CZ285567B6

CZ285567B6 - Superaktivní analog GRF, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Info

Publication number: CZ285567B6
Application number: CS921211A
Authority: CZ
Inventors: Richard Dennis Dimarchi; Mark Louis Heiman; James Edwin Shields; David Lee Smiley
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1991-04-26
Filing date: 1992-04-21
Publication date: 1999-09-15
Also published as: TW360661B; BR9201512A; NZ242459A; ES2129430T3; FI921855A0; AU1513292A; GR3030459T3; ZA922746B; HUT64589A; IE921338A1; IL101620A0; KR100233804B1; MX9201878A; AU2333495A; EP0511003B1; HU9201399D0; DK0511003T3; NO921595L; NO921595D0; KR920019817A

Abstract

Analogy faktoru uvolňujícího růstový hormon (GRF) s modifikovaným aminokoncem s vyšší účinností a potencí, než nativní GRF a než dosud známé analogy. Tyto analogy zahrnují GRFb peptidy se včleněnými vybranými aminokyselinovými modifikacemi z přírodně se vyskytujících forem GRF peptidů. Jde o analogy hovězího, vepřového, lidského a dalších druhů GRF. Sloučeniny podporují uvolňování růstového hormonu a používá se jich pro formulaci farmaceutických prostředků k ošetřování různých onemocnění, způsobovaných nedostatečnou hladinou růstového hormonu a také pro zvyšování libové svaloviny užitkových zvířat.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká superaktivního analogu faktoru, uvolňujícího růstový hormon (GRF - growth hormone releasing factor).

Dosavadní stav techniky

Růstový hormon je sekreční bílkovina hypofyzy živočichů se značným vlivem na vývin organismu. Umělé řízení koncentrace růstového hormonu má značný terapeutický význam. Náhrada lidského růstového hormonu se jeví jakožto účinné opatření při nedostatku růstového hormonu a při ošetřování chorobných stavů v případě lidí. Nezávisle na tomto vynálezu byly nalezeny nové a významné vlastnosti růstového hormonu, které dále podpořily význam řízení růstového hormonu. Například z nejnovějších klinických studií vyplývá, že doplnění růstového hormonu může být užitečné při boji proti nemocem, které s sebou přináší stárnutí lidí. Zvýšené hladiny růstového hormonu u živočichů vedou ke zvyšování netučné svalové hmoty. Tohoto poznatku by se mohlo použít ke zvýšení produkce libového masa nebo pro produkci větších a/nebo robustnějších zvířat.

Jakkoliv je růstový hormon produkován hypofyzou, řídí sekreci růstového hormonu do krve druhá bílkovina, označovaná jakožto faktor uvolňování růstového hormonu (GRF). Tento hormon je rovněž obecně znám jakožto somatocrinin, hormon, uvolňující růstový hormon (GHRH - growth hormone realeasing hormone) a hormon, uvolňující růst (GRH - growth releasing hormone). Existují proto dva způsoby řešení problému zvýšení cirkulace růstového hormonu: (1) přímé zvýšení koncentrace lidského růstového hormonu v organismu, nebo (2) zvýšení přirozeného sklonu organismu produkovat růstový hormon. Tohoto druhého způsobu se může dosahovat dodáváním GRF. Zjistilo se, že GRF zvyšuje cirkulaci růstového hormonu in vivo (Rivier a kol., 1982, Nátuře, 300, str. 276). Vliv GRF (a jeho různých strukturálních analogů) na produkci růstového hormonu byl studován v široké míře. První překážkou při použití GRF při přímém podávání je jeho krátká životnost in vivo (Frohman L.A. a kol., 1986, J. Clin. Invest. 78, str. 906. Je proto žádoucí vyvinout účinnější a/nebo déle působící molekuly GRF pro účinné ošetřování lidí a zvířat.

Struktura GRF byla modifikována četnými způsoby, což vedlo k analogům s delší životností a/nebo s větším účinkem. Ukázalo se, že prvních 29 aminokyselin od koncového dusíku je dostatečných k udržení plné účinnosti GRF (Speiss a kol., 1982, Biochemistry 21, str. 6037). Jednou strategií je včleňovat nové D-aminokyselinové zbytky v různém množství do molekuly GRF (Laňce V. A. a kol., 1984, Biochem. Biophys. Res. Commun. 119, str. 265, Coy D. H. a kol., 1986, Peptides, 8 (suppl. 1), 49). Jiným přístupem je modifikace peptidového skeletu GRF včleněním peptidových vazebných izoter do N-koncové oblasti (Tourwe D., 1985, Janssen. Chim. Acta 3, str. 3, S.J. a kol., 1990, J. Med. Chem. 33, str., 1954 až 1958.

Vynález se týká analogů GRF se zvýšenou účinností a s dalšími charakteristikami, které představují technické přednosti ve srovnání s analogy GRF, známými ze stavu techniky. Sloučeniny podle vynálezu jsou vhodné pro veterinární účely, zvláště pro hovězí dobytek, vepře, ovce, drůbež a ryby.

-1 CZ 285567 B6

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je superaktivní syntetický analog GRF peptidu (GRF peptidy) vzorce I

Xl-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A 12-V al-Leu-A 15-Gln-Leu-Ser-AlaArg-A21-A22—Leu-Gln-A25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T, kde znamená

A9 Ser, Ala, Leu, Thr, nebo Asn,

AI 2 Arg nebo Lys,

A15 Gly, Ala, Thr nebo Leu,

A21 Arg nebo Lys,

A22 Ala nebo Leu,

A25 Asp nebo Glu,

A27 Met, Ser, Arg, Leu nebo norleucin,

A28 Ser nebo Asn,

Y nulu nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí ze souboru, zahrnujícího Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu, Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu, nebo jejich funkční derivát,

Z nulu nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí ze souboru, zahrnujícího Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-GluSer-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly, Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-GluSer-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly, nebo jejich funkční derivát,

T karboxylovou koncovou skupinu obecného vzorce

-COOR_a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(Rb) nebo CH₂OR_a, kde znamená

R_a a Rb na sobě nezávisle alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, atom vodíku, Hse (lakton), HseOH nebo skupinu HSeNÍRcXRj), kde znamená Re a Rj na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

XI acylovou skupinu obecného vzorce

O

II

R^A-CCH.jd-CNHX-B-CNHjb-CCHzX-CH-CR₂ kde znamená

R] atom vodíku, skupinu methylovou, ethylovou, hydroxyethylovou, fenylovou nebo fenylovou substituovanou atomem halogenu, alkylovou nebo alkoxyskupinou vždy s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyskupinou, nitroskupinou nebo aminoskupinou, acetamidoskupinu, trifluormethylovou skupinu, skupinu vzorce -CHr-OH, sulfoamidoskupinu nebo pětičlennou nebo šestičlennou heterocyklickou skupinu, obsahující jeden až tři heteroatomy ze souboru, zahrnujícího atom dusíku, kyslíku a síry,

-2CZ 285567 B6 a nulu, 1, 2 nebo 3, b nulu nebo 1, c nulu nebol, d nulu až 12,

A nulu, atom kyslíku nebo síry,

B skupinu karbonylovou, sulfonylovou nebo sulfmylovou,

R₂ atom vodíku, skupinu methylovou, skupinu vzorce CH₂OH, skupinu hydroxybenzylovou nebo skupinu obecného vzorce

O

-(CH₂)_e-C-R₃ kde znamená e nulu až 5,

R₃ skupinu methylovou, ethylovou, hydroxyethylovou, aminoskupinu, skupinu fenylovou nebo fenylovou substituovanou atomem halogenu, alkylovou nebo alkoxyskupinou vždy s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyskupinou, nitroskupinou nebo aminoskupinou, acetamidoskupinu, sulfoamidoskupinu nebo pětičlennou nebo šestičlennou heterocyklickou skupinu, obsahující jeden nebo několik heteroatomů ze souboru, zahrnujícího atom dusíku, kyslíku a síry, a jeho farmaceuticky vhodné soli.

Vynález se tedy týká analogů GRF, které mají vyšší účinnost a jiné vlastnosti, které poskytují technické přednosti ve srovnání se shora uvedenými analogy GRF. Sloučeniny podle vynálezu jsou výhodné pro veterinární účely, zvláště pro chov skotu, vepřů, ovcí, drůbeže a ryb.

Nadále se používá následujících zkratek a výrazů:

Ala: aminokyselina alanin, analog: sloučenina, která je strukturálně podobná jiné sloučenině, v souvislosti s peptidy se týká primární, sekundární nebo terciární struktury,

Arg: aminokyselina arginin,

Asn: aminokyselina asparagin,

Asp: aminokyselina kyselina asparagová, pár bází (bp): se týká DNA nebo RNA,

Zkratky A, C, G a T se týkají 5'-monofosfátových forem nukleotidů (deoxy)adenin, (deoxy)cytidin, (deoxy)guanin a (deoxy)thymin, pokud se vyskytují v DNA molekulách. Zkratky U, C, G a T se týkají 5'-monofosfátových forem nukleotidů uráčil, cystidin, guanin a thymin, pokud se vyskytují v RNA molekulách. Ve dvouřetězcové DNA se může pár bází týkat vztahu A s T nebo C s G. V DNA/RNA heteroduplexní pár bází se může týkat partnerského vztahu T s U nebo C s G,

Cys: aminokyselina cystein nebo polovina cysteinového zbytku, kovalentně vázaného prostřednictvím disulfidického můstku na jinou polovinu cysteinového zbytku.

DNA: deoxyribonukleová kyselina,

EDTA: zkratka kyseliny ethylendiamintetraoctové,

Funkční analog: molekula, mající podobné funkční vlastnosti avšak modifikovanou strukturu se zřetelem na přírodně se vyskytující formu takové molekuly nebo sloučeniny. Funkční analog zahrnuje fragmenty (nebo adice) mateřské molekuly, který má podobné funkční vlastnosti a reaktivity jako mateřská molekula.

-3CZ 285567 B6

Gin: aminokyselina glutamin,

Glu: aminokyselina kyselina glutamová,

Gly: aminokyselina glycin,

GRF PEPTID: polypeptid, obsahující 27 až 76 aminokyselinových zbytků, které promotují uvolňování a syntézu růstového hormonu zhypofyzy. GRF PEPTIDY zahrnují přírodní nebo syntetické funkční analogy, jak se uvádí v amerických patentových spisech číslo 4 517181, 4 518586, 4 528190, 4 529595, 4 563352, 4 585756, 4 595676, 4 605643, 4 620976, 4 626523, 4 628043 a 4 689318. Výraz GRF PEPTID zahrnuje také své netoxické soli,

His: aminokyselina histidin,

Hse: aminokyselina homoserin,

Ile: aminokyselina izoleucin,

Leu: aminokyselina leucin,

Lys: aminokyselina lysin,

Met: aminokyselina methionin nebo její deformylovaný analog, mRNA: mediátorová RNA,

MWCO: zkratka odříznuté molekulové hmotnosti (cut-off'),

Om: omithin,

Phe: aminokyselina fenylalanin,

Plazmid: extrachromozomální spontánně replikační genetický element,

PMSF: zkratka fenylmethylsulfonylfluoridu,

Pro: aminokyselina prolin,

Čtecí rámec: nukleotidová sekvence, ze které dochází ke čtení translace v tripletech translační aparaturou tRNA a ribosomů a asociovaných faktorů, přičemž každý triplet odpovídá zvláštní aminokyselině. Jelikož je každý triplet zřetelný a téže délky, musí být kódovací sekvence násobkem tří, včlenění nebo vypuštění páru bází (ukončení posunové mutace) může vést ke dvěma různým bílkovinám, které se zakódovávají stejným DNA segmentem. Aby se tomu předešlo, tripletové kodony, odpovídající žádanému polypeptidu, musí být vázány na násobky tří počátečních kodonů, to znamená, že se musí dodržovat správný čtecí rámec.

