HU205172B

HU205172B - Process for producing new insulin derivatives and pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HU205172B
Application number: HU896781A
Authority: HU
Inventors: Laszlo Vertesy; Karl Geisen; Guenther Johannes Riess; Klaus Sauber
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-12-29
Filing date: 1989-12-27
Publication date: 1992-03-30
Also published as: AU623963B2; DK173178B1; CA2006818C; PH27425A; JPH02225498A; ZA899946B; FI102843B; DK669889A; GR3019560T3; DE3844211A1; NZ231944A; PT92757B; FI896279A0; NO180379C; AU4733289A; IL92905A0; EP0376156A3; CA2006818A1; EP0376156B1; KR900009698A

Description

A leírás terjedelme: 14 oldal (ezen belül 7 lap ábra)

HU 205172 Β

A találmány tárgya eljárás diahetes mellitus kezeléséhez alkalmas új inzulinszármazékok, valamint az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

Ismeretes, hogy a diabetes mellitus kezeléséhez nagymennyiségű inzulinra és inzulinszármazékokra van szükség, ezeket részben nagyiparilag is előállítják. Annak ellenére, hogy jelentős számban állnak már inzulinkészítmények és -változatok rendelkezésre különféle hatásprofilokkal, a szervezetek különbözősége és egyéni ingadozásai miatt még mindig fennáll az igény újabb, más sajátosságokkal és hatás-jellegzetességekkel rendelkező további inzulinkészítményekre.

Késleltetett hatású inzulinkészítményeket ismertetnek például az EP-A 132796 és EP-A 132 770 sz. európai szabadalmileírások az (I) általános képletű, az inzuÜn-B-láncB31-es pozíciójában bázikusan modifikált származékokról van szó. Aképletben

R¹ jelentése hidrogénatom vagy H-Phe,

R³® jelentése valamely neutrális, genetikusán kódolható L-aminosavmaradéka,

R³¹ jelentése fiziológiai szempontból közömbös, bázikus karakterű, legfeljebb 50 szénatomos szerves csoport, melynek létrehozásában 0-3 α-aminosav részes, és amelynek adott esetbem meglévő, véghelyzetű karboxil-csoportja észterfunkcióként, amidfunkcióként, laktonként vagy CH₂OH-vá redukálva lehet jelen.

Ezekre az inzulinszármazékokra 5,8 és 8,5 közötti izoelektromos pont (az izoelektromos fókuszálásban mérve) jellemző. Az izoelektromos pont—mely a modifikálatlan természetes inzulinnal vagy proinzulinnal (pH 5,4-nél) szemben a semleges tartományba tolódott —a járulékos, a bázikus modifikálás következtében a molekula felületén található pozitív töltések függvénye. így ezek a bázikusan modifikált inzulinszármazékok a semleges tartományban kevésbé oldhatók mint a természetes inzulin vagy proinzulin, melyek semleges közegben rendszerint oldott állapotban találhatók.

Az 0) általános képletű modifikált inzulinszármazékok késleltető vagy retard hatása az izoelektromos ponton mutatkozó gyenge oldhatóságra vezethető vissza. Az előbb említett kétleírás értelmében az inzulinszármazékok fiziológiai feltételek között újra oldhatóvá lesznek a járulékos bázisos csoportok lehasítása révén, ami a származéktól függően triptikus vagy tripszinhez hasonló és/vagy karboxipeptidáz B, vagy a karboxipeptidáz B-hez hasonló és/vagy észteráz aktivitáshatásáramegyvégbe.Alehasítottcsoportokvagy tiszta fiziológiai metabolítok, vagy pedig könnyen metabolizálhatő, fiziológiai szempontból közömbös anyagok.

Az előbbiekben említett, az inzulin bázikus modifikációja következtében fennálló retardelvet még tovább hasznosítják más—főleg az A- és B-láncon belül —bázikusan modifikált inzulinszármazékokmegfelelő alkalmazásával; lásd például az EP-A 0194 864 és EP-A0254 516sz. európai szabadalmi leírásokat.

Ismeretesek olyan bázikusan modifikált inzulinszármazékok is, amelyeknél a bázikus modifikálásra az A-lánc meghosszabbításában, az Al-pozíción át került sor; 1. pl. Rösen és tsai., Biochem. J. 186,945952. (1980). Ebben az irodalmi hivatkozásban részletesen ismertetnek bázikus aminosavakkal modifikált inzulinszármazékokat:

Lys-Arg-Gly^A1-marhainzulin

Arg-GIy^A1-marhainzulin

Arg-Arg-Gly^A1-marhainzulin

Arg-Arg-Arg-Gly^A1-marhainzulm.

Ezek az inzulinszármazékok — szemben a modifikálatlan inzulinnal — jelentősen csökkent biológiai aktivitást mutatnak; 1. pl. afentebb megadott irodalmi hely 947. oldalán található táblázatot. Az említett hivatkozás nem utal a vegyületek esetleges retard-hatására.

