589 A HUT64589 A HU T64589A HU 9201399 A HU9201399 A HU 9201399A HU 9201399 A HU9201399 A HU 9201399A HU T64589 A HUT64589 A HU T64589A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- arg
- leu
- gln
- grf
- gly
- Prior art date
Links
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- -1 amino, acetamido Chemical group 0.000 claims description 73
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 66
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 42
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 17
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 16
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 13
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 12
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 9
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 7
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 7
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 6
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 5
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 claims description 4
- 125000002373 5 membered heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000004070 6 membered heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 claims description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 3
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003143 4-hydroxybenzyl group Chemical group [H]C([*])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003854 p-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1Cl 0.000 claims description 2
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 claims description 2
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims 4
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 claims 2
- 125000001255 4-fluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1F 0.000 claims 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 claims 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 40
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 abstract description 32
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 abstract description 32
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 abstract description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000894007 species Species 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 28
- 101000825768 Bos taurus Somatoliberin Proteins 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 23
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 9
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 8
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 7
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007160 ty medium Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N homoserine Chemical compound OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NOJXRHBIVBIMQY-UHFFFAOYSA-N 3-anilino-3-oxopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)NC1=CC=CC=C1 NOJXRHBIVBIMQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NQUVCRCCRXRJCK-UHFFFAOYSA-N 4-methylbenzoyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(C(Cl)=O)C=C1 NQUVCRCCRXRJCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 4
- 101710117971 Peptide Y Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WFAJBYGUONQMCI-UHFFFAOYSA-N acetic acid urea Chemical compound NC(=O)N.NC(=O)N.NC(=O)N.NC(=O)N.NC(=O)N.NC(=O)N.C(C)(=O)O WFAJBYGUONQMCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 4
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 4
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- TZFLUWBMBJLZQO-UHFFFAOYSA-N n-(6,7-difluoro-5-phenyl-1h-indazol-3-yl)butanamide Chemical compound C1=C2C(NC(=O)CCC)=NNC2=C(F)C(F)=C1C1=CC=CC=C1 TZFLUWBMBJLZQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 102000034452 Methionyl aminopeptidases Human genes 0.000 description 3
- 108090000192 Methionyl aminopeptidases Proteins 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CZKLEJHVLCMVQR-UHFFFAOYSA-N 4-fluorobenzoyl chloride Chemical compound FC1=CC=C(C(Cl)=O)C=C1 CZKLEJHVLCMVQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N Arg-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- HOBNTSHITVVNBN-ZPFDUUQYSA-N Asp-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N HOBNTSHITVVNBN-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N Ile-Phe-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- LPEPZBJOKDYZAD-UHFFFAOYSA-N flufenamic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 LPEPZBJOKDYZAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- VZCCSZRICJFBSI-VIFPVBQESA-N (2s)-4-amino-2-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C=C1 VZCCSZRICJFBSI-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNEGRERRLGQPGA-UHFFFAOYSA-N 1-(hydroxyamino)cyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound ONC1(C(O)=O)CCCCC1 SNEGRERRLGQPGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- YCOPMEYGYMUHNR-UHFFFAOYSA-N 2-(thiophene-3-carbonylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C=1C=CSC=1 YCOPMEYGYMUHNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IPOVOSHRRIJKBR-UHFFFAOYSA-N 2-ethylpropanedioyl dichloride Chemical compound CCC(C(Cl)=O)C(Cl)=O IPOVOSHRRIJKBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004198 2-fluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(F)=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004204 2-methoxyphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran Chemical compound C1OC=CC=C1 MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGIJRRREJXSQJR-UHFFFAOYSA-N 2h-thiazine Chemical compound N1SC=CC=C1 AGIJRRREJXSQJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003762 3,4-dimethoxyphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(OC([H])([H])[H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1* 0.000 description 1
- LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-aminophenyl)sulfonylaniline Chemical group NC1=CC=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(N)C=CC=2)=C1 LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMKFYQZTVRBBDO-UHFFFAOYSA-N 3-(4-methylanilino)-3-oxopropanoic acid Chemical compound CC1=CC=C(NC(=O)CC(O)=O)C=C1 BMKFYQZTVRBBDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006275 3-bromophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(Br)=C([H])C(*)=C1[H] 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-tritiopyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C([3H])=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 0.000 description 1
- RLLLLYQXLREVPW-UHFFFAOYSA-N 4-anilino-2-hydroxy-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(=O)NC1=CC=CC=C1 RLLLLYQXLREVPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKIDDEGICSMIJA-UHFFFAOYSA-N 4-chlorobenzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 RKIDDEGICSMIJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical class OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004860 4-ethylphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000005168 4-hydroxybenzoic acids Chemical class 0.000 description 1
- YIPHYCQSJTXLFM-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoyl chloride Chemical compound OC1=CC=C(C(Cl)=O)C=C1 YIPHYCQSJTXLFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004203 4-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylacetic acid Chemical class OC(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000590 4-methylphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- SKDHHIUENRGTHK-UHFFFAOYSA-N 4-nitrobenzoyl chloride Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(C(Cl)=O)C=C1 SKDHHIUENRGTHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000000565 5-membered heterocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2,3-dihydro-1H-pyrimidin-4-one Chemical compound N1CNC=C(C1=O)C KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical compound C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000000644 6-membered heterocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMMKUCQIKKXKNP-DCAQKATOSA-N Ala-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CCCN=C(N)N IMMKUCQIKKXKNP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N Arg-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JEXPNDORFYHJTM-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JEXPNDORFYHJTM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N Arg-Val-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QIRJQYQOIKBPBZ-IHRRRGAJSA-N Asn-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QIRJQYQOIKBPBZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LDLZOAJRXXBVGF-GMOBBJLQSA-N Asp-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N LDLZOAJRXXBVGF-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100310222 Caenorhabditis briggsae she-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700114 Chinchillidae Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- BUDQDWGNQVEFAC-UHFFFAOYSA-N Dihydropyran Chemical compound C1COC=CC1 BUDQDWGNQVEFAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BRKUZSLQMPNVFN-SRVKXCTJSA-N Glu-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O BRKUZSLQMPNVFN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JWNZHMSRZXXGTM-XKBZYTNZSA-N Glu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JWNZHMSRZXXGTM-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEDLDRJXLCZLAJ-UHFFFAOYSA-N N'-(2H-1,3-thiazin-2-yl)butanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NC1SC=CC=N1 PEDLDRJXLCZLAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSPQDMRTZZYQLM-UHFFFAOYSA-N N-(2-furoyl)glycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CO1 KSPQDMRTZZYQLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBSGKPYXQINNGF-UHFFFAOYSA-N N-nicotinoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CN=C1 ZBSGKPYXQINNGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- YUSRGTQIPCJNHQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YUSRGTQIPCJNHQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101000825745 Sus scrofa Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- DDHFMBDACJYSKW-AQZXSJQPSA-N Trp-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O DDHFMBDACJYSKW-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001734 carboxylic acid salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- AOGYCOYQMAVAFD-UHFFFAOYSA-N chlorocarbonic acid Chemical class OC(Cl)=O AOGYCOYQMAVAFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N dicarbon monoxide Chemical compound [C]=C=O VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N ethyl chloroformate Chemical compound CCOC(Cl)=O RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- JKFAIQOWCVVSKC-UHFFFAOYSA-N furazan Chemical compound C=1C=NON=1 JKFAIQOWCVVSKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012623 in vivo measurement Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000020997 lean meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940100630 metacresol Drugs 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical group 0.000 description 1
- BLLTVCOWSFYXPC-UHFFFAOYSA-N n'-ethyl-n'-phenylpropanediamide Chemical compound NC(=O)CC(=O)N(CC)C1=CC=CC=C1 BLLTVCOWSFYXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KAGZPZAHOMVEAF-UHFFFAOYSA-N n'-phenylpentanediamide Chemical compound NC(=O)CCCC(=O)NC1=CC=CC=C1 KAGZPZAHOMVEAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1 PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- WCPAKWJPBJAGKN-UHFFFAOYSA-N oxadiazole Chemical compound C1=CON=N1 WCPAKWJPBJAGKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001820 oxy group Chemical group [*:1]O[*:2] 0.000 description 1
- NRSCPTLHWVWLLH-UHFFFAOYSA-N p-methylhippuric acid Chemical compound CC1=CC=C(C(=O)NCC(O)=O)C=C1 NRSCPTLHWVWLLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWXJULSLLONQHY-UHFFFAOYSA-N phenylcarbamic acid Chemical compound OC(=O)NC1=CC=CC=C1 PWXJULSLLONQHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical class OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000005420 sulfonamido group Chemical group S(=O)(=O)(N*)* 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measurement Of Velocity Or Position Using Acoustic Or Ultrasonic Waves (AREA)
- Steering-Linkage Mechanisms And Four-Wheel Steering (AREA)
- Oscillators With Electromechanical Resonators (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
Description
A növekedési hormon az agyalapi mirigy szekretálódó proteinje, amelynek jelentős hatása van az organizmus fejlődésére. A növekedési hormon szintjének mesterséges befolyásolásával a vizsgálatok szerint komoly terápiás hatásokat érhetünk el. Kimutatták, hogy a humán növekedési hormon adagolásával a növekedési hormon hiánya miatt fellépő tünetcsoportokat és a hiány'miatt fellépő humán megbetegedéseket hatásosan kezelhetjük a növekedési hormon adagolásával. Az ilyen irányú felhasználáson túl bizonyos vizsgálatok a növekedési hormon uj és jelentős tulajdonságait tárták fel, amelyek a növekedési hormon szintjének szabályozhatóságával összefüggő, további jelentős lehetőségeket tártak fel. így például, újabb klinikai vizsgálatok jelzik, hogy növekedési hormon adagolásával sikeresen küzdhetünk az ember öregedésével együttjáró problémákkal. Az állatok megnövelt növekedési hormonszintje a vizsgálatok szerint növeli a zsírmentes, azaz a sovány izomzat tömegét. Ez utóbbi megfigyelés azt eredményezheti, hogy növelhetjük a sovány hús termelését vagy a nagyobb és/vagy erősebb állatok tenyésztését.
A növekedési hormon természetes körülmények között az agyalapi mirigyben bioszintetizálódik, ugyanakkor a növekedési hormon szekréciója a véráramba egy másik protein által szabályozott, ezt növekedési hormon releasing faktornak (a továbbiakban GRF) nevezzük. Ezt a hormont a szakemberek szomatokrininnek, növekedési hormon releasing hormonnak (GHRH) vagy növekedési releasing hormonnak (GRH) is nevezik. A fentiek szerint a véráramban jelenlevő növekedési hormon szintjének növelésére két lehetőségünk van:
1) a növekedési hormon koncentrációját az organizmusban közvetlenül fokozzuk, vagy
2) fokozzuk a szervezet természetes képességét a növekedési hormon termelésére.
Ez utóbbit elérhetjük GRF adagolásával. A GRF in vivő növeli a vér növekedési hormon szintjét (Rivier és munkatársai, Natúré, 300, 276., 1982). A GRF hatását (továbbá ennek különböző szerkezeti analógjainak hatását) a növekedési hormontermelésre széleskörűen tanulmányozták. A GRF közvetlen adagolásának elsődleges akadálya ennek in vivő mutatkozó rövid felezési ideje (Frohman, L. A. és munkatársai, J. Clin. Invest., 7 8, 906., 1986). Hatásosabb és/vagy hosszabb életidejü GRF molekulák használata éppen ezért előnyös lenne a hatásos humán terápia vagy az állattenyésztés szempontjából.
A GRF szerkezetét sokféleképpen módosították, amiután hosszabb életidejü és/vagy hatékonyabb GRF analógokat kaptak. Kimutatták, hogy az első 29 N-terminális aminosav elegendő a GRF teljes aktivitásának megtartásához (Speiss és munkatársai, Biochemistry, 21, 6037., 1982). Az egyik stratégia az volt, hogy a GRF molekula különböző régióiba uj D-aminosavakat építettek be (Láncé, V. A. és munkatársai, BBRC, 119, 265., 1984; Coy, D. H. és munkatársai, Peptides, 8(1), 49., 1986). Másik stratégia szerint a GRF peptid lánc gerincét módosították oly módon, hogy az N-terminális részbe peptidkötés izotereket építettek be (Tourwe, D., Janssen. Chim. Acta, 3, 3., 1985; Hocart, S. J.
és munkatársai, J. Med. Chem., 33, 1954 - 58., 1990).
az eddig | A találmány tárgya eljárás megnövelt hatású és ismert GRF analógokhoz képest technikai előnyökkel |
rendelkező GRF analógok előállítására. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket előnyösen használhatjuk az állatorvosi gyakorlatban, különösen a szarvasmarha-,
sertés-, | juh-, baromfi- és haltenyésztésben. Az alábbiakban megadjuk a leírásban használt rö- |
viditések és kifejezések jelentését:
Alá: | alanin aminosav. |
Analóg: | egy vegyülethez szerkezetileg hasonlító vegyület. Ha a kifejezést polipeptidekkel kapcsolatban használjuk, úgy az a primer, szekunder és tercier szerkezetre is vonatkozik. |
Arg: | az arginin aminosav. |
Asn: | az aszparagin aminosav. |
Asp: | az aszparaginsav aminosav. |
Bázispár | (bp): dezoxi-ribonukleinsavat vagy ribonukleinsavat jelent. Az A, C, G és T betűk a nukleotidok 5'-monofoszfát alakjait jelenti, nevezetesen a dezoxi-adenint, dezoxi-citidint, dezoxi-guanint, illetve a dezoxi-timint, akkor, ha dezoxi-ribonukleinsav molekulákról van szó. Az U, C, G és T betűk a ribonukleinsav molekulák esetén az uracil, citidin, guanin és timin nukleozidok monofoszfát alakjait jelentik sorrendben. A kettősszálu dezoxi-ribonukleinsavban az adenin timinnel vagy a |
• · · · citozin guaninnal párosodik. A dezoxi-ribonukleinsav/ribonukleinsav heteroduplex bázispárok kialakulásakor a timin uracillal, a citozin guaninnal párosodik.
Cys: cisztein aminosavat jelent, vagy a cisztein molekula egy részét, amely diszulfid kötéssel kovalensen kapcsolódik egy másik cisztein molekularészhez .
DNS:' dezoxi-ribonukleinsav.
EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav.