Rekombinantní DNA klonovací vektor: jakékoliv autonomní replikační činidlo, zahrnující, avšak bez jakéhokoliv omezení, plazmidy a fágy, obsahující DNA molekulu, na kterou se může adovat nebo na kterou je adován jeden nebo několik DNA segmentů.

Rekombinantní DNA expresní vektor: jakýkoliv rekombinantní DNA klonovací vektor, do kterého je včleněn promotor.

Replikon: DNA sekvence, která řídí a umožňuje autonomní replikaci plazmidu nebo jiného vektoru.

RNA: kyselina ribonukleová.

RP-HPLC: zkratka reverzní fázové vysoce účinné kapalinové chromatografie.

Ser: aminokyselina serin.

Thr: aminokyselina threonin.

Transkripce: proces, kterým se informace, obsažená v nukleotidové sekvenci DNA, přenáší na komplementární RNA sekvenci.

Translace: proces, při kterém se genetická informace mediátorové RNA používá ke specifikaci a přímo k syntéze polypeptidového řetězce.

Tris: zkratka pro tris(hydroxymethyl)aminomethan.

Trp: aminokyselina tryptofan.

Tyr: aminokyselina tyrosin.

Val: aminokyselina valin.

-4CZ 285567 B6

Vektor: replikon, používaný pro transformaci buněk v gelové manipulaci, nesoucí polynukleotidové sekvence, odpovídající vhodnému řízení sekvencí, dodává specifické vlastnosti transformované hostující buňce. Plazmidy, viry a bakteriofágy jsou vhodnými vektory, jelikož jsou replikony v pravém slova smyslu. Umělé vektory jsou konstruovány odřezáváním nebo připojováním DNA molekul z různých zdrojů za použití restrikčních enzymů a ligáz. Používaný výraz vektor zahrnuje rekombinantní DNA klonovací vektory a rekombinantní DNA expresní vektory. Restrikční místo a funkční mapy na připojených výkresech přibližně znázorňují popisované rekombinantní DNA vektory. Informace restrikčního místa není vyčerpávající: proto může být více restrikčních míst daného typu na vektoru, než je na výkresech znázorněno.

Na obr. 1 je restrikční místo a funkční mapa plazmidu pHS190. Na obr. 2 je restrikční místo a funkční mapa plazmidu pHS500. Na obr. 3 je restrikční místo a funkční mapa plazmidu pHS452.

Na obr. 4 je graf, ukazující zvýšení hladiny růstového faktoru u kastrovaného kance při podání p-methylhippuroyl pGRF(2-76)OH.

Na obr. 5 je graf, ukazující vliv na exkreci koncentrace močovinového dusíku v moči v případě kastrovaného kance jako odezvy na podání p-methylhippuroyl pGRF(2-76)OH.

Vynález se tedy týká syntetických GRF peptidových analogů (GRF PEPTIDU) shora uvedeného vzorce I, kde jednotlivé symboly a zkratky mají shora uvedený význam, a jejich farmaceuticky vhodných netoxických solí.

V obecném vzorci I znamená výraz nižší alkylová skupina vždy alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, jako je například skupina methylová, ethylová, n-propylová, izo-propylová, nbutylová, sek.-butylová, izobutylová a terc.-butylová skupina. Výrazem nižší alkoxyskupina se zde vždy míní skupiny, jako je příkladně methoxyskupina, ethoxyskupina, n-propoxyskupina, terc.-butoxyskupina. Výrazem atom halogenu se zde vždy míní atom fluoru, chloru, bromu a jodu. Výrazem substituovaná fenylová skupina se zde vždy míní fenylová skupina, substituovaná jednou nebo dvěma stejnými nebo odlišnými skupinami, volenými ze souboru, zahrnujícího atom halogenu, nižší alkylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, hydroxyskupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, acetamidoskupinu nebo sulfonamidoskupinu. Jakožto příklady takových skupin se uvádějí skupina 4-chlorfenylová, 3-jodřenylová, 2-fluorfenylová, 4-methylfenylová, 3-chlor-4-methylfenylová, 3-bromfenylová, 4-ethylfenylová, 3-ethoxyfenylová, 2methoxyfenylová, 4-izopropoxyfenylová, 4-hydroxyfenylová, 3,4-dihydroxyfenylová, 2,4-dihydroxyfenylová, 4-nitrofenylová, 3-aminofenylová, 3-chlor-4-hydroxyfenylová, 2-acetamidofenylová, 4-sulfonamidofenylová, 3,4-dimethoxyfenylová a 2-fluor-4-aminofenylová skupina. Pětičlennou nebo šestičlennou heterocyklickou skupinou se zde vždy míní skupina, obsahující jeden nebo několik atomů ze souboru, zahrnujícího atom dusíku, kyslíku nebo síry. Jakožto příklady pětičlenné heterocyklické skupiny se uvádějí skupina pyrrolová, thiofenová, furanová, imidazolová, oxazolová, oxadiazolová, thiazolová, 1,3,4-thiodiazolová, asoxazolová skupina, a jakožto příklady šestičlenné heterocyklické skupiny se uvádějí skupina pyridinová, pyrimidinová, pyranová, dihydropyranová, thiazinová, thiapyramová a triazinová skupina. Takové pětičlenné nebo šestičlenné heterocyklické skupiny mohou mít také substituenty ze souboru, zahrnujícího nižší alkylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, hydroxyskupinu, aminoskupinu a atom halogenu.

Jakožto příklady acylových skupin symbolu XI ve vzorci I se uvádějí skupina p-chlorhippuroylová, p-methylhippuroylová, p-nitrohippuroylová, hippuroylová, p-hydroxyhippuroylová, 3-benzoylpropionylová, n-fthaloylglycylová, N-fenylmalonamidoylová, p-methyl-Nfenylmalonamidoylová a p-fluorhippuroylová skupina.

Jak shora uvedeno, výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou deriváty a modifikace živočišných GRF peptidů.

-5CZ 285567 B6

Označení A20, A21 atd. v souvislosti s aminokyselinovými zbytky sloučeniny vzorce I odpovídají číslu zvláštní aminokyseliny, když se čísluje po sobě od koncové aminokyseliny bílkoviny, jak se vyskytují v přírodě a jak jsou popsány v literatuře. Takové číslování aminokyselinových zbytků, jakož také charakterizace bílkovin, jsou pracovníkům v oboru známy. Označení například des-Tyrl-GRF je v oboru dokonale srozumitelné, přičemž se míní přírodní GRF molekula, prostá koncového aminotyrosinového zbytku. Přečíslování zbylých aminokyselinových zbytků bílkoviny není nutné a může vést ke zmatku. Podle shora uvedeného příkladu aminokyselinou, zaujímající druhou polohu v přírodně se vyskytující bílkovině, bude koncový aminozbytek, přičemž si například udržuje označení Ala2. Označení podle dobře známého přijatého označování aminokyselin různých typů GRF bude dále uvedeno.

Výhodný peptid podle vynálezu zahrnuje modifikaci vepřového GRF (pGRF) vzorce I, kde: A9 = Asn, A12 = Arg, A15 = Thr, A21 = Arg, A22 = Leu, A25 = Asp, A27 = Leu a A28 = Ser.

Další výhodný peptid podle vynálezu zahrnuje modifikaci hovězího GRF (bGRF) vzorce I, kde: A9 = Asn, A12 = Arg, AI5 = Thr, A21 = Arg, A22 Leu, A25 = Asp, A27 Leu a A28 = Asn.

Další výhodný peptid podle vynálezu zahrnuje modifikaci lidského GRF (hGRF) vzorce I, kde: A9 = Ser, A12 = Lys, A15 = Gly, A21 = Lys, A22 = Leu, A25 = Asp, A27 = Met a A28 = Ser.

Výhodnými peptidy podle vynálezu jsou sloučeniny vzorce I, kde znamená Y 30—43 aminokyselinovou sekvenci zralého GRF PEPTIDŮ. Výhodnými podle vynálezu jsou sloučeniny vzorce I, kde Y znamená 30—43 aminokyselinovou sekvenci přírodně se vyskytující 30-43 aminokyselinové sekvence určitých druhů GRF, přicházejících v úvahu, například pGRF, bGRF, hGRF. Obzvláště výhodně znamená Y aminokyselinovou sekvenci:

Gln-Gln-Gly-Glu-A34-A35-Gln-Glu-A38-A39-A40-Arg-A42-Arg-Leu, kde znamená

A34 Asp nebo Ser,

A38 Arg nebo Gin,

A39 Gly nebo Arg,

A40 Ala nebo Ser,

A42 Ala, Val nebo Phe.

Dále obzvláště výhodně znamená Y aminokyselinovou sekvenci:

Glu Gin Gly Glu Ser Asn Gin Glu Arg

Gly Ala Arg Ala Arg Leu.

Dále obzvláště výhodně znamená Y aminokyselinovou sekvenci:

Gin Gin Gly Glu Arg Asn Gin Glu Gin

Gly Ala Arg Val Arg Leu, pokud je zvláštní, v úvahu přicházející GRF formou vepřový GRF.

Dále obzvláště výhodně znamená Y aminokyselinovou sekvenci:

Glu Gin Gly Glu Ser Asn Gin Glu Arg Gly

Ala Arg Ala Arg Leu, pokud je zvláštní, v úvahu přicházející formou GRF lidský GRF.

Výhodnými jsou peptidy podle vynálezu vzorce I, kde znamená Z 44-76 aminokyselinovou sekvenci GRF prekurzorových PEPTIDŮ. Obzvláště výhodná je 44-76 aminokyselinová sekvence přírodně se vyskytující 44-76 aminokyselinové sekvence GRF zvláštního výzkumu.

-6CZ 285567 B6

Nejvýhodněji peptidový podíl Z zahrnuje přírodně se vyskytující 44-76 aminokyselinovou GRF sekvenci zvláštního druhu, jejíž lysinové zbytky jsou nahrazeny argininovými zbytky a methioninové zbytky jsou nahrazeny leucinovými zbytky. Například nejvýhodnější aminokyselinová sekvence GRF PEPTIDU přichází v úvahu tehdy, jestliže Z zahrnuje aminokyselinovou sekvenci

Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu—Ser-IleLeu-Ala—Trh-Leu—Leu-Gln-Glu—His-Arg-Asn—Ser—Gin—Gly, která je modifikací vepřového GRF a je výhodné, když v úvahu přicházející GRF druhy jsou vepřové.

Nejvýhodnější aminokyselinové sekvence GRF PEPTIDU se dosahuje, jestliže Z zahrnuje aminokyselinovou sekvenci:

Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-ThrLeu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly, která je takovou modifikací hovězího GRF a je výhodné, když v úvahu přicházející druhy GRF jsou hovězí.

Dále nejvýhodněji Z sekvence ve vzorce I je nulová, což je výhodné, jestliže GRF druhy, přicházející v úvahu, jsou lidské.

Výhodnými jsou sloučeniny podle vynálezu vzorce I, kde A a/nebo Z peptidy mají dostatečnou délku, takže se dosahuje vysoké exprese E. Coli.