Kutatásaink arra irányultak, hogy a korábban említett retard-elvet a diabetes mellitus betegség kezelése érdekében előnyösebb módon továbbfejlesszük és hasznosítsuk; ennek során a bázikusan modifikált inzulinszármazékok új csoportját találtuk meg: olyan, összefoglalólag a (Π) általános képlettel jellemezhető új inzulinszármazékokat, amelyek az AO-pozícióban a bázisos arginin aminosavat tartalmazzák. Ezeknek az új inzulinszármazékoknak a (Π) általános képletében

a) R³⁰+R³¹ együtt egy hidroxilcsoportot (Ha általános képlet) vagy

b) R³⁰ egy Thr-maradékot,

R³¹ egy hidroxilcsoportot vagy metil-karbonil-csoportot (= Hb általános képlet) képvisel.

Az új inzulinszármazékok az AO-pozícióban történt bázikus modifikáció következtében—hasonlóan az ismert bázikusan modifikált inzulinszármazékokhoz — késleltetett hatásprofillal rendelkeznek és — szemben az ismert származékokkal—a szervezet számára való elviselhetőség szempontjából jelentős előnyt mutatnak. Ezen túlmenően, figyelemmel a fentebb már említett irodalmi hely közléseire (P. Rösen és tsai), rendkívül meglepő, hogy a találmány szerinti származékok biológiai aktivitása azonos a természetes inzulinéval:

a) Azok a (Π) általános képletű vegyületek, amelyeknél R³⁰+R³¹ jelentése együttesen OH-csoport, a megfelelő AO-Arg-dez-B30 inzulinok; ezek különösen előnyös vegyületek.

b) Alternatívaként az is lehetséges, hogy a (Π) általános képletben az R³⁰ jelentése Thr-maradék és R³¹jelentéseOH-csoportvagymetil-karbonil-csoport,

Ha R³¹ jelentése hidroxilcsoport, akkor olyan inzulin-származékok keletkeznek, amelyek a megfelelő inzulintól csak az AO-pozícióban (Arg) történt módosításban különböznek. Az A- és Bl-19-láncok a humáninzulin szekvenciái, így a kapott származék az AOArg-humáninzulin.

A (Π) általános képletű inzulinszármazék izoelektromos pontja 5,5 és 9,0 között van (az izoelektromos fókuszálásban mérve).

A 01) általános képletű inzulinszármazékot úgy állítjuk elő, hogy valamely 0Π) általános képletű inzulinban—ahol

HU 205172 Β

X„ a humán vagy majom-proinzulin C-láncát vagy az N-terminális láncvégen egy arginin-maradékkál megrövidített majom-proinzulin C-láncát és

Rj a humán- vagy majom-preproinzulin preszekvenciáját jelenti, és az A- és B(l-29)-lánc a humán inzulin szekvenciáját tartalmazza—lizil-endopeptidázzal kezelünk, majd a kapott vegyületet tripszinnel vagy valamely tripszin típusú endopeptidázzal, mint plazminnal, trombinnal vagy klosztripszinnel kezeljük és így a (HA) általános képletű AÖ-Arg-dez-B30 inzulinszármazékot kapjuk;

és kívánt esetben a kapott (Ha) általános képletű AO-Arg-dez-B30 inzulinszármazékot lizil-endopeptidáz vagy tripszin jelenlétében valamely H-R³⁰-R³¹ általános képletű vegyülettel — ahol R³⁰ és R³¹ jelentése egyezik az (üb) általános képletnél megadottal — reagáltatunk, miközben a reaktánsokban jelenlévő szabad -COOH, -OH, SH, -NH₂, guanidino- éslv&gy imidazolil funkciós csoportokat kívánt esetben ismert módon védhetjük és a reakció után az adott esetben ' jelenlévő védó'csoportokat ismert módon lehasítjuk, amikor is a (Hb) általános képletű inzulinszármazékot kapjuk.

A (IH) általános képlet meghatározásában a „proinzulin C-lánc” az az aminosav-szekvencia, amely a proinzulinban az inzulin A- és B-láncot összeköti. Ez a PTF1 proteinben (2. ábra) az Arg-81 aminosavtól az Arg-118 aminosavig terjedő láncnak felel meg.

A humán- illetőleg majom-preproinzulin preszekvenciáján az az aminosav-szekvencia értendő, amely a preproinzulin B-lánca előtt áll. Ez a PTF1 proteinban az Asp-1 aminosavtól az Arg-50 aminosavig terjedő szekvenciának felel meg.

A fentiekben vázolt találmány szerinti eljárást az alábbiakban részletesebben ismertetjük.