EDj-θ: közepes hatásos dózis.
Funkcionális analóg:
olyan molekulát jelent, amely funkcionális tulajdonságaiban hasonló, de a vegyület természetben előforduló alakjától szerkezetileg különbözik. Funkcionális analógként tárgyaljuk a szülőmolekula fragmenseit (vagy ezek különböző csoportokkal kiegészített alakjait), amelyek a szülőmolekulához viszonyítva hasonló funkcionális tulajdonságokkal rendelkeznek.
Gin: glutamin aminosav.
Glu: glutaminsav aminosav.
Gly: glicin aminosav.
GRF PEPTID: egy olyan polipeptid, amely a 27 - 76. helyen olyan aminosavakat tartalmaz, amely elősegíti az agyalapi mirigyben a növekedési hormon szekrécióját és szintézisét. A GRF PEPTIDEK közé soroljuk a természetes vagy a szintetikus utón ·«··· · · ·
His : | előállított funkcionális analógokat is, amelyeket a 4,517,181, 4,518,586, 4,528,190, 4,529,595, 4,563,352, 4,585,756, 4,595,676, 4,605,643, 4,620,976, 4,626,523, 4,628,043 és a 4,689,318 sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetnek; a fenti leírásokat referenciaként épitjük'be a jelen leírásba. A GRF PEPTID-ek kifejezés magában foglalja a fentiek nem toxikus sóit is. a hisztidin aminosav. |
Hse: | a homoszerin aminosav. |
Ile: | az izoleucin aminosav. |
Leu: | a leucin aminosav. |
Lys : | a lizin aminosav. |
Met: | a metionin aminosav vagy ennek deformilezett |
mRNS: | analógja. hírvivő ribonukleinsav. |
MWCO: | a molekulasúlyában csökkentett vegyület rövidítése . |
Orn: | ornitin. |
Phe: | a fenil-alanin aminosav. |
Plazmid: | extrakromoszómális, autonóm replikálódó genetikai elem. |
PMSF: | a fenil-metil-szulfonil-fluorid rövidítése. |
Pro: | a prolin aminosav. |
Leolvasási | fázis: olyan nukleotid szekvencia, amelyről a nukleotid triplettek, a transzlációs apparátus, a transzfer |
• · ♦ · ·
- 7 ribonukleinsav és a riboszómák, továbbá az ezzel kapcsolatos sejtfaktorok közreműködésével a fehérje szintézise (transzláció) megtörténik, oly módon, hogy az egyes aminosavakat meghatározó tripletteket helyes sorrendben ismeri fel az apparátus. Mivel mindegyik triplett különböző és ugyanakkor azonos hosszúságú, a kódoló szekvencia a hármas egységek többszöröséből áll, egy bázispár beépülése vagy kiesése (ezt frameshift mutációnak nevezzük) azt eredményezheti, hogy azonos dezoxi-ribonukleinsav szegmens két különböző proteint kódol. Ennek elkerülésére a megfelelő polipeptidet meghatározó triplett kodonok az iniciációs kodontól kezdve megfelelő hármas egységbe kell, hogy sorakozzanak, azaz meg kell, hogy tartsák a megfelelő leolvasási fázist.
Rekombináns DNS klónozó vektor:
bármely replikálódó molekula,.ideértve - nem limitáló jelleggel - a plazmidokat és fágokat, amelyekbe egy vagy több további dezoxi-ribonukleinsav szegmens építhető be, vagy amelyekbe ez a beépítés már megtörtént.
Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektor: bármely olyan rekombináns DNS klónozó vektor, amelybe egy promotert építettünk be.
Replikon: egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely szabályozza és amely így lehetővé teszi egy plazmid vagy egy másik vektor molekula autonóm replikációját.
«*« «
RNS: | ribonukleinsav. |
RP-HPLC: | reverz fázisú nagyfelbontású folyadék-kromatográfia. |
Ser: | a szerin aminosav. |
Thr: | a treonin aminosav. |
Transzkripció: az a folyamat, amelynek során a dezoxi-ribonukleinsav nukleotid-szekvenciájában meghatározott információ a komplementer ribonukleinsav szekvenciává alakul.
Transzláció: | az a folyamat, amelynek során a hírvivő ribonukleinsavban meghatározott genetikai információ a polipeptid lánc szintézisében nyilvánul meg. |
Trisz: | a trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán rövidítése. |
Trp: | a triptofán aminosav. |
Tyr: | a tirozin aminosav. |
Val: | a valin aminosav. |
Vektor: | egy olyan replikon, amely génmanipulációs technikák során használatos sejtek transzformálására, továbbá, amely egy megfelelő protein molekula szintézisét meghatározó polinukleotid-szekvenciát hordoz, amely megfelelő szabályozó szekvenciákkal kombinálva a transzformált gazdasejtnek specifikus tulajdonságokat biztosit. A plazmidok, vírusok és bakteriofágok megfelelő vektorok, mivel ezek saját törvényeik szerint replikálódnak. Mesterséges vektorokat állíthatunk elő oly módon, hogy restrikciós enzimekkel és ligázokkal hasítjuk és |
« « · · · · • * · · * · •»♦# < * · · • « · ····♦·· r
- 9 összekapcsoljuk a különböző forrásból származó dezoxi-ribonukleinsav molekulákat. A vektor kifejezést a leírásban a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorokra és a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorokra is használjuk.
A leíráshoz mellékelt ábrákon megadott restrikciós helyek és funkcionális térképek a leírásban megadott rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorokat reprezentálják. A restrikciós helyek nem kizárólagosak, azaz az ábrákon megadott vektorok több restrikciós helyet is tartalmazhatnak.
Az 1. ábrán megadjuk a pHS19O jelű plazmid restrikciós és funkcionális térképét.
A 2. ábrán ismertetjük a pHS5OO plazmid restrikciós és funkcionális térképét.
A pHS452 sorszámú plazmid restrikciós és funkcionális térképét a 3. ábrán adjuk meg.
A 4. ábrán grafikusan ábrázoljuk a p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH adagolásával elért növekedési hormon szint növekedését sertésekben.
Az 5. ábrán grafikusan ábrázoljuk a p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH adagolását követő változásokat a sertés vizeletben levő karbamid nitrogén szint-kiválasztásban.
- 10 A találmány eljárás az alábbi képletben megadott szintetikus GRF peptid analógok (GRF PEPTIDEK) előállítására:
Xl-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12
Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu
Gln-A25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T,
ahol | |
A9 | : Ser, Alá, Leu, Thr vagy Asn, |
A12 | : Arg vagy Lys, |
A15 | : Gly, Alá, Thr vagy Leu, |
A21 | : Arg vagy Lys, |
A2 2 | : Alá vagy Leu, |
A25 | : Asp vagy Glu, |
A27 | : Met, Ser, Arg, Leu vagy norleucin, |
A28 | : Ser vagy Asn, |
Y | : 0 vagy az 1-15. aminosavaknak megfelelő amino- |
sav-szekvencia, | |
Z | : 0 vagy az 1-32. aminosavaknak megfelelő |
aminosav-szekvencia, és | |
ahol | |
T | : az alábbi általános képletekkel megadható karb- |
oxil-terminális csoport: -C00R , -CR 0, 8. 8 -CONHNHR , -C0N(R ) (R, ) vagy CH„0R , ahol 8 8 D Z cL R és R. egymástól függetlenül rövidszénláncu |
alkilcsoport, hidrogénatom, egy Hse(lakton), HseOH vagy HseN(Rc)(R^), ahol Rc és R^ egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövidszénláncu alkilcsoport • *« • 44 « • •4 4 44
XI az alábbi általános képlettel megadott acil csoport:
II
Rx-A-(CH2)d-(NH)c-B-(NH)b~(CH2)aCH-CR2 ahol R1 : hidrogénatom, metil-, etil-, hdiroxi-etilvagy fenilcsoport, vagy halogénatommal szubsztituált fenilcsoport, rövidszénláncu alkilcsoport, rövidszénláncu alkR2 oxicsoport, hidroxilcsoport, acetamido-, trifluor-metil-, vagy szulfamidocsoport; vagy nitro-, amino-, hidroxi-metil5- vagy 6-tagu, egy vagy több nitrogénatomot, oxigénatomot vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos gyűrű;
1, 2 vagy 3;
: 0 vagy 1;
- 12;
: 0, oxigén- vagy kénatom;
: karbonil-, szulfonil- vagy szulfinilcsoport;
: hidrogénatom, metilcsoport, hidroxi-metil-csoport, p-hidroxi-benzil-csoport vagy ahol
5;
·*»·
- 12 met.il-, etil-, hidroxi-etil-, amino-, hidroxil-, fenil- vagy halogénatommal, alkilcsoporttal, alkoxicsoporttal, hidroxilcsoporttal, nitrocsoporttal, aminocsoporttal vagy acetamidocsoporttal szubsztituált fenilcsoport, vagy szulfamidocsoport, vagy egy vagy több nitrogén-, oxigén- vagy kénatomot tartalmazó, 5- vagy 6-tagu heterociklusos gyűrű;
továbbá fentiek nem-toxikus, gyógyszerészeti szempontból elfogadható sói.
Az (1) általános képletben rövidszénláncu alkilcsoport jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport, például metil-, etil-, n-izopropil-, izopropil-, η-butil-, szek-butil-, izobutil- vagy tercier-butil-csoport, rövidszénláncu alkoxicsoport jelentése például metoxi-, etoxi-, n-propoxi-, tercier-butoxi-csoport és hasonlók; a halogénatom jelentése fluor-, klór-, bróm- vagy jódatom; a szubsztituált fenilcsoport egy vagy több, azonos vagy különböző csoporttal, például halogénatommal, rövidszénláncu alkil-, rövidszénláncu alkoxi-, hidroxil-, nitro-, amino-, acetamido- vagy szulfonamidocsoporttal szubsztituált fenilcsoport, például 4-klór-fenil-, 3-jód-fenil-, 2-fluor-fenil-, 4-metil-fenil-, 3-klór-4-metil-fenil-, 3-bróm-fenil-, 4-etil-fenil-,
3-etoxi-fenil-, 2-metoxi-fenil-, 4-izopropoxi-fenil-,
4-hidroxi-fenil-, 3,4-dihidroxi-fenil-, 2,4-dihidroxi-fenil-, 4-nitro-fenil-, 3-amino-fenil-, 3-klór-4-hidroxi-fenil-, 2-acetamido-fenil-, 4-szulfonamido-fenil-, 3,4-dimetoxi-fenil-, 2-fluor-4-amino-fenil-csoport vagy hasonlók; az egy vagy több nitrogén-, oxigén- vagy kénatomot tartalmazó 5- vagy 6-tagu heterociklusos gyűrű alatt olyan 5-tagu heterociklusokat értünk, mint például a pirrol, tiofén, furán, imidazol, oxazol, oxadiazol, tiazol, 1,3,4-tiodiazol, azoxazol és más, hasonlók; 6-tagu gyűrűk alatt például piridint, pirimidint, piránt, dihidro-piránt, tiazint, tiapirámot, triazint és más, hasonló, 6-tagu heterociklusokat értünk. Az ilyen 5- és 6-tagu heterociklusos vegyületek szubsztituenseket is hordozhatnak, például rövidszénláncu alkil-, rövidszénláncu alkoxi-, hidroxil-, aminocsoportot vagy halogénatomot .
Az (1) általános képletben
XI például p-klór-hippuroil-csoport, p-metil-hippuroil-csoport, p-nitro-hippuroil-csoport, hippuroilcsoport, p-hidroxi-hippuroil-csoport, 3-benzoil-propionil-csoport, n-ftáloil-glicil-csoport, n-fenil-malonamidoil-csoport, p-metil-N-fenil-malonamidoil-csoport vagy p-fluor-hippuroil-csoport lehet.
Ahogy a fentiekben már megadtuk, a találmány előnyös vegyületei az állati eredetű GRF peptidek származékai és módosu latai .
A korábbiakban (1) általános képletben az A20, A21, stb. jellel jelölt csoportok az egyes aminosavaknak felelnek meg, mégpedig úgy, hogy a protein egyes aminosavait az amino-terminális végtől kezdve számozzuk, ahogy ezek a természetes vegyületben és az irodalomban szerepelnek. A témában jártas szakemberek előtt a jól jellemzett proteinek aminosav-csoportjainak jelölése ismert. Például a des-Tyrl-GRF jelölés jól érthető a szakember számára, a jelölés azt jelenti, hogy a természetes GRF molekulában hiányzik az amino-terminális tirozin aminosav. A további aminosavak ujraszámozása az adott proteinben szükségtelen, és zavarokat okozhat. A fenti példában a természetben előforduló protein második aminosava lesz az amino-terminális aminosav, de a számozáskor Ala2 jelet fog kapni. Az aminosavak jelölése terén a különböző GRF molekulákat a fentiek szerint adjuk meg.
A találmány egyik előnyös peptidje a sertés GRF (pGRF) módosult változata, ezt a korábbiakban megadott (1) képlettel Írhatjuk le, ahol
A9 | Asn, |
A12 | Arg, |
A15 | Thr, |
A21 | Arg, |
A2 2 | Leu, |
A2 5 | Asp, |
A2 7 | Leu, és |
A2 8 | Ser. |
A találmány egy további előnyös peptidje a szarvasmarha GRF (bGRF) egy módosított változata, amely az (1) általános képlettel irható le, ahol
A9 | Asn, |
A12 | Arg, |
A15 | Thr, |
A21 | Arg, |
A2 2 | Leu, |
A25 | Asp, |
A27 | Leu, és |
A28 | Asn. A találmány egy további előnyös peptidje a |
humán GRF (hGRF) egy módosított változata, amely az (1) kép-
lettel | adható meg, ahol |
A9 | Ser, |
A12 | Lys, |
A15 | Gly, |
A21 | Lys, |
A22 | Leu, |
A25 | Asp, |
A27 | Met, és |
A2 8 | Ser. |
A találmány előnyös peptidjeit azzal az (1) általános képlettel írhatjuk le, ahol az érett GRF PEPTID 30 - 43. aminosav-szekvenciája.
A találmány előnyös peptidjei között szerepel egy olyan (1) képletű vegyület, ahol
Y a természetben előforduló egyes GRF peptidek, például a pGRF, bGRF, hGRF, stb. 30 - 43. amino sav-szekvenciájával azonos.