Výhodnými jsou dále sloučeniny podle vynálezu vzorce I, kterými jsou GRF PEPTIDY, jejichž žádná, jedna nebo více než jedna aminokyselina, mající volnou aminoskupinu, je modifikována. Výrazem chemicky modifikována se zde vždy míní derivatizace volné aminoskupiny aminokyselin alkylovou nebo hydroxyalkylovou skupinou. Míra modifikace se řídí délkou doby reakce nebo množstvím reakčního činidla. Je výhodné, aby všechny aminokyseliny měly volnou aminoskupinu chemicky modifikovanou. Obzvláště je výhodný GRF PEPTID, který má pouze jednu aminoskupinu, která se může chemicky modifikovat. Taková sloučenina je prosta lysinových a methioninových zbytků. Sloučeniny, obsahující lysin a/nebo methionin, se převádějí na sloučeniny s volnou aminoskupinou pouze na N-terminu náhradou lysinu argininy a methioninů leuciny.

Konstrukce GRF sloučenin podle vynálezu vzorce I vychází nejdříve ze syntetizování GRF PEPTIDU, majícího volnou aminoskupinu na N-terminu, a pak acylací N-terminu žádanou XI kyselinou nebo jejím aktivním derivátem. GRF PEPTIDY se mohou také připravovat způsobem s pevnou fází nebo rekombinantními způsoby. Oba způsoby jsou popsány v americkém patentovém spise číslo 4 617149. Rekombinantní způsoby jsou vhodné v případech, kdy jsou žádoucí vysoké výtěžky.

Principy chemické přípravy polypeptidů s pevnou fází jsou v oboru dobře známy a popsal je například Dugas H. a Penney C., Bioorganic Chemistry, 1981, Springer Verlag, New York, str. 54 až 92. Popis způsobu a metodologie syntézy v pevné fázi GRF analogů je také v evropské přihlášce vynálezu číslo 85302975.9, publikované pod číslem 0 161852 21. listopadu 1985.

Podle výhodného provedení vynálezu se GRF PEPTID syntetizuje rekombinantní DNA technologií. V oboru je dobře známo konstruovat totálně syntetickou nebo polosyntetickou DNA sekvenci, zakódující danou aminokyselinovou sekvenci (Brown a kol., Methods in Enzymology 68, str. 109, 1979). K dosažení translace žádaného polypeptidů se vnáší konstruovaná syntetická DNA sekvence do jakéhokoliv nadbytečného množství rekombinantních DNA expresních vektorů použitím vhodných restrikčních endonukleáz. Použití určitých endonukleáz je dáno restrikčním endonukleázovým vzorcem štěpení používaného mateřského expresního vektoru. GRF PEPTID zakódující sekvenci, se musí umístit tak, aby byl ve vhodném čtecím rámci s promotorem a s ribosomovým vazným místem expresního vektoru, kteréžto oba jsou funkční

-7CZ 285567 B6 v hostující buňce, ve které má dojít k expresi GRF PEPTIDU. V oboru jsou dále dobře známy zvláštní kodony, kterých se může používat k dosažení vysoké míry exprese v určitém rekombinantním prostředí (W. Fiers a kol., 1976, Nátuře 260, str. 500 a americký patentový spis číslo 4 356270).

Výhodným vektorem pro expresi je E. coli hostující buňka, odvozená od E. coli plazmidu pHS190, která zahrnuje TcR gen, lambda cl857 repressor a lambda pL promotor. Restrikční místo a funkční mapa pHS190 je na obr. 1. Plazmid pHS190 je uložen organizací Northem Regional Research Laboratories pod číslem NRRL B-l 8410 (datum uložení: 9. září 1988).

Syntéza genových sekvencí podle vynálezu zakódovává vepřový, hovězí a lidské GRF analogy struktury Mefi-Alar-pGRFO^ójOH, Met!-Ala₂-bGRF(3-76)OH a Meti-Ala₂-hGRF(376)OH. GRF analogy, použitelné v nejrůznějších jiných druzích, jako například koňském, kachním, krysím, morčat, činčil a kuřat se mohou získat se syntetickými geny, zakódujícími odpovídající GRF PEPTID ze známých aminokyselinových sekvencí v takových molekulách a jejich modifikací analogickým způsobem k hovězímu a vepřovému GRF PEPTIDU, jak se zde příkladně uvádí.

Působením methionylové aminopeptidázy (MAP), bílkoviny vlastní E. coli, se odstraní Nkoncový methionin ze shora uvedených sloučenin za získání žádaných peptidů pGRF(2-76)OH, bGRF(2-76)OH a hGRF(2-76)OH. Tyto (2-76)OH GRF PEPTIDY se pak převádějí na sloučeniny podle vynálezu (vzorec I) acylací aminokoncové aminoskupiny kyselinou XI nebo jejím aktivovaným derivátem. V oboru molekulární biologie je však možná exprese peptidů jakožto fúzovaných bílkovin. V takových případech, kdy se má GRF PEPTID produkovat jakožto fúzovaná bílkovina a GRF PEPTID se pak odštěpuje od konstruktu, musí se konstruovat zakódování sekvence tak, aby docházelo k proteázovému (například karboxypeptidázovému) nebo chemickému (například bromkyanovému) štěpení mezi GRF PEPTIDEM a heterologovým peptidem ve výsledném fúzovaném konstruktu. Technika produkce fúzovaných bílkovin způsoby pro dosahování štěpení exogenního heterologového peptidů od fúzovaného bílkovinového konstruktu je v oboru známa (viz například americký patentový spis číslo 4 366246 a 4 425437). Při stanovování vhodného proteolytického enzymu je výhodné, aby aminokyselinová kostra fúzované bílkoviny neměla žádná přídavná štěpná místa v žádaném polypeptidu (to je GRF PEPTIDU) s výjimkou styčné plochy mezi žádaným peptidem a exogenním peptidem. Tím se předchází možné degradaci žádaného GRF peptidů. Specifita aminokyselinové sekvence nej různějších enzymatických a chemických činidel jev oboru dobře známa (viz například Proteolytic Enzymes: A Practical Approach - Proteolytické enzymy: praktický přístup Benyon R. J. a Bond J. S., vyd. 1989 Oxford University Press, Oxford, Anglie, UK).

Při výhodném provádění vynálezu, jak příkladně doloženo, se žádaná syntetická DNA sekvence, zakódující příslušný GRF PEPTID, konstruuje tak, aby měla místo Xbal na konci 5' kódující větve a místo BamEfi na konci 3' kódující větve. Ke generaci vektoru DNA, se eliminuje místo EcoRI pHS190. Vektor pHS190 se digeruje sEcoRI, vystupující konce se zaplní a plazmid se religuje. Následující digesce s BamHI a Xbal poskytuje vektor DNA. Syntetická GRF PEPTID zakódující sekvence se pak vnese do vektoru DNA a vektor se religuje.

Transformace ligovaného expresního vektoru do bakteriální (např. E. coli) nebo savčí hostující buňky umožňuje pro určitý používaný expresní vektor vznik rekombinantní buňky, schopné exprese GRF PEPTIDU, vhodné pro použití podle vynálezu. Vhodné expresní vektory pro bakteriální a savčí expresní prostředí se mohou nalézt v příručkách pro tento obor (například Current Protocols in Molecular Biology - Současné protokoly v molekulární biologii, 1989 a doplňky, Ausubel a kol., vyd. John Wiley and Sons, NY).

Podle výhodného provedení vynálezu, příkladně doloženého, se plazmid pHS 452 připravuje, jak shora popsáno, včleňováním kódující sekvence pro Meti-Alar-pGRF(3-76)OH GRF

-8CZ 285567 B6

PEPTID. DNA sekvence zakódující Meti-Ala-pGRF(3-76)OH GRF PEPTID a odpovídající aminokyselinová sekvence odpovídají:

	ATG Met	GCT GAT	GCT Ala	ATT TTT ile Phe	ACT AAT Thr Asn
Ala	Asp
AAT	TAT	CGA	CGC	GTT	CTG	ACT	CAG	CTG	TCT
Asn	Tyr	Arg	Arg	Val	Leu	Thr	Gin	Leu	Ser
GCT	CGT	CGT	CTG	CTG	CAG	GAT	ATT	CTG	TCT
Ala	Arg	Arg	Leu	Leu	Gin	Asp	Ile	Leu	Ser
CGT	CAG	CAG	GGT	GAA	CGT	AAC	CAG	GAA	CAA
Arg	Gin	Gin	Gly	Glu	Arg	Asn	Gin	Glu	Gin
GGA	GCC	CGT	GTT	CGT	CTT	GGT	CGT	CAG	GTT
Gly	Ala	Arg	val	Arg	Leu	Gly	Arg	Gin	Val
GAT	TCT	CTG	TGG	GCT	GAT	CAA	CGT	CAG	CTT
Asp	Ser	Leu	Trp	Ala	Asp	Gin	Arg	Gin	Leu
GCT	CTC	GAG	TCT	ATC	CTG	GCT	ACT	CTG	CTG
Ala	Leu	Glu	Ser	Ile	Leu	Ala	Thr	Leu	Leu
CAG	GAA	CAT	CGT	AAT	TCT	CAG	GGT	TAA	TAG
Gin	Glu	HÍS	Arg	Asn	Ser	Gin	Gly	StopStop

Jestliže se včlení DNA sekvence, zakódovává Met]-Ala2-bGRF(3-76)OH GRF PEPTID a vzniklý plazmid se označuje jako pHS500. Zakódující DNA sekvence a aminokyselinová sekvence, odpovídající Met[-Ala2-bGRF(3-76)OH GRF PEPTIDU, odpovídá:

ATG	GCT	GAT	GCT	ATT	TTT	ACT	AAT	TCT	TAT
Met	Ala	Asp	Ala	Ile	Phe	Thr	Asn	Ser	Tyr
CGT	CGT	GTC	CTT	ACT	CAG	CTG	TCT	GCG	CGC
Arg	Arg	Val	Leu	Thr	Gin	Leu	Ser	Ala	Arg
CGT	CTG	CTG	CAG	GAT	ATC	CTG	AAT	CGT	CAG
Arg	Leu	Leu	Gin	Asp	ile	Leu	Asn	Arg	Gin
CAA	GGT	GAA	CGT	AAT	CAG	GAA	CAA	GGT	GCT
Gin	Gly	Glu	Arg	Asn	Gin	Glu	Gin	Gly	Ala
CGT	GTA	CGT	CTG	GGT	CGC	CAA	GTT	GAT	GGT
Arg	Val	Arg	Leu	Gly	Arg	Gin	val	Asp	Gly
GGT	TGG	ACT	GAT	CAA	CAG	CAG	CTT	GCT	CTC
Val	Trp	Thr	Asp	Gin	Gin	Gin	Leu	Ala	Leu
GAG	TCT	ACA	CTA	GTT	TCT	CTG	CTG	CAG	GAA
Glu	Ser	Thr	Leu	Val	Ser	Leu	Leu	Gin	Glu
CTG	CGG	AAT	TCT	CAA	GGT	TAA	TAG
Arg	Arg	Asn	Ser	Gin	Gly	StopStop

-9CZ 285567 B6

Může se včlenit DNA sekvence, která zakódovává Meti—Ala2-hGRF(3—44)OH GRF PEPTID. Zakódovávající sekvence DNA a aminokyselinová sekvence, odpovídající Met]-Ala₂-hGRF (3-44)OH GRF PEPTIDU, je

ATG	GCT	GAC	GCT	ATC	TTC	ACT	AAC	TCT	TAC	CGT
Met	Ala	Asp	Ala	Ile	Phe	Thr	Asn	Ser	Tyr	Arg
AAA	GTT	CTG	GGT	CAG	CTG	TCT	GCT	CGT	AAA	CTG
Lys	Val	Leu	Gly	Gin	Leu	Ser	Ala	Arg	Lys	Leu
CAG	GAC	ATC	ATG	TCT	CGT	GAG	CAG	GGT	GAA	TCT
Gin’	Asp	Ile	Met	Ser	Arg	Glu	Gin	Gly	Glu	Ser
AAC	CAG	GAA	CGT	GGT	GCT	CGT	GCT	CGT	CTG	TAA
Asn	Gin	Glu	Arg	Gly	Ala	Arg	Ala	Arg	Leu	Stop

Cravador A. a kol., 1985, Biochimie 67, str. 829 až 834.