A (ΙΠ) általános képletű vegyületeket, amelyek a humán- vagy majom-proinzulin C-láncát vagy az Nterminális láncvégen egy arginin-maradékkal megrövidített majom-proinzulin C-láncát és Rj helyén a humán- vagy majom-preproinzulin preszekvenciáját tartalmazzák, előnyösen géntechnológiai útón, különösen az A-0289 936 sz. európai szabadalmi leírásból ismert eljárás szerint állítjuk elő. Ez a leírás majomproinzulin esetére írja le részletesen az eljárást, amely azonban a leírás szerint ugyanilyen módon folytatható le más analóg szekvenciákkal is. így a (ΙΠ) általános képlet fenti definíciójának bármely változatát ugyanígy állíthatjuk elő. Ezek a prekurzorok a humán- vagy majom-proinzulinból (adott esetben rövidített) tendamisztáttal létrejött, rövid peptidhitaggal összekötött fúziósproteinek. Ilyen fúziósproteineket streptomyces fajok sejtjeiben lehet exprimálni és a tenyészetben kiválasztani, amelyből könnyen elkülöníthetők. A P 38 37 273.8 (HOE 88/F 313) sz. NSZK-beli közzétételt szabadalmi bejelentésben speciálisan kialakított fúziósproteineket javasolnak, melyeknek az a jellemzője, hogy az inzulin A- és B-láncú korrekt diszulfidhidakkal kapcsolódnak össze és a C-peptid a lizin aminosavra rövidített. Teljesen analóg módon lehet olyan fúziósproteint előállítani, melyben a C-lánc az arginínra rövidített. A javasolt eljárás különösen előnyös változata abban rejlik, hogy az arginint kódoló kodont a lizint kódoló kodonhoz kapcsolják, úgyhogy ugyancsak egy fúziósprotein keletkezik, melynek C-lánca Lys-Arg-bóláll..

Megfelelő fúziósproteineket más egyéb, önmagukban ismert eljárásokkal is elő lehet állítani, például E. coli-ban, az EP-A 0 227 938, EP-A 0 229 998, EP-A 0 286 956 és az EP-A 0 290 005 sz. szabadalmi leírások alapján.

Az eljárás végrehajtásához ezután a (ΙΠ) általános képletű vegyületet lizil-endopeptidázzal (pl. Lysobacter enzymogenesből) vizes oldatban illetve szuszpenzióban érintkeztetjük. A tiszta enzim beadagolt (súlytömege a (ΙΠ) általános képletű kiindulási inzulintermékek tömegének előnyösen kb. 1/50-1/10000, különösen kb. 1/100-1/1000 közötti része.

A reakcióelegy pH-értéke viszonylag széles határok között ingadozhat; előnyben részesül mégis az 5,5 és 10,5, különösen a 7 és 9 közötti tartomány.

A reakció ideje, főleg az enzim tömegétől függően, néhány perctől több napig, előnyösen néhány óra hosszat tart.

Alizil-endopeptidáz enzim a lizint tartalmazó peptidláncokat a lizin karbonü-oldalán hasítja, így a (Hl) általános képletű vegyűletekből AO-Arg-dez-B30-inzulin keletkezik. A kapott inzulinszármazékot ismert módszerekkel elkülönítjük és tisztítjuk.

Az irodalomban a lizil-endopeptidázt gyakran a tripszinhez hasonló endopeptidázok között adják meg, de gyakran e mellett is,még megnevezik. Jelen esetben az utóbbi módot követtük.

A találmány szerinti eljárás kívánt esetben lefolytatható második lépésében az első lépésben kapott (Ha) általános képletű AO-Arg-dez-B30 inzulinszármazékot egy (V) általános képletű vegyülettel reagáltatjuk és így a megfelelő (Hb) általános képletű AOArg-inzulint, illetőleg inzulinszármazékot kapjuk. Ezt a további átalakítási eljárási lépést önmagukban ismert módszerekkel analóg módon, pl. az EP-A-00 56 951 sz. szabadalmi leírásban leírt transzamidálást követve lehet végrehajtani.

Amennyiben olyan kiindulási anyagokat alkalmazunk, melyek védőcsoportokkal vannak ellátva, e csoportokat végül ismert módon újra lehasítjuk.

A (Π) általános képletű (a/b) inzulinszármazékok és fiziológiai szempontból elfogadható savaddíciós sóik elsősorban a diabetes mellitus kezeléséhez szükséges gyógyszerkészítmények hatóanyagául szolgálnak.

A találmány tárgyához tartozik az olyan gyógyszerkészítmény előállítása is, amely legalább egy (Π) általános képletű inzulinszármazékot és/vagy annak legalább egy, gyógyászati szempontból elfogadható savaddíciós sóját tartalmazza oldott, amorf és/vagy kristályos — előnyösen amorf és/vagy kristályos — formában.

E gyógyszerkészítmény szempontjából előnyös (H) általános képletű inzulinszármazékok a következők:

AO-Arg-Des-B30-humáninzu.lin,

HU 205172 Β

AO-Arg-humáninzulin,

AO-Arg-B31-ArgOH-humáninzulin és AO-Arg-B3 l-Arg-B32-OH-humáninzulin, valamint ezek gyógyászati szempontból elfogadható sói.