Különösen előnyös Y peptid az alábbi:
Gln-Gln-Gly-Glu-A34-A35-Gln-Glu-A38-A39-A4O-Arg-A42Arg-Leu, ahol
A34 Asp vagy Ser,
A38 Arg vagy Gin,
A39 Gly vagy Arg,
A40 Alá vagy Ser, és
A42 Alá, Val vagy Phe.
Egy különösen előnyös Y peptid az alábbi aminosav- sor rendű:
Glu Gin Gly Glu Ser Asn Gin Glu Arg
Gly Alá Arg Alá ^.rg Leu, ahol egyébként a kérdéses GRF a szarvasmarha GRF-je.
Egy másik, különösen előnyös Y peptid az alábbi aminosav-sorrendű:
Gin Gin Gly Glu Arg Asn Gin Glu Gin
Gly Alá Arg Val Arg Leu, ahol az adott GRF a sertés GRF-je.
Különösen előnyös Y peptid továbbá az alábbi aminosav-sorrendű:
Glu Gin Gly Glu Ser Asn Gin Glu Arg Gly
Alá Arg Alá Arg Leu, amikor az adott GRF peptid a humán GRF.
A találmány szerinti előnyös peptideket azok a vegyületek jelentik, ahol az (1) képletben
Z a GRF prekurzor peptidek 44 - 76. aminosav-szekvenciája.
Különösen előnyösek azok, amelyekben a 44 - 76. aminosav-szekvencia a kérdéses GRF természetben előforduló 44 - 76. aminosav-szekvenciájával azonos. A legelőnyösebb Z peptid-szekvencia az a GRF természetben előforduló 44 - 76. aminosav-szekvencia, ahol a lizint argininnel, és a metionint leucinnal helyettesítjük. Például, az egyik legelőnyösebb GRF peptid aminosav-szekvencia az, amikor Z az alábbi aminosav- szekvencia :
Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-AlaAsp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-LeuLeu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-GIn-Gly, amely a sertés GRF egy módosulata, és amely akkor előnyös, ha a kérdéses GRF a sertés GRF peptidje.
A GRF PEPTID egy igen előnyös aminosav-szekvenciája az, amikor az (1) képletben
Z az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti:
Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-LeuAla-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-ArgAsn-Ser-Gln-Gly, amely a szarvasmarha GRF egy módosulata, és amely akkor előnyös, ha a kérdéses GRF a szarvasmarha peptidje.
Az egyik legelőnyösebb Z szekvencia az (1) képletben az, amikor Z jelentése 0, és ez akkor előnyös, ha a kérdéses GRF a humán peptid.
A találmány előnyös vegyületeit reprezentálják azok, amelyek olyan, korábban megadott (1) általános képlettel irhatok le, ahol Y és/vagy Z peptidek elegendő hosszúak ahhoz, hogy E. coli sejteken nagymértékű expressziót érhetünk el.
A találmány szerinti előnyös vegyületeket továbbá azok a GRF peptidek reprezentálják, amelyekben szabad aminocsoporttal rendelkező aminosavakat egyáltalán nem, vagy ezek közül egyet, vagy több mint egyet kémiailag módosítunk.
A találmány során kémiai módosítás alatt azt értjük, hogy egy aminosav szabad aminocsoportját alkil- vagy hidroxi-alkil-csoporttal dérivatizáljuk. A módosítás mértékét a reakcióidő hosszával vagy a reagens mennyiségével szabályozzuk. Előnyös, ha a szabad aminocsoporttal rendelkező összes aminosavat kémiailag módosítjuk. Különösen előnyös az a GRF peptid, amely mindössze egy kémiailag módosítható aminocsoportot tartalmaz. Egy ilyen vegyületben nincs lizin vagy metionin.
A lizint és/vagy metionint tartalmazó vegyületeket olyan vegyületekké alakítjuk, amelyek az N-terminális végen hordoznak szabad aminocsoportot, az átalakítás során a lizineket argininekké, és a metioninokat leucinokká cseréljük ki.
A találmány szerinti GRF peptidek előállításakor először az N-terminális végen szabad aminocsoporttal rendelkező GRF peptidek szintetizálunk, majd ezután egy megfelelő XI savval vagy ennek egy aktív származékával acilezzük az N-terminális véget. A GRF peptideket előállíthatjuk peptidszintézissel vagy rekombináns módszerekkel. Mindkét módszert megismerhetjük a 4,617,149 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból; a leírást a jelen találmányban referenciaként használjuk. A rekombináns módszerek akkor előnyösek, ha magas hozam elérése a cél.
A szilárd fázisú polipeptid szintézis alapjai jól ismertek a szakemberek körében, alapjai megismerhetők például az alábbi irodalomból: Dugas, H. és Penney, C., Bioorganic Chemistry, Springer-Verlag, New York, 54 - 92. oldal (1981). A GRF analógok szilárd fázison kivitelezett szintézisének technikáit és módszerét leírják a 85302975.9 sorszámú európai közrebocsátási iratban (publikációs száma: 0,161,852, 1985. november 21.). Ezen leírást teljes egészében referenciaként építjük be a jelen leírásba .
A találmány egyik előnyös kiviteli módja szerint a GRF peptideket rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákkal állítjuk elő. A témában jártas szakemberek tudják azt, hogy hogyan kell teljes mértékben vagy szemiszintetikus módon egy adott aminosav-szekvenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat előállítani /lásd például Brown és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 109. (1979)/. Az adott polipeptid transzlációjához az előállított szintetikus dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát a bőségesen rendelkezésre álló rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok valamelyikébe építjük be megfelelő restrikciós endonukleázokat használva.
A ténylegesen használt endonukleázokat a használt expressziós vektor restrikciós térképe határozza meg. A GRF peptidet kódoló szekvenciát a promoterhez és a riboszóma kötőhelyhez képest megfelelő leolvasási fázisba kell beépítenünk az expressziós vektorba, a promoternek és a riboszóma kötőhelynek abban a mikroorganizmus sejtben funkcionálnia kell, amelyben a GRF peptidet expresszálni kívánjuk. Ismeretes a szakemberek körében az is, hogy megfelelő mértékű expreszszió eléréséhez milyen kodonokat kell használnunk /lásd See, W. Fiers és munkatársai, Natúré, 260, 500. (1976) ·, továbbá a 4,356,270 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást/.
Az E. coli sejtekben történő expresszióhoz előnyösen használhatjuk a pHS190 jelű E. coli plazmid származékait, ezek tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztositó gént, lambda cI857 jelű represszort és lambda pL promotert hordoznak. A pHS19O plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg. A pHS190 plazmid a Northern Régiónál Research Laboratories törzsgyüjteményében van letétbe helyezve NRRL B-18410 sorszámon (1988. szeptember 9-i letéti dátummal).
• · · · ·
- 21 A találmány szerinti szintetikus gén-szekvenciák az alábbi sertés, szarvasmarha és humán GRF analógokat kódolják:
Met1-Ala2-pGRF(3-76)OH, Met^-Ala2~bGRF(3-76)OH, és Met1-Ala2-hGRF(3-76)OH.
Más állatfajoknál, például lónál, kacsánál, patkánynál, tengeri malacnál, csincsillánál, baromfiaknál és más állatoknál felhasználható GRF analógok előállítására az ismert aminosav-szekvenciák alapján tervezett szintetikus génekkel állítjuk elő az adott GRF peptidet, és a leírásban a szarvasmarha és a sertés GRF peptidek kapcsán bemutatott módon módosítjuk azokat.
Az E. coli sejtekben meglevő metionil-amino-peptidáz (MAP) enzim hatására a fenti vegyületekről sejten belül lehasad az N-terminális metionin, amiután létrejönnek az alábbi GRF peptidek:
pGRF(2-76)OH, bGRF(2-76)OH és hGRF(2-76)OH.
Ezeket a (2-76)OH GRF peptideket a találmány szerinti vegyületekké /(1) képlet/ alakítjuk át az amino-terminális aminocsoport acilezésével, amit egy XI savval vagy ennek egy aktivált származékával végzünk el.
A molekuláris biológusok körében ismeretes, hogy peptideket fúziós proteinként is expresszálhatunk. Abban az esetben, ha a GRF peptidet fúziós proteinként állítjuk elő, és ezt a terméket később hasítjuk, akkor a kódoló szekvenciát úgy kell megterveznünk, hogy egy proteázzal (például karboxi-peptidázzal) vagy egy kémiai vegyülettel (például bróm-ciánnal) hasítható helyek alakuljanak ki a GRF peptid és a kapott fúziós konstrukció heterológ peptidje között.
A szakemberek körében jól ismertek azok a technikák, amelyekkel olyan fúziós proteinek állíthatók elő, amelyekből az exogén heterológ peptid felszabadítható a fúziós proteinből. Ilyen módszereket ismertetnek például a 4,336,246 számú, valamint a 4,425,437 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. A megfelelő proteolitikus enzim kiválasztásakor azt kell figyelembe vennünk, hogy előnyös, ha a fúziós protein aminosav-láncában az előállítani kívánt polipeptid nem rendelkezik további hasítható hellyel (esetünkben a GRF peptidről van szó). Hasítható helynek az előállítandó peptid és az exogén peptid között kell lenni. így elkerüljük az előállítandó GRF peptid degradációját. Néhány kémiai és enzimatikus ágens specifikus aminosav-szekvenciája jól ismert a szakemberek körében: lásd például Benyon, R. J. és Bond,
J. S., Proteolytic Enzymes: A Practical Approach (1989), Oxford University Press, Oxford, Anglia.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint a GRF peptidet kódoló kívánt szintetikus dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát úgy tervezzük, hogy a kódoló szál 51-végén egy Xbal hely, a kódoló szál 3'-végén pedig egy BamHI hely legyen. A vektor dezoxi-ribonukleinsav előállítására a pHS19O plazmid EcoRI helyét eltávolítjuk. A pHS19O vektort EcoRI enzimmel emésztjük, az egyszálu végeket feltöltjük, és a plazmidot újra ligáljuk. Az ezután végzett BamHI és Xbal emésztés után megkapjuk a használható vektor dezoxi-ribonukleinsavat. A szintetikus GRF peptidet kódoló • · · ·
- 23 szekvenciát ezután beépítjük a vektor dezoxi-ribonukleinsavba, és religáljuk.
A ligáit expressziós vektort baktériumsejtbe (például E. coli sejtbe) vagy megfelelő expressziós vektor használatakor emlős gazdasejtbe transzformáljuk, amiután GRF peptid expressziójára képes rekombináns sejtet kapunk, amelyeket a találmány szerinti eljárás során használhatunk. Baktérium és emlős expressziós körülmények között használható megfelelő expressziós vektorok jól ismertek a laboratóriumi gyakorlatban (lásd például Current Protocols in Molecular Biology (1989 és a kiegészítések), Ausubel és munkatársainak szerkesztésében, John Wiley és fia, New York.
A találmány egy előnyös kiviteli változata szerint a pHS452 plazmidot állítjuk elő, és az előzőekben röviden ismertetett módon beépítjük a Met1-Ala2~GRF(3-76)OH GRF peptidet kódoló szekvenciát. A fenti peptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát és az ebből adódó megfelelő aminosav-szekvenciát az alábbiakban adjuk meg:
ATG Met | GCT Alá | GAT Asp | GCT Alá | ATT Ile | TTT Phe | ACT Thr | AAT Asn | ||
AAT | TAT | CGA | CGC | GTT | CTG | ACT | CAG | CTG | TCT |
Asn | Tyr | Arg | Arg | Val | Leu | Thr | Gin | Leu | Ser |
GCT | CGT | CGT | CTG | CTG | CAG | GAT | ATT | CTG | TCT |
Alá | Arg | Arg | Leu | Leu | Gin | Asp | Ile | Leu | Ser |
CGT | CAG | CAG | GGT | GAA | CGT | AAC | CAG | GAA | CAA |
Arg | Gin | Gin | Gly | Glu | 'Arg | Asn | Gin | Glu | Gin |
GGA | GCC | CGT | GTT | CGT | CTT | GGT | CGT | CAG | GTT |
Gly | Alá | Arg | Val | Arg | Leu | Gly | Arg | Gin | Val |
GAT | TCT | CTG | TGG | GCT | GAT | CAA | CGT | CAG | CTT |
Asp | Ser | Leu | Trp | Alá | Asp | Gin | Arg | Gin | Leu |
GCT | CTC | GAG | TCT | ATC | CTG | GCT | ACT | CTG | CTG |
Alá | Leu | Glu | Ser | Ile | Leu | Alá | Thr | Leu | Leu |
CAG | GAA | CAT | CGT | AAT | TCT | CAG | GGT | TAA | TAG |
Gin | Glu | His | Arg | Asn | Ser | Gin | Gly | StopStop |
Ha a beépített dezoxi-ribonukleinsav szekvencia a Met^-Ala2“bGRF(3-76)OH GRF peptidet kódolja, úgy a kapott plazmidot pHS5OO jellel jelöljük. A fenti GRF peptidet kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát és a megfelelő aminosav-szekvenciát az alábbiakban adjuk meg:
ATG | GCT | GAT | GCT | ATT | TTT | ACT | AAT | TCT | TAT |
Met | Alá | Asp | Alá | Ile | Phe | Thr | Asn | Ser | Tyr |
CGT | CGT | GTC | CTT | ACT | CAG | CTG | TCT | GCG | CGC |
Arg | Arg | Val | Leu | Thr | Gin | Leu | Ser | Alá | Arg |
CGT | CTG | CTG | CAG | GAT | ATC | CTG | AAT | CGT | CAG |
Arg | Leu | Leu | Gin | Asp | Ile | Leu | Asn | Arg | Gin |
25 | |||||||||
CAA | GGT | GAA | CGT | AAT | CAG | GAA | CAA | GGT | GCT |
Gin | Gly | Glu | Arg | Asn | Gin | Glu | Gin | Gly | Alá |
CGT | GTA | CGT | CTG | GGT | CGC | CAA | GTT | GAT | GGT |
Arg | Val | Arg | Leu | Gly | Arg | Gin | Val | Asp | Gly |
GGT | TGG | ACT | GAT | CAA | CAG | CAG | CTT | GCT | CTC |
Val | Trp | Thr | Asp | Gin | Gin | Gin | Leu | Alá | Leu |
GAG | TCT | ACA | CTA | GTT | TCT | CTG | CTG | CAG | GAA |
Glu | Ser | Thr | Leu | Val | Ser | Leu | Leu | Gin | Glu |
CTG | CGG | AAT | TCT | CAA | GGT | TAA | TAG | ||
Arg | Arg | Asn | Ser | Gin | Gly | StopStop . |
Beépíthetünk egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát is, amely a Met-^Ala^hGRF (3-44) OH GRF peptidet határozza meg. A fenti peptidet kódoló dezoxi-ribonukleinsavat és az ebből adódó aminosav-szekvenciát az alábbiakban adjuk meg:
ATG | GCT | GAC | GCT | ATC | TTC | ACT | AAC | TCT | TAC | CGT |
Met | Alá | Asp | Alá | Ile | Phe | Thr | Asn | Ser | Tyr | Arg |
AAA | GTT | CTG | GGT | CAG | CTG | TCT | GCT | CGT | AAA | CTG |
Lys | Val | Leu | Gly | Gin | Leu | Ser | Alá | Arg | Lys | Leu |
CAG | GAC | ATC | ATG | TCT | CGT | GAG | CAG | GGT | GAA | TCT |
Gin | Asp | Ile | Met | Ser | Arg | Glu | Gin | Gly | Glu | Ser |
AAC | CAG | GAA | CGT | GGT | GCT | CGT | GCT | CGT | CTG | TAA |
Asn | Gin | Glu | Arg | Gly | Alá | Arg | Alá | Arg | Leu | Stop |
/Cravador, A. és munkatársai, Biochemie 67:829-834. oldal (1985)/.