Při výhodném provedení vynálezu, jak příklady doloženo, kde expresní vektor používá pHS 190 skeletu, roste hostující buňka při teplotě 32 °C, pokud je žádoucí exprese polypeptidové sloučeniny. Represor cI857 se stane inaktivním po posunutí teploty růstu na přibližně 42 °C a po derepresi promotoru pL. Velké množství polypeptidu s aktivitou GRF se pak produkuje v množství až do přibližně 15 % celkové buněčné bílkoviny. Aktivní polypeptid se může čistit způsoby, dobře známými pracovníkům v oboru, a jak bude ukázáno v příkladové části. Jak shora uvedeno, působení MAP odstraňuje N—koncový methioninový zbytek za vzniku GRF(2-76)OH GRF peptidu. Avšak po čištění bílkoviny se může odstranit jakýkoliv zbylý N-koncový zbytek o sobě známými enzymatickými způsoby, například působením vhodné aminopeptidázy nebo chemickým způsobem, například bromkyanem.

Sloučeniny podle vynálezu vzorce I se připravují N-acylací aminoterminu (2-76)OH GRF PEPTIDU aktivním esterem XI žádané karboxylové kyseliny. Acylace aminokoncového dusíku (2-76)OH GRF PEPTIDU se s výhodou provádí sukcinimidylestery XI kyseliny. Nukleofilní atakování aminokoncovým dusíkem (2-76)OH GRF PEPTIDU na karbonylovém uhlíku esterové vazby sekcinimidylesteru vede kacylaci. Uvedené reakční schéma objasňuje acylaci, vedoucí k syntéze hippuroyl-GRF(2-76)OH.

Při acylaci se mohou požívat také jiné estery XI karboxylové kyseliny. Například se mohou používat aktivní estery, vytvářené s chlorformáty, jako jsou například ethylchlorformát a izobutylchlorformát, nebo s H-hydroxyheterocykly, jako je například HoBT (hydroxybenzotriazol). Může se také používat jiných aktivních derivátů, běžně používaných pro acylaci aminokyselin nebo pro kopulaci aminokyselin. Tato činidla mohou zahrnovat symetrické nebo N-karboxy anhydridy.

Acylace se provádí ve vodném prostředí při hodnotě pH 7,5 až 9,5 a při teplotě 15 až 35 °C. Nebo se může použít aprotického rozpouštědla, jako například dimethylsulfoxidu.

Jakožto příklady XI kyselin, používaných pro přípravu GRF sloučenin vzorce I acylaci (2-29, 44 nebo 76)GRF PEPTIDU se uvádějí kyselina hippurová, p-methylhippurová, p-chlorhippurová, p-nitrohippurová, p-hydroxyhippurová, feny lam inokarboxylová, 4-hydroxyfenylvinná, pfluorhippurová kyselina, amid kyseliny N-fenylmalonové, amin kyseliny p-methyl-Nfenylmalonové, N-(2-thienyl)glycin, N-(2-furoyl)glycin, kyselina N-(2-furoyl)-b-aminopropionová, kyselina N-(3-thienoyl)-a-aminopropionová, N-(3-pyridinoyl)glycin, N-(4- 10CZ 285567 B6 pyridinyl)malonamidkyselina, N-( 1,3-thiazinyl)malonamidkyselina, N-( 1,3-thiazinyl)sukcinamid, N-fenylglutaramidkyselina, N-/(2-methoxyethyl)aminosulfonyl/glycin a sulfinyl, N-/(2ethylthioethyl)aminosulfonyl/glycin a sulfinyl a N-(2-hydroxyethyl)malonamid kyseliny.

Benzoyl glycin

O O /=\ II II ^_ý~C -N -CH₂ -C —OH H

N-hydroxy sukcinimid

DCC/DMF

Sukcinimidyl-N;, benzoyl glycinat

GRF(2-76)OH GRF PEPTID

ŇH₂

I H— C —CH₃

o.A

I (3-76)-OH GRF PEPTID i-------p ’’ __ ° °

-N -CH₂ -c -N —C H - GRF(2-76)OH Η H CHg hippuroyl GRF(2-76)OH

Pracovníkům v oboru je jasné, že se sloučeniny podle vynálezu mohou také připravovat, začínaje například od (3-29, 44 nebo 76)GRF PEPTIDU nebo od GRF(4-29, 44 nebo 76)GRF PEPTIDU, volného nebo vázaného na nosiči s podobným N-koncovým blokovaným peptidem nebo derivátem substituované karboxylové kyseliny.

Vynález zahrnuje také farmaceuticky vhodné netoxické soli acylovaných GRF PEPTIDŮ. Výrazem farmaceuticky vhodné netoxické soli se vždy míní organické nebo anorganické adiční soli. Příkladně se uvádějí soli, připravené z kyselin, jako jsou kyselina chlorovodíková, fluorovodíková, sírová, sulfonová, vinná, fumarová, bromovodíková, glykolová, citrónová, maleinová, fosforečná, jantarová, octová, dusičná, benzoová, askorbová, p-toluensulfonová, benzensulfonová, naftalensulfonová a propionová kyselina. Výhodnými jsou adiční soli s kyselinou, které se připravují za použití kyseliny chlorovodíkové, octové nebo jantarové. Všechny shora uvedené soli se připravují o sobě známými způsoby. Pojem soli karboxylových kyselin zahrnuje také například amin, amoniové, kvartemí amoniové soli, soli alkalických kovů a kovů

-11 CZ 285567 B6 alkalických zemin, například soli vápenaté, hořečnaté, sodné, draselné a lithné, vytvářené s kteroukoliv obsaženou karboxylovou skupinou.

Následující tabulky I, II a III objasňují zvýšenou účinnost sloučenin vzorce I podle vynálezu:

Tabulka I dokládá zvýšeno účinnost uvolňování růstového hormonu bGRF (1-77)OH substitucemi pro Tyr 1+

Tabulka II dokládá zvýšenou účinnost uvolňování růstového hormonu bGRF (1-77)OH ío substitucemi pro Tyr +

Tabulka III dokládá in vitro potenci p-methylhippuroyl-1 pGRF analogů různé délky +

Vysvětlení poznámek v tabulkách + růstový hormon, uvolněný do prostředí z krysích primárních buněk hypofýzy, měřen po vystavení 7 dávkám sekretagogu po 3 hodiny ++ EC₅o je vypočítaná střední účinná dávka

Tabulka 1

Peptid EC_S0 (nM)**

bGRF (1-77) OH	0,59
Hippuroyl-l-bGRF(2-77)OH	0,86
p-Hydroxy Hippuroyl bGRF (2—77)OH	0,33
p-Chloro Hippuroyl bGRF (2-77)OH	0,19
p-Fluoro Hippuroyl bGRF (2-77)OH	0,14
p-Nitro Hippuroyl bGRF (2-77)OH	0,51
p-Methyl Hippuroyl bGRF (2-77)OH	0,05
n-Fenylmalonamindoyl bGRF (2-77)OH	0,19

Tabulka II

Peptid	EC₅₀ (nM) **
des Tyr—1 pGRF (2-76)OH Hippuroyl-1 pGRF (2-76)OH p-Methyl Hippuroyl pGRF (2-76)OH p-Methyl fenylmalonamindoyl pGRF (2-76) OH	95,0 0,28 0,06 0,06

Tabulka III

Peptid___________________________________________________ECso (nM)** p-Methyl Hippuroyl pGRF (2-29)NH2 0,02 p-Methyl Hippuroyl pGRF (2-44)OH 0,07 p-Methyl Hippuroyl pGRF (2-76)OH 0,06

Vynález se rovněž týká farmaceutických prostředků, které obsahují jakožto účinnou látku polypeptidovou sloučeninu vzorce I nebo její farmaceuticky vhodnou netoxickou sůl a 35 farmaceuticky vhodný pevný nebo kapalný nosič.

- 12CZ 285567 B6

Pro podávání polypeptidových sloučenin podle vynálezu parenterálně jsou vhodnými farmaceutickými formami pro vstřikování sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro zpracování na sterilní vstřikovatelné roztoky nebo disperze. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní prostředí, jako jsou například voda, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol, a kapalný polyethylenglykol), jejich vhodné vzájemné směsi a rostlinné oleje. Vhodná tekutost se může udržovat například použitím povlaku, jako lecithinu, udržováním požadované velikosti částic v případě disperze a použitím povrchově aktivních činidel. Prevence působení mikroorganismů se může zajistit použitím různých antibakteriálních a protihoubových činidel, jako jsou například parabeny, chlorbutanol, fenol a kyselina sorbová. V mnoha případech je žádoucí včleňovat izotonická činidla, jako jsou například cukry a chlorid sodný. Prodloužené absorpce vstřikovatelných forem se může dosáhnout použitím činidel prodlužujících absorpci, jako jsou například monostearát hlinitý a želatina.

Sterilní vstřikovatelné roztoky se mohou připravovat včleňováním sloučenin podle vynálezu v požadovaném množství do vhodného rozpouštědla popřípadě s jinými složkami. Popřípadě a pro účinnější rozdělení se sloučeniny mohou vnášet do systémů, zpomalujících uvolňování, nebo do štítových uvolňovacích systémů, jako jsou polymemí matrice, liposomy a mikrokuličky. Sloučeniny se mohou uvolňovat z mechanických dávkovačích zařízení, zosmotických pump nebo z jiného zařízení nebo ze systémů, které zajišťují nepřetržité dávkování nebo pulzační dávkování.

Pro intravenózní podávání (IV) se ve vodě rozpustná forma sloučeniny podle vynálezu může rozpouštět v některé kapalině, běžně používané pro intravenózní účely a může se podávat ve formě infuze. Takovými kapalinami jsou například fyziologický roztok, Ringerův roztok nebo 5% roztok glukózy. Může se připravovat vhodná nerozpustná forma sloučeniny podle vynálezu a může se podávat jakožto vodná báze nebo farmaceuticky vhodná olejová báze, například ester mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, jako ethyloleát.

Jednotkovou dávkovači formou sloučeniny podle vynálezu může být roztok sloučeniny, s výhodou ve formě její soli, ve vhodném ředidle ve sterilní, hermeticky uzavřené ampuli. Koncentrace sloučeniny se může měnit, například od 1 do 50 %, v závislosti na příslušné formě sloučeniny, na její rozpustnosti a na žádané podávané dávce.

Vynález se také týká způsobu navozování uvolňování růstového hormonu, při kterém se podává účinné množství polypeptidové sloučeniny vzorce 1 nebo její farmaceuticky vhodné netoxické soli spolu s farmaceuticky vhodným pevným nebo kapalným nosičem.