A gyógyszerkészítmény előnyösen, injekcióhoz alkalmas oldat vagy szuszpenzió, kb. 3,0 és 9,0, előnyösen 5,0 és 8,0 közötti pH-értékkel, mely egy megfelelő izotonizálő szert, egy megfelelő konzerváló szert és adott esetben egy megfelelő puffért, továbbá adott esetben meghatározott koncentrációban cinkiont vagy egymásikkésleltetőt, mint pl. protamin-szulf átot tartalmaz, mindezt természetesen steril vizes oldatban vagy szuszpenzióban. A készítmény alkotóinak öszszessége — a hatóanyag kivételével — a készítményhordozótképezi.

Alkalmas izotónikumok pl. a glicerin, glükóz, mannit, kalcium- vagy magnézium-vegyületek, mint pl. CaCl₂, MgCl₂ stb.

Megfelelő konzerválószerek pl. a fenol, m-krezol, benzil-alkohol és/vagyp-hidroxi-benzoesavészter.

Pufferként, különösen az 5,0 és 8,5 közötti pH-érték beállításához pl. nátrium-acetátot, nátrium-citrátot, nátrium-foszfátot stb. lehet alkalmazni. A pH-érték beállításához fiziológiai szempontból érdektelen hígított savak (tipikusan HC1) illetve lúgok (tipikusan NaOH) is megfelelnek.

Ha a készítmény cinket is tartalmaz, ennek mennyisége előnyösen 1 pg-2 mg, különösen 5 μ-200 μg cink/ml.

A találmány szerinti készítményhez a hatásprofil bővítése céljából más egyéb, a találmány szerinti eljárással előállított inzulinszármazékokkal nem szinergetikus hatású, adott esetben ismert módon modifikált (lásd például EP-A132 769 és EP-A 132 770) és/vagy modifikálatlan inzulint, előnyösen marha-, sertés-vagy humáninzulint, különösen humáninzulint islehetkevemi.

Előnyben részesülnek azok a hatóanyagkoncentrációk, amelyek kb. 1-15 000, közelebbről 5-1000 és különösen mintegy 40-400 nemzetközi egység/ml koncentrációnakfelelnekmeg.

A gyógyszerkészítményt úgy állítjuk elő, hogy legalább egy (H) általános képletű inzulinszármazékot és/vagy ennek legalább egy, gyógyászati szempontból elfogadható sóját, adott esetben más, modifikált és/vagy modifikálatlan inzulinnal illetve -származékkal, gyógyászati szempontból közömbös hordozóval, valamint adott esetben megfelelő kiegészítő- és segédanyagokkal együtt beadásra alkalmas formába hozzuk.

Találmányunkat a következő példák segítségével részletesen ismertetjük:

Eljárás AO-Arg-dez-B3Q-humáninzulin előállítására

A) Eljárás (©) általános képletű kiindulási anyag előállítására:

Al) Az 1. táblázatban ábrázolt szintetikus (1) gént önmagában ismert módon, a foszfoamidit-módszert követve kémiai úton szintetizáljuk. A kodon kiválasztásánál figyelembe vettük a streptomyces fajok előnyös voltát G és C szempontjából. Hasonlóan az EP-A 0 289 936 sz. dokumentum 2. táblázatában ismertetett, a majom-proinzulint kódoló génhez, a leírásunkban szereplő 1. táblázat szerinti (1) gén is az 5’-végen egy, az EcoRI restrikciós enzimre tipikus, áthajtó szekvenciával rendelkezik. Á struktúrgén után két stopp-kodon található, valamint egy kapcsolódó szekvencia, felismerési hellyel a Sáli enzim részére.

A kereskedelemben kapható pVC19 plazmidot az EcoRI és Hindin enzimekkel vágjuk és az (1) szintetikus gént az 1. táblázat szerint belekapcsoljuk. Ilyen módon a (2) pI3 plazmidot kapjuk. A megnövelés után a szintetikus gént az EcoRI és Sallenzimekkelmint (3) f ragmentet kihasítjuk és a további, az alábbiakban leírtkonstrukcióhozfelhasználjuk.

ApUC19 plazmidot Smal enzimmel teljesen átalakítjuk és a 2. táblázatban a példák után bemutatott (4) terminátor-szekvenciával kapcsoljuk. Azokat a plazmidokat, melyek ezt a szekvenciát ahelyes orientációban tartalmazzák, aPT3 megjelölést kapják. Ezt az (5) plazmidotEcoRI enzimmel nyitjuk ésahasításihelyeket DNS-polimerázzal (Klenow-fragment) feltöltjük. Újbóli kapcsolással a (6) pT4 plazmidot kapjuk. Ezt a plazmidot a Sáli és Sphl enzimekkel nyitjuk és a (7) nagy fragmentet elkülönítjük.