A találmány előnyös kiviteli változata szerint, amikor a pHS19O expressziós vektort használjuk, a gazdasejtet 32°C hőmérsékleten tenyésztjük, mig az alkalmassá nem válik a polipeptid expressziójára. A CI857 represszor inaktiválódik, ha a tenyésztési hőmérsékletet 42°C-ra emeljük, és akkor a pL promoter derepresszálódik. Ilyenkor nagy mennyiségű GRF aktivitással rendelkező polipeptid termelődik, ennek mennyisége eléri a sejt összproteinjének 15 %-át. Az aktív polipeptidet a témában jártas szakemberek által jól ismert módon tisztíthatjuk, ahogy azt a következő példákban is megadjuk. Ahogy azt az előzőekben ismertettük, a MAP sejten belüli működése révén lehasad az N-terminális metionin, amiután megkapjuk a GRF(2-76)OH GRF peptidet. A protein ezután következő tisztítása során ismert enzimatikus kezeléssel eltávolíthatjuk az esetleg megmaradó N-terminális helyzetű metionint, például megfelelő amino-peptidázzal vagy kémiai utón, például bróm-ciánnal kivitelezett kezeléssel.
A találmány igénypontjaiban megadott vegyületek előállítására a (2-76)OH GRF peptidek amino-terminális végét egy XI karbonsav aktív észterével N-acilezzük. A (2-76)OH GRF peptid amino-terminális nitrogénjének acilezését előnyösen az XI általános képletű karbonsav szukcinimidil-észtereivel végezzük. A (2-76)OH GRF peptid amino-terminális nitrogénjének nukleofil támadása a szukcinimidil-észter észterkötésének karbonil-szénatomjára eredményezi az acilezést. Az A-reakcióegyenlettel szemléltetjük az acilezési reakciót, amely után a hippuroil-GRF(2-76)OH-t kapjuk meg.
• ·ν 4·· • 9 · ··· • « ··< «
9999 » W ♦ w
99 999 ····
Az XI karbonsav más aktív észtereit is használhatjuk acilezésre. Használhatunk például kloroformátokkal, például etil-kloroformáttal és izobutil-kloroformáttal vagy N-hidroxi-heterociklikus vegyületekkel, például a HoBT (hidroxi-benzotriazol)-lal kialakított aktív észtereket is. Felhasználhatók az aminosavak acilezésére, vagy az aminosavak kapcsolására általánosan használt más aktív származékok is. Ilyenek lehetnek például a szimmetrikus vagy az N-karboxi-anhidridek is.
Az acilezést vizes közegben végezzük, 7,5 és 9,5 közötti pH-η, és 15 - 35°C hőmérsékleten. Használhatunk aprotikus oldószert, például dimetil-szulfoxidot (DMSO) is.
Az (1) képletű GRF peptidek előállítására használt XI savak például a következők lehetnek: hippuroilsav, para-metil-hippuroilsav, para-klór-hippuroilsav, para-nitro-hippuroilsav, para-hidroxi-hippuroilsav, fenil-amino-karbonsav, 4-hidroxi-fenil-piruvánsav, p-fluor-hippuroilsav, N-fenil-malonsav-amid, p-metil-N-fenil-malonsav-amid, N- (2-tienoil)-glicin, N-(2-furoil)-glicin, N-(2-furoil)-b-amíno-propionsav, N-(3-tienoil)-a-amino-propionsav, N-(3-piridinoil)-glicin, Ν-4-piridinil)-malonamidsav, N-(l,3-tiazinil)-malonamidsav, N-(1,3-tiazinil)-szukcinamid, N-fenil-glutáramidsav, N-(2-metoxi-etil)-amino-szulfonil-glicin és -szulfinil, N-/(2-etil-tio-etil)-amino-szulfonil/-glicin és -szulfinil, N-(2-hidroxi-etil)-malonamidsav, amikor egy (2-29,44 vagy 76)GRF peptidet acilezünk.
A témában jártas szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vegyületeket előállíthatjuk egy (3-29,44 vagy 76) GRF peptiddel, (4-29,44 vagy 76) GRF peptiddel kezdve, szabadon vagy hordozóhoz kötve, egy hasonlóképpen N-terminálisan védett peptiddel vagy szubsztituált karbonsav-származékkal.
A találmány szerinti vegyületek közé soroljuk az előállított acilezett GRF peptidek gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sóit is. A gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sók alatt értjük a szerves és szervetlen savakkal képzett addiciós sókat, például azokat, amelyeket savakkal, például hidro-kloriddal, hidro-fluoriddal, kénsavval, szulfonsavval, fumársavval, hidro-bromiddal, glikolsavval, citromsavval, maleinsavval, foszforsavval, borostyánkősavval·, ecetsavval, salétromsavval, benzoesavval, aszkorbinsavval, para-toluol-szulfonsavval, benzol-szulfonsavval, naftalin-szulfonsavval, propionsavval vagy hasonló, más savakkal állítunk elő. Az előnyös savaddiciós sók azok, amelyeket hidro-kloriddal, ecetsavval vagy borostyánkősavval kapunk. A fenti sók bármelyikét ismert módszerekkel kapjuk. Ideértjük a karbonsav-sókat is, például az aminokat, az ammóniumsókat, a kvaterner ammóniumsókat, az alkálifém és alkáli-földfémsókat, mint például a kalcium-, magnézium-, nátrium-, kálium-és lítium-sókat, továbbá minden hasonló sót, ami a jelenlevő bármelyik karboxilcsoporttal képződik.
A következőkben megadott I., II. és III. táblázatban ismertetjük a jelen leírás szerinti vegyületek megnövekedett aktivitását:
I. TÁBLÁZAT
A bGRF (1-77)OH peptid Tyr-1 cserével elért megnövekedett növekedési hormon releasing aktivitása
Peptid
EC5O (nM)XX bGRF (1-77)OH 0,59 hippuroil-1 bGRF(2-77)OH 0,86 p-hidroxi-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,33 p-klór-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,19 p-fluor-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,14 p-nitro-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,51 p-metil-hippuroil bGRF(2-77)OH 0,05 n-fenil-malonamindoil bGRF(2-77)OH 0,19
II. TÁBLÁZAT | |
A bGRF (1-77)OH peptid Tyr-1 cserével elért | megnövekedett |
növekedési hormon releasing aktivitása | |
Peptid | EC50 (nM)xx |
dez-Tyr-1 pGRF(2-76)OH | 95,0 |
hippuroil-1 pGRF(2-76)OH | 0,28 |
p-metil-hippuroil pGRF(2-76)OH | 0,06 |
p-metil-fenil-malonamindoil pGRF(2-76)OH | 0,06 |
III. TÁBLÁZAT
A különböző hosszúságú p-metil-hippuroil-1 pGRF analógok in vitro aktivitása
Pép | t i d | EC50 (nM) |
p-metil-hippuroil | pGRF(2-29)NH2 | 0,02 |
p-metil-hippuroil | pGRF(2-44)OH | 0,07 |
p-metil-hippuroil | pGRF(2-76)OH | 0,06 |
= A patkány primer agyalapi mirigyéből a közegbe szekretált növekedési hormont 7 dózis (3 óra alatt) adagolása után mértük.
= A számított közepes hatásos dózis.
A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyszerészeti készítmények előállítására, amelyek aktív összetevőként az (1) képletü vegyületek valamelyikét tartalmazzák, vagy ezek egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sóját és egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható, szilárd vagy folyékony halmazállapotú vivőanyagot .
A találmány szerinti polipeptidek parenterális adagolásakor olyan gyógyszerészeti alakot készítünk, amely alkalmas injekciózásra, idetartoznak a steril vizes oldatok vagy diszperziók és a steril porok, amelyekből steril injektálható oldatokat vagy diszperziókat állítunk elő. Vivőanyagként oldatot vagy diszpergáló közeget használhatunk, ezek lehetnek például viz, etanol, poliolok (például glicerin, propilén-glikol, folyékony polietilén-glikol és mások), használhatjuk fentiek megfelelő keverékeit, és használhatunk növényi olajokat is. A megfelelő fluiditást megtarthatjuk például lecitin adagolásával, diszperziók esetén pedig a diszperzió fenntartására adhatunk különböző szereket, például felületaktív anyagokat. A mikroorganizmusok hatását gátolhatjuk különböző antibakteriális és gombaellenes szerek, például parabének, klór-butanol, fenol, vagy más, hasonló és ismert anyagok adagolásával. Sok esetben előnyös, ha a készítményhez izotóniás szereket, például cukrokat, nátrium-kloridot vagy más, hasonlókat adunk. A prolongált abszorpció az injektálható gyógyszerészeti készítményeknél elérhető különböző abszorpciót befolyásoló szerekkel, például aluminium-monosztearáttal vagy zselatinnal.
A steril injektálható oldatok előállítására a találmány szerinti peptideket megfelelő mennyiségben adagoljuk megfelelő oldószerhez, amihez azután más összetevőket adunk, szükség szerint. Ha szükséges, vagy a hatásosabb eloszlás elősegítésére a vegyületeket beépíthetjük olyan anyagokba, amelyekből azok lassan szabadulnak fel, vagy adott helyen lépnek ki a rendszerből. Ilyen lehet például egy polimer mátrix, ilyenek a liposzómák és a mikroszférák.
A hatásos anyag felszabadítható mechanikai eszközökkel, ozmotikus pumpákkal vagy bármely más rendszerrel vagy eszközzel, amely folyamatos vagy pulzáló felszabadulást tesz lehetővé.
Intravénás (iv) használathoz a találmány szerinti vegyületek vízben oldható alakjait intravénás oldatokhoz adjuk, és infúzióval adagoljuk. Ilyen intravénás anyagok például a következők: fiziológiás só-oldat, Ringer-oldat vagy például az 5 %-os dextróz-oldat. A vegyület megfelelő oldhatatlan alakja előállítható, és vizes bázisként vagy gyógyszerészeti szempontból elfogadható olajos bázisként adagolható, például egy hosszú szénláncu zsírsav, például etil-oleát észtereként .
A találmány szerinti peptid egységdózisa lehet a. vegyület egy oldata, ilyenkor a készítmény előnyösen só, az oldást megfelelő oldószerben végezzük steril, hermetikusan lezárható ampullákban. A vegyület koncentrációja változó, az egyes vegyületektől függően, függően az oldhatóságtól és a felhasználáskor szükséges dózistól 1 és 50 % között változhat.
A találmány tárgya módszer növekedési hormon szekréció indukálására, amely abban áll, hogy az (1) képletű polipeptid vegyület vagy ennek egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sóját gyógyszerészeti szempontból elfogadható, szilárd vagy folyékony halmazállapotú vivőanyaggal együtt hatásos mennyiségben adagoljuk.
A találmány szerinti vegyületek különböző dózisait a páciensnek olyan időn át adagoljuk, amialatt kívánatos a növekedési hormon szekréciójának stimulálása. A szük séges dózis nagyságát befolyásolja a páciens testsúlya, az adagolás módja és az egyén válasza az indukcióra. Juhoknál az előnyös dózis 0,01 - 3,0 mg/kg/nap; legelőnyösebben
0,5 mg/kg/nap. Sertéseknél az előnyös dózis 3 ^ug/kg/nap és /Ug/kg/nap között változik. A legelőnyösebb dózis sertésnél 3 /Ug/kg/nap. Szarvasmarhánál az előnyös dózis
0,5 - 12 mg/kg/nap, különösen előnyös a 3 mg/kg/nap dózis ada golása. Embernél az előnyös dózis 0,03 és 1,0 mg/kg/nap között változik, legelőnyösebb a 0,3 mg/kg/nap nagyságú dózis.
Különösen előnyösen járunk el akkor, ha a találmány szerinti vegyületekből készült készítményeket egységdózisként formulázzuk, ilyenkor könnyű az adagolás és a dózisok hasonlóak. Az egységdózisok azokat a mennyiségeket reprezentálják, amelyek a kezelendő páciensnek adagolandók. Mindegyik egység előre meghatározott mennyiségű vegyületet tartalmaz, amely a gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt a kívánt terápiás hatást kiváltja. A specifikus dózisegységek kialakítása attól függ, hogy az adott készítmény milyen tulajdonságú, illetve, hogy milyen különleges terápiás hatást kívánunk elérni.
A GRF és előnyösen a találmány szerinti GRF vegyületek megfelelő gyógyszerészeti szempontból elfogadható alakként való adagolásakor emlősökben növekszik a növekedési hormon termelése. Ezért az emlős növekedési hormon gyógyászati és mezőgazdasági célú alkalmazása kiváltható a találmány szerinti vegyületek adagolásával. Jelenleg növekedési hormont adagolnak például törpe-növekedéskor és oszteoporóziskor (csontritkulás). A növekedési hormonnak más hatásai is vannak, például növekszik a zsírmentes izomtömeg, gyorsabban gyógyulnak a sebek, és az öregkori tünetek csökkennek. Mindezek elérhetők a találmány szerinti vegyületek adagolásával.