Sloučenina podle vynálezu se podává ošetřovanému jedinci po dobu, po kterou je žádoucí stimulace uvolňování růstového hormonu. Hmotnost ošetřovaného jedince a způsob podávání mají vliv na velikost dávky, nutnou pro navození žádané odezvy. Výhodnou dávkou v případě ovcí je 0,01 až 3,0 mg/kg/den, nejvýhodnější je dávka 0,5 mg/kg/den. Výhodnou dávkou v případě vepřů je přibližně 3 až 10 pg/kg/den, nejvýhodnější je dávka 3 pg/kg/den. Pro kachny je výhodnou dávka přibližně 0,5 až 12 mg/kg/den, nej výhodnější je dávka 3 mg/kg/den. Výhodná dávka u lidí je přibližně 0,03 až 1,0 mg/kg/den, nejvýhodnější je dávka 0,3 mg/kg/den.

Je obzvláště výhodné formulovat sloučeniny podle vynálezu vzorce I na jednotkovou dávkovači formu pro snadné podávání a rovnoměrnost dávky. Jednotkovou dávkovači formou se zde míní fyzikálně oddělené jednotky, vhodné pro jednotné dávkování ošetřovanému jedinci. Každá dávkovači jednotka obsahuje předem stanovené množství sloučeniny podle vynálezu, vypočtené pro dosažení žádaného terapeutického účinku, spolu s farmaceuticky vhodným nosičem. Specifická jednotková dávkovači forma se řídí v přímé závislosti na /a/ charakteristikách jednotky daného složení a /b/ na žádaném dosahovaném terapeutickém působení.

-13 CZ 285567 B6

GRF a zvláště GRF sloučeniny podle vynálezu při vhodném podávání ve formě terapeutického prostředku, vedou ke zvýšení produkce růstového hormonu v případě savců. Proto se podáváním sloučenin podle vynálezu může podobně dosahovat léčebných a zemědělsky vhodných výsledků. Jakožto příklady chorobných stavů, vhodných pro ošetřování podáváním růstového hormonu, se uvádějí dwarfismus a osteoporóza. Jakožto jiná příznivá působení růstového hormonu se uvádějí zvyšování libového masa, urychlení léčení ran a boj proti vlivu stárnutí, kterých se může dosáhnout podáváním sloučenin podle vynálezu.

Polypeptidové sloučeniny podle vynálezu se mohou testovat nej různějšími způsoby. Jedna zkouška in vivo se provádí za použití krys, anestetizovaných pentobarbitalem (Wehrenberg a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 109, str. 382, 1982). Uvolňování růstového hormonu se měří in vitro za použití buněk krysí hypofyzy (Heimen a kol., Edocrinol., 116, str. 410, 1985).

Následující příklady praktického provedení vynález objasňují, nijak jej však neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava s pevnou fází bGRF(2-77)OH

GRF peptidy se syntetizují metodikou pevné fáze za použití peptidového syntetizéru Applied biosystems 430A (obchodně dostupné zařízení společnosti Applied Biosystems, Foster City Kalifornie) a syntézních cyklů, dodávaných společností Applied Biosystems. Boc aminokyseliny a jiné reagencie jsou dostupné u společnosti Applie Biosystems a u jiných dodavatelů. Sekvenční Boc chemie, používající dvojích kopulačních protokolů, se používá pro výchozí p-methylbenzhydrylové aminopryskyřice pro produkci C-koncových karboxamidů. Pro produkci Ckoncových kyselin se používá odpovídající PAM pryskyřice. Asparagin, glutamin, arginin, /a(p-hydroxyfenyl)octové kyseliny/, /p-(p-hydroxyfenyl)propionové kyseliny/, p-hydroxypropionové kyseliny, p—hydroxyskořicové kyseliny a p—hydroxyfenoxyoctové kyseliny se kopulují za použití předem připravených hydroxybenzotriazolových esterů. Všechny N-koncové adice se provádějí za použití HOBT aktivovaných aminokyselin v syntéze s pevnou fází.

Používá se následující chráněné vedlejší řetězce:

Arg, tosyl

Asp, cyklohexyl Glu, cyklohexyl Ser, benzyl

Thr, benzyl

Tyr, 4-bromkarbobenzoxy

Odstraňování Boc chránící skupiny se provádí kyselinou trifluoroctovou (TFA) v methylenchloridu. Po ukončení syntézy peptidů se odstraňují chránící skupiny a produkt se odštěpí od pryskyřice bezvodým fluorovodíkem, obsahujícím 10 % meta-kresolu. Odštěpení skupiny nebo skupin, chránících vedlejší řetězec, a peptidu od pryskyřice se provádí při teplotě 0 °C nebo při nižší teplotě, s výhodou při teplotě -20 °C. Po odstranění fluorovodíku se systém peptid/ pryskyřice promyje etherem a peptid se extrahuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se. Čištění se provádí size-exclusion chromatografií na sloupci Sephadexu G-10 (Pharmacia) v 10% kyselině octové.

-14CZ 285567 B6

Příklad 2

Rekombinantní příprava GRF PEPTIDU

2.A. Rekombinantní exprese GRF(2-76)OH

2.A.I. Syntéza plazmidu pHS452

Zakódování Met]-pGRF(2-76)OH

Plazmid pHS452 je rekombinantní DNA expresní vektor, který produkuje velké množství výhodné pGRF(2-76)OH polypeptidové sloučeniny podle vynálezu při kultivaci hostujících buněk za vhodných podmínek.

Lyofil E. coli K12 RV308/pHS190 je dostupný v organizaci Northem Regional Research Laboratories (NRRL) Peoria, IL 61604, je uložený pod číslem NRRL B-18410 (datum uložení: 9. září 1988) a používá se ho přímo jakožto kultury při dále popsaném způsobu. Restrikční místo a funkce map plazmidu pHS190 jsou na obr. 1. 10 ml TY živné půdy (10 g tryptofanu, 5 g chloridu sodného a 5 g kvasnicového extraktu na litr), obsahující 5 mg/ml tetracyklinu, se naočkuje kulturou E. coli K12 RV308/pHS190 a inkubuje se za provzdušňování při teplotě 30 °C přes noc (po dobu 15 až 18 hodin). Získané kultury se použije jakožto zdroje plazmidu pHS190.

Naočkovává se 1 litr TY živné půdy, obsahující 5 mg/ml tetracyklinu, kulturou E. coli K12 RV308/pHS190 se inkubuje se za provzdušňování při teplotě 32 °C přes noc /15 až 18 hodin/. Kultura se pak odstřeďuje při otáčkách 5200/min v jednotce Sorvall /DUPont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CT 06470) GSA rotor po dobu 10 minut při teplotě 4 °C za získání pelet buněk. Vzniklý supematant se vyhodí. Pelety buněk se resuspendují ve 28 ml roztoku 25% sacharózy a 50 mM ethylendiamintetraoctové kyseliny. Do buněčné suspenze se přidá přibližně 1 ml roztoku 20 mg/ml lysozynu v 0,25 M Tris-HCl /tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid/, hodnota pH 8,0, a přibližně 1,5 ml 0,5 M kyseliny ethylendiamintetraoctové, hodnota pH 8,0 a promísí se. Získaná směs se inkubuje na ledu po dobu 15 minut. Přidají se 3 ml roztoku (připraveného smíšením 3 ml 10% Tritonu X-100 společnosti Rohm & Haas, 75 ml 0,25 M kyseliny ethylendiamintetraoctové, hodnota pH 8,0, a 7 ml vody) do buněk ošetřených lysozymem za mírného míchání. Získaný roztok se inkubuje na ledu po dobu dalších 15 minut.

Buněčné zbytky se odstraní z roztoku odstředěním při otáčkách 17000/min v jednotce Sorvall SS34 rotor v průběhu 45 minut při teplotě 4 °C. Přidá se přibližně 28,6 g chloridu česného a přibližně 1 ml roztoku 5 mg/ml ethidiumbromidu do přibližně 30 ml supematantu. Pak se objem upraví na 40 ml vodou a roztok se dekantuje do ultracentrifugové zkumavky. Zkumavka se utěsní a roztok se odstřeďuje při otáčkách 49 500/min v Ti70 rotoru (Beckman, 7360 N. Lincoln Avenue, Lincolnwood, IL 60646) po dobu přibližně 18 hodin. Získaný plazmidový pás, zviditelněný ultrafialovým světlem, se izoluje, extrahuje se izopropanolem nasyceným chloridem česným k odstranění ethidiumbromidu a dialyzuje se proti třem změnám přibližně 20 objemů TE pufru (10 mM Tris-HCl), hodnota pH 7,5 a 1 mM kyselina ethylendiamintetra-octová-EDTA). Dialyzát se shromáždí. Pak se přidají dva objemy ethanolu a 0,05 objemů 3 M roztoku octanu sodného. Ethanolová směs se ochladí na teplotu -20 °C a plazmid DNA se peletizuje odstředěním při otáčkách 10 000 v průběhu 30 minut v SS34 rotoru při teplotě -10 °C. Získaná peleta se resuspenduje v přibližně 1 ml TE pufru a pak se extrahuje stejným objemem směsi fenol: chloroform (1:1, objem/objem). DNA ve vodné fázi se získá přidáním 0,1 objemu 3M octanu sodného a dvou objemů ethanolu, následnou inkubací při teplotě -20 °C po dobu přibližně 30 minut a odstředěním při otáčkách 15000/min v SS34 rotoru v průběhu 20 minut. Získaná DNA peleta se promyje nejdříve 70% ethanolem a pak 100% ethanolem a vysuší se.

-15CZ 285567 B6

Shora uvedeným způsobem získaný přibližně 1 mg plazmidu pHS190 DNA se suspenduje v 1,5 ml Ο,ΙΧ TE pufru a uloží se při teplotě -20 °C. Přibližně 10 mg plazmidu pHS190 DNA se digeruje s restrikčním enzymem EcoRI (přibližně 10 jednotek) v reakční směsi, obsahující DNA v EcoRI pufru (100 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 5 mM chloridu hořečnatého, 50 mM chloridu sodného). Reakční směs se inkubuje po dobu dvou hodin při teplotě 37 °C.

Pro převedení 5' převislých konců na vázané konce se přidá 0,5 mM každé dNTP (dATP, dCTP, dGTP a TTP) spolu s 1 až 5 jednotkami Klenowa fragmentu (Boehringer Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Dr., P.O. Box 50816, Indianopolis, IN 46250). Reakční směs se inkubuje při teplotě 30 °C po dobu 15 minut, pak se enzym inaktivuje působením teploty 75 °C po dobu 10 minut. Reakční směs se extrahuje fenolem, systémem fenol/chloroform, chloroformem a pak se vysráží ethanolem.

Plazmid se resuspenduje v 50 ml roztoku, obsahujícího 40 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, lOmM chloridu hořečnatého, lOmM dithiotreitolu (DTT), 0,5 mM adenosintrifosfátu a 1 jednotku T4 DNA ligázy (Boehringer-Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Drive, Indianopolis, IN 46250). Reakční směs se inkubuje přes noc při teplotě 14 °C.

Ligázovaná směs se převede do E. coli K12 RV308 (dostupná u organizace NRRL jakožto NRRL B-15624) způsobem, který popsal Maniatis a kol., Molecular Cloning, str. 250 až 251 (Cold Spring Harbor Press, 1982). Naočkovává se 100 ml TY živné půdy v baňce o obsahu 500 ml 1 ml kultury RV308 přes noc. Buňky se nechávají růst za intenzivního protřepávání při teplotě 37 °C až na hustotu přibližně 5 x 100 buněk/ml. Kultura se vnese na led na dobu 10 minut, pak se odstřeďuje při 4000 x g po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. Buňky se resuspendují v 50 ml ledově chladného 50 mM chloridu vápenatého v 10 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0. Buňky se opět inkubují na ledu po dobu 15 minut a znova se odstředí. Buňky se resuspendují v 3,3 ml chloridu vápenatého. Ligační směs se přidá do 200 ml buněk a inkubuje se na ledu po dobu 30 minut. Buňky se převedou do vodní lázně o teplotě 42 °C na dobu dvou minut. Přidá se 1 ml TY živné půdy do zkumavky a buňky se inkubují po dobu jedné hodiny při teplotě 30 °C. Na TY agarové destičky (TY živná půda + 1,5 % agaru), obsahující 5 mg/1 tetracyklinu, se vnesou dva 100 mikrolitrové podíly a ponechají se růst přes noc při teplotě 30 °C.