A (8) pKK400 plazmidot (I. EP-A 0 289 936 számú európai szabadalmi leírás, 4. ábra /20/) Sphl és EcoRI enzimekkel nyitjuk és a (9) kis fragmentet a tendamisztál-génnel izoláljuk.

A- (3), (7) és (9) fragmentek kapcsolásával a (10) pKK700 plazmidot kapjuk, amelyben a tendamisztátszekvenciára a 12 aminosavat kódoló híd-tag

Phe Asn AlaMet Alá Thr Gly Asn Ser Asn Gly Lys

TTCAAT GCG ATG GCC ACC GGGATT TCG AACGGCAAG

AAG TTA CGC TAC CGG TGG CCC TAA AGC TTGCCGTTC

EcoRI és erre a modifikált proinzulint kódoló gén következik. A helyes elrendezést az Sphl és SstI enzimekkel történő vágással szabályozzuk, amikor is a mintegy 3,5 kb nagyságú plazmádból egy826bp fragmentet kapunk. A szekvencia helyességét a di-dezoxi-módszer szerint DNS-szekvenciálás révén bizonyítjuk.

Analóg módon állítunk elő génkonstrukciókat* amelyekben a C-peptidként működő Lys-tArg-ra cseréljük. Ehhez a Lys-t kódoló tripletet CCC-vel cseréljük ki. Analóg módon kapjukapl5 plazmidotés ebből a pKK800 vektort.

Az 1. ábra a fent leírt, Al módszer szerinti génkonstrukciót mutatja be; az ábra nem mérethű,

A2) AzEP-A0 289 936sz. szabadalmi leírásban szereplő pGFl vektorral kapcsolatban leírtakkal analóg módon állítjuk elő a pKK700 és pKK800 vektorokból apGF4 és pGF5 expressziós plazmidokat. Ennek során apKK700 és pKK800 vektorokból Sphl és SstI enzimekkel való átalakítással

HU 205 172 Β

826 illetve 823 bp fragmentet izolálunk és ezt a DNS-fragmentetaz ugyanazon enzimekkel hasított pU702 expressziós plazmidba kapcsoljuk. A kapcsolási keveréket S. lividans TK 24-ben transzformáljuk és a Thiostrepton-rezisztens transzformánsokból, melyek tendamisztát-aktivitást mutatnak (lemezteszt), a DNS-plazmidot elkülönítjük. Valamennyi pozitív klón tartalmazza a pKK.700 illetve pKK800 vektorokból származó fragmentet.

A kódolt fúziósprotein expressziójára ismert módon kerülhet sor. A transzformált S. lividans TK 24 törzset 4 napon keresztül 28 °C-on keverőlombíkban inkubáljuk, és a micéliumot centrifugálással elválasztjuk a tenyészoldattól; a fúziósproteint az alábbiak szerint mutathatjuk ki a tiszta oldatban:

10-100 μΐ oldatot 20-200 pl 15%-os triklór-ecetsawal elegyítünk, a kicsapódott proteint centrifugálással töményítjük, mossuk és SDS-tartalmú próbapufferral (U. Laemmli, Natúré 227 (1970) 680-685) felvesszük. 2 perces 90 ’C-on történő inkubáció után egy 10-17%-os SDS-poliakrilamid-gélen elektroforetikusan szétválasztjuk. Ennek során 15 kD molekulasúlyú proteint kapunk, tehát a tendamisztátból és proinzulinból álló fúziósproteinre várt molekulasúly-tartományban. A fúziósprotein — a (ΠΙ) általános képlet körébe tartozó termék — mind a tendamisztát, mind az inzulin ellen antitestekkel reagál.

A3) Törzstartás és fermentáció

S. lividans törzseket, melyek a pGF4 rekombináns plazmidot (A2 szerint) tartalmazzák, agar-lemezekre kenünk, amelyek komplex tápanyagként R2YE médiumot (Hopwood és társai, Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual; John Innes Foundation, Norwich, England; 1985) tartalmaznak és 25-30, előnyösen 28 ’C-on tenyésztünk. A plazmid stabilizálására a tápanyag szelekciós adalékként 20 jxg/I tiostreptont tartalmaz. A spóraképződés befejeződése után a lemezekre vizet rétegezve és ultrahanggal kezelve a spórákat learatjuk, A spórák titrálása után 20% vizes glicerinnel 10¹⁰ spóra/ml koncentrációjú oldatotkészítünk és -20 ’C-on tartjuk.

A4) A tenyészet elkészítése

Az alaptenyészethez egy komplex táptalajt alkalmazunk, mely a következőkből áll:

szójaliszt (20 g/1), glükóz (10 g/1), kukoricakeményítő (2 g/1), karbamid (1 g/1), ammónium-nitrát (1 g/1), malátakivonat (5 g/1) és KH₂PO₄ (2 g/1), továbbá szelekciós adalékként 10-50 pg/l tiostreptont. Az alaptenyészethez 220 rpm-mel 27 ’C-on keverjük és 60 óra elteltével 1:20 hígításban a főkultúrába átoltjuk.