A találmány szerinti polipeptid tipusu vegyületeket különböző rendszerekben mérhetjük. Egy in vivő mérési módszer nátrium-pentobarbitállal altatott patkányokkal vételezhető ki /Wehrenberg és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 109:382 (1982)/. A növekedési hormon releasing-jét (felszabadulását, szekrécióját) in vitro patkány anterior agyalapi mirigy sejtekkel mérjük /Heiman és munkatársai, Endocrinol., 116:410 (1985)/.
Az alábbiakban példákkal szemléltetjük a találmány szerinti eljárást, a példák azonban nem limitálják a leírás oltalmi körét.
1. példa
A bGRF(2-77)OH előállítása szilárd fázison
A GRF peptideket szilárd fázishoz kötött módszerrel állítjuk elő Applied Biosystems 43OA peptidszintetizátorral (megkapható az Applied Biosystems-től, Foster City California), és a szintézis ciklusait az Applied Biosystems-től kaptuk. A BOC aminosavakat és más reagenseket is a fenti cégtől, illetve más katalógusokban szereplő forrásokból szereztük be. Kettős kapcsolásos protokolokat használva szekvenciális BOC kémiát alkalmaztunk a kiindulási p-metil-benzhidril-amin gyantán a C-terminális karboxamidok termelésére. A C-terminális savak előállítására a megfelelő PAM gyantát alkalmaztuk. Aszparagint, glutamint, arginint, /alfa-(p-hidroxi-fenil)-ecetsavakat/, /béta-(p-hidroxi-fenil)-propionsavakat/, p-hidroxi-benzoesavakat, p-hidroxi-cinnaminsavakat, para-hidroxi-fenoxi-ecetsavakat kapcsoltunk előre elkészített hidroxi-benzo-triazol-észtereket használva. Az összes N-terminális kapcsolást HOBT-aktivált aminosavakkal végeztük a szilárd fázisos szintézisben.
Az alábbi oldallánc-védőcsoportokat használtuk:
arginin, tozilcsoport aszparagin, ciklohexilcsoport glutamin, ciklohexilcsoport szerin, benzilcsoport, treonin, benzilcsoport, tirozin, 4-bróm-karbobenzoxicsoport.
A BOC hasítást trifluor-ecetsavval (TFA) végeztük metilén-kloridos reakcióelegyben. A peptidszintézis befejezését követően a peptideket védőcsoport-mentesitjük, és 10 % meta-krezolt tartalmazó vízmentes hidrogén-fluoriddal lehasitjuk a gyantáról. Az oldallánc-védőcsoportok hasítását és a peptid leválasztását a gyantáról 0°C vagy hidegebb, előnyösen -20°C hőmérsékleten végezzük 30 percen át, majd a reakciót 30 percen át 0°C hőmérsékleten folytatjuk. A hidrogén-fluorid eltávolítása után a peptid/gyanta szuszpenziót éterrel mossuk, majd a peptidet jégecettel extraháljuk, és fagyasztva szárítjuk. A tisztítást kiszoritásos kromatográfiával végezzük Sephadex G-10 gyantán (Pharmacia), 10 %-os HOAc jelenlétében.
2. példa
A GRF peptidek előállítása rekombináns technikával
2A. A GRF(2-76)OH rekombináns peptid expressziója
2A.1. A Met^-pGRF(2-76)OH peptidet kódoló pHS452 plazmid szintézise
A pHS452 plazmid egy olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektor, amely nagy mennyiségben expresszálja a találmány szerinti egyik előnyös polipeptidet, a pGRF(2-76)OH-t, akkor, ha a gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztjük.
A liofilezett E. coli K12 RV3O8/pHS19O törzset az NRRL, Peoria, IL 61604 törzsgyüjteményből szerezhetjük be
NRRL B-18410 letéti számon (a letét ideje: 1988. szeptember 9.). Ezt a törzset közvetlenül használjuk az alábbi eljárásban. A pHS19O plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg.
Az E. coli K12 RV3O8/pHS19O törzset 10 ml, az alábbiakban megadott összetételű TY táptalajba oltjuk:
tripton 10 g nátrium-klorid 5 g élesztőkivonat 5 g víz 1 1.
A táptalajt ml-enként 5 mg tetraciklinnel egészítjük ki. A tenyészetet 30°C hőmérsékleten, 15 - 18 órán át levegőztetve inkubáljuk. A kapott tenyészetet használjuk fel a pHS190 plazmid izolálására.
1, 5 mg/ml tetraciklint tartalmazó TY táptalajt oltunk az E. coli K12 RV3O8/pHS19O tenyészettel, és 32°C hőmérsékleten, 15 - 18 órán át levegőztetve inkubáljuk a tenyészetet. Ezután percenként 52OO-at forduló rotorban centrifugálunk (Sorvall, DuPont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CT 06470). A GSA tipusu rotor 10 percen át 4°C hőmérsékleten forog, amikor a sejtek leülepszenek. A felüluszót kiöntjük. A sejteket 28 ml alábbi összetételű elegyben szuszpendáljuk:
% szacharóz és mmól etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA).
A szuszpenzióhoz 1 ml, 0,25 mólos trisz-hidro-klorid-oldatban oldott 20 mg/ml koncentrációjú lizozim-oldatot (pH = 8,0),
1,5 ml 0,5 mólos EDTA-oldatot (pH = 8,0) adagolunk, és keverjük a szuszpenziót. A kapott készítményt 15 percen át jégfürdőben inkubáljuk. Ezután a lizozimmal kezelt sejtekhez enyhe keverés közben 3 ml lizáló oldatot adagolunk, ennek összetétele a következő:
% Triton^ X-100 (Rohm and Haas) 3 ml;
0,25 mólos EDTA (pH = 8,0) 75 ml; és ml viz.
A kapott szuszpenziót 15 percen át jégfürdőben inkubáljuk.
Centrifugálással eltávolítjuk a sejttörmeléket az oldatból, a centrifugálást Sorvall SS34 rotorban végezzük 45 percen át, 4°C hőmérsékleten úgy, hogy a rotor percenként 17.000-et fordul. A 30 ml térfogatú felüluszóhoz 28,6 g cézium-kloridot és 1 ml 5 mg/ml koncentrációjú etidium-bromid-oldatot adunk. Ezután vízzel 40 ml-re egészítjük ki az elegy térfogatát, és az oldatot ultracentrifuga-csőbe dekantáljuk. A csövet leforrasztjuk, és az oldatot Ti70 rotorban percenkénti 49.500-as fordulatszámmal centrifugáljuk Beckman centrifugában (7360 N. Lincoln Avenue, Lincolnwood, IL 60646). A centrifugálást 8 órán át végezzük. A plazmidcsikot ultraibolya fényben vizsgálva azonosítjuk, izoláljuk, cézium-kloriddal telitett izopropanollal extraháljuk az etidium-bromid eltávolítására, és három oldatcserével 20-szoros térfogatú, alábbi összetételű TE pufferral szemben dializáljuk:
mmól trisz-hidro-klorid, pH = 7,05, mmól EDTA.
A dializátumot összegyűjtjük, majd 2 térfogat etanolt és 0,05 térfogat 3 mólos nátrium-acetát-oldatot adunk hozzá.
Az etanolos oldatot -20°C hőmérsékletre hütjük, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat centrifugálással összegyűjtjük. A centrifugálást SS34 rotorban végezzük, percenkénti 10.000-es fordulatszámmal 30 percen át, -10°C hőmérsékleten. A kapott üledéket 1 ml TE pufferban reszuszpendáljuk, és ezután azonos térfogatú, alábbi eleggyel extraháljuk:
fenol : kloroform =1:1 (térfogatarány). A vizes fázisban levő dezoxi-ribonukleinsavat 0,1 térfogat 3 mólos nátrium-acetát és 2 térfogat etanol adagolásával kicsapjuk, a szuszpenziót 30 percen át -20°C hőmérsékleten inkubáljuk, amiután SS34 jelű rotorban percenkénti 15.000-es fordulatszámmal 20 percen át centrifugálunk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav csapadékot 70 %-os etanolban, majd 100 %-os etanolban mossuk, és szárítjuk.
A fenti eljárással előállított 1,0 mg mennyiségű pHS190 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 1,5 ml O,1X TE pufferban szuszpendáljuk, és -20°C hőmérsékleten tároljuk. 10 mg pHS190 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 10 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk, az alábbi reakcióelegyben:
trisz-hidro-klorid, pH = 7,5 | 100 | mmól |
magnézium-klorid | 5 | mmól |
nátrium-klorid | 50 | mmól. |
A reakcióelegyet 2 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten.
Az 5'-kinyúló végek tompa véggé alakítására
O, 5 - 0,5 mmól mennyiségű dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és TTP-t adagolunk a reakcióelegyhez 1-5 egység Klenow fragmenssel együtt (Boehringer Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Dr.,
P. O. Box 50816, Indianapolis', IN 46250). 15 percen át 30°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd az enzim inaktiválására 10 percen át 75°C hőmérsékleten tartjuk. Fenollal, fenol és kloroform elegyével, végül kloroformmal extraháljuk az elegyet, ezután etanollal kicsapjuk.
A kicsapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 50 ml alábbi összetételű elegyben szuszpendáljuk:
trisz-hidro-klorid, pH = | 7,5 | 40 mmól |
magnézium-klorid | 10 mmól | |
ditio-treitol | 10 mmól | |
adenozin-trifoszfát | 0,5 mmól | |
T4 dezoxi-ribonukleinsav | ligáz | 1 egység. |
A ligázt a Boehringer Mannheim Biochemicals-tól vásároltuk (lásd előbb). A reakcióelegyet egy éjszakán át 14°C hőmérsékleten inkubáljuk.
A ligáit termékkel ezután E. coli K12 RV3O8 sejteket transz formálunk Maniatis és munkatársai szerint /Molecular Cloning, 250 - 251. oldal, Cold Spring Harbor
Press (1982)/. Az E. coli törzset az NRRL törzsgyüjteményből szerezzük be NRRL B-15624 deponálási számon.
500 ml térfogatú lombikban 100 ml TY táptalajt sterilezünk, majd 1 ml RV3O8 tenyészettel oltjuk be. Az inokulumot egy éjszakai tenyésztéssel kapjuk. A sejteket erőteljes rázással növesztjük 37°C hőmérsékleten addig, mig a teg nyészet ml-enként 5 x 10 sejtet tartalmaz. 10 percen át jégfürdőben tartjuk a tenyészetet, majd 4000 x g-vel centrifugáljuk 5 percen át, 4°C hőmérsékleten. 50 ml jéghideg, alábbi összetételű elegyben szuszpendáljuk a sejteket:
mmól kalcium-klorid, 10 mmól trisz-hidro-klorid, pH = 8,0.
percen át ismét jégfürdőben tartjuk a sejtszuszpenziót, majd centrifugáljuk. A sejteket ezután 3,3 ml kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk. A ligációs elegyet 200 ml sejthez adjuk, és 30 percen át jégfürdőben inkubálunk. Ezután 42°C-os vízfürdőbe helyezzük a sejtszuszpenziót, és 2 percen át ott tartjuk. 1 ml TY táptalajt adunk a szuszpenzióhoz, és a sejteket további 1 órán át 30°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután TY agarra 0,2 ^ul alikvotokat teszünk, és 30°C hőmérsékleten egy éjszakán át tenyésztünk. A TY agar összetétele azonos a TY táptalajéval, azzal a különbséggel, hogy 1,5 % agart is tartalmaz. A petri-csészékbe öntött TY agart 5 mg/ml tetraciklinnel egészítjük ki.
A plazmidot ezután 10 ml vízben oldjuk. A vektor előállítására a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Xbal és BamHI enzimekkel emésztjük. 10 ml plazmid dezoxi-ribonukleinsavhoz (10 mg) 1 ml Xbal restrikciós enzimet (10 egység) adunk, és 5 ml 10X Xbal pufferral egészítjük ki a reakcióelegyet. A puffer összetétele a következő:
trisz-hidro-klorid, pH = 8,0 magnézium-klorid nátrium-klorid
500 mmól
100 mmól
500 mmól percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 0,5 ml 5 mólos nátrium-klorid-oldatot adagolunk, és 1 ml BamHI (10 egység) enzimmel egészítjük ki az elegyet.
Az inkubációt további 90 percen át folytatjuk 37°C hőmérsékleten. A reakcióelegyet agaróz gél-elektroforézissel választjuk szét, és az 5,75 kb nagyságú Xbal-BamHI vektor fragmenst elektroelucióval izoláljuk, majd etanollal kicsapjuk.
Az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát szintetizáljuk Applied Biosystems Model 38OB szintetizátorral, a témában jártas szakemberek előtt jól ismert technikákat alkalmazva. Szintetikus gén előállítására oligonukleotid szekvenciákat állítunk elő, majd ezeket az oligonukleotidokat ligáljuk. A folyamatot lényegében Brown és munkatársai szerint eljárva végezzük (Methods in Enzymology, 68:109 (1979). Az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvencia a találmány egyik előnyös polipeptidjét kódolja, ahol A9 aszparagin,
A12 arginin,
A15 treonin,
A21 arginin,
A22 leucin,
A25 aszparagin,
A27 leucin,
A28 szerin, « A • · v · «
- 43 - | |
A38 | glutamin, |
A39 | glicin, |
A40 | alanin, |
A42 | valin, és ahol |
Z | az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti: |
Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-LeuAla-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-ArgAsn-Ser-Gln-Gly.
A fenti szekvencia pozitív szálja az alábbi nukleotid sorrendű:
ATG | GCT | GAT | GCT | ATT | TTT | ACT | JVAT | AAT | TAT | CGA | CGC | GTT |
CTT | ACT | CAG | CTG | TCT | GCT | CGT | CGT | CTG | CTG | CAG | GAT | ATT |
CTG | TCT | CGT | CAG | CAG | GGT | GAA | CGT | AAC | CAG | GAA | CAA | GGA |
GCT | CGT | GTT | CGT | CTT | GGT | CGT | CAG | GTT | GAT | TCT | CTG | TGG |
GCT | GAT | CAA | CGT | CAG | CTT | GCT | CTC | GAG | TCT | ATC | CTG | GCT |
ACT | CTG | CTG | CAG | GAA | CAT | CGT | ΆΑΤ | TCT | CAG | GGT | TAA | TAG |
A kódoló szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsavat összekapcsoljuk a fentiek szerint előállított Xbal-BamHI vektor fragmenssel. A ligáit eleggyel ezután a fentiek szerint eljárva E. coli K12 RV3O8 sejteket transzformálunk. A tetraciklinre rezisztens transzformánsok plazmid dezoxi-ribonukleinsavát restrikciós enzimekkel analizáljuk a pHS452 plazmid azonosítására.