Plazmid se pak resuspenduje v 10 ml vody. Vektor se generuje digerováním plazmidu s Xbal a BamHI. Přidá se přibližně 1 ml Xbal (přibližně 10 jednotek) do 10 ml plazmidu DNA (přibližně 10 jednotek) a 5 ml Xbal pufru (500 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0, 100 mM chloridu hořečnatého a 500 mM chloridu sodného). Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 90 minut se přidá 0,5 ml 5 M chloridu sodného a 1 ml BamHI (10 jednotek) a v inkubaci se pokračuje při teplotě 37 °C po dobu dalších 90 minut. Reakční směs se pak podrobuje agarosové gelové elektroforéze a při přibližně 5,75 kb Xbal-BamHI vektorový fragment se izoluje elektroelucí s následným vysrážením ethanolem.

Následující DNA sekvence se syntetizuje na syntetizéru Applied Biosystems Model 380B způsobem dobře známým pracovníkům v oboru. Proces, při kterém se konstrukce syntetického genu dosahuje dělením sekvence na oligonukleotidy a následnou ligací těchto oligonukleotidů, je v podstatě stejný, jak ho popsal Brown a kol., Methods in Enzymology 68, str., 109, 1979. Následující DNA sekvence zakódovává výhodný polypeptid podle vynálezu, přičemž

A9 = Asn, A12 = Arg, A15 = Thr, A21 = Arg, A22 = Leu, A25 = Asp, A27 = Leu, A28 = Ser, A38 = Gin, A39 = Gly, A40 = Ala, A42 = Val, a Z - Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-LeuTrp-Ala—Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu—Leu-Gln-GluHis-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly, pozitivní kmen této sekvence zahrnuje:

-16CZ 285567 B6

ATG

GCT

GAT

GCT

ATT

TTT

ACT

AAT

TAT

CGA

CGC

GTT

CTT

ACT

CAG

CTG

TCT

GCT

CGT

CTG

CAG

GAT

ATT

CTG

TCT

CGT

CAG

GGT

GAA

CGT

AAC

CAG

GAA

CAA

GGA

GCT

CGT

GTT

CGT

CTT

GGT

CGT

CAG

GTT

GAT

TCT

CTG

TGG

GCT

GAT

CAA

CGT

CAG

CTT

GCT

CTC

GAG

TCT

ATC

CTG

GCT

ACT

CTG

CAG

GAA

CAT

CGT

AAT

TCT

CAG

GGT

TAA

TAG

DNA, obsahující kódovací sekvenci, se pak mísí sXbal-BamHI shora konstruovaným vektorovým fragmentem a váže se na něj. Směs se pak transformuje v E. coli, jak shora popsáno. Plazmid DNA transformátu, odolného tetracyklinu, se analyzuje restrikční enzymovou digescí k ověření, že plazmidem je pHS4562.

2.A.2 Syntéza plazmidu pHS500

Zakódování Meti-bGRF(2-76)OH

Hovězí odvozené rekombinantní GRF PEPTIDY se produkují v podstatě způsobem podle příkladu 2.A.I. Avšak při produkci rekombinantního hovězího GRF PEPTIDU sekvence DNA zakódovává výhodný polypeptid podle vynálezu, přičemž A9 = Ser, AI2 - Arg, AI5 Thr, A21 = Arg, A22 = Leu, A25 = Asp, A27 = Leu, A28 = Asn, A38 = Gin, A39 = Gly, A40 = Ala, A42 = Val, a Z = Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-LeuAla-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly, pozitivní větví této DNA sekvence je:

ATG

GCT

GAT

GCT

ATT

TTT

ACT

AAT

TCT

TAT

CGT

GTC

CTT

ACT

CAG

CTG

TCT

GCG

CGC

CGT

CTG

CAG

GAT

ATC

CTG

AAT

CGT

CAG

CAA

GGT

GAA

CGT

AAT

CAG

GAA

CAA

GGT

GCT

CGT

GTA

CGT

CTG

GGT

CGC

CAA

GTT

GAT

GGT

GTT

TGG

ACT

GAT

CAA

CAG

CTT

GCT

CTC

GAG

TCT

ATA

CTA

GTT

TCT

CTG

CAG

GAA

CGT

CGG

AAT

TCT

CAA

GGT

TAA

TAG

DNA, obsahující kódovací sekvenci, se mísí s Xbal-BamHI vektorovým fragmentem a váže se sním, jak popsáno v příkladu 2.A.L Směs se transformuje vE. coli K12 RV308, jak shora

-17CZ 285567 B6 popsáno. Plazmid zakódující bGRF sekvenci se označuje jako pHS500. Plazmid DNA transformátu, odolného tetracyklinu, se analyzuje restrikční enzymovou digescí k ověření, že plazmidem je pHS500.

2.A.3. Syntéza DNA zakódující Met]-hGRF(2-46)OH

Lidské odvozené rekombinantní GRF PEPTIDY se produkují v podstatě stejně, jako je popsáno v příkladu 2.A.I. Avšak podle výhodného provedení vynálezu se pro produkci lidského rekombinantního GRF PEPTIDU používá modifikovaného hGRF peptidu, přičemž: A9 = Ser, A12 = Lys, A15 = Gly, A21 = Lys, A22 = Leu, A25 = Asp, A27 = Met a A28 = Ser, Y obsahuje aminokyselinovou sekvenci:

Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu a Z znamená nulu: Pozitivní sekvence větve DNA sekvence zakódující tento peptid zahrnuje sekvenci:

ATG GCT GAC GCT ATC TTC ACT AAC TCT TAC CGT AAA

GTT CTG GGT CAG CTG TCT GCT CGT AAA CTG CTG CAG

GAC ATC ATG TCT CGT GAG CAG GGT GAA TCT AAC CAG

GAA CGT GGT GCT CGT GCT CGT CTG TAA

DNA, obsahující kódující sekvenci, se pak mísí s Xbal-BamHI vektorovým fragmentem a váže se, jak uvedeno v odstavci 2.A.I. Směs se transformuje v E. coli K12 RV308, jak shora popsáno.

Příklad 2.B.

Izolace rekombinantních GRF PEPTIDŮ

2.B.1, Exprese GRF analogu v E. coli

E. coli K12 RV308/pHS451 se nechá růst v živné půdě TY, obsahující 5 mg/ml tetracyklinu při teplotě 32 °C až do dosažení stavu buněk mid-log fáze. Teplota směsi se zvýší na 42 °C a v inkubaci se pokračuje přibližně po další tři hodiny. K teplotě citlivý represor cil857 promotoru lamda pL, umístěný k navození exprese GRF analogu na plazmid pHS451, se inaktivuje při teplotě 42 °C, čímž se umožní exprese GRF analogu. Exprese bGRF PEPTIDU je v podstatě stejná, jak shora popsáno pro pGRF stou výjimkou, že se používá plazmidu pHS500 místo pHS452.

2.B.2 Izolace granulí obsahujících GRF analog

Při použití vysoce koncentrovaného E. coli expresního systému, jak příkladně uvedeno, se bílkovinový produkt sekvestruje v inkluzní formě nebo v granulích. Granule, obsahující GRF analog, se izoluje a solubilizují se k izolaci příslušného GRF peptidu. Především se všechny buňky odstřeďují, pak se resuspendují ve vodě o teplotě 10 °C. Suspenze buněk se homogenizuje v homogenizéru Gaulin za přetlaku 55 200 kPa. Homogenizovaná suspenze se zředí vodou a míchá se po dobu 10 minut, načež se hodnota pH nastaví na 8,4 až 8,6 10% roztokem hydroxidu sodného. Směs se pak odstředí. Pevnými podíly jsou granule, obsahující GRF analog, které se zmrazí na -70 °C až do dalšího použití.

-18CZ 285567 Β6

2.Β.3. Konečné čištění GRF analogu

Granule, připravené způsobem podle odstavce 2.B.2, se nechají roztát při teplotě 2 až 5 °C. Granule se solubilizují přidáním deseti objemů systému 0,05 N kyselina octová - 7M močovina a homogenizují se po dobu 5 až 8 minut. Hodnota pH se nastaví na 2,5 až 2,6 přidáním 10% kyseliny chlorovodíkové. Směs se míchá po dobu 12 až 15 hodin při teplotě 2 až 5 °C. Roztok se vyčeří filtrací filtrem Sparkler, povlečeným filtrační pomocnou látkou Dicalite Speedes (Grefco, Torrance, CA). Vodivost roztoku se sníží na méně než 4000 mohm zředěním roztokem kyseliny octové a močoviny.

Připraví se katexový sloupec za použití pryskyřice S Sepharose^R (Pharmacia, 800 Centennial Ave., Piscataway NJ 08854). Sloupec obsahuje jeden litr pryskyřice na 50 g materiálu. Materiál se vnese na sloupec rychlostí 0,1 1/cm/h a promývá se dvěma objemy sloupce 0,1 M chloridu sodného v roztoku kyseliny octové a močoviny. Analog GRF se eluuje lineárním gradientem 0,25 M až 1,6 M chloridu sodného v systému kyselina octová - močovina za použití tří objemů sloupce, přičemž se shromažďují frakce vždy z 0,1 objemu sloupce. Frakce, obsahující analog GRF, se identifikují podle vodivosti O.D.276, HPLC a polyakrylamidovou gelovou elektroforézou. Tyto frakce se pak spojí.

Stejný objem roztoku systému kyselina octová - močovina se přidá do spojených frakcí. Materiál se pak nanese na sloupec piyskyřice S Sepharose^R v systému kyselina octová - močovina o rozměru pro 50 g bílkoviny na litr pryskyřice. Průtoková rychlost je 0,02 l/cm²/h. Frakce analogu GRF se eluují lineárním gradientem 0,25 M až 1,2 M chloridu sodného v systému kyselina octová - močovina. Shromažďují se frakce o objemu 0,1 sloupce. Frakce se analyzují, jak shora uvedeno, a spojí se frakce, obsahující analog GRF.

Připraví se sloupec Sephadexu^R G-15 (Pharmacia) v 0,02 M glycinu, hodnota pH 2,5 a objem sloupce odpovídá pětinásobku objemu spojených frakcí. Izoluje se frakce s pikem O.D.276·

Připraví se sloupec, obsahující pryskyřici SP20SS (Sephabeads^R, Mitsubishi Chemical, Tokyo), v systému 10 % acetonitrilu - 0,02 M glycinu o hodnotě pH 2,5. Připraví se roztok, obsahující spojený GRF analog 10% v acetonitrilu a vnáší se na sloupec rychlostí 1,5 až 2 objemy sloupce za hodinu.Sloupec se promyje dvěma objemy sloupce pufru acetonitril-glycin. Analog GRF se eluuje gradientem, vytvořeným třemi objemy sloupce systému 10% acetonitril - 0,02 M glycin, smíšenými se třemi objemy sloupce 50% acetonitril - 0,02 M glycin. Shromáždí se frakce 0,1 objemu sloupce a zkouší se na analog GRF.