A főtenyészethez 7,2 pH-ra beállított komplex táptalajt alkalmazunk, mely a következőkből áll: oldható keményítő (40 g/1), Cornsteep, folyékony (4 g/1) soványtejpor (7 g/l), glükóz (10 g/1), (NH₄)₂SO₄ (12 g/1) és szójaliszt (4 g/1).

A fermentáció 48 óra alatt megy végbe szokásos keverő fermentorban, levegő bevezetésével (0,5 wm), 200-240 rpm keverés mellett, 25 ’C-on. A fermentáció bevezetése után a tenyészetet tovább kezeljük, melyek során aeroszol képződés elkerülése érdekében egy zárt nucson történő szűréssel a sejtpelleteket elválasztjuk a szűrlettől. A tiszta szűrlet a kívánt fúziósproteint tartalmazza.

A fúziósprotein hozama kb. 20%-kal magasabb, ha a főtenyészet pH-értékét NaOH-val és 3% foszforsavval 6,5-7,2, előnyösen 6,9 pH-értéken tartjuk.

A5) A PTF1 fúziósprotein elkülönítése

Az EP-A 0 289 936 sz. szabadalmi leírásban foglalt eljárás szerint nyert, plazmiddal kódolt fúziósprotein —a továbbiakban PTF1 — képzésére szolgáló, Streptomyces lividans fermentáció tenyészoldatából 301-t a tenyészet elpusztítására 4,0 g p-klór-metakrezollal elegyítünk és 30 percig állni hagyjuk. Ezután egy szűrőprésen a sejtmasszát elválasztjuk és a szűrletet hűtés közben triklór-ecetsawal 4,0 pH-ra állítjuk be. 3 óra elteltével a csapadékot centrifugálással összegyűjtjük. Utána tízszeres mennyiségű acetonnal való kikeveréssel zsírtalanítunk. Az acetónfázist leszűrjük és félredobjuk. A PTF1 proteint 6 mólos karbamidoldattal feliszapolva és a pH-értéket 7,5-re beállítva oldatba visszük, és a fel nem oldott anyagot újabb centrifugálással elkülönítjük, A tiszta folyékony fázist közvetlenül egy Q^-Sepharose-oszlopra visszük fel, amit tris/HCi-pufferrel (pH 7,5) 3 mólos karbamidban kezelünk. Az oszlop (5 cm átmérő, 15 cm magas) 300 ml ioncserélőt tartalmaz. Az eluálást 0-0,5 mólos NaCl-karbamidoldattal hajtjuk végre. A PTF1 -tartalmú frakciókat összegyűjtjük és dialízissel sótlanítjuk. A töményített termékből 300 mg-ot egy Macrobore^) Nucleosil 120-10 C4 HPLC-oszlopra viszünk fel és 0,1 %-os trifluor-ecetsavval eluálunk, a pépesedő tömeghez acetonitrilt vezetünk. A PTF1 proteint 36%os acetonitrillel leoldjuk. A megfelelő frakciókból az oldószert vákuumban eltávolítjuk. 186 mg tiszta PTFl-t kapunk. A szerkezeti képletet a 2. ábra mutatja be, a 2/a. ábra a szekvencia szokásos képlete.

A6/ A PTF1 föziósprotein diszulfidhídjainak átrendezése mg PTFl-t 70 ml 8 mólos karbamidban (pH 8,6) oldunk és 5 percig héliummal kezelünk, majd 760 μΐ β-merkapto-etanolt (pH 10,5) adunk hozzá. 30 perc reakcióidő után oxigén kizárásával, glicin/NaOH-pufferrel szemben (pH 10,5) 16 óra hosszat dializálunk. 16 óra elteltével a terméke levegővel hozzuk össze, végül savasra állítjuk be, és Nucleosil 120 10 Ca oszlopon szétválasztjuk. Az átrendezett termék szerkezetét a 3. ábrán mutatjuk be, a 3/A. ábra a szekvencia szokásos képlete.

A hozam 8,2 mg, ez az elméleti hozam 24%-ának felel meg.

A7) A PGF4 protein elkülönítése

Az A4) szerint kialakított proteint az A5) szerint dolgozzuk fel.

Az alábbi példák szerint előállított inzulinszármazékokat az áminosav-szekvencia Edmann-lebontása útján azonosítottuk.