2A.2. A Met^-bGRF(2-76)OH peptidet kódoló pHS5OO plazmid szintézise A szarvasmarha GRF peptidek rekombináns alakját | |
a 2A.1. | példában megadottak alapján állítjuk elő. A rekombi- |
náns szarvasmarha GRF peptid előállításakor a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia az alábbi előnyös, találmány szerinti polipeptidet határozza meg:
A9 | szerin, |
A12 | arginin, |
A15 | treonin, |
A21 | arginin, |
A22 | leucin, |
A25 | aszparagin, |
A27 | leucin, |
A2 8 | aszparagin, |
A3 8 | glutamin, |
A39 | glicin, |
A40 | alanin, |
A42 | valin, továbbá |
- 45 ··«
Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-GlnGln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-SerLeu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
A fenti dezoxi-ribonukleinsav szekvencia pozitív szálja az alábbi nukleotid sorrendű:
ATG | GCT | GAT | GCT | ATT'TTT | ACT | AAT | TCT | TAT | CGT | CGT | GTC |
CTT | ACT | CAG | CTG | TCT GCG | CGC | CGT | CTG | CTG | CAG | GAT | ATC |
CTG | AAT | CGT | CAG | CAA GGT | GAA | CGT | AAT | CAG | GAA | CAA | GGT |
GCT | CGT | GTA | CGT | CTG GGT | CGC | CAA | GTT | GAT | GGT | GTT | TGG |
ACT | GAT | CAA | CAG | CAG CTT | GCT | CTC | GAG | TCT | ATA | CTA | GTT |
TCT | CTG | CTG | CAG | GAA CGT | CGG | AAT | TCT | CAA | GGT | ΤΆΑ | TAG, |
A kódoló szekvenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat elegyítjük az Xbal-BamHI vektor fragmenssel, és ligáijuk a 2A.1. példában megadottak szerint eljárva. A ligáit eleggyel a fentiek szerint E. coli K12 RV3O8 sejteket transzformálunk. A bGRF szekvenciát kódoló plazmidot pHS5OO jellel jelöljük. A tetraciklinre rezisztens transzformánsok plazmid dezoxi-ribonukleinsavát restrikciós enzimes analízissel vizsgáljuk a pHS5OO plazmid azonosítására.
- 46 4 «4 « « · • « ·>
• ·4 ·«·♦ • 4 4« ···· · *
2A.3. A Met,-hGRF(2-46)OH peptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szintézisé^ A humán GRF peptidek rekombináns előállítását a |
2Ά.1. példában megadottak alapján végezzük. Ugyanakkor, a találmány előnyös kiviteli módja szerint a rekombináns humán GRF peptid előállításakor módosított hGRF peptidet használunk, ahol
A9 | szerin, |
A12 | lizin, |
A15 | glicin, |
A21 | lizin, |
A2 2 | leucin, |
A25 | aszparáginsav, |
A27 | metionin, |
A28 | szerin, továbbá, ahol |
Y | az alábbi aminosav sorrendű: Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg- Ala-Arg-Leu, és továbbá, ahol |
Z | 0. |
A peptidet kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvencia pozitív szálja az alábbi nukleotid szekvenciáju:
ATG | GCT | GAC | GCT | ATC | TTC | ACT | AAC | TCT | TAC | CGT | AAA |
GTT | CTG | GGT | CAG | CTG | TCT | GCT | CGT | AAA | CTG | CTG | CAG |
GAC | ATC | ATG | TCT | CGT | GAG | CAG | GGT | GAA | TCT | AAC | CAG |
GAA | CGT | GGT | GCT | CGT | GCT | CGT | CTG | . TAA |
•w *» t V · ··« ♦ · Ο ·* ···· * · *Τ * ··· ····
A kódoló szekvenciát hordozó dezoxi-ribonukleinsavat összekeverjük a 2A.1. példában megadottak szerint előállított Xbal-BamHI fragmenssel, és ligálunk. A ligáit elegygyel a fentiek szerint eljárva E. coli K12 RV3O8 sejteket transz formálunk.
2B. példa
A rekombináns GRF peptidek izolálása
2B.1. A GRF analóg expressziója E. coli sejtekben
Az E. coli K12 RV3O8/pHS451 törzset 5 mg/ml tetraciklint tartalmazó TY táptalajban tenyésztjük 32°C hőmérsékleten addig, mig a tenyészet eléri a közép-logaritmikus fázist. A tenyészet hőmérsékletét ekkor 42°C-ra emeljük, és az inkubációt 3 órán át folytatjuk. A lambda pL promoter cI857 jelű hőmérséklet-érzékeny represszora, amely a pHS451 plazmádban a GRF analóg expresszióját szabályozza, 42°C-on inaktiválódik, amiután lehetségessé válik a GRF analóg expressziója. A bGRF peptidet a pGRF expressziója kapcsán a fentiekben megadottak alapján expresszáljuk, azzal a különbséggel, hogy a pHS452 plazmid helyett a pHS500 jelű plazmidot használjuk.
2B.2. A GRF analógot tartalmazó granulátumok izolálása
Ha igen erős E. coli expressziós rendszert használunk, ahogy az itt meg van adva, a protein termék úgynevezett inclusion bodies vagy granulátumok alakjában képződik.
• ···· • ·· » 4 · · • · ·· • t·· · « • ·· ·
- 48 A GRF analógot tartalmazó granulátumokat izoláljuk, és a számunkra érdekes GRF peptid izolálására oldatba visszük. Először a teljes sejtet centrifugáljuk, majd 10°C hőmérsékletű vízben szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót Gaulin homogenizátorban homogenizáljuk 8000 psig-en. A homogenizált szuszpenziót vízzel hígítjuk, és 10 percen át keverjük, amiután pH-ját 10 %-os,-> vizes nátrium-hidroxid-oldattal 8,4 - 8,6-ra állítjuk be. Ezután centrifugálunk. Az üledék a GRF analógot tartalmazó granulátumokból áll, ezt további felhasználásig -70°C hőmérsékleten tartjuk.
2B.3. A GRF analóg végső tisztítása
A fenti 2B.2. példában megadottak szerint izolált granulátumokat 2 - 5°C hőmérsékleten felolvasztjuk. A granulátumok oldására 10 térfogat 0,05 normál ecetsav és 7 mólos karbamid elegyét adagoljuk, majd 5-8 percen át homogenizálunk. Ezután 10 %-os hidroklorid-oldattal
2,5 - 2,6-ra állítjuk be a szuszpenzió pH-já.t. 12 - 15 órán át 2 - 5°C hőmérsékleten keverünk. Az oldatot szűréssel tisztítjuk, a szűrést Dicalite Speedex szűrési segédanyaggal (Grefco, Torrance, CA) fedett Sparkler szűrőn végezzük. Az oldat konduktivitása 4000 mohm-ra csökken az ecetsavas-karbamidos oldattal való hígítás után.
p Kationcserélő oszlopot készítünk S Sepharose (Pharmacia, 800 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854) gyantából. Az oszlopot úgy készítjük el, hogy az 1 1 gyantát tartalmazzon 50 g anyagra számítva. A feldolgozandó anyagot 0,1 1/cm/óra ráfolyási sebességgel juttatjuk az oszlopra, és 2 oszlop-térfogatnyi, 0,1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk a gyantát, a sós oldatot ecetsav-karbamid-oldattal készítjük el. A GRF analógot lineáris gradienssel eluáljuk, ezt ecetsav-karbamid-oldattal készített 0,25 mólos - 1,6 mólos nátrium-klorid koncentrációval állítjuk be. Mindegyik eluátumból háromszoros oszlop-térfogatnyi mennyiséget használunk, ugyanakkor 0,1 oszlop-térfogatnyi frakciókat gyűjtünk. A GRF analógot tartalmazó frakciókat konduktivitás-méréssel, Οϋ,^θ meghatározással, HPLC-analizissel és poliakril-amid gél-elektroforézissel azonosítjuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük.
Az összegyűjtött frakciókat azonos térfogatú ecetsav-karbamid eleggyel egészítjük ki. Ezután az oldatot p ecetsav-karbamid-oldattal kiegyensúlyozott S Sepharose gyantára visszük, az oszlopot úgy készítjük el, hogy 50 g proteinre 1 1 gyantát számítunk. Az átfolyási sebességet
0,02 1/cm /órára állítjuk be. A GRF analógot tartalmazó frakciókat olyan lineáris gradienssel eluáljuk, amely ecetsav és karbamid elegyével készült, és 0,25 mól - 1,2 mól nátrium-kloridot tartalmaz. 0,1 oszlop-térfogatnyi frakciókat gyűjtünk. A frakciókat az előzőekben megadottak szerint analizáljuk, és a GRF analógot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük.
- 50 ρ
Sephadex G-15 (Pharmacia) oszlopot készítünk 0,02 mólos, 2,5 pH-ju glicin-oldattal. Az oszlop térfogata az előzőleg összegyűjtött frakciók térfogatának ötszöröse. A kromatográfia során összegyűjtjük az θ°276 hullámhosszon csúcsot mutató frakciókat.
%-os acetonitril - 0,02 mól glicin (pH = 2,5) p kiegyenlítő oldattal SP20SS'gyantából (Sephabeads ,
Mitsubishi Chemical, Tokyo) oszlopot készítünk. Az összegyűjtött GRF analógokat tartalmazó oldatot 10 %-osra hígítjuk acetonitrillel, és az oszlopra juttatjuk 1,5 - 2 oszlop-térfogat/óra átfolyási sebességgel. Az oszlopot 2 oszlop-térfogatnyi acetonitril-glicin pufferral mossuk. A GRF analógot gradiens elucióval eluáljuk, a gradienst 3 oszlop-térfogatnyi, 10 % acetonitril - 0,02 mól glicin és 3 oszlop-térfogatnyi, 50 % acetonitril - 0,02 mól glicin elegyével állítjuk elő. 0,1 oszlop-térfogatnyi frakciókat gyűjtünk, és meghatározzuk bennük a GRF analóg koncentrációját.
A GRF analógot tartalmazó elegyet ezután
R
Sephadex G15 oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot
0,25 mólos ecetsavval egyensúlyozzuk ki. Az 0D2^g csúcsot mutató frakciókat összegyűjtjük, és felhasználásig fagyasztva szárított alakban tároljuk.
3. példa
A hippuroil-l-pGRF(2-76)OH előállítása ml dimetil-formamidban keverés közben
3,58 g benzoil-glicint (Transworld Chemicals) oldunk, az oldatot jégfürdőben lehűtjük. 2,5 g N-hidroxi-szukcinimidet adunk az oldathoz, majd 4,5 g diciklohexil-karbodiimidet (DCC). Egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet.
A reakció során képződött oldhatatlan diciklohexil-karbamidot (DCU) szűréssel eltávolítjuk, és a dimetil-formamidos szürletet csökkentett nyomású térben töményitjük. A desztillációs maradékot diklór-metánnal·hígítjuk. A képződő csapadékot szűréssel eltávolítjuk, és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amikor 3,79 g szukcinimidil-hippuroátot kapunk.
A 2A. példában megadottak szerint eljárva 72 mg pGRF(2-76)OH-t állítunk elő. A terméket 3 ml 0,1 mól trisz-hidroklorid (pH = 7,8) és 30 %-os propanol élegyében oldjuk úgy, hogy szobahőmérsékleten keverjük. 57 mg szukcinimidil-N-benzoil-glicinátot adunk a reakcióelegyhez, és szobahőmérsékleten keverjük, miközben a 15. percben, az 1. órában és a 2. órában a szukcinimidil-N-benzoil-glicinát adagolása után 5 ./Ul mintákat veszünk, a reakció előrehaladtának vizsgálatára. A mintákat 500 /U1 0,1 %-os trifluor-ecetsav-oldattal (0,15 - 0,2 mg/ml) hígítjuk, és nagynyomású folyadék-kromatográfiás analízis céljából 0,46 x 15 cm-es
Vydac C18 oszlopba injektáljuk, majd összehasonlítjuk az eredményekét a kiindulási anyagéval.
2.5 óra múlva a reakcióelegyet 1 ml jégecettel készült HOAc-oldattal savanyítjuk, és 2,2 x 28,5 cm méretű Sephadex G-10 oszlopra öntjük. Az oszlopot 10 %-os HOAc-oldattal eluáljuk, és 7,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk.
A frakciók abszorpcióját 280 nm-en mérjük, a peptid jelenlétét vizsgálva. A 7 - 10. frakciók peptidet tartalmaznak, ezeket összeöntjük, fagyasztjuk, és fagyasztva szárítjuk, amiután 70 mg liofilizátumot kapunk.
mg mintát 1,0 ml 0,1 %-os trifluor-ecetsavban oldunk. Az oldatot 10 x 0,1 ml térfogatú alikvótokra osztjuk, majd lefagyasztjuk, és fagyasztva szárítjuk. A liofilizátum egy mintáját tömegspektrográfiával (FAB-MS) analizáljuk. Egy másik mintából aminosav-szekvencia analízist végzünk.
4. példa
A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH előállítása
4A. A p-metil-benzoil-glicin szintézise
7.5 g glicint oldunk 105 ml 2 normál nátrium-hidroxidból· és 50 ml dioxánból készült elegyben, az oldatot O - 5°C hőmérsékleten keverjük. Ezután 14,9 ml p-toluil-kloridot 50 ml-re egészítünk ki dioxánnal, majd ezt
- 20 perc alatt cseppenként hozzáadjuk a fenti reakcióelegyhez. Egy éjszakán át 25°C hőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet.