Materiál, obsahující analog GRF, se pak chromatografuje na sloupci Sephadex^R G15, vyváženém v 0,25 M kyselině octové. Pík O.D,₂76 se pak izoluje a lyofilizuje se až do dalšího použití.

Příklad 3

Příprava hippuroyl-l-pGRF(2-76)OH

Rozpustí se 3,58 g benzoylglycinu (obchodně dostupný u společnosti Transworld Chemicals) v přibližně 20 ml dimethylformamidu za míchání a chlazení v ledové lázni. Do roztoku se přidá 2,5 g N-hydroxysukcinimidu a pak 4,5 g dicyklohexylkarbodiimidu (DCC). Reakční směs se míchá přes noc a zároveň se nechá ohřát na teplotu místnosti.

Při reakci vytvořená nerozpustná dicyklohexylmočovina (DCU) se odfiltruje a dimethylformamidový filtrát se zkoncentruje ve vakuu, zbytek se zředí dichlormethanem. Vytvořená sraženina se odfiltruje a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 3,79 g sukcinimidylhippuroátu.

-19CZ 285567 B6

Přibližně 72 mg pGRF(2-76)OH, připraveného v podstatě, jako je popsáno shora v odstavci 2.A, se rozpustí ve 3 ml 0,1 M Tris-HCl, hodnota pH 7,8, 30% propanol za míchání při teplotě místnosti. Do reakční směsi se přidá 57 mg sukcinimidyl-N-benzoylglycinátu a reakční směs se míchá při teplotě místnosti za odebrání 5 μΐ vzorků za 15 minut, za 1 hodinu a za 2 hodiny po zavedení sukcinimidyl-n-benzoylglycinátu pro sledování postupu reakce. Každý z těchto vzorků se zředí na 500 μΐ 0,1% TFA (0,15 až 0,20 mg/ml) a vstřikne se na sloupec 0,46 x 15 cm pryskyřice Vydac Cl8 pro analýzu RP-HPLC a pro srovnání s výchozím materiálem.

Po 2,5 hodinách se reakční směs okyselí přibližně 1 ml ledové kyseliny octové a vnese se na sloupec 2,2 x 28,5 cm pryskyřice Sephadex G-10. Sloupec se eluuje 10% kyselinou octovou a shromažďují se 7,5 ml frakce. Stanoví se ABS₂go každé frakce k indikaci přítomnosti peptidů. Frakce 7 až 10, obsahující peptid, se spojí, vymrazí se a lyofilizují se, čímž se získá 70 mg lyofilizátu.

Přibližně 9 mg vzorku se rozpustí v 1,0 ml 0,1 % TFA. Roztok se rozdělí na 10 podílů o objemu 0,1 ml, které se zmrazí a lyofilizují se. Vzorek lyofilizátu se podrobí FAB/MS spektrometrii (Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry). Druhý vzorek se podrobí aminokyselinové sekvenční analýze.

Příklad 4

Příprava p-methylhipuroyl pGRF(2-76)OH

Část A. Syntéza p-methylbenzoylglycinu

Přibližně 7,5 g glycinu se rozpustí v roztoku, obsahujícím 105 ml 2N hydroxidu sodného a 50 ml dioxanu, za mechanického míchání při teplotě 0 až 5 °C. Přibližně 14,9 ml p-toluoylchloridu se zředí na objem 50 ml dioxanem a přidá se po kapkách do reakční směsi v průběhu 15 až 20 minut. Reakční směs se míchá přes noc za udržování teploty zahříváním na 25 °C (teplota místnosti).

Reakční směs se alkalizuje vodným roztokem hydroxidu sodného a extrahuje se diethyletherem. Vodná fáze se okyselí na hodnotu pH 3,0 6N kyselinou chlorovodíkovou. Vodná fáze se extrahuje ethylacetátem, ethylacetátový roztok se promyje vodou a vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje se a filtrát se zkoncentruje ve vakuu téměř k suchu. Pevné podíly se suspendují v diethyletheru, zfiltrují se a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 14,25 g produktu, který se pak identifikuje jakožto p-methylhippurová kyselina. Identita produktu se potvrzuje teplotou tání a elementární spalovací analýzou, přičemž výsledky se dobře shodují s hodnotami pro p-methylhippurovou kyselinu. Teplota tání produkované sloučeniny je 151 až 154 °C. Výsledky elementární spalovací analýzy jsou uvedeny v tabulce.

Část B. Syntéza p-methylhippuroyl pGRF(2-76)OH

Přibližně 1,65 g kyseliny p-methylhippurové, připravené v podstatě stejně, jako je shora uvedeno v příkladu 4, část A, se rozpustí v 15 ml dimethylformamidu za míchání a chlazení v ledové lázni. Do roztoku se přidá přibližně 1 g N-hydroxysukcinimidu a pak 1,9 g DCC. Reakční směs se míchá přes noc a zahříváním se udržuje teplota na teplotě místnosti (25 °C).

DCU sraženina se izoluje odfiltrováním a filtrát se zkoncentruje ve vakuu. Zbylý olej se zředí diethyletherem a dojde k určité krystalizaci. Pevné podíly se izolují filtrací, promyjí se diethyletherem a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 3,28 g produktu o teplotě tání 167 až 170 °C.

-20CZ 285567 B6

Produkt se analyzuje elementární spalovací analýzou a výsledky se porovnávají s teoretickými hodnotami, očekávanými pro sukcinimidylester p-methylhippurové kyseliny (C14H14N2O5).

Přibližně 72 mg pGRF(2-76)OH, připraveného v podstatě jako podle příkladu 2.A., se rozpustí v 3 ml 0,1 Tris-HCl, hodnota pH 7,8, 30% propanolu za míchání při teplotě místnosti. Do reakční směsi se přidá 57 mg sukcinimidylesteru p-methylhippurové kyseliny a reakční směs se míchá při teplotě místnosti za odebírání 5 μΐ vzorků 15 minut, jednu hodinu a dvě hodiny po zavedení sukcinimidyl-N(p-methyl)hippurové kyseliny ke sledování postupu reakce. Každý ze vzorků se zředí na 500 ml 0,1% TFA a vstřikuje se na 0,46 x 15 cm sloupec piyskyřice Vydac C18 pro RPHPLC analýzu a porovnává se s výchozím materiálem.

Po 2,5 hodinách se reakční směs okyselí přibližně 1 ml ledové kyseliny octové a vnese se na 2,2 x 28,5 cm sloupec Sephadexu G-10. Sloupec se eluuje 10% kyselinou octovou a 7,5 ml frakce se shromažďují. Stanoví se ABS280 každé frakce k indikaci přítomnosti peptidylové sloučeniny. Frakce 7 až 10, indikující přítomnost polypeptidu, se spojí, zmrazí se a lyofilizují se, čímž se získá 70 mg lyofilizátu.

Příklad 5

Příprava p-chlorhippuroyl bGRF(2-77)OH

Příprava p-chlorhippuroylového GRF derivátu je v podstatě stejná, jako je popsáno v příkladu 4, místo p-toluoylchloridu se však použije p-chlorbenzoylchloridu ve fázi podle odstavce A a bGRF(2-77)OH GRF PEPTID se připravuje v podstatě stejně, jako je popsáno shora v příkladu 1 ( pevná fáze).

Příklad 6

Příprava p-nitrohippuroyl bGRF(2-77)OH

Příprava p-nitrohippuroylového GRF derivátu je v podstatě stejná, jako je popsáno v příkladu 4, místo p-toluoylchloridu se však použije p-nitrobenzoylchloridu ve fázi podle odstavce A a bGRF(2-77)OH GRF PEPTID se připravuje v podstatě stejně, jako je popsáno shora v příkladu 1 (pevná fáze).

Příklad 7

Příprava p-hydroxyhippuroyl bGRF(2-77)OH

Příprava p-hydroxyhippuroylového GRF derivátu je v podstatě stejná, jako je popsáno v příkladu 4, místo p-toluoylchloridu se však použije p-hydroxybenzoylchloridu ve fázi podle odstavce A a bGRF(2-77)OH GRF PEPTID se připravuje v podstatě stejně, jako je popsáno shora v příkladu 1 (pevná fáze).

-21 CZ 285567 B6

Příklad 8

Příprava p-fluorhippuroyl bGRF(2-77)OH

Příprava p-fluorhippuroylového GRF derivátu je v podstatě stejná, jako je popsáno v příkladu 4, místo p-toluoylchloridu se však použije p-fluorbenzoylchloridu ve fázi podle odstavce A a bGRF(2-77)OH GRF PEPTID se připravuje v podstatě stejně, jako je popsáno shora v příkladu 1 (pevná fáze).

Příklad 9

Příprava N-fenylmalonamindoyl-l-bGRF(2-77)OH

Rozpustí se přibližně 9,1 ml (0,1 mol) anilinu ve 100 ml dichlormethanu za mechanického míchání a při teplotě 25 °C. Do roztoku se přidá 15,1 g uhličitanu draselného a pak po kapkách 14 ml ethylmalonylchloridu ve 20 ml dichlormethanu. Reakční směs se míchá po dobu 3 až 4 hodin při teplotě 25 °C a nechá se postupovat po dobu přibližně 72 hodin. Reakční směs se zředí přibližně 500 ml systému voda/dichlormethan. Směs se protřepe a dichlormethanová fáze se oddělí, promyje se nejdříve vodou kyselinou chlorovodíkovou a pak vodou a vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje se a filtrát se odpaří, čímž se získá olej v množství 14,5 g.

Přibližně 14 g ethyl-N-fenylmalonamidu, připraveného shora, se rozpustí ve 25 ml dioxanu a 75 ml 1N roztoku hydroxidu sodného. Reakční směs se míchá při teplotě 25 °C po dobu přibližně tří hodin.

Reakční směs se extrahuje diethyletherem za udržování alkalického prostředí. Vodná fáze se okyselí 6N kyselinou chlorovodíkovou, extrahuje se ethylacetátem a vysuší se síranem hořečnatým. Ethylacetátový filtrát se odpaří k suchu. Pevná látka se trituruje s ethyletherem, zfiltruje se a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 5,1 g produktu. Produkt se analyzuje elementární spalovací analýzou a 'H-NMR analýzou. Výsledky ukazují, že produktem je N-fenylmalonamid kyseliny nebo monoamid N-fenylmalonové kyseliny.

N-Fenylmalonamid kyseliny se kopuluje na bGRF(2-77)pryskyřici prostřednictvím HOBT esteru.

Příklad 10

Příprava N-fenylmalonamindoyl-l-pGRF(2-77)OH

Příprava se 3,58 g N-fenylmalonamidkyseliny v podstatě stejným způsobem, jako je shora popsáno v příkladu 9, a rozpustí se přibližně ve 20 ml dimethylformamidu za míchání a chlazení v ledové lázni. Do roztoku se přidá 2,5 g N-hydroxysukcinimidu a pak 4,5 g dicyklohexylkarbodiimidu (DCC). Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti za zahřívání.

DCU se odfiltruje a dimethylformamidový filtrát se zkoncentruje ve vakuu. Zbytek se zředí diethyletherem. Vytvořená sraženina se odfiltruje a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 3,79 g sukcidimylesteru N-fenylmalonamidkyseliny.