1. példa

Az átrendezett PTF1 protein enzimatikus hasítása

HU 205 172 B

8,2 g átrendezett PTFl-t (2. ábra) 1 ml tris-pufférben (pH 8) feloldunk és Lysobacter enzymogenesből származó, 1 mg/l koncentrációjú lizil-endopeptidáz (LEP) oldat 10 μΐ-jét adjuk hozzá. Az oldatot szobahőmérsékleten 2 óra hosszat állni hagyjuk, majd Nucleosil 120-5 Ca-HPCL oszlopra visszük, és a terméket 0,5 t%-os vizes trifluor-ecetsav-oldat és 20 tf%-tól 50 tf%-ig emelkedő mennyiségű acetonitril elegyével történő eluálás útján elkülönítjük a terméket. Hozam: 3,8 mg (az elméleti hozam 92%-a).

A 3,8 mg inzulin-prekurzort, amely a PTFl szekvenciát tartalmazza, a 80-104 aminosavak nélkül, 1 ml trisz-pufferben (pH 8,4) oldjuk és szobahőmérsékleten 1 mg/ml koncentrációjú tripszinoldathól 6 μΐ-t adunk hozzá. 90 perc elteltével a pH-t 3,0-ra állítjuk be és ezzel a reakciót megállítjuk, majd a terméket egyNucleosil 120-5 C4-HPCL oszlopra (25 cm x 4,8 cm) visszük, majd 32,8 percig eluálunk 0,5 t% trifluor-ecefeavat tartalmazó víz és 20 tf%-tól 50 tf%ig emelkedő mennyiségű aceton elegyével. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és a terméket liof ilizálással elkülönítjük. íly módon 2,1 mg tiszta AO-Arg-dez-Thr-B30-humáninzuIint kapunk. Az új anyag izoelektromos pontja 6,2.

2. példa

Az AO-ArgHÍez-Thr-B30-inzulin kinyerése E. coliproteinekből

Kiindulási termék:

Egy E. coli törzset, melyet egy plazmiddal transzformáltunk — a plazmid megfelel az EP-A 0 286 956 számú szabadalmi leírás 3. példájában leírt pWZIP dMdC plazmidnak, de egy Arg-ra rövidített C-láncú proinzuiint kódol — a fenti A3 szakaszban leírt módon fermentálunk; az utána következő izolálás valamint a képződött proteinnek az idézett európai szabadalmi leírásban, a 3. példábanlefrt módon, bróm-ciánnalvagy tripszines emésztéssel történő átalakítása egy analóg inzulin-prekurzort eredményez.

A találmány szerinti eljárás:

Ebből az anyagból208mg-t 100 ml tris/HCl-pufferban, 0,1 mól (pH 8,4), oldunk és Lysobacter enzymogenes-ből származó 1 mg, ugyanebben a pufferban oldott lizil-endopeptidázzal elegyítjük. Az elegyet szobahőmérsékleten, alkalmankénti megkeveréssel 4 óra hosszat reagálni hagyjuk. A reakciót rendszeresen HPLC-vel felülvizsgáljuk. A megadott idő után a Cpeptid 95%-ot meghaladó része lehasad. Ezután a reakcióelegyhez 416 μΐ tripszinoldatot adunk (1 mg/ml koncentráció) és további3 órahosszathagyjukreagálni. A reakciót végül trifluor-ecetsavval történő savanyítással megállítjuk és a terméket az 1. példában leírt módon egy Nucleosil RP-C4-oszlopon (25 cm x 4,8 cm), víz-trifluorecetsav (0,l%)-acetonitril oldószer -rendszerrel eluálva elkülönítjük. Az inzulintartalmú frakció fagyasztva szárítása után 88 mg AOArg-dez-Ihr-B30-humáninzulinkeletkezik

AO-Arg-humáninzulin előállítása a b) eljárás szerint:

3. példa

AO-Arg-Des-Thr-B30-humánmzulin átalakítása AO-Arg-humáninzulinná mg AO-Arg-B30-Des-Thr-humáninzulint, melyet az 1. vagy 2. példa szerint állítottunk elő, 0,25 ml 10 mólos ecetsavval és 0,65 ml 1,54 mól L-treoninmetilészterrel DMSO/butándiolban-1,3, (1:1) oldunk. Ehhez 150 pl lizil-endopeptídázt (Lysobacter enzymógenesből) (Calbiochem No. 440275) adunk, vízben előre oldva (14mg/ml). Akialakult pH-értékkb. 5,3. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 2 óra hosszat állni hagyjuk Az AO-Arg-humáninzulin megfelelő metilésztere keletkezik 94%-ban. Az átalakulást HPLC-vel követjük A proteint 1 ml metanol és 4 ml metil-tercbutiléter hozzáadásával kicsapjuk A csapadékot éterrel egyszer mossuk és szárítjuk A metilészter lehasításához a terméket 10 ml 0,1 mólos glicinpufferben +10 mmól butilaminban illetve 10,0 pH értéken néhány óra hosszat állni hagyjuk

Ezután a terméket acetonnal ismét kicsapjuk és a csapadékot 0,1%-os trifluor-ecetsavban oldjuk és preparatív nagynyomású folyadék-kromatográfiával tisztítjuk A tiszta frakciók Ao-Arg-humánmzulint tartalmaznak; izoelektromos pontja: 6,3.