Ezután vizes nátrium-hidroxid-oldattal bázikusra állítjuk be az elegy pH-ját, majd ezután dietil-éterrel extraháljuk. A vizes fázis pH-ját 6 normál hidroklorid-oldattal 3,0-ra állítjuk be. A vizes fázist etil-acetáttal extraháljuk, az extraktumot vízzel mossuk, és magnézium-szulfáttal szárítjuk. A vízmentes oldatot szűrjük, a szürletet csökkentett nyomású térben közel szárazra pároljuk. A szilárd desztillációs maradékot Et2O-ban szuszpendáljuk, szűrjük és desztilláljuk, amiután 14,25 g, a vizsgálatok szerint p-metil-hippuroilsavval azonos terméket kapunk. A termék azonosítását olvadáspontjával és elemanalizissel végezzük, a kapott eredményeket összehasonlítjuk a termék elméleti számítás szerinti értékeivel. Az előállított termék olvadáspontja 151 - 154°C. A következőkben megadott I. táblázatban ismertetjük az elemanalizis adatait.
4B. A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH szintézise
1,65 g, a 4A. példában megadottak szerint előállított p-metil-hippuroilsavat 15 ml dimetil-formamidban oldunk keverés közben, majd jégfürdőben lehűtjük. Az oldathoz 1 g N-hidroxi-szukcinimidet adunk, majd 1,9 g DCC-t. A reakcióelegyet 25°C hőmérsékleten keverjük egy éjszakán át.
A DCU csapadékot szűréssel izoláljuk, és a szürletet csökkentett nyomáson koncentráljuk. A desztillációs maradékként kapott olajos anyagot Et20-ban hígítjuk, amikor kristályosodás indul meg. A kristályokat szűréssel elkülönítjük, Et20-val mossuk, és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután 167 - 170°C hőmérsékleten olvadó 3,28 g súlyú terméket kapunk. A terméket elemanalizissel azonosítjuk, és az elméleti értékkel összehasonlítva a kapott eredményeket, a termék azonosnak bizonyult a p-metil-hippuroilsav szukcinimidil-észterével (C34Hi4N2O5^·
A 2A. példában megadottak szerint előállított pGRF(2-76)OH 72 mg-ját 3 ml, 30 % propanolt tartalmazó 0,1 mólos trisz-hidrokloridban (pH = 7,8) oldjuk szobahőmérsékleten, keverés közben. A reakcióelegyhez 57 mg p-metil-hippuroilsav-szukcinimidil-észtert adunk, és szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet, miközben az adagolást követő 15., 60. és 120. percben 5-5 ^ul mintát veszünk a reakció előhaladásának vizsgálatára. Mindegyik mintát 500 ml-re hígítunk 0,1 %-os trifluor-ecetsavval, és RP-HPLC analízishez 0,46 x 15 cm-es Vydac C18 oszlopba injektálunk. Az analízis eredményeit összehasonlítjuk a kiindulási anyaggal kapott értékkel.
2,5 óra múlva a reakcióelegyet 1 ml jégecettel savanyítjuk, és az oldatot 2,2 x 28,5 cm méretű Sephadex G-10 oszlopra juttatjuk. Az oszlopot 10 %-os HOAc-oldattal eluáljuk, és 7,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A frakciók abszorpcióját 280 nm-en meghatározzuk, az eredmények jelzik a polipeptid-vegyületek jelenlétét. A 7., 8., 9. és 10. frakciók polipeptidet tartalmaznak, ezeket egyesitjük, fagyasztjuk és fagyasztva szárítjuk, amiután 70 mg lizofilizátumot kapunk.
5. példa
A p-klór-hippuroil-bGRF(2-77)OH előállítása
A 4. példában megadottak szerint eljárva p-klór-hippuroil-GRF-származékot állítunk elő, azzal a különbséggel, hogy a p-toluoil-klorid helyett p-klór-benzoil-kloridot használunk az A. részben megadott reakcióban, és a bGRF(2-77)0H-GRF peptidet az 1. példában ismertetett, szilárd fázishoz kötött eljárással állítjuk elő.
6. példa
A p-nitro-hippuroil-bGRF(2-77)OH előállítása
A 4. példában megadottak szerint eljárva előállítjuk a p-nitro-hippuroil-GRF-származékot, azzal a különbséggel, hogy az eljárásban a p-toluoil-klorid helyett p-nitro-benzoil-kloridot használunk az A. részben ismertetett reakcióban, és a bGRF(2-77)OH-GRF peptidet az 1. példában megadottak szerint (szilárd fázison) állítjuk elő.
7. példa
A p-hidroxi-hippuroil-bGRF(2-77)OH előállítása
A p-hidroxi-hippuroil-GRF-származék előállítására a 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a p-toluoil-klorid helyett az A. példa részében megadott reakcióban p-hidroxi-benzoil-kloridot használunk, és a bGRF(2-77)OH GRF peptidet az 1. példában megadott módon szilárd fázishoz kötött módszerrel állítjuk elő.
8. példa
A p-fluor-hippuroil-bGRF(2-77)OH előállítása
A p-fluor-hippuroil-GRF-származék előállítására a 4. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a példa A. részében megadott reakcióban p-toluoil-klorid helyett p-fluor-benzoil-kloridot használunk, és a bGRF(2-77)OH GRF peptid előállítására az 1. példában megadottak szerint járunk el (szilárd fázis).
9. példa
Az N-fenil-malonamindoil-l-bGRF(2-77)OH előállítása
Keverés közben 25°C hőmérsékleten 9,1 ml (0,1 mól) anilint oldunk 100 ml diklór-metánban. Az oldathoz 15,1 g dikálium-karbonátot adunk, majd 20 ml diklór-metánban 14 ml etil-malonil-kloridot csepegtetünk a reakcióelegyhez. 3-4 órán át keverjük az elegyet 25°C hőmérsékleten, majd 72 órán át hagyjuk tovább futni a reakciót.
Ezután 500 ml vizes diklór-metánnal hígítjuk az elegyet. Összerázzuk, majd a diklór-metános fázist elkülönítjük, először sósavval, majd vízzel mossuk, ezután magnézium-szulfáttal vizmentesitjük, szűrjük, és a szürletet olajos desztillációs maradékig desztilláljuk, amiután 14,5 g terméket kapunk.
A fentiek szerint előállított etil-N-fenil-malonamid 14 g-ját 25 ml dioxán és 75 ml 1 normál nátrium-hidroxid elegyében oldjuk. 3 órán át 25°C hőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet.
Ezután dietil-éterrel extraháljuk az elegyet, ekkor az még lúgos kémhatásu. A vizes fázist 6 normál hidroklorid-oldattal savanyítjuk, és EtOAc-val extraháljuk. Az extraktumot magnézium-szulfáttal vizmentesitjük. A szerves oldószeres szürletet szárazra pároljuk. A desztillációs maradékot dietil-éterrel telitjük, szűrjük, és csökkentett nyomású térben szárazra desztilláljuk, amiután 5,1 g súlyú terméket kapunk.
A terméket elemanalizissel és ^H-NMR vizsgálattal azonosítjuk. Az eredmények szerint a termék N-fenil-malonamidsav vagy N-fenil-malonsav-monoamid.
Az N-fenil-malonamidsavat bGRF(2-77)-gyantához kapcsoljuk egy HOBT-észterrel.
10. példa
Az N-fenil-malonamindoil-l-pGRF(2-77)OH előállítása
A 9. példában megadottak szerint előállított N-fenil-malonamidsav 3,58 g-ját keverés közben 20 ml dimetil-formamidban oldjuk, és az oldatot jégfürdőben lehűtjük. Az oldathoz 2,5 g N-hidroxi-szukcinimidet, majd ezután
4,5 g diciklohexil-karbodiimidet (DCC) adunk. Egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet.
A DCU csapadékot szűréssel eltávolítjuk, és a dimetil-formamidos szürletet csökkentett nyomású térben desztilláljuk. A desztillációs maradékot dietil-éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük, és csökkentett nyomású térben desztillálva töményitjük, amikor desztillációs maradékként 3,79 g N-fenil-malonamidsav-szukcidimidil-észtert kapunk.
A 2A. példában megadottak szerint előállított pGRF(2-76)OH 72 mg-ját 3 ml, 30 % propanolt tartalmazó, 0,1 mólos trisz-hidrokloridban (pH = 7,8) oldjuk, majd szobahőmérsékleten keverjük az elegyet. Az oldathoz 57 mg, a fentiek szerint előállított N-fenil-malonamidsav-szukcidimidil-észtert adunk, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük, miközben az észter adagolását követő 15., 60. és 120. percben 5-5 /Ül térfogatú mintát veszünk, a reakció előrehaladtának ellenőrzésére. A mintákat 500 ^ul 0,1 %-os trifluor-ecetsavval hígítjuk (0,15 - 0,2 mg/ml), és RP-HPLC analízisre 0,46 x 15 cm méretű Vydac C18 oszlopra injektáljuk. Az analízis során az eredményeket összehasonlítjuk a kiindulási anyag eredményével.
2,5 óra múlva a reakcióelegyet 1 ml jégecetes HOAc-val savanyítjuk, és az elegyet 2,2 x 28,5 cm méretű Sephadex G-10 oszlopra öntjük. Az oszlopot 10 %-os HOAc-oldattal eluáljuk, és 7,5 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciók abszorpcióját 280 nm-en meghatározzuk, és a polipeptidet tartalmazó frakciókat kiválasztjuk. A 7 - 10. frakciókban polipeptid van jelen, ezeket összeöntjük, fagyasztjuk, és liofilezzük, amiután 70 mg liofilizátumot kapunk.
11. példa
A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH-t tartalmazó készítmény előállítása
1,38 g dinátrium-hidrogén-foszfátot és 1,0 g
PSA-t oldunk 1 1 végtérfogatban, pirogénmentes vízben, az elegy pH-ja 5,1. 27,4 mg, a 4B. példa szerint előállított p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH peptidet adunk 64 ml vivőanyaghoz, amiután ml-enként 360 milliekvivalens végkoncentráció ju készítményt kapunk.
12. példa
A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH in vivő hatása napi háromszori szubkután vagy intravénás adagoláskor, sertésekben hibrid sertést, amelyek átlagsulya 72 kg, katéterezünk a femorális vénában, majd a p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH hatását vizsgáljuk. A 11. példában megadottak szerint előállított p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH-t tartalmazó készítményt naponta háromszor injekciózzuk intravénásán vagy szubkután az állatoknak 10,0 ^ug/kg/injekció mennyiségben.
Az állatokat naponta 2000 g 18,5 % nyers proteint tartalmazó kukorica-szója takarmánnyal etetjük, az etetést két alkalommal, reggel 8 órakor és délután 4 órakor végezzük.
Az állatok az injekciót reggel 8 órakor, délután 4 órakor és éjjel 12 órakor kapják. A vizeletben kiválasztott karbamid-nitrogént 5 napos kontroll szakaszban határozzuk meg, négy 3 napos kezelési időszakban, és két 3 napos szakaszban, a kezelés után. 24 órás időszakban 30 vérszérum mintát gyűjtöttünk a kezelés 12. napján. A szérum mintákat a növekedési hormon (GH), a BÚN, a glükóz, az inzulin, az FFA és a trigliceridek koncentrációjának meghatározására használtuk. A mérési eredmények átlagait az alábbi, IV. táblázatban adjuk meg.
d •rl r—I
N d H
U H tó EH tó tó
N Ό tó :d r4 u
IV. TABLAZAT
tó u
Ό •H g (tí tói ín cd tó tn 'Φ ω •H >s d d Φ 3 ui 'Φ i—I
Φ
N Φ tó
tó | rQ | tó | O 1 | 0 | d | |||||
00 | 00 | 00 | σ> | μ | •H | |||||
X | X | X | - 1 | ρ | ||||||
o | kD | CM | λ | |||||||
CM | r- | CM | t—1 1 | Ο, | μ | |||||
1-1 1 | •Η | φ | X | |||||||
Λ | m | tó | ||||||||
1 | 1 | m | Φ | |||||||
r—! | P | +1 | ||||||||
tói 1 | Ή | Ö4 | ω | |||||||
tó | X | tó | rö | | 41 | Φ | |||||
00 | CO | co | in | Φ | •μ | |||||
X | X | X | ·> 1 | g | 'cd | Γ—1 | ||||
co | in | 04 , | 1 | m | :0 | |||||
CM | co | CM | m 1 | Λ | N | Γ—1 | ||||
| | (Λ | φ | ||||||||
cd | o | Λ | ||||||||
l | ||||||||||
X | ·*— | d | ||||||||
tó | Λ | tó | tó! 1 | d | φ | |||||
00 | co | συ | m , | ο | ι—1 | tó | ||||
X | X | X | X | Ό | cd | 'Φ | ||||
in | r- | in | t 1 | Ό | tn | 41 | ||||
in | συ | in | σ> | g | Cn | μ | ||||
1 | cd | 'φ | ||||||||
| | -μ | >1 | ||||||||
•μ | d | ιη | ||||||||
tó | XI | tó | tó! 1 | φ | cd | Ο | ||||
r- | m | Ν | »0 | X | ||||||
X | X | X | 1 | ι—1 | > | ο | ||||
m | CM | yd | f 1 | Φ | •H | |||||
σ> | CO | o | •ΓΊ | > | ||||||
yd | r—1 | rH 1 | ||||||||
1 | tó | cd | tó | |||||||
I | -Ρ | 1—1 | cd | |||||||
tó | tói | tó | tó! | tó | cd | • | ||||
00 | o | in | m i | Λί | g | d | tó | |||
X | X | x | X | 0 | g | 0 | :Ρ | |||
in | r- | in | r- 1 | -Ρ | o | Π5 | 41 | |||
«----1 | yd | 1 | tó | 1—1 | Ό | Φ | ||||
ι—1 | cd | g | Λ | |||||||
1 | 1—1 | tó! | ||||||||
'tó | 1—1 | Ή | ω | |||||||
tó | Λ | tó | tói 1 | <d | ω | 0 | ||||
in | συ | t—1 | cn , | Ν | 'cd | d | ||||
χ | X | X | X | tó | m | ι—1 | 0 | |||
CM | συ | CM | 00 1 | o | Ν | |||||
Λί | •H | tr> | <d | |||||||
1 | :p | £14 | cd | |||||||
| | -Ρ | * | cd | TJ | Ν | I | ||||
ι—1 | 1—1 | d | cd | cd | 41 | |||||
1 | Φ | Φ | d | |||||||
Ν | TJ | -μ | •μ | ι—1 | • | Ή | ||||
1 | Φ | Ό | cd | -μ | ω | Ν | ||||
| | rM | •μ | tó! | 0 | 1—I | <—ι | ω | |||
tó | rQ | tó | tói | -μ | 0 | Φ | μ | |||
m | CO | o | 1 | 1------1 | μ | cd | Λ | φ | d | |
χ | X | »* | *· | tó | φ | cd | Κζ* , I | ο | ||
<D | co | <o i | § | £14 | r~d | N | d | 1 | g | |
CM | yd | CM | 1-1 1 | g | t—1 | cd | ο | d | μ | |
0 | W | 'tó | £14 | <d | 0 | |||||
1 | rd | O | ·. | 0 | g | χ: | ||||
tó | .—. | I—1 | tó | Γ—1 | ζ* | |||||
1 | X | l£> | r*d | 2 | Ν | Φ | •Η | |||
1 | ι—1 | r~ | o | 41 | Μ | tó | ω | |||
o | o | tó | 1 | P | N | 0 | ι | 'Φ | ||
o | n | O | oi i | CM | -P | Ό | 41 | Ό | ||
CO | '— | £ | -H | tn | d | Φ | ||||
> | > | o | O 1 | tó | 0 | 0 | 0 | φ | tó | |
H | H | cn | ω i | •H | tó | Λί | tó | £ | Ό | Φ |
CU | u | Φ | Ο | μ | > | |||||
1 | tó | £14 | tó | •π | Ν | 41 | :Ο | |||
1 | a | 1 | tó | ω | d | |||||
| | ,, | ι—1 | ||||||||
ω | ω | ι—1 | ||||||||
-μ | 'Φ I | 'Φ | 0 | -—X | ||||||
• | 1—1 | • | I—I | 1—1 | μ | X | ||||
•P | φ | -P | φ 1 | Φ | -μ | |||||
c | N | a | Ν , | N | d | X | .. | |||
o | Φ | o | Φ 1 | Φ | o | tó | ||||
tó | tó ι | X | tó | ο |
- 62 A táblázat adatai jelzik, hogy a napi háromszor adagolt (30,0 /Ug/kg/nap) p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH hatásos volt, ami látszik a vizelet csökkent karbamid-nitrogén tartalmából (41 %), a szérum BÚN értékének csökkenéséből (54 %) . A p-metil-hippuroil-pGRF(2-76)OH adagolása négyszeres növekedést okozott a szérum növekedési hormon szintjében, ami együttjárt a szérum glükóz, inzulin, FFA és triglicerid koncentrációjának növekedésével.