Přibližně 72 mg pGRF(2-76)OH, připraveného v podstatě stejně, jako je popsáno shora v příkladu 2.A, se rozpustí ve 3 ml 0,1 M Tris-HCl, hodnota pH 7,8, 30% propanol za míchání při teplotě místnosti. Do reakční směsi se přidá 57 mg shora připraveného sukcidimylesteru N

-22CZ 285567 B6 fenylmalonamidkyseliny a reakční směs se míchá při teplotě místnosti za odebírání 5 μΐ vzorků 15 minut, jednu hodinu a 2 hodiny po zavedení sukcidimidylesteru N-fenylmalonamidkyseliny ke sledování postupu reakce. Všechny vzorky se zředí na 500 μΐ 0,1% TFA (0,15 až 0,20 mg/ml) a vstřikují se na 0,46 x 15 cm sloupec pryskyřice Vydac Cl8 pro RP-HPLC analýzu a výsledky se porovnávají s výchozím materiálem.

Po 2,5 hodinách se reakční směs okyselí přibližně 1 ml ledové kyseliny octové a nanese se na 2,2 x 28,5 cm sloupec Sephadexu G-10. Sloupec se eluuje 10% kyselinou octovou a 7,5 ml frakce se shromažďují. Stanoví se ABS₂so každé frakce k indikaci přítomnosti polypeptidylových sloučenin. Frakce 7 až 10 se zjištěnou přítomností polypeptidu se spojí, zmrazí se a lyofilizují se, čímž se získá 70 mg lyofilizátu.

Příklad 11

Prostředek, obsahující p-methylhippuroyl pGRF (2-76)OH

Připraví se roztok nosiče rozpuštěním 1,38 g dihydrogenfosforečnanu sodného a 1,0 g PSA ve vodě prosté pyrogenu, které se použije do konečného objemu jeden litr, přičemž je hodnota pH přibližně 5,1. Do 64 ml nosičového roztoku se přidá 27,4 mg přibližně 5,1. Do 64 ml nosičového roztoku se přidá 27,4 mg The p-methylhippuroyl pGRF (2-76)OH, připraveného způsobem v podstatě podle příkladu 4.B k dosažení konečné koncentrace 360 miliekvivalentů na ml.

Příklad 12

Působení in vivo p-methylhippuroyl pGRF (2-76)OH při subkutánním vstříknutí nebo intravenózním podání třikrát denně vykastrovanému kanci.

Skupina 20 křížených vykastrovaných kanců o střední hmotnosti přibližně 72 kg, s vnitřním katetrem chirurgicky vneseným do stehenní cévy, se použije ke stanovení účinku p-methylhippuroyl pGRF (2-76)OH. Připraví se prostředek p-methylhippuroyl pGRF (2-OH) v podstatě podle příkladu 11 a vstřikuje se třikrát denně v množství 10,0 pg/kg/injekci buď intravenózně (I.V.) nebo subkutánně (S.Q.). Vykastrovaní kanci se krmí 2000 g 18,5% surovým kukuřičným sojovým krmivém, rovnoměrně rozděleným na dvě krmení v 8:00 dopoledne a ve 4:00 odpoledne. Kanci dostávají injekci v 8:00, v 16:00 a ve 24:00. Shromažďují se hodnoty exkrece urinámího močovinového dusíku v průběhu 1 až 5 denní kontrolní periody, 4 až 3 denní periody ošetření a 2 až 3 denní periody po ukončeném ošetření. V průběhu 24 hodin se shromáždí 30 vzorků krevního séra 12. den ošetření. Vzorky séra se zkoušejí se zřetelem na GH, BUN, glukózu, inzulín, FFA a triglyceridy. Střední hodnoty výsledků zkoušek jsou v tabulce IV.

Tabulka IV

TRT.	Hladina pg/kg/d	močovina g/dav	GH ng/ml	BUN mg/dl	glukóza mg/dl	FFA μΜ/la	TRIG. mg/dla	INSULIN gu/ml
CONT.	IVO	27,5’	2,5’	15,8’	95,4’	55,8’	23,8’	20,8’
TRT.	IV 30	16,3^b	9,9^b	7,0^b	132,7^b	97,3^b	35,3^b	76,8^b
CONT.	SQ0	28,0“	2,1’	15,5’	101,4’	55,9’	24,3’	22,8’
TRT.	SQ 30	16,4^b	8,9^b	7,5^b	147,3^b	97,5^b	32,5’^b	112,9^C

TRT. = p-methylhippuroyl pGRF (2-76)OH se vstřikuje třikrát denně odpovídajícím způsobem podání,

-23CZ 285567 B6

Conr. = kontrolním vykastrovaným kancům se vstřikuje třikrát denně roztok nosiče (fosfátový pufr) odpovídajícím způsobem podání, (a,b) = středy stejného sloupce se stejnými písmeny nejsou odlišné P< .05, Student-NewmanKeuls

GH = hladina růstového hormonu.

Hodnoty dokládají, že p-methyl-hippuroyl pGRF (2-76)OH, vstřikovaný třikrát denně v množství 30,0 pg/kg/den, je velmi anabolický, jak dokládá snížení exkrece urinámího močovinového dusíku (41 %) a snížení hladiny BUN v séru (54 %). Vstřikování p-methylhippuroyl pGRF (2-76)OH způsobuje čtyřnásobné zvýšení hladin GH v séru (viz obr. 4), které je spojeno se vzrůstem hladiny glukózy, inzulínu, FFA a triglyceridů v séru. Nejeví se žádný rozdíl odezvy v séru v závislosti na způsobu podání, s výjimkou hladiny inzulínu v séru, která vzrůstá více při subkutánním vstřikování kancům než při intravenózním podání. Také deprese exkrece urinámího močovinového dusíku (viz obr. 5), je prodloužená pro 2 až 3 dny po ukončeném ošetření subkutánní cestou v případě kastrovaných kanců.

Průmyslová využitelnost

Nové analogy faktoru, uvolňujícího růstový hormon (GRF) s modifikovaným aminokoncem, mající vyšší účinnost než nativní GRF a dosud známé analogy, použitelné pro zvyšování množství libového masa savců.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Superaktivní analog GRF vzorce I

X1 -Ala—Asp-Ala—Ile-Phe—Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A 12-V al-Leu-A 15-Gln-Leu-Ser-AlaArg-A21-A22-Leu-Gln-A25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T (I) kde znamená

A9 A12 A15 A21 A22 A25 A27 A28 Ser, Ala, Leu, Thr nebo Asn, Arg nebo Lys, Gly, Ala, Thr nebo Leu, Arg nebo Lys, Ala nebo Leu, Asp nebo Glu, Met, Ser, Arg, Leu nebo norleucin, Ser nebo Asn, Y chybí, nebo znamená peptid s aminokyselinovou sekvencí ze souboru, zahrnujícího Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu, Glu-Gln-Gly-Glu—Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu, nebo jejich funkční derivát, Z chybí, nebo znamená peptid s aminokyselinovou sekvencí ze souboru, zahrnujícího

-24CZ 285567 B6

Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-GluSer-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly,

Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-GluSer-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly nebo jejich funkční derivát,

T karboxylovou koncovou skupinu obecného vzorce

-COOR_a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(Ra)(Rb) nebo CH₂OR_a, kde znamená

Ra a Rb na sobě nezávisle alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, atom vodíku, Hse (lakton), HseOH nebo skupinu HseN(Rc)(R<j), kde znamená R< a Rj na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

XI acylovou skupinu obecného vzorce

O

R₁-A-(CH₂)_ír<NH)_c-B-(NH)_b-(CH₂)a-CH-CI r₂ kde znamená

Ri atom vodíku, skupinu methylovou, ethylovou, hydroxyethylovou, fenylovou nebo fenylovou substituovanou atomem halogenu, alkylovou nebo alkoxyskupinou vždy s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyskupinou, nitroskupinou nebo aminoskupinou, acetamidoskupinu, trifluormethylovou skupinu, skupinu vzorce -CHr-OH, sulfoamidoskupinu nebo pětičlennou nebo šestičlennou heterocyklickou skupinu, obsahující jeden až tři heteroatomy ze souboru, zahrnujícího atom dusíku, kyslíku a síry, a nulu, 1, 2 nebo 3, b nulu nebo 1, c nulu nebol, d nulu až 12,

A chybí nebo znamená atom kyslíku nebo síry

B skupinu karbonylovou, sulfonylovou nebo sulfinylovou,

O

II

-<CH₂)_e-C-R₃ kde znamená e nulu až 5

R₃ skupinu methylovou, ethylovou, hydroxyethylovou, aminoskupinu, skupinu fenylovou nebo fenylovou substituovanou atomem halogenu, alkylovou nebo alkoxyskupinou vždy s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyskupinou, nitroskupinou nebo aminoskupinou, acetamidoskupinu, sulfoamidoskupinu nebo pětičlennou nebo šestičlennou heterocyklickou skupinu, obsahující jeden až tři heteroatomy ze souboru, zahrnujícího atom dusíku, kyslíku a síry,

-25CZ 285567 B6 a jeho farmaceuticky vhodné soli.

2. Superaktivní analog GRF podle nároku 1 vzorce I, kde znamená a 0, b 1, B karbonylovou skupinu, c 0, d 0 a A chybí.

3. Superaktivní analog GRF podle nároku 2 vzorce I, kde znamená Ri skupinu methylovou, fenylovou, p—nitrofenylovou, p-chlorfenylovou, p-fluorfenylovou, p—hydroxyfenylovou, pmethylfenylovou, N-benzylovou (izonikotinylovou).

4. Superaktivní analog GRF podle nároku 3 vzorce I, kde znamená R₂ atom vodíku, skupinu methylovou nebo hydroxymethylovou.

5. Superaktivní analog GRF podle nároku 3 vzorce I, kde znamená R₂ atom vodíku.

6. Superaktivní analog GRF podle nároků 1 až 5 vzorce I, kde znamená A9 Asn, A12 Arg, AI5 Thr, A21 Arg, A22 Leu, A25 Asp, A27 Leu, A28 Ser.

7. Superaktivní analog GRF podle nároku 6 vzorce I, kde znamená Y peptid s aminokyselinovou sekvencí Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu, nebo sjejím funkčním derivátem.

8. Superaktivní analog GRF podle nároku 7 vzorce I, kde znamená Z peptid s aminokyselinovou sekvencí Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-IleLeu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly, nebo sjejím funkčním derivátem.

9. Superaktivní analog GRF podle nároků 1 až 5 vzorce I, kde znamená A9 Ser, A12 Arg, AI 5 Thr, A21 Arg, A22 Leu, A25 Asp, A27 Met, Ser, Arg, Leu nebo norleucin, A28 Asn.

10. Superaktivní analog, GRF podle nároku 9 vzorce I, kde znamená Y peptid s aminokyselinovou sekvencí Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu, nebo sjejím funkčním derivátem.

11. Superaktivní analog GRF podle nároku 10 vzorce I, kde znamená Z peptid s aminokyselinovou sekvencí Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-ThrLeu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly nebo její funkční derivát.

12. Superaktivní analog GRF podle nároků 1 až 5 vzorce I, kde znamená A9 Ser, A12 Lys, AI 5 Gly, A21 Lys, A22 Leu, A25 Asp, A27 Met, A28 Ser.

13. Superaktivní analog GRF podle nároku 12 vzorce I, kde znamená Y peptid s aminokyselinovou sekvencí Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu, nebo její funkční derivát.

14. Superaktivní analog GRF podle nároku 10 vzorce I, kde Z chybí.

-26CZ 285567 B6

15. Farmaceutický prostředek pro zvyšování hladiny růstového hormonu a pro zvyšování libové svaloviny a vhodný pro ošetřování dwarfísmu a osteoporózy, vyznačující se tím, že obsahuje jakožto účinnou látku superaktivní analog GRF podle nároků 1 až 14 spolu s alespoň jedním farmaceuticky vhodným nosičem, excipientem nebo ředidlem.