4. példa

Foszfátsók előállítása Az 1. példa szerint előállított inzulinszármazék 10 mg-ját 5 ml vízben oldjuk és az oldat pH-értékét ammónium-hidroxid-oldattal 6,2-re állítjuk be. Az ennek hatására levált csapadékot szűréssel elkülönítjük, desztillált vízzel mossuk majd 1 ml vízben szuszpendáljuk A szuszpenzióhoz 3,5 pH-érték-eléréséig foszforsavat adunk, amikoris az inzulinszármazék ismét oldatbamegy. Az így kapott oldatot, amely 4 mól/1 koncentrációban tartalmazza akiindulási inzulinszármazék foszfátsóját, közvetlenül felhasználhatjuk galenikus gyógyszerkészítmények elkészítésére.

1. táblázat

B¹ 10

ASN SER ASN GLY LYS PHE VAL ASNGLN HISLEUCYSGLYSERHIS AATTCGAACGGCAAGTTC GTC AAC CAG CAC CTGTGCGGCTCG CAC

GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG (EcoRI)

30

LEU VALGLUALALEUTYRLEU VAL CYS GLYGLUARGGLYPHEPHE CTCGTGGAGGCCCTCTACCTGGTGTGCGGGGAGCGCGGCTTCTTC

HU 205 172 Β

1. táblázat folytatása

GAG CACCTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG C¹ A¹ 40

TYRIHRPROLYSTHRLYSARGGLYILEVALGLUGLNCYSCYSTHRSER

TAC ACC CCC AAG ACC AAG CGG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC

ATG TGG GGG TTC TGG TTC GCC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACATGC AGG 50

ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN SÍP STP

ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA

TAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT

GTC GAC CTG CAG CCA

CAG CTG GAC GTC GGT TCG A

Sáli (Hindin)

2. táblázat

5’CGATAAACCGATACAATTAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGGATC

GCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTGCACCTAG-5

Claims

SZABADALMIIGÉNYPONTOK

1. Eljárás a (Π) általános képletű, előnyösen 5,5 és 9,0 közötti izoelektromos pontú inzulin-származékok —ebben a képletben

a) R³⁰+R³¹ együtt egy hidroxilcsoportot (Ha általános képlet), vagy

b) R³⁰ egy Thr-maradékot és

R³¹ egy hidroxilcsoportot vagy metil-karbonil-csoportot (Hb általános képlet) képvisel—valamint fiziológiailag elviselhető savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (ΙΠ) általános képletű inzulint—ahol

Xjj a humán vagy majom-proinzulin C-láncát vagy az N-terminális láncvégen egy arginin-maradékkal megrövidített majom-proinzulin C-láncát és

Rj a humán- vagy majom-preproinzulin preszekvenciáját jelenti, és az A- és B(l-29)-lánc a humán inzulin szekvenciáját tartalmazza— lizil-endopeptídázzal kezelünk, majd a kapott vegyületet tripszinnel vagy valamely tripszin típusú endopeptidázzal kezeljük; és kívánt esetben a kapott (Ha) általános képletű j|\O-Arg-dez-B30 inzulinszármazékot lizil-endopeptidáz vagy tripszin jelenlétében valamely H-R³⁰-R³¹ általános képletű vegyülettel — ahol R³⁰ és R³¹ jelentése egyezik a (Ilb) általános képletnél megadottal — reagáltatunk, miközben a reaktánsokban jelenlévő szabad -COOH, -OH, -SH, -NH₂, guanidino- és/vagy imidazolil funkciós csoportokat kívánt esetben ismert módon védhetjük és a reakció után az adott esetben jelenlévő védőcsoportokat ismert módon lehasítjuk, amikoris a (Hb) általános képletű inzulinszármazékot kapjuk; és kívánt esetben a kapott inzulinszármazékot fiziológiailag elviselhető savaddíciós sóvá alakítjuk.

2. Eljárás diabetes mellitus kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (Π) általános képletű inzulinszármazékot — e képletekben R³⁰ ésR³¹ jelentése egyezik az 1. igénypont tárgyi körében adott meghatározás szerintivel — és/vagy ennek gyógyászati szempontból elfogadható savaddíciós sóját, kívánt esetben más, nem szinergetikus hatású, modifikált és/vagy modífikálatlan inzulinnal illetve inzulinszármazékkal együtt gyógyászati szempontból elfogadható hordozóval és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal összekeverjük és parenterális beadásra alkalmas készítménnyé alakítjuk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (Π) általános képletű inzulinszármazékként AOArg-dez-B30~humáninzulint vagy AO-Arg-humáninzulint, és/vagy ezek gyógyászati szempontból elfogadható savaddíciós sóját alkalmazzuk.

4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítményt 3,0-9,0, előnyösen 5,0-8,5 pH-értékű injekciós oldatvagy szuszpenzió alakjában állítjuk elő.