Nem mutatkozott különbség a szérum vizsgált értékeiben az adagolás módja szerint, kivéve, hogy szubkután adagolással magasabb inzulin-koncentrációt mértünk a sertéseknél, mint intravénás adagoláskor. A vizelet karbamid-nitrogén kiválasztásában is csökkenést tapasztaltunk, a kezelés befejezését követő 2-3 napon át, ha az állatokat szubkután injekcióval kezeltük (lásd az 5. ábrát).
Claims (16)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás GRF (növekedési hormon releasing faktor) analógok előállítására, azzal jellemezve, hogya) kémiai vagy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákat használva egy dez-Tyrl-GRF peptidet állítunk elő, ésb) a peptid amino-terminális végét kémiailag módosítjuk .
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azXl-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu-GlnA25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T általános képletű vegyületek és ezek gyógyszerészeti szempontból elfogadható, nem-toxikus sóinak előállítására, az-
zal jellemezve, hogy a képletben A9 Ser, Alá, Leu, Thr vagy Asn, * A12 Arg vagy Lys, A15 Gly, Alá, Thr vagy Leu, A21 Arg vagy Lys, A22 Alá vagy Leu, A25 Asp vagy Glu, A27 Met, Ser, Arg, Leu vagy norleucin, A2 8 Ser vagy Asn, - 64 Υ Ο vagy egy 1-15 aminosavból álló peptid,Z 0 vagy egy 1-32 aminosavból álló peptid,T az alábbi karboxil-terminális csoportok egyike:-COOR , -CR 0, -CONHNHR , -C0N(R ) (R, ) vagy - 3 3 3 3 D-CH„0R , aholZ 3Ra és Rfc egymástól függetlenül rövidszénláncu alkilcsoport, hidrogénatom, egy Hse(lakton), HseOH vagy HseN (R^) (R^) , aholRc és R^ egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövidszénláncu alkilcsoport,XI egy alábbi általános képlettel megadható acilcsoport:llR1-A- (CH2) d- (NH) c-B- (NH) (CH^ a~CH-C- , R2 aholR^ hidrogénatom, metil·-, etil·-, hidroxi-etil- vagy fenilcsoport, vagy halogénatommal, rövidszénláncu alkilcsoporttal, rövidszénláncu alkoxicsoporttal, hidroxilcsoporttal, nitrocsoporttal vagy aminocsoporttal szubsztituált szubsztituált fenilcsoport, acetamidocsoport, trifluor-metil-csoport, hidroxi-metil-csoport vagy szulfamidocsoport, vagy egy 5- vagy 6-tagu, nitrogén-, oxigén- vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos gyűrű, továbbá, ahol ·»♦ ·*·0, 1, 2 vagy 3, vagy 1, vagy 1,12, vagy oxigén- vagy kénatom, karbonil-, szulfonil- vagy szulfinil csoport, R2 R3 hidrogénatom, metilcsoport, hidroxi-metil-csoport, p-hidroxi-benzil-cso port vagy az alábbi csoport:II-(CH2)e-C-R3, metil-, etil-, hidroxi-etil-, amino-, hidroxil-, fenil- vagy halogénatommal, alkil-, alkoxi-, hidroxil-, nitro-, amino-, acetamido- vagy szulfamido csoporttal szubsztituált fenilcsoport vagy 5- vagy 6-tagu, nitrogén-, oxigén vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos gyütü.3. A2.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 0,1, B karbonilcsoport, c 0, d0 és A 0.
- 4. A igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R^ metil-, fenil-, p-nitro-fenil-, p-klór-fenil-, p-fluor-fenil-, p-hidroxi-fenil-, p-metil-fenil- vagyN-benzil-csoport (izonikotinil).
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle mezve, hogy hidrogénatom, metilcsoport vagy hidroxi-metil-csoport.··· »···0 « «· • ♦ ·*
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R2 hidrogénatom,
- 7. A 2 - 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Ά9 aszparagin, A12 arginin, A15 treonin, A21 arginin, A22 leucin, A25 aszparaginsav, A27 leucin ésA28 jelentése szerin.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Y az alábbi aminosav-székvenciát jelenti:Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu vagy ennek egy funkcionális származéka.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Z az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti:Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-AlaLeu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-SerGln-Gly vagy ennek egy funkcionális származéka.
- 10. A 2 - 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A9 szerin, A12 arginin, A15 treonin,A21 arginin, A22 leucin, A25 aszparaginsav és A28 aszparagin.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Y az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti: Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu vagy vagy ennek egy funkcionális származéka.
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Z az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti: Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-AlaLeu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-SerGln-Gly.
- 13. A 2 - 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A9 szerin, A12 lizin, A15 glicin, A21 ·· *>·*·» lizin, A22 leucin, A25 aszparaginsav, A27 metionin és A28 szerin.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Y az alábbi aminosav-szekvenciát jelenti: Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu vagy ennek egy funkcionális származéka.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Z 0.
- 16. Eljárás gyógyszerészeti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy GRF analógot egy vagy több gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal, higitószerrel vagy excipienssel keverünk.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US69209091A | 1991-04-26 | 1991-04-26 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9201399D0 HU9201399D0 (en) | 1992-08-28 |
HUT64589A true HUT64589A (en) | 1994-01-28 |
Family
ID=24779221
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9201399A HUT64589A (en) | 1991-04-26 | 1992-04-27 | Superactive grf analogues |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0511003B1 (hu) |
JP (1) | JPH05279388A (hu) |
KR (1) | KR100233804B1 (hu) |
CN (1) | CN1068123A (hu) |
AT (1) | ATE178073T1 (hu) |
AU (1) | AU1513292A (hu) |
BR (1) | BR9201512A (hu) |
CA (1) | CA2067304A1 (hu) |
CZ (1) | CZ285567B6 (hu) |
DE (1) | DE69228717T2 (hu) |
DK (1) | DK0511003T3 (hu) |
ES (1) | ES2129430T3 (hu) |
FI (1) | FI921855A (hu) |
GR (1) | GR3030459T3 (hu) |
HU (1) | HUT64589A (hu) |
IE (1) | IE921338A1 (hu) |
IL (1) | IL101620A (hu) |
MX (1) | MX9201878A (hu) |
NO (1) | NO921595L (hu) |
NZ (1) | NZ242459A (hu) |
SG (1) | SG46364A1 (hu) |
TW (1) | TW360661B (hu) |
YU (1) | YU44292A (hu) |
ZA (1) | ZA922746B (hu) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5453418A (en) * | 1988-03-07 | 1995-09-26 | Eli Lilly And Company | Ractopamine and growth hormone combinations |
JPH07509128A (ja) * | 1992-07-13 | 1995-10-12 | バイオネブラスカ・インコーポレーテッド | 組換型ポリペプチドの修飾方法 |
CA2222068C (en) * | 1995-05-26 | 2007-04-10 | Theratechnologies Inc. | Chimeric fatty body-pro-grf analogs with increased biological potency |
EP0766966A3 (en) * | 1995-09-08 | 2001-02-28 | Eli Lilly And Company | Method of treating insulin resistance |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4628043A (en) * | 1983-04-26 | 1986-12-09 | The Salk Institute For Biological Studies | Hypothalamic GRF agonists |
US4626523A (en) * | 1983-09-13 | 1986-12-02 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs II |
US4528190A (en) * | 1983-10-25 | 1985-07-09 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs IV |
CA1271600A (en) * | 1985-01-07 | 1990-07-10 | David Howard Coy | Growth hormone-releasing peptides and method of treating mammals therewith |
-
1992
- 1992-04-14 ZA ZA922746A patent/ZA922746B/xx unknown
- 1992-04-16 IL IL10162092A patent/IL101620A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-04-21 CZ CS921211A patent/CZ285567B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-04-23 MX MX9201878A patent/MX9201878A/es unknown
- 1992-04-23 NZ NZ242459A patent/NZ242459A/en unknown
- 1992-04-24 KR KR1019920006975A patent/KR100233804B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-04-24 BR BR929201512A patent/BR9201512A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-04-24 CN CN92104215A patent/CN1068123A/zh active Pending
- 1992-04-24 DK DK92303717T patent/DK0511003T3/da active
- 1992-04-24 SG SG1996003583A patent/SG46364A1/en unknown
- 1992-04-24 FI FI921855A patent/FI921855A/fi unknown
- 1992-04-24 DE DE69228717T patent/DE69228717T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-04-24 YU YU44292A patent/YU44292A/sh unknown
- 1992-04-24 AU AU15132/92A patent/AU1513292A/en not_active Abandoned
- 1992-04-24 NO NO92921595A patent/NO921595L/no unknown
- 1992-04-24 AT AT92303717T patent/ATE178073T1/de active
- 1992-04-24 EP EP92303717A patent/EP0511003B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-24 ES ES92303717T patent/ES2129430T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-24 IE IE133892A patent/IE921338A1/en unknown
- 1992-04-24 JP JP4106569A patent/JPH05279388A/ja active Pending
- 1992-04-27 HU HU9201399A patent/HUT64589A/hu unknown
- 1992-04-27 CA CA002067304A patent/CA2067304A1/en not_active Abandoned
- 1992-05-14 TW TW081103757A patent/TW360661B/zh active
-
1999
- 1999-06-09 GR GR990401532T patent/GR3030459T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ242459A (en) | 1993-12-23 |
FI921855A (fi) | 1992-10-27 |
IL101620A (en) | 1996-08-04 |
TW360661B (en) | 1999-06-11 |
CA2067304A1 (en) | 1992-10-27 |
ATE178073T1 (de) | 1999-04-15 |
KR920019817A (ko) | 1992-11-20 |
BR9201512A (pt) | 1992-12-01 |
NO921595D0 (no) | 1992-04-24 |
NO921595L (no) | 1992-10-27 |
GR3030459T3 (en) | 1999-10-29 |
IE921338A1 (en) | 1992-11-04 |
AU690264B2 (en) | 1998-04-23 |
SG46364A1 (en) | 1998-02-20 |
DK0511003T3 (da) | 1999-05-25 |
MX9201878A (es) | 1992-10-01 |
AU1513292A (en) | 1992-10-29 |
EP0511003B1 (en) | 1999-03-24 |
AU2333495A (en) | 1995-09-14 |
HU9201399D0 (en) | 1992-08-28 |
YU44292A (sh) | 1994-06-24 |
DE69228717D1 (de) | 1999-04-29 |
CS121192A3 (en) | 1992-11-18 |
JPH05279388A (ja) | 1993-10-26 |
CZ285567B6 (cs) | 1999-09-15 |
ES2129430T3 (es) | 1999-06-16 |
IL101620A0 (en) | 1992-12-30 |
KR100233804B1 (ko) | 1999-12-01 |
CN1068123A (zh) | 1993-01-20 |
ZA922746B (en) | 1992-12-30 |
FI921855A0 (fi) | 1992-04-24 |
EP0511003A1 (en) | 1992-10-28 |
DE69228717T2 (de) | 1999-08-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3164463B2 (ja) | ペプチド類 | |
US5304473A (en) | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
AU630912B2 (en) | Insulin analogs | |
Sekine et al. | Cloning and expression of cDNA for salmon growth hormone in Escherichia coli | |
KR910002701B1 (ko) | 합성 펩티드 및 이를 함유한 제약학적 조성물 | |
US5268453A (en) | Tissue-selective insulin analogs | |
IE58128B1 (en) | Growth hormone release factor analogs | |
JPH01156998A (ja) | 血清担体タンパク質との結合力が減少しているヒトインスリン様成長因子類以体及び酵母におけるそれらの産生 | |
SK704783A3 (en) | Dna sequences, recombinant molecules of dna and a method of producing polypeptides similar to sow growth hormone | |
FI91074C (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi | |
JPH0786120B2 (ja) | ポリペプチド | |
HUT64589A (en) | Superactive grf analogues | |
JP2512638B2 (ja) | 安定化された効力のあるgrfアナログ | |
EP0454367B1 (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
AU654142B2 (en) | Stable and bioactive modified somatotropins | |
CA2026776A1 (en) | Stabilized, potent grf analogs | |
JPH04503061A (ja) | 安定で強力なgrfアナログ類 